İnsan Fibroblastlarında Hücresel Yaşlanmanın Nicel Değerlendirmesi İçin LysoTracker ile Lizozomal Profilleme

Özet

Bu makale, IMR-90 insan fibroblastlarında yaşlanma sırasında lizozomal yeniden modelleşmeyi ölçmek için canlı hücreli bir LysoTracker protokolünü sunmaktadır.

Özet

Hücresel yaşlanma, büyümüş hücre morfolojisi, değişmiş sekretör sinyal ve belirgin lizozomal yeniden modellenme gibi karakteristik fenotiplerle ilişkili kararlı bir hücre döngüsü durdurma durumudur. Yaşlanan hücreler genellikle asidik endo-lizozomal bölmenin genişlemesini gösterir; bu durum ışığı asidite ve bozunma kapasitesinde değişikliklerle birlikte olur; bu da yaşlanmaya bağlı organel yeniden yapılanmasının basit canlı hücre okumaları için fırsat sunar. Bu çalışma, asidik organel bölmesi için dolaylı, pH'a bağımlı bir vekil sağlamak için asidotropik floresan boya olan LysoTracker Deep Red kullanan canlı hücre görüntüleme protokolünü tanımlıyor; bu protokol yaşlanma yükünün bir korelatı olarak asidik organel bölmesi için dolaylı, pH'a bağımlı bir vekil sağlıyor. Bu yöntem, seri geçiş boyunca replikatif yaşlanma sürecinde gerçekleşen IMR-90 insan akciğer fibroblastlarında gösterilmiştir. Protokol, hücre kültürü ve geçiş takibi, LysoTracker boyama, floresans görüntüleme ve lizozomal sinyal yoğunluğu ile hücre başına sinyal pozitif alanının görüntü tabanlı nicelenmesini detaylandırıyor. Paralel kültürlerde yaşlanma ile ilişkili β-galaktosidaz (SA-β-Gal) boyama, referans standardı yerine isteğe bağlı bir onaylayıcı işaret olarak dahil edilmiştir. Temsilci sonuçlar, geç geçiş kültürlerinde erken geçiş kontrollerine göre daha yüksek asidotropik floresan boya sinyali ve daha büyük lizo-pozitif bölgeler göstermektedir; bu da yaşlanma sırasında asidik organel bölmesinin genleşmesiyle uyumludur. Okuma bölümü hacmi, proton gradyanı ve boya kullanılabilirliğine bağlı olduğundan, lizozom sayısı veya biyogenezin doğrudan ölçümü değil, lizozomal yeniden modellenmenin dolaylı bir korelatı olarak en iyi yorumlanabilir. Protokol benimsemesi kolaydır ve diğer hücre tiplerine veya yaşlanma yaratan streslere uyarlanabilir; böylece geleneksel uç nokta testlerine pratik, nicel bir tamamlayıcı sağlar.

Giriş

Hücresel yaşlanma, çeşitli stresler ve yaşlanmaya bağlı^{tetikleyiciler} 1,2,3,4 tarafından aktive edilen dayanıklı bir hücre döngüsü durdurma programıdır. Yaşlanan hücreler klasik olarak bir takımyıldız takımyıldızı tarafından tanımlanır, çünkü hiçbir belirteç tamamen spesifik değildir. Özellikler arasında büyümüş, yassılaşmış hücre morfolojisi, yaşlanmaya bağlı β-galaktosidaz (SA-β-Gal) aktivitesi, DNA hasar odaklarının oluşumu ve pro-inflamatuar sekretör profil (SASP)^2,4,5 bulunur. Bu özellikler arasında, lizozomal yeniden şekillendirme, yaşlanmanın belirgin ve işlevsel olarak önemli bir özelliği^{olarak ortaya çıkmıştır 6,7}. Yaşlanan hücreler, lizozomal boyut ve sayıda dramatik bir artış ile fonksiyonun değişmesi (genellikle lizozomal pH'ın kısmi nötralizasyonu ve bozulmamış maddenin birikimini içerir) gibi derin lizozomal değişiklikler gösterir.6,7,8,9. Bu lizozomal genişleme, yaşlanan hücrelerde yüksek lizozomal β-galaktosidaz aktivitesini yansıtan yerleşik bir yaşlanma belirteçsi olan SA-β-Gal aktivitesinin artmasına katkıda^bulunur 10,11,12. Gerçekten de, SA-β-Gal boyama, bu olgunu kullanarak optimal olmayan pH (6.0) kuluçka kullanarak yaşlı hücreli lizozomlarda boya seçici olarak çökeltirir; bu lizozomlar enzimi biriktirmiş ve genç^{hücrelerden daha yüksek pH sergiler;} 10,12,13.

Lizozomlar, protein dönüşümü ve sinyal iletiminde merkezi roller oynar ve düzensizlikleri artık yaşlanma ve yaşlanmanın^{ayırt edici özellikleri olarak kabul edilmektedir} 1,2,4,6. Yaşlanan hücreler genellikle lizozomal disfonksiyon gösterir; bu, yüksek luminal pH, değişen enzim aktivitesi ve oksitlenmiş makromoleküllerin otofloresan pigmenti olan lipofuscin birikimiyle ^{kanıtlanır.6,14}. Lizozomal biyogenez, transkripsiyon faktörü EB (TFEB) ve ilgili^{faktörler 6,7,15} kontrolü altında koordineli lizozomal ifade ve regülasyon (CLEAR) ağı aracılığıyla sıklıkla yukarı regülasyon veya değiştirilir. Bu süreç, yaşlanan hücrelerde strese uyum sağlarken bozunucu^{bölmeyi genişleterek} lizozomal kütleyi artırabilir ^6,7,10. Buna karşılık, yaşlanan hücreler lizozomal fonksiyonel düşüş (örneğin, azalmış asidite) yaşayabilir; bu da otofaji gibi süreçleri etkileyebilir ve ferroptotik hücre ölümü ^6,8 gibi belirli streslere karşı direnç kazandırabilir. Bu nedenle, lizozomal içerik ve fonksiyonun ölçülmesi, yaşlanma ^6,16'yı anlamak ve tanımlamak için merkezi bir noktadır.

LysoTracker Deep Red, membran performası olan bir floresan probdur ve lizozomal membran boyunca protonasyon odaklı hapsetme yoluyla asidik organellerde seçici olarak birikir^. Ortaya çıkan sinyal, lizozomal kütleden ziyade birleşik asidik bölme hacmi, proton gradyan gücü ve yerel boya kullanılabilirliğini yansıtır ve toplam^{lizozom sayı 6,16'dan} bağımsız olarak lizozomal pH veya membran durumundaki değişikliklerle değişebilir. Hücresel yaşlanma bağlamında, hücreler yaşlanma öncesi muadillere kıyasla daha genişlemiş ve daha yoğun şekilde etiketlenmiş LysoTracker-pozitif bölmeler^{sergiler sergiler 9}; bu, biyokimyasal ve ultrastruktural çalışmalarda bildirilen asidik organel bölmeninin genişlemesi ve lizozomal biyogenezin artmasıyla uyumlu. Bu canlı hücre yaklaşımı, geleneksel son nokta SA-β-Gal boyamaya kıyasla birkaç avantaj sunar: bireysel hücrelerin nicel ve mekansal çözümlü analizini mümkün kılar, diğer floresan raporlayıcılarla birleştirilebilir, fiksasyon gerektirmez ve heterojenliği ikili bir son nokta yerine sürekli özellikler bildirerek^{yakalar 6,16}. Bu protokol boyunca, LysoTracker sinyali canlı hücrelerdeki asidik organel bölmesinin bir okuması olarak kullanılır ve kohale bağlı değişiklikler, lizozom^{sayı 6,16'nın} mutlak ölçüsü olarak ele alınmak yerine buna göre yorumlanır.

Bu protokol, LysoTracker Deep Red'in IMR-90 fibroblastlarında replikatif yaşlanma sürecinde lizozomal değişiklikleri profillemek için kullanımını detaylandırır. IMR-90, yaşlanma araştırmalarında yaygın olarak kullanılan normal bir insan diploid fibroblast hattıdır (dişi, fetal akciğer kökenli); diğer primer benzeri fibroblastlar gibi (örneğin, WI-38), IMR-90 hücreleri, telomer kısaltması ve DNA hasarı sinyalleri nedeniyle ~50–60 popülasyon ikiye katlanmadan (Hayflick sınırı) sonra yaşlanmaya başlar^(18,19). Protokol, IMR-90 hücrelerinin seri geçişle yaşlanmayı nasıl indükleyeceğini, morfoloji ve SA-β-Gal boyama ile yaşlanmayı doğrulamayı, LysoTracker Deep Red ile canlı kültürlerin floresans^{görüntüleme 5,10,12,13} için nasıl boyanacağını açıklar. Görüntü alımı ve analizi dahil edilir; hücre başına lizozomal sayı, hücre başına toplam lizozomal alan ve ortalama floresans yoğunluğu gibi nicel okumalar da dahil edilir. Deneysel kontroller ve güvenlik hususları vurgulanır; boyaların ve fiksatörlerin dikkatli kullanımı, görüntüleme sırasında fototoksisitenin en aza indirilmesi ve yaşlı hücrelerde hücresel otofloresansın hesaba katılması yer alır. Yöntem, replikatif yaşlanma kullanılarak gösterilmiştir ancak diğer modellere uyarlanabilir; örneğin, ilaç kaynaklı yaşlanma (örneğin, doksorubisin veya etoposid tedavisi) veya^oksidanlar 2,3,4,19,20 tarafından stresle indüklenen erken yaşlanma (SIPS) dahil. Her durumda, LysoTracker tabanlı okumalar uygun kontrollerle (çoğalan veya hareketsiz hücreler) karşılaştırılmalı ve mümkün olduğunda en az bir geleneksel yaşlanma belirteciyle (örneğin SA-β-Gal veya p16INK4a ifadesi) çapraz doğrulanmalı^.

Canlı hücre lizozomal profilleme, yaşlanma testlerinde pratik bir boşluğu doldurur; çünkü bu ölçüm yaşlanma hücre fonksiyonuyla doğrudan bağlantılı olan ana organel fenotipin—lizozomal genişlemenin—tekrarlanabilir, tek hücre çözünürlüklü ölçümü sağlar (örneğin, gelişmiş degradasyon kapasitesi ve sekretor aktivite)2,3,4,6 . LysoTracker boyama, yüksek verimli görüntüleme ve akış sitometrisiyle uyumlu olduğundan, protokol ilaç taraması gibi uygulamalar için ölçeklenebilir (örneğin, senolitiklerin veya lizozomal fonksiyonun modülatörlerinin testi)^2,3,6. Gelecek bir yön olarak, bu protokol tarafından üretilen hücre başına lizozomal özellikler, makine öğrenimi modelleri dahil olmak üzere aşağı akış sınıflandırma yaklaşımlarına uygundur; Bu tür sınıflandırıcıların eğitimi ve doğrulaması bu protokolün kapsamının dışındadır. Genel olarak, bu yöntem (Şekil 1), yaşlanma biyolojisinin lizozomal boyutunun görselleştirilmesini ve nicelendirilmesini sağlar; yaşlanma veya stres sırasında lizozomal biyogenezin ve morfolojinin nasıl değiştiğine dair içgörü sağlar ve yaşlı hücrelerde lizozomları hedef alan müdahalelerin test edilmesi için bir platform sunar. Çekirdekleri segmente almak, hücre ile ilişkili bölgeleri, eşik değerini türetmek ve LysoTracker özelliklerini nicelendirmek için kullanılan görüntü analizi iş akışı, burada sunulan kuyu başına ve hücre başına analizleri yeniden üretmek için kullanılan bir görsel analiz iş akışı (SenTrackLite v0.5.0) olarak uygulanmıştır; bu paket Ek Dosya 1 olarak sağlanır ve atıf ve yeniden kullanım için kalıcı bir DOI^{ile arşivlenir 21}.

Şekil 1: Canlı hücreli lizozomal yaşlanma testinin genel görünümü. (A) Deneysel iş akışı. Hücreler, LysoTracker Deep Red ve nükleer boya ile canlı boyanır, standart floresan mikroskopisiyle görüntülenir ve doğrulama için SA-β-Gal boyama için isteğe bağlı olarak paralel olarak işlenir. (B) Görüntü teşefekti hücre başına ölçümler. Nükleer kanal, bireysel hücreleri tanımlamak için kullanılır ve çekirdek sabitli genişleme, LysoTracker kanalından lizozom ile ilişkili ölçümlerin çıkarılması için hücre başına bir bölge tanımlar. Hücre başına temsil etkileyici ölçümler arasında lizozomal alan, ortalama LysoTracker yoğunluğu ve lizozom sayısı yer alır. SA-β-Gal boyama, referans veri setleri oluşturulurken veya doğrulanırken isteğe bağlı doğrulama etiketi olarak kullanılabilir. (C) Nicelik ve çıktılar. Hücre başına lizozomal ölçümler, basit bir puanlama yöntemiyle tek bir hücre başına yaşlanma puanı veya olasılığı olarak birleştirilir. Çıktılar, hücre başına değerler ve yaşlanma yükünün iyi seviye veya koşul düzeyindeki özetlerini içerir; bunlar yaşlanma-indüksiyon veya senolitik tedavi koşulları arasında karşılaştırılabilir. BioRender.com ile oluşturuldu
Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Protokol

IMR-90 hücreleri, insan fibroblast hücre hattının köklü bir hattıdır ve insan denek araştırması kapsamında değildir. Etik onay veya bilgilendirilmiş onay gerekmiyordu. Tüm prosedürler, New York Eyalet Üniversitesi Albany Üniversitesi'nin biyogüvenlik yönergelerine uygun olarak insan kaynaklı hücre hatlarıyla Biyogüvenlik Seviye 2 (BSL-2) koşullarında gerçekleştirilmiştir.

1. Genel hazırlık ve iş akışı genel görünümü

1. Deneysel hedefi, LysoTracker Derin Kırmızı boyama ve canlı nükleer boya kullanarak IMR-90 hücrelerinde yaşlanma yükünün sürekli bir şekilde ölçülmesini sağlayan lizozomal yeniden şekillendirmeyi niceleyen canlı hücre lizozomal profilleme testi olarak tanımlayın. Birincil biyolojik karşılaştırmayı aşağıdaki tasarımlardan biri olarak tanımlayın:
   1. Yaşlanma indüksiyonu vs. eşleşen indüklenmiş indüklenmiş kontrol arasında.
   2. Yaşlanma yüksek ve düşük yaşlanma koşulları, bir doz veya zaman serisi genelinde.
   3. Senolitik vs. ile tedavi edilen yaşlanma yüksek durum araçta tedavi edilen yaşlanma-yüksek kontrol.
   4. Senolitik tedavi serileri, hem yaşlanma düşük başlangıç grubu hem de yüksek yaşlanma grubu içerir.
2. Tüm deneyler için minimum kontrol yapısını belirleyin.
   1. Kaplama yoğunluğu, boyama zamanlaması ve görüntüleme ayarları için eşleştirilmiş yaşlanma açısından düşük bir kontrol grubu ekleyin.
   2. Tanımlanmış bir yaşlanma tetikleyicisi veya geç geçiş tekrarlayıcı yaşlanma ile oluşturulan bir yaşlanma yüksek grubu ekleyin.
   3. Her durum için biyolojik kopyaları ekleyin ve koşullar arasında aynı zamanlamayla boyama ve görüntüleme yapın.
3. Analiz okumalarını lizozomal yeniden modellemenin doğrudan görüntü tabanlı ölçümleri olarak tanımlayın:
   1. Lizo-pozitif maske içinde hücre başına ortalama LysoTracker yoğunluğunu birincil test okuması olarak tutarlı bir yoğunluk eşiği kullanarak ölçün. Tek hücre düzeyinde, bu metrik yaşlanma düşük ile yaşlanma yüksek koşulları en büyük etki boyutuna sahip olarak ayırır ve alan düzeyindeki nükleer yoğunluğa duyarsızdır (Ek Şekil 1).
   2. Aşağıdakileri, bölme genişlemesini belgeleyen ancak segmentasyon seçeneklerine veya alan düzeyindeki nükleer yoğunluğa daha duyarlı olan ikincil okumalar olarak kaydedin: hücre başına lizozom zenginleştirilmiş alan ve alan seviyesinde çekirdek başına entegre LysoTracker yoğunluğu. Çekirdek başına entegre yoğunluk, iyi nüfuslu alanlarda bilgilendiricidir, ancak bir alan az sayıda çekirdek içerdiğinde dengesiz hale gelir; çünkü çekirdek başına normalleşme bireysel hücreler tarafından domine edilir.
   3. Görüntüleme çözünürlüğü nokta ayrımcılığını desteklediğinde isteğe bağlı lizozom nokta sayı ve boyut metriklerini kaydedin.
4. Deneysel kısıtlamalara bağlı olarak, paralel kuyular veya eşleştirilmiş örnekler üzerinde isteğe bağlı bir doğrulama adımı olarak yaşlanma ile ilişkili β-galaktosidaz (SA-β-Gal) boyama kullanın. Bu doğrulamayı kullanarak geç geçiş kültürlerinin erken geçiş kültürlerine kıyasla daha yüksek SA-β-Gal pozitifliği gösterdiğini doğrula.
5. Veri toplamadan önce aşağıdaki değişkenleri sabitleyerek testi koşullar arasında standartlaştırın:
   1. LysoTracker çalışma konsantrasyonu (75 nM) ve boyama süresi (30 dakika).
   2. Nükleer boya kimliği ve çalışma konsantrasyon aralığı (örneğin, 1 μg/mL'den 2 μg/mL'ye kadar Hoechst 33342).
   3. Görüntüleme parametreleri; objektif büyütme, pozlama süresi, aydınlatma yoğunluğu, binleme ve odak stratejisi dahil.
   4. Plaka formatı ve görüntüleme konfigürasyonu (şeffaf tabanlı görüntüleme plakaları veya cam tabanlı çanaklar), çoğaltma kuyu düzeni dahil.
   5. Eşik seçimi ve yoğunluk normalizasyonu.
      1. Bir deneydeki tüm kuyruklarda LysoTracker kanalına tek bir sabit yoğunluk eşiği uygulanarak lizo-pozitif maske tanımlanır.
      2. Test kurulumu sırasında bir kez beklenen yoğunluk aralığını kapsayan bir kalibrasyon alanı seti kullanarak (örneğin, iki yaşlanma-düşük ve iki yaşlanma-yüksek alan) eşik seçin ve o oturumdaki tüm kuyular boyunca sabit tutulur; eşiğin kuyuya göre değişmesine izin vermek, ölçüm ile sonuç arasında döngüsel bir bağımlılık oluşturur.
      3. Çapraz deney karşılaştırmaları için, tüm koşulları tek bir oturumda aynı lazer gücü, pozlama ve kazanç ayarları altında alın ve bu ayarları şekil efsanesinde bildirin.
      4. Seanslar arasında mutlak yoğunluk karşılaştırmaları gerekiyorsa, floresan referans standardı (örneğin, referans boncuk plakası veya sabit referans kuyusu) ekleyin ve ölçülen yoğunlukları buna göre normalize edin.
         NOT: Aynı alım ayarları veya referans tabanlı normalleştirme olmadan seanslar arasında ham yoğunluk değerlerini karşılaştırmayın.
   6. Nükleer yoğunluk normalizasyonu.
      NOT: Yaşlanan kültürler genellikle karşılaştırılabilir tohumlama sürelerinde daha düşük proliferasyon ve daha düşük nükleer yoğunluk gösterdiğinden7,10, mutlak piksel sayılarına (örneğin, toplam lizo-pozitif alan) dayalı saha düzeyindeki metrikler, tarladaki hücre sayısına göre etkilenebilir.
      1. Hem ham hem de çekirdek başına normalleştirilmiş değerleri raporlayın (ham değerin Hoechst-segmentli çekirdek sayısına bölünmesi).
         NOT: Çekirdek başına normalizasyon kontrolleri yoğunlukla ilgili karıştırmaları sağlar ve hücre başına yorumlama için uygun karşılaştırmadır. Alan tabanlı okumalar için, normalize edilmiş değer birincil metrik olarak kullanılırken, normalize edilmemiş toplam tamlık için korunur.
6. Canlı hücre sinyal kalitesini koruyan ve teknik değişkenliği en aza indiren koşullarda görüntü edinin. Erken ve geç geçiş plakalarını boyama ve taşıma sırasında ışıktan koruyun ve görüntüleme sırasında kontrollü kültür koşulları dışındaki zamanı en aza indirin.
7. Flüoresans görüntülerini tek düzlemli, tek kanallı, kayıpsız TIFF dosyaları olarak kaydedin. Nükleer ve LysoTracker görüntüleri arasındaki eşleşmeyi koruyan ve plaka, iyi koşullar altına ve çoğaltma ile izlenebilirliği koruyan tutarlı bir adlandırma şeması kullanın. Kanal ekleriyle ortak bir baz adı kullanın (örneğin, _Hoechst.tif ve _Lyso.tif). Görüntüleri deneye göre düzenlenmiş özel bir klasörde, gerekirse alt klasörler halinde sakla.
   NOT: Pratik bir duraklama noktası, erken ve geç geçiş kohortlarının belirlenmesi ve geç geçiş kültürlerinin yavaş büyüme ve yaşlanma benzeri morfolojisi gösterdiği doğrulanmasıdır.
8. (İsteğe bağlı) Oksijeni, ortam ve düşük oksijen koşullarında uyumlu IMR-90 kohortlarını koruyarak deneysel değişken olarak dahil edin. Tüm grupları aynı şekilde işle.

2. Hücre kültürü ve replikatif yaşlanmanın indüksiyonu

1. IMR-90 insan akciğer fibroblastlarını standart hücre kültürü uygulamalarına göre eritmek ve hücreleri %10 fetal sığır serumu ile takviye edilmiş Minimum Temel Ortamda (MEM) genişletmek. Laboratuvar uygulamaları ve deneysel tasarıma uygunsa, %1 oranında penisillin-streptomisin ekleyin. Hücreleri %5 CO₂ içinde 37 °C'de tutun.
2. Kültürleri logaritmik büyüme ve geçiş aralığında %70 ila %80 birleşmeden önce sürdürmek. Deneysel çalışmalar arasında değişkenliği azaltmak için tutarlı medya işleme ve besleme programları kullanın. Geçişler arasında her 2-3 günde bir tam kültür ortamını değiştirin.
   NOT: Ortamın 72 saatten fazla değişmemesine izin vermeyin; çünkü besin tükenmesi ve salgılanan faktörlerin birikimi stresle tetiklenen fenotipleri teşvik edebilir ve bu fenotipler tekrarlayıcı yaşlanmayı karıştırabilir.
3. Yaşlanma seviyesi düşük başlangıç grubunu, normal büyüme davranışını koruyan koşullar altında tutulan aktif olarak çoğalan IMR-90 kültürleri olarak tanımlayın. Tüm deneysel gruplara kaplama yoğunluğunu ve kullanımı eşleştirmek.
4. Deneysel hedeflere göre seçilen aşağıdaki yaklaşımlardan birini kullanarak yaşlanma yüksek bir grup oluşturun.
   1. Popülasyon çiftini takip ederek seri geçişle çoğaltıcı yaşlanma indüklenir; ta ki yavaşlayan proliferasyon ve yaşlanmaya bağlı morfoloji belirginleşene kadar.
      NOT: Nüfus katına çıkma seviyesi (PDL) ve geçiş sayısı ayrı ölçütlerdir ve ayrı ayrı takip edilir. PDL, birikimli erime sonrası çiftleşmeleri ifade eder ve her pasajda şu şekilde hesaplanır:
      PDL_i = PDL_i-1 + log₂(hasat edilen hücreler / tohumlanmış hücreler)¹⁸,
      Geçiş sayısı ise çözülmeden sonra alt kültürlerin sayısını sayar. Kültürler genellikle yaklaşık %70–%80 birleşimde 1:4 olarak bölündüğünden, her pasaj yaklaşık iki popülasyon katına çıkar, bu nedenle geçiş sayısı ve kümülatif PDL birbirinin yerine geçmez.
      NOT: Yaşlanma yüksek kültürler genellikle gelişmiş popülasyon ikiye katlanma seviyelerinde, çoğalma yavaşladığında ve yaşlanmaya bağlı morfolojinin belirginleştiği durumlarda gözlemlenir. Her IMR-90 partisi için kesin eşikler ampirik olarak belirlenmelidir, çünkü PDL'ler satıcılar arasında farklılık gösterir.
   2. Belirgin bir yaşlanma tetikleyicisi uygulanarak ve uygun fenotipik gelişim penceresine izin verilerek stresle tetiklenen yaşlanma.
   3. Tedavi sonucu şekillendirilen yaşlanma, hücreleri incelenen duruma maruz bırakarak yapılır; amaç ise bu durumun yaşlanıp oluşmadığını test etmek.
5. Seçilen yaklaşımın, paralel kuyular üzerinde yapılan en az bir ortogonal okuma kullanarak yaşlanma açısından yüksek fenotip ürettiğini doğrulayın. Isteğe bağlı doğrulama yöntemi olarak SA-β-Gal boyama işlemi yapın ve dahil edildiğinde her koşul başına pozitif hücrelerin oranını belgeleyin.
   1. Bir kültür, hücrelerin en az %50'sinde pH 6.0'da 12 ila 16 saat kuluçkadan sonra kesin mavi perinükleer SA-β-Gal boyama gösterirse, yaşlanma yüksekliği sayılırken, eşleşen yaşlanma-düşük kontrol aynı boyama koşullarında %10'dan fazla pozitif hücre^{göstermez 13}.
   2. Bu sınırların dışındaki değerler, eksik yaşlanma indüksiyonu veya yükselmiş arka plan gösterir ve görüntülemeye geçmeden önce yeniden optimizasyon gerektirir.
      NOT: Yaşlanma düşük ve yüksek yaşlanma kohortları belirlendikten sonra morfoloji ve isteğe bağlı validasyon boyama ile net fenotipik farkı doğrulayın.
6. İsteğe bağlı: Senolitik tedavi tasarımı
   1. Plaka yaşlanması düşük ve yüksek yaşlanma koşulları, çoğaltıcı kuyularda hücrelerin tedavi öncesi yapışmasını ve iyileşmesini sağlar.
   2. Yaşlanma yüksek kuyuları senolitik bileşiklerle tedavi edin ve araçla tedavi edilen yaşlanma yüksek kontrol ekleyin.
   3. Aynı araç ile tedavi edilen bir yaşlanma düşük grup ve uygun olduğunda aynı bileşik konsantrasyonu ile dahil edilip, yaşlanmayan hassasiyeti izlemek için oluşturulur.
   4. LysoTracker ve nükleer boyama işlemlerinden sonra tüm koşullarda tutarlı bir zamanda uygulanmaya devam edin.
7. Geç geçiş/tedavi ilerlemesi sırasında kültürleri izleyin ve morfoloji, büyüme desenlerini belgeleyin. Yaşlanmış kültürleri yavaşlatılmış proliferasyon, büyütülmüş ve yassılaştırılmış morfoloji ile artan sitoplazmik granülarlıkla tanımlayın. Büyüme durması belirgin hale geldiğinde, kültürü daha fazla geçmeden boyanma ve görüntüleme için yaşlanma yüksek grup olarak koruyun.
8. Kültür bakımı sırasında karmaşık stres faktörlerini en aza indirin; tutarlı medya hazırlığı, tutarlı beslenme programları ve kuluçka dışı tutarlı kullanım süresi kullanın. Sıcaklık dalgalanmalarını, kontrollü CO₂ dışında uzun süre ve tutarsız ortam ısınmasını önlenebilir teknik değişkenlik kaynakları olarak ele alın.
9. Isteğe bağlı: Ortam oksijeninde ve düşük oksijen altında eşleşen kültürleri korumak. Kültürleri %21 O₂ altında ve %5 altında O₂ ayrı kohortlar olarak tutmak ve mümkün olduğunda rutin kültür yönetimi sırasında her kohortu atanan oksijen koşulları altında tutmak gerekir. Düşük oksijenli kohortlar için transferler ve görüntüleme hazırlıkları sırasında ortam oksijene maruz kalmayı sınırlayın.
   NOT: Pratik bir duraklama noktası, erken ve geç geçiş kohortlarını tanımlayıp stabilize ettikten sonra geç geçiş kültürlerinin tutarlı yavaş büyüme ve yaşlanma ilişkili morfolojisi gösterdiğini doğrulamaktır.

3. LysoTracker Deep Red ve nükleer boya ile canlı hücreli lizozomal ve nükleer boyama

1. Tüm deneysel koşullar için şeffaf tabanlı görüntüleme plakalarında veya cam tabanlı çanaklarda plaka IMR-90 hücreleri kullanılır. Seçilen tetikleyici tarafından oluşturulan en az bir yaşlanma seviyesi kontrol koşulu ve en az bir yaşlanma yüksek koşulu ekleyin ve her koşul için biyolojik kopyalar ekleyin.
2. Tohum hücreleri, boyama gününde alt konfuzent monokatman elde etmek için. Her deney için tohumlama yoğunluğunu ve kaplama ile boyama arasındaki zamanı kaydederek koşudan koşuya karşılaştırılabilirliği destekleyin.
3. 37 °C'ye kadar tam kültür ortamı ısındır. Isıtılmış ortamda 75 nM'de LysoTracker Deep Red çalışma çözümü hazırlayın ve ışıktan koruyun. Çalışma çözeltisi, üretici tarafından DMSO'da sağlanan 1 mM LysoTracker Deep Red stokunun ısıtılmış tam kültür ortamında 1:13.333 derecesinde seyreltilmesiyle hazırlanır (örneğin, 10 mL ısıtılmış ortam başına 0,75 μL 1 mM stok).
   NOT: Geç geçiş ve stres kaynaklı yaşlanma hücreleri, geniş dalga boyu aralıklarında yayılan ve lekelenmemiş kontrollerde belirgin LysoTracker sinyaline katkıda bulunan lipofuscin ve diğer spesifik olmayan otofloresan maddeleri^{biriktirir 14}. Bir deneyde otofloresansın katkısını tahmin etmek için, her koşulda en az bir lekelenmemiş kuyuyu dahil edin ve aynı görüntüleme ortamlarında elde edinin. Boyalı kuyu ölçümlerinden ortalama lekelenmemiş kuyuyu sinyalini çıkarın veya hem ham hem de arka plan çıkarılmış değerleri raporlayın.
   NOT: Pratikte, IMR-90 kültürlerinde lekelenmemiş LysoTracker-kanal sinyali, boyalı yaşlanma sinyaline göre küçüktür (mevcut veri setinde boyanmış yaşlanma ortalamasının yaklaşık %5 ila %10'u), ancak katkı geçiş sayısıyla artar ve derin yaşlanma veya onkogen kaynaklı yaşlanma kültürlerinde önemli (%20'den fazla) olabilir ^6,14. Yeni bir hücre tipi veya yaşlanma-indüksiyon modeli için bu protokolü benimserken otofloresans büyüklüğünü her zaman doğrulayın.
4. Akışta lekelenen tüm kuyular için yeterli LysoTracker çalışma çözümü hazırlayın. Çalışma çözeltiyi nazikçe ters çevirerek karıştırın ve kullanıma kadar ışıktan korunmasını sağlayın.
5. Her kuyyudan orta harcanmış aspirasyon. LysoTracker çalışma çözeltisini kuyu duvarı boyunca nazikçe ekleyin; böylece tek katmanı rahatsız etmeyin ve kuyular boyunca sabit bir boyama hacmi sağlansın.
6. Hücreleri LysoTracker ile 30 dakika boyunca 37 °C'de %5 CO₂ içinde inkübe edin. Tüm deneysel grupları aynı kuluçka süresi ve sıcaklık altında tutun.
7. LysoTracker kuluçkasının son 10 dakikasında canlı bir nükleer boya ekleyin. Hoechst 33342'yi doğrudan LysoTracker içeren ortama, örneğin 1 μg/mL'den 2 μg/mL'ye kadar ekleyin ve plakayı hafifçe sallayarak karıştırın.
8. İnkubasyonun sonunda boyama ortamını çıkarın. Hücreleri bir kez önceden ısıtılmış fosfatla tamponlanmış tuzlu suyla durulayın, böylece arka plan floresansını azaltın.
9. Durulamadan hemen sonra önceden ısıtılmış fenol kırmızısı içermeyen kültür ortamı veya görüntüleme tamponu ekleyin. Doğrudan canlı görüntülemeye geçin ve deneydeki tüm kuyular boyunca tampon değişimi ile görüntü alımı arasında tutarlı bir süre tutun.
10. Transfer ve görüntüleme kurulumu sırasında plakaları ışıktan koruyun. Kontrol ve görüntü alımı sırasında dışarıda kontrol edilen sıcaklık ve CO₂ koşullarında harcanan zamanı en aza indirin.
    DIKKAT: Flüoresan boyaları eldiven ve göz koruyucu ile kullanın. Boya içeren sıvıları ve kirlenmiş tüketim malzemelerini kurumsal kimyasal güvenlik prosedürlerine uygun olarak bertaraf et.
    NOT: Görüntüleme için birden fazla plaka sahnelenmesi gerekiyorsa, Step 3.9'dan sonra bir duraklama noktası kullanın. Plakaları 37 °C'de ışıktan koruyun ve lekelenme kaymasını azaltmak için görüntülemeye mümkün olan en kısa sürede devam edin.
    NOT: Deneysel tasarımda oksijen değişken olarak yer alıyorsa, boyama ve kuluçka sırasında her kohortu atanan oksijen koşullarında tutmak ve atanan koşul dışındaki işlem süresini kaydetmek gerekir.

4. Doğrulama için SA-β-Gal boyama (isteğe bağlı)

1. Yaşlanma yüksek durumunun, yaşlanma düşük kontrole kıyasla artan SA-β-Gal aktivitesi gösterdiğini doğrulamak için isteğe bağlı bir doğrulama adımı olarak SA-β-Gal boyama kullanın. Aynı plaka formatında ve görüntüleme kuyularıyla aynı işlem zaman çizelgesinde işlenmiş paralel kuyular üzerinde doğrulama yapılabilir.
2. Fiksasyondan önce doğrulama kuyuları için tam canlı görüntüleme. Eşleştirildiğinde, aynı alanın önceden ve sonrasında karşılaştırmalar istendiğinde (Şekil 2), alınımda aşama koordinatlarını kaydedin, fiksasyon ve boyamadan sonra her alanı manuel olarak yeniden konumlandırın ve eşleşen alanların eşleştiğinden emin olmak için nükleer konum ve hücre morfolojisini görsel olarak nokta olarak kontrol ederek bunları sonraki analize dahil edin.
3. Hücreleri, önerilen 1x çalışma konsantrasyonu ile hazırlanan SA-β-Gal boyama setinde sağlanan fiksasyon çözeltisi ile sabitleyin; bu konsantrasyon %2 formaldehit ve %0,2 glutaraldehit içerir. Oda sıcaklığında 10 dakika ila 15 dakika kuluçka yapın. Referans olarak, fiksasyon çözeltisi fosfatla tamponlanmış tuzlu sönümde %2 (w/v) formaldehit ve %0,2 (w/v) glutaraldehit içerir. pH 6.0'daki SA-β-Gal boyama çözeltisi, kullanımdan hemen önce dimetilformamidde çözünmüş 1 mg/mL X-gal (5-bromo-4-kloro-3-indolil-β-D-galaktopiranozid), pH 6.0'da 40 mM sitrik asit / sodyum fosfat tamponu içerir; pH 6.0, 5 mM potasyum ferrosiyanid, 5 mM potasyum ferrosiyanür, 150 mM NaCl ve 2 mM MgCl₂^12,13 içerir. Bu özelliklere uyan ticari kitler, boyama tamponu pH 6.0 olarak doğrulandığı sürece birbirinin yerine kullanılabilir.
4. Fiksator çıkarın ve kuyrukları fosfatla tamponlanmış tuzlu suyla iki kez durulayın. Her kuyuya pH 6.0'da X-gal substrat içeren SA-β-Gal boyama çözeltisi ekleyin.
5. Kuluçka sırasında buharlaşmayı sınırlamak için plakayı mühürleyin. Plakayı 37 °C, CO₂ içermeyen bir kuluçka makinesine 12-16 saat boyunca yerleştirin.
6. Kuyular parlak alan mikroskobu ile incelen ve boyalanma desenini belgeleyin. Her durum için temsilli görüntüler alın ve sonuçları doğrularken her kuyu başına SA-β-Gal-pozitif hücrelerin oranını raporlayın.
   DIKKAT: Formaldehit ve glutaraldehit toksik ve uçucudur. Kimyasal bir duman kapüşonunda fiksasyon çözeltisi hazırlayın ve kullanın, eldiven, göz koruma ve laboratuvar önlüğü dahil olmak üzere uygun kişisel koruyucu ekipman giyin.
   NOT: SA-β-Gal boyama, yaşlanma-düşük kontrol seviyesinde yüksek arka plan veya yaşlanma-yüksek durumda zayıf boyama gösterirse, kaplama yoğunluğu, fiksasyon süresi, kuluçka süresi ve sıcaklık tutarlılığını ayarlayarak tampon pH 6.0'da tutularak doğrulamayı tekrarlayın.

Sonuçlar

Bu protokolü, yaşlanma düşük ve yüksek yaşlanma koşullarında IMR-90 fibroblastlarına uygulanması, tek hücre düzeyinde ve istendiğinde tüm alan düzeyinde özetlenebilen nicel lizozomal okumalar elde eder.

Şekillerde ve tablolarda gösterilen temsil veri seti, IMR-90 kültürlerinin 13. (P13; yaşlanma düşük, ~PDL 26) ve 23. (P23; yaşlanma yüksek, ~PDL 46) aşamasındaki IMR-90 kültürlerini karşılaştıran tek bir biyolojik deneyden türemiştir. Her koşulda iki kuyu görün...

Tartışma

Bu protokol, lizozomal yeniden modelleme yoluyla yaşlanmayı ölçen ve hücre başına ve kuyuya göre yaşlanma yükünün nicel okumalarını sağlayan canlı hücre görüntüleme iş akışını tanımlar. Güvenilir bir test elde etmek için özellikle birkaç adım önemlidir. Öncelikle, biyolojik modelin kendisi iyi kontrol edilmelidir. IMR-90 fibroblastlarında replikatif yaşlanmanın indüksiyonu, popülasyon çiftleşmelerinin dikkatli izlenmesini ve yaşlanmayan olmayan referans^olarak...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
24-well tissue culture plate (flat bottom, TC-treated)	CellTreat Scientific Products	229124	Canlı hücre floresan görüntüleme ile uyumlu herhangi bir berrak tabanlı çok kuyuluk kültür plakası (örn., 6-, 12- veya 24-kuyuluk TC-tedavi edilmiş polistiren plakalar; daha yüksek çözünürlüklü görüntüleme için cam tabanlı görüntüleme plakaları tercih edilebilir).
Beta-galaktosidaz boyama kiti (yaşlanma analizi)	Cell Signaling Technology	9860	pH 6.0'da doğrulanmış boyama tamponu olan herhangi bir ticari SA-β-galaktosidaz kiti. Referans amaçlı, fiksasyon çözeltisi PBS içinde %2 formaldehit ve %0,2 glutaraldehit içerir ve boyama çözeltisi DMF içinde 1 mg/mL X-gal, 40 mM sitrat/fosfat pH 6.0, 5 mM potasyum ferrosiyanür, 5 mM potasyum ferrisiyanür, 150 mM NaCl, 2 mM MgCl2 içerir.
BioRender (bilimsel çizim yazılımı)	BioRender	N/A — web uygulaması	Şematik şekiller oluşturmak için kullanılır (Şekiller 1–3). https://www.biorender.com
Karbon dioksit gazı (CO2), sıkıştırılmış silindir	Airgas (veya benzer bir tedarikçi)	N/A	Hücre kültürü inkübatör ve sahne üstü görüntüleme odasında %5 atmosferi korumak için kullanılan medikal sınıf CO2.
Isı ile inaktive edilmiş fetal boğaz serumu (FBS)	Thermo Fisher Scientific (Gibco)	10082147	56 °C'de ısı ile inaktive edilmiş herhangi bir hücre kültürü sınıfı FBS; tam kültür ortamında %10 v/v oranında kullanılır.
Canlı hücre yeteneğine sahip floresan mikroskopu	Thermo Fisher Scientific	AMF7000	Canlı hücre sıcaklığı ve CO2 kontrolüne sahip herhangi bir geniş alan veya konfokal floresan mikroskobu, uzak kırmızı (yaklaşık 647 nm eksitasyon / yaklaşık 670 nm emisyon) ve DAPI/Hoechst (yaklaşık 405 nm eksitasyon / yaklaşık 460 nm emisyon) kanalları için filtre setleri ve lizozomal özellikleri çözmek için yeterli NA'ya sahip 20×-40× bir objektif. Bu çalışmada EVOS M7000 Görüntüleme Sistemi kullanılmıştır.
Hoechst 33342 nükleer boyası	Thermo Fisher Scientific	H3570	Canlı hücre nükleer boyaması için hücreye geçirgen DNA boyası (mavi floresan, yaklaşık 405 nm eksitasyon). DAPI ile değiştirilemez, çünkü fizyolojik koşullar altında hücreye geçirmez.
Görüntü analiz yazılımı	Python Yazılım Vakfı	N/A	Çekirdek segmentasyonu, çekirdekten hücreye bölge genişletme, yoğunluk eşiği ve temel görüntü istatistiklerini destekleyen herhangi bir bilimsel hesaplama ortamı (örn., scikit-image ile Python, MATLAB, ImageJ/Fiji, CellProfiler). SenTrack işlem hattı (bkz. Ek Dosya S1) bu çalışma için geliştirilmiştir.
IMR-90 insan akciğer fibroblastları (hücre hattı)	ATCC	CCL-186	Replikasyon yaşlanmasını modellemekte kullanılan normal insan fetal akciğer diploid fibroblast hücre hattı; benzer şekilde karakterize edilmiş herhangi bir insan fibroblast hattı ikame edilebilir.
LysoTracker Deep Red	Thermo Fisher Scientific (Invitrogen)	L12492	Asidik organellerin canlı hücre boyanması için asidotropik floresan boya; DMSO içinde 1 mM stoklar halinde tedarik edilir. Hazırlanan hücre kültürü ortamında çalışma konsantrasyonu 75nM'dir. Uzak kırmızı emisyon (ek 647 nm / em 668 nm) lipofusin otofloresans ile çakışmayı en aza indirir, ancak bunu ortadan kaldırmaz.
Minimum Temel Ortam (MEM)	Thermo Fisher Scientific (Gibco)	11-095-080	IMR-90 fibroblastları için bazal kültür ortamı; %10 FBS ve %1 penisilin-streptomisin ile takviye edilmiştir. Herhangi bir standart Eagle's Minimum Temel Ortam formülasyonu Earle'in tuzları ve L-glutamin ile ikame edilebilir.
Penisilin-streptomisin çözeltisi (100×)	Thermo Fisher Scientific (Gibco)	15140122	Tam kültür ortamı için antibiyotik takviyesi; %1 v/v (son konsantrasyon 100 U/mL penisilin, 100 μg/mL streptomisin) oranında kullanılır. Herhangi bir standart pen-strep çözeltisi ikame edilebilir.
Fenol kırmızısız görüntüleme ortamı	Thermo Fisher Scientific (Gibco)	A1896701	Canlı hücre görüntüleme için kullanılan fon ışığını azaltmak amacıyla kullanılır; 10% FBS ile takviye edilmiş herhangi bir phenol kırmızısız görüntüleme tamponu ikame edilebilir.
Fosfat tamponlu salin (PBS), pH 7.4 (1×)	Thermo Fisher Scientific (Gibco)	10010023	Hücre yıkama ve reaktif seyreltme için izotonik tampon; pH 7.4'de herhangi bir steril 1× PBS ikame edilebilir.
SenTrackLite v0.5.0 (yazılım)	Açık Kaynak (Estrada / Melendez Lab)	v0.5.0	Lizozomal yaşlanma görüntü analizi için açık kaynaklı tek dosyalık Python / Tkinter uygulaması. Ek Dosya S1 olarak dağıtılmıştır. Zenodo'da arşivlendi, doi:10.5281/zenodo.19701255. MIT lisansı. Kaynak: https://github.com/goldbader-hub/Sentrack
Mikroskop