İnsan Fibroblastlarında Hücresel Yaşlanmanın Nicel Değerlendirmesi İçin LysoTracker ile Lizozomal Profilleme

Özet

Bu makale, IMR-90 insan fibroblastlarında yaşlanma sırasında lizozomal yeniden modelleşmeyi ölçmek için canlı hücreli bir LysoTracker protokolünü sunmaktadır.

Özet

Hücresel yaşlanma, büyümüş hücre morfolojisi, değişmiş sekretör sinyal ve belirgin lizozomal yeniden modellenme gibi karakteristik fenotiplerle ilişkili kararlı bir hücre döngüsü durdurma durumudur. Yaşlanan hücreler genellikle asidik endo-lizozomal bölmenin genişlemesini gösterir; bu durum ışığı asidite ve bozunma kapasitesinde değişikliklerle birlikte olur; bu da yaşlanmaya bağlı organel yeniden yapılanmasının basit canlı hücre okumaları için fırsat sunar. Bu çalışma, asidik organel bölmesi için dolaylı, pH'a bağımlı bir vekil sağlamak için asidotropik floresan boya olan LysoTracker Deep Red kullanan canlı hücre görüntüleme protokolünü tanımlıyor; bu protokol yaşlanma yükünün bir korelatı olarak asidik organel bölmesi için dolaylı, pH'a bağımlı bir vekil sağlıyor. Bu yöntem, seri geçiş boyunca replikatif yaşlanma sürecinde gerçekleşen IMR-90 insan akciğer fibroblastlarında gösterilmiştir. Protokol, hücre kültürü ve geçiş takibi, LysoTracker boyama, floresans görüntüleme ve lizozomal sinyal yoğunluğu ile hücre başına sinyal pozitif alanının görüntü tabanlı nicelenmesini detaylandırıyor. Paralel kültürlerde yaşlanma ile ilişkili β-galaktosidaz (SA-β-Gal) boyama, referans standardı yerine isteğe bağlı bir onaylayıcı işaret olarak dahil edilmiştir. Temsilci sonuçlar, geç geçiş kültürlerinde erken geçiş kontrollerine göre daha yüksek asidotropik floresan boya sinyali ve daha büyük lizo-pozitif bölgeler göstermektedir; bu da yaşlanma sırasında asidik organel bölmesinin genleşmesiyle uyumludur. Okuma bölümü hacmi, proton gradyanı ve boya kullanılabilirliğine bağlı olduğundan, lizozom sayısı veya biyogenezin doğrudan ölçümü değil, lizozomal yeniden modellenmenin dolaylı bir korelatı olarak en iyi yorumlanabilir. Protokol benimsemesi kolaydır ve diğer hücre tiplerine veya yaşlanma yaratan streslere uyarlanabilir; böylece geleneksel uç nokta testlerine pratik, nicel bir tamamlayıcı sağlar.

Giriş

Hücresel yaşlanma, çeşitli stresler ve yaşlanmaya bağlı^{tetikleyiciler} 1,2,3,4 tarafından aktive edilen dayanıklı bir hücre döngüsü durdurma programıdır. Yaşlanan hücreler klasik olarak bir takımyıldız takımyıldızı tarafından tanımlanır, çünkü hiçbir belirteç tamamen spesifik değildir. Özellikler arasında büyümüş, yassılaşmış hücre morfolojisi, yaşlanmaya bağlı β-galaktosidaz (SA-β-Gal) aktivitesi, DNA hasar odaklarının oluşumu ve pro-inflamatuar sekretör profil (SASP)^2,4,5<....

Protokol

IMR-90 hücreleri, insan fibroblast hücre hattının köklü bir hattıdır ve insan denek araştırması kapsamında değildir. Etik onay veya bilgilendirilmiş onay gerekmiyordu. Tüm prosedürler, New York Eyalet Üniversitesi Albany Üniversitesi'nin biyogüvenlik yönergelerine uygun olarak insan kaynaklı hücre hatlarıyla Biyogüvenlik Seviye 2 (BSL-2) koşullarında gerçekleştirilmiştir.

1. Genel hazırlık ve iş akışı genel görünümü

1. Deneysel hedefi, LysoTracker Derin Kırmızı boyama ve canlı nükleer boya kullanarak IMR-90 hücrelerinde yaşlanma yükünün sürekli bir şekilde ölçülmesini sağlayan lizo....

Sonuçlar

Bu protokolü, yaşlanma düşük ve yüksek yaşlanma koşullarında IMR-90 fibroblastlarına uygulanması, tek hücre düzeyinde ve istendiğinde tüm alan düzeyinde özetlenebilen nicel lizozomal okumalar elde eder.

Şekillerde ve tablolarda gösterilen temsil veri seti, IMR-90 kültürlerinin 13. (P13; yaşlanma düşük, ~PDL 26) ve 23. (P23; yaşlanma yüksek, ~PDL 46) aşamasındaki IMR-90 kültürlerini karşılaştıran tek bir biyolojik deneyden türemiştir. Her koşulda iki kuyu görün.......

Tartışma

Bu protokol, lizozomal yeniden modelleme yoluyla yaşlanmayı ölçen ve hücre başına ve kuyuya göre yaşlanma yükünün nicel okumalarını sağlayan canlı hücre görüntüleme iş akışını tanımlar. Güvenilir bir test elde etmek için özellikle birkaç adım önemlidir. Öncelikle, biyolojik modelin kendisi iyi kontrol edilmelidir. IMR-90 fibroblastlarında replikatif yaşlanmanın indüksiyonu, popülasyon çiftleşmelerinin dikkatli izlenmesini ve yaşlanmayan olmayan referans^{olarak.......}

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
24-well tissue culture plate (flat bottom, TC-treated)	CellTreat Scientific Products	229124	Canlı hücre floresan görüntüleme ile uyumlu herhangi bir berrak tabanlı çok kuyuluk kültür plakası (örn., 6-, 12- veya 24-kuyuluk TC-tedavi edilmiş polistiren plakalar; daha yüksek çözünürlüklü görüntüleme için cam tabanlı görüntüleme plakaları tercih edilebilir).
Beta-galaktosidaz boyama kiti (yaşlanma analizi)	Cell Signaling Technology	9860	pH 6.0'da doğrulanmış boyama tamponu olan herhangi bir ticari SA-β-galaktosidaz kiti. Referans amaçlı, fiksasyon çözeltisi PBS içinde %2 formaldehit ve %0,2 glutaraldehit içerir ve boyama çözeltisi DMF içinde 1 mg/mL X-gal, 40 mM sitrat/fosfat pH 6.0, 5 mM potasyum ferrosiyanür, 5 mM potasyum ferrisiyanür, 150 mM NaCl, 2 mM MgCl2 içerir.
BioRender (bilimsel çizim yazılımı)	BioRender	N/A — web uygulaması	Şematik şekiller oluşturmak için kullanılır (Şekiller 1–3). https://www.biorender.com
Karbon dioksit gazı (CO2), sıkıştırılmış silindir	Airgas (veya benzer bir tedarikçi)	N/A	Hücre kültürü inkübatör ve sahne üstü görüntüleme odasında %5 atmosferi korumak için kullanılan medikal sınıf CO2.
Isı ile inaktive edilmiş fetal boğaz serumu (FBS)	Thermo Fisher Scientific (Gibco)	10082147	56 °C'de ısı ile inaktive edilmiş herhangi bir hücre kültürü sınıfı FBS; tam kültür ortamında %10 v/v oranında kullanılır.
Canlı hücre yeteneğine sahip floresan mikroskopu	Thermo Fisher Scientific	AMF7000	Canlı hücre sıcaklığı ve CO2 kontrolüne sahip herhangi bir geniş alan veya konfokal floresan mikroskobu, uzak kırmızı (yaklaşık 647 nm eksitasyon / yaklaşık 670 nm emisyon) ve DAPI/Hoechst (yaklaşık 405 nm eksitasyon / yaklaşık 460 nm emisyon) kanalları için filtre setleri ve lizozomal özellikleri çözmek için yeterli NA'ya sahip 20×-40× bir objektif. Bu çalışmada EVOS M7000 Görüntüleme Sistemi kullanılmıştır.
Hoechst 33342 nükleer boyası	Thermo Fisher Scientific	H3570	Canlı hücre nükleer boyaması için hücreye geçirgen DNA boyası (mavi floresan, yaklaşık 405 nm eksitasyon). DAPI ile değiştirilemez, çünkü fizyolojik koşullar altında hücreye geçirmez.
Görüntü analiz yazılımı	Python Yazılım Vakfı	N/A	Çekirdek segmentasyonu, çekirdekten hücreye bölge genişletme, yoğunluk eşiği ve temel görüntü istatistiklerini destekleyen herhangi bir bilimsel hesaplama ortamı (örn., scikit-image ile Python, MATLAB, ImageJ/Fiji, CellProfiler). SenTrack işlem hattı (bkz. Ek Dosya S1) bu çalışma için geliştirilmiştir.
IMR-90 insan akciğer fibroblastları (hücre hattı)	ATCC	CCL-186	Replikasyon yaşlanmasını modellemekte kullanılan normal insan fetal akciğer diploid fibroblast hücre hattı; benzer şekilde karakterize edilmiş herhangi bir insan fibroblast hattı ikame edilebilir.
LysoTracker Deep Red	Thermo Fisher Scientific (Invitrogen)	L12492	Asidik organellerin canlı hücre boyanması için asidotropik floresan boya; DMSO içinde 1 mM stoklar halinde tedarik edilir. Hazırlanan hücre kültürü ortamında çalışma konsantrasyonu 75nM'dir. Uzak kırmızı emisyon (ek 647 nm / em 668 nm) lipofusin otofloresans ile çakışmayı en aza indirir, ancak bunu ortadan kaldırmaz.
Minimum Temel Ortam (MEM)	Thermo Fisher Scientific (Gibco)	11-095-080	IMR-90 fibroblastları için bazal kültür ortamı; %10 FBS ve %1 penisilin-streptomisin ile takviye edilmiştir. Herhangi bir standart Eagle's Minimum Temel Ortam formülasyonu Earle'in tuzları ve L-glutamin ile ikame edilebilir.
Penisilin-streptomisin çözeltisi (100×)	Thermo Fisher Scientific (Gibco)	15140122	Tam kültür ortamı için antibiyotik takviyesi; %1 v/v (son konsantrasyon 100 U/mL penisilin, 100 μg/mL streptomisin) oranında kullanılır. Herhangi bir standart pen-strep çözeltisi ikame edilebilir.
Fenol kırmızısız görüntüleme ortamı	Thermo Fisher Scientific (Gibco)	A1896701	Canlı hücre görüntüleme için kullanılan fon ışığını azaltmak amacıyla kullanılır; 10% FBS ile takviye edilmiş herhangi bir phenol kırmızısız görüntüleme tamponu ikame edilebilir.
Fosfat tamponlu salin (PBS), pH 7.4 (1×)	Thermo Fisher Scientific (Gibco)	10010023	Hücre yıkama ve reaktif seyreltme için izotonik tampon; pH 7.4'de herhangi bir steril 1× PBS ikame edilebilir.
SenTrackLite v0.5.0 (yazılım)	Açık Kaynak (Estrada / Melendez Lab)	v0.5.0	Lizozomal yaşlanma görüntü analizi için açık kaynaklı tek dosyalık Python / Tkinter uygulaması. Ek Dosya S1 olarak dağıtılmıştır. Zenodo'da arşivlendi, doi:10.5281/zenodo.19701255. MIT lisansı. Kaynak: https://github.com/goldbader-hub/Sentrack
Mikroskop