Sağlıklı ve KOAH Koşullarında Araştırma İçin Epitelyal-Endotel Ortak Kültürü Akciğer-Çip Üzerine Kurulması

Özet

Bu protokol, sağlıklı ve KOAH modeli olmak üzere insan birincil hava yolu epitelyal ve pulmoner mikrovasküler endotel hücrelerini birleştiren dinamik bir akciğer-çip üzerinde ko-kültür sistemi kurmaktadır: sağlıklı ve KOAH. Sistem, hava-sıvı arayüzü ve akışı altında hava yolu-vasküler etkileşimlerini yeniden üretir ve bariyer değerlendirmesi, hücre fenotipi ve RNA analizi sağlar.

Özet

İki dinamik akciğer-çip üzerinde eş-kültür modeli, birincil hava yolu epitelyal ve pulmoner mikrovasküler endotel hücrelerini dahil ederek hava yolu-damar arayüzü yeniden yaratmak için geliştirilmiştir. Bir model, sağlıklı bağışçılardan ticari olarak temin edilen hücreleri kullanırken, diğeri kronik obstruktif akciğer hastalığı (KOAH) olan hastalardan türetilen hücreleri kullanır; böylece aynı kültür koşullarında sağlıklı ve hastalıklı koşulların doğrudan karşılaştırılmasını sağlar. Her iki model de sürekli perfüzyon ve hava-sıvı arayüzü (ALI) koşullarında epitel farklılaşmasını destekler; bu da altta yatan endotel tabakası tarafından desteklenen fizyolojik olarak ilgili epitel bariyeri oluşturur. İş akışı, hücre dışı matris kaplaması, hücre tohumlama, ALI oluşumu, bariyer fonksiyon değerlendirmesi, hücre fenotipleme ve hücre tipine özgü RNA çıkarımı içerir. Geçirgenlik testleri her iki sistemde de sağlam bariyer bütünlüğünü gösterdi; immünoflüoresans ise Zonula Occludens-1 (ZO-1) ve vasküler endotel kadherin'in (VE-cadherin) hücre birleşimlerinde sürekli lokalizasyonunu doğruladı. Epitelel farklılaşma, β-tubulin IV boyama ve siliyer atımın görselleştirilmesiyle doğrulandı. Her bölmeden ayrı olarak yüksek kaliteli RNA elde edildi ve bu da hücre tipine özgü moleküler analizleri destekledi. KOAH modeli, hastalığın temel özelliklerini, özellikle mukus üretimini artırmayı, engel fonksiyonu veya hücre canlılığı zarar vermeden özetledi. Hastadan kaynaklanan epitel ve endotel hücrelerinin kullanımı, bireysel patolojik özellikleri koruyarak KOAH'ta hücre arası mekanizmaların araştırılmasını mümkün kılar. Bu yaklaşım, statik in vitro ve hayvan modellerine fizyolojik olarak ilgili bir alternatif sunar ve solunma ilaçları, patojenlere maruz kalma ve epitelal–endotel etkileşimlerinin preklinik çalışmalarını destekler. Önemli olarak, sağlıklı ve KOAH akciğer-çip üzerinde modeller doğrudan karşılaştırmalı çalışmalar için veya mekanik araştırmalar, terapötik testler ve ilaç keşfi için bağımsız olarak kullanılabilir. Sistem, epitel veya endotel bölmelerinin değiştiği diğer solunum durumlarına da uyarlanabilir ve solunum araştırmaları için çok yönlü ve translasyonel bir platform sunar.

Giriş

Hava yolu epitel hücreleri ile pulmoner mikrovasküler endotel hücreleri arasındaki etkileşim, akciğer homeostazını sürdürmek ve yaralanma, enfeksiyon ve iltihaplanmaya karşı yanıtların koordine edilmesi için gereklidir. Bu hücre tipleri birlikte gaz değişimini, bağışıklık gözetimini ve damar geçirgenliğini düzenleyen fonksiyonel bir bariyer oluşturur. Dinamik çapraz konuşmaları, parakrin sinyal, doğrudan hücre-hücre etkileşimleri ve mekanik uyarıcılara yanıtlar içerir; bunların hepsi akciğer fonksiyonu ve yapısal bütünlük için kritik^{öneme sahiptir 1}.

Kronik obstrüktif akciğer hastalığında (KOAH), kronik iltihap, hava yolu yeniden şekillendirilmesi ve alveolar–kapiller arayüzünün tahrip edilmesi ile karakterize edilen ilerleyici bir akciğer hastalığında, hem hava yolu epitelinin hem de pulmoner vasküler endotelinin bariyer fonksiyonu bozulur ve anormal sitokin salınımı ile düzensiz doku onarım^{mekanizmalarıyla birlikte olur 2,3}. Ancak, hava yolu epitelyal ve pulmoner mikrovasküler endotel hücreleri arasındaki etkileşim hâlâ yeterince anlaşılmamaktadır. Bu sınırlama kısmen mevcut in vitro ve in vivo modellerin eksikliklerinden kaynaklanmaktadır. Hayvan modelleri solunum fizyolojisi ve patolojisi konusunda önemli bilgiler sağlamış olsa da, bağışıklık fonksiyonu, akciğer yapısı, hücresel sinyal ve ilaç metabolizmasındaki türler arası farklılıklar nedeniyle önemleri sınırlıdır; bu da insan biyolojisine geçişi engelleyebilir.

Ölümsüzleştirilmiş hava yolu epitel hücre hatlarının iki boyutlu (2D) kültürleri gibi geleneksel in vitro sistemler, doğru farklılaşma ve biyomekanik tepki verme gibi hava yolu epitelinin temel özelliklerini yeniden bir şekilde yansıtamıyor. Birincil hava yolu epitel hücrelerinin üç boyutlu (3D) hava-sıvı arayüzü (ALI) monokültürleri fizyolojik önemi artırsa da, sabit kalırlar ve diğer hücre tipleri ile mekanik uyarıcılarla etkileşimden^{yoksundurlar 4}. Akciğer, nefes almanın oluşturduğu döngüsel gerilmeye, hava akışına, kesme stresine, hücre dışı matriks sertliğine ve döngüsel gerilmeye sürekli maruz kalan dinamik bir organdır. Bu faktörler hücresel davranışı ve doku yeniden modellenmesini güçlü^{şekilde etkiler 5}. Bu nedenle, statik modeller lökosit yapışması, bağışıklık hücresi ticareti ve ilaç maruziyetine gerçek zamanlı yanıtlar gibi süreçleri çoğaltmak için yetersizdir.

Bu sınırlamaları gidermek için, karmaşık hücresel etkileşimleri modellemek için gelişmiş sistemler olarak organ-on-a-chip platformları ortaya çıkmıştır. Çip üzerinde akciğer modelleri, mikrofluidik teknolojiyi insan kaynaklı hücrelerle entegre ederek akciğer mikro ortamının temel yapısal ve mekanik özelliklerini taklit eder. Bu platformlar, in vivo koşulları daha yakından taklit eden dinamik, üç boyutlu bir ortamda hava yolu epitelyal ve akciğer vasküler endotel hücrelerinin birlikte^{kültürlenmesini sağlar 6}. Fizyolojik solunum hareketlerinin, sıvı akışının ve gerçek zamanlı izlemenin dahil edilmesi, hem normal hem de hastalıklı koşullarda epitelyal–endotel iletişiminin incelenmesini^geliştirir.

Bu gelişmelere rağmen, mevcut akciğer üzerinde çip sistemlerinin çoğu sağlıklı bağışçılardan türetilen^{hücrelere dayanıyor 10}, bu da hastalık spesifik etkileşimleri modelleme yeteneklerini sınırlıyor. Ayrıca, birçok platformda hastadan kaynaklı hücreleri dahil etme veya karmaşık KOAH mikro ortamını yeniden yaratma esnekliği yoktur. Ayrıca, birincil hava yolu epitelyal ve pulmoner mikrovasküler endotel hücrelerin—ticari kaynaklardan veya KOAH hastalarından alınan olsun—hücre tipine özgü ekstrasellüler matriks (ECM) kaplamaları kullanılarak birlikte kültürlenmesi için ayrıntılı protokoller sınırlı kalmaktadır.

Bu çalışmada, ticari olarak sunulan iki kanallı mikrofluidik akciğer-çip üzerinde platform, birincil hava yolu epitelyal ve pulmoner mikrovasküler endotel hücrelerinden oluşan iki ortak kültür modeli oluşturmak için kullanıldı. Farklı bağışçılardan türetilen ticari olarak mevcut hücreler kullanılarak sağlıklı bir model oluşturulurken, aynı hastadan alınan hava yolu epitelyal ve endotel hücreleri kullanılarak bir KOAH modeli oluşturuldu. Her iki modelde de, in vivo akciğer mikro ortamını daha iyi taklit etmek için hücre tipine özgü bir ECM kaplaması kullanılır. Bu sistemler, epitelal–endotel etkileşimlerinin fizyolojik ve patolojik koşullarda incelenmesini mümkün kılar. Sağlıklı ve KOAH modelleri, doğrudan karşılaştırmalı çalışmalar için veya mekanik araştırmalar ve terapötik testler için bağımsız olarak birlikte kullanılabilir.

Bu ortak kültür sistemi, hava yolu epitelinin ve akciğer damarlarının anatomik organizasyonunu yansıtır ve bunlar entegre epitelal–endotel birimi olarak işlev görür. Hava yolu epiteli, bazal, sekretör ve silial hücrelerden oluşan psödostratifiye bir tabakadır ve damarlanmış bağ dokusu tabakasının (lamina propria) üzerinde yer alır ve endotelden bazal membran ile ayrılır. Bu modelde, ECM kaplaması (kolajen tip I, fibronektin ve laminin) epitel ve endotel bazal zarlarının bileşimini yaklaşık olarak yansıtır. İki kanalı ayıran gözenekli membran, damar karmaşıklığından yoksun olmasına rağmen, subepitelyal bağ dokusunu taklit eder. Epitelal–endotel iletişimine birden fazla mekanizma katkıda bulunur; bunlar arasında parakrin sinyal, geçirgenliğin koordineli düzenlemesi, bağışıklık hücresinin katılımı ve solunumla indüklenen esneme gibi mekanik uyaranlara yanıtlar bulunur; bunlar damar direncini ve mekanotransdüksiyon yollarını etkiler.

Bu metodolojik çalışma, altta akciğer mikrovasküler endotel bulunan hava-sıvı arayüzü (ALI) koşullarında kültürlenmiş tamamen farklılaşmış bir hava yolu epitelini oluşturmak için gereken adımları özetlemektedir. Sistem, bariyer bütünlüğünün niteliksel ve fonksiyonel değerlendirmesini sağlar ve 1 × 10⁻⁶ cm/s ≤ tekrarlanabilir görünür geçirgenlik (Papp) değerlerine ulaşır. Ayrıca, hücre fenotipi ve her bölmeden RNA'nın çıkarılması ve nicelendirilmesi için protokoller sağlanmakta olup, tutarlı olarak yüksek kaliteli RNA (RNA bütünlüğü numarası > 7) elde edilir. Bu yöntem, nicel mRNA analizi veya mukus üretiminin ayrıntılı değerlendirmesi için tasarlanmamıştır, ayrıca mekanik gerilmenin etkilerini araştırmaz; ancak bu tür uygulamalar bu sistemle uygulanabilir.

Protokol

Birincil insan hücrelerinin tüm kullanımı, Yerel Etik Komitesi Araştırma UZ Leuven (S51577/S57114/S70453) tarafından onaylanmıştır. Ticari olarak mevcut birincil insan bronşiyel epitel hücreleri (HBEC) ve pulmoner mikrovasküler endotel hücreleri (HPMEC), sigara içmeyen iki donörden alındı (Ek Tablolar 1, 2). KOAH modeli için birincil hücreler, sigara geçmişi olan üç KOAH hastasının eksektilmiş akciğer dokusundan, iyi kurulmuş bir protokole (etik onay S51577) göre izole edildi ve BREATHE biyobankasında saklandı. Hem HBEC hem de HPMEC aynı KOAH hastasından alındı.

Sağlıklı akciğer-çip modelini oluşturmak için ticari HBEC ve HPMEC kullanıldı. KOAH modeli için, akciğer nakli sonrası aynı hastadan alınan eksplantasyon akciğer dokusundan primer bronşiyal epitelyal ve pulmoner mikrovasküler endotel hücreleri izole edildi. Bu çalışmada kullanılan çip üzerinde akciğer sistemi, paralel hava yolu (üst) ve vasküler (alt) mikrokanallardan oluşan mikrofluidik iki kanallı bir platformdur ve gözenekli, ekstrahücre matris kaplamalı bir membranla ayrılmıştır (Şekil 1). Aynı protokol hem sağlıklı hem de KOAH modelleri oluşturmak için kullanıldı. Protokolde kullanılan kimyasallar, reaktifler ve kitler Malzeme Tablosu'nda listelenmiştir.

1. Laminar akış altında akciğer-çip üzerinde akciğer eş-kültür modellerinin kurulması

1. Çip hazırlığı
   1. Çip beşiğini, köşeleri yukarı bakacak şekilde 120 mm kare hücre kültürü kabına yerleştirin, doğru yönü sağlamak için, ardından çipleri beşiğe yerleştirin. Tüm çiplerin aktivasyon aşamasından önce doğru şekilde yerleştirildiğinden emin olun (Şekil 2).
   2. Aktivasyon çözeltisi, üretici tarafından sağlanan aktivasyon reaktif tozunu ilgili tamponunda çözerek nihai 0,5 mg/mL konsantrasyon elde edersiniz.
   3. Çip kanallarının iç yüzeylerini, alt kanal girişinden yaklaşık 35 μL aktivasyon çözeltisi ile dikkatlice aktarıma geçirerek ekstrahücre matriks (ECM) tutumunu teşvik etmek için aktive edin. Çözelti alt kanal çıkışından çıkmaya başlayana kadar pipet yapın. Prosedür, üst kanal girişine yaklaşık 50 μL çözelti ekleyerek tekrarlayın.
      NOT: Aktivasyon reaktif tozu ışığa duyarlıdır. Aktivasyon çözeltisini hemen kullanmadan önce hazırlayın ve kalan çözeltiyi yeniden yapılandırdıktan 1 saat sonra atın.
   4. Çip yüzeyinden nazik aspirasyonla tüm fazla aktivasyon çözeltisini çıkarın. Aktivasyon çözeltisini sadece çip yüzeyinden çıkardığınızdan emin olun — kanallardan aspirasyon yapmayın.
      NOT: Ultraviyole (UV) aktivasyonundan önce, kanalları mikroskop altında inceleyerek baloncukları tespit edin. Varsa, tüm kabarcıklar temizlenene kadar aktivasyon solüsyonuyla nazikçe yıkayarak onları yerinden çıkarın.
   5. Çipleri 10 dakika boyunca bir UV lambaya maruz bırakın, ardından her kanalı ilgili tampondan 200 μL ile iki kez yıkayın.
   6. Yukarıda açıklandığı gibi her iki kanala taze aktivasyon solüsyesini pipet yapın ve çipleri ek 5 dakika UV'ye maruz bırakın.
   7. Her iki kanaldan çözeltiyi tamamen aspire edin, her kanalı 200 μL tampon ile iki kez yıkayın, ardından her kanalı 200 μL steril soğuk fosfat-tamponlu tuzlu suyla bir kez yıkayın, Ca²⁺ ve Mg²⁺ (DPBS -/-) olmadan.
   8. DPBS (-/-) içinde insan kolajeni tip I (100 μg/mL), insan fibronektini (50 μg/mL) ve insan laminin (50 μg/mL) içeren bir ECM kaplama çözeltisi hazırlayın. Her çip başına referans hacmi olarak 100 μL çözelti kullanın.
   9. Üst kanala 50 μL, alt kanala 35 μL eklenirken, çıkış portlarından aynı anda aspirasyon yapılır.
      NOT: Kanalları mikroskop altında inceleyin ve herhangi bir kabarcık tespit edin. Varsa, ECM çözeltisiyle nazikçe yıkayarak çıkarabilirsiniz.
   10. Gece boyunca (ON) kuluçka sırasında buharlaşmayı önlemek için hem kanal giriş hem çıkış portlarında küçük ECM solüstüm damlaları bırakın.
   11. Çipleri %5 CO₂ ile 37 °C'de ON'da inkübe edin. Ertesi gün, ECM çözeltisi aspire edilip her iki kanalı da 37 °C'de 200 μL önceden ısıtılmış DPBS (-/-) ile yıkayın.
2. Hücre tohumlaması ve sualtı kültür
   HBEC'yi, insan kollajen tip IV ile kaplanmış T25^{cm 2} şişede (DPBS'de 150 μg/mL (-/-)) hava yolu epitel hücresi genleşme ortamı kullanılarak, %60–70 birleşime ulaşılana kadar genişletin.
   Paralel olarak, HPMEC'i endotel hücresi (EC) büyüme ortamı kullanılarak jelatin (DPBS'de 2 mg/mL (-/-)) ile kaplanmış T75 cm² şişelerde %90–%100 birleşmeye ulaşılana kadar genişletin.
   Anahtar reaktiflerin ve kültür ortamlarının bileşimi için Ek Tablo 4'e bakınız.
3. HPMEC tohumlama
   1. Ortamı aspire edin. Hücreleri 10 mL DPBS (-/-) ile yıkayın.
   2. 3 mL %0,25 tripsin-EDTA (1X) ekleyin. Oda sıcaklığında (RT) 30 saniye kuluçka yapın.
   3. Tripsin inaktive etmek için 12 mL EC büyüme ortamı (kullanılan tripsin hacminin 4× oranında) ekleyin. Kalıntı hücreleri toplamak için 5 mL EC büyüme ortamı ekleyin (nihai hacim = 20 mL).
   4. Mikroskop altında tam hücre ayrılmasını doğrulayın.
   5. Trypan mavisi kullanarak canlı hücreleri saymak için ~20 μL alın.
   6. Kalan hücre süspansiyonunu 900 × g sıcaklığında 5 dakika boyunca RT ile 50 mL konik tüpte santrifüj yapın.
   7. Pelleti EC büyüme ortamına yeniden askıya alın. 7 × 10⁶ hücre/mL'ye ayarlayın.
   8. HPMEC (5. geçiş) alt kanala tohum ekin (~20 μL; 1.4 × 10⁵ hücre/kanal).
   9. Hemen çipleri ters çevirin ve %5 CO₂ ile 37 °C'de 2 saat kuluçka yapın (Şekil 3).
   10. Çipleri orijinal konumuna geri döndür.
   11. 200 μL sıcak (37°C) EC büyüme ortamı ile yıkayın.
   12. Mikroskop altında takıntıyı doğrulayın. Gerekirse kuluçka sürecini uzatın.
4. HBEC'nin tohumlanması
   1. Ortamı aspire edin. 5 mL sıcak DPBS (-/-) ile yıkayın.
   2. 1 mL tripsin ekleyin. %5 CO₂ ile 37 °C'de 5 dakika kuluçka yapın.
   3. Kopmanı mikroskop altında izleyin.
   4. 1:1 oranında 1 mL tanımlanmış tripsin inhibitörü (DTI) ekleyin ve tripsin inaktive edilir.
   5. 8 mL hava yolu epitel hücresi genleşme ortamı ekleyin (son hacim = 10 mL).
   6. 50 mL'lik bir tüpe aktar.
   7. Tripan mavisi ile hücre sayımı için ~20 μL alın.
   8. Kalan hücre süspansiyonunu 200 × g ile RT'de 5 dakika boyunca santrifüj yapın.
   9. Üst yüzeyi at.
   10. Pelleti hava yolu epitel hücresi genleşme ortamında yeniden süspansiyona alın. 3.5 × 10⁶ hücre/mL'ye ayarlayın.
   11. Hava yolu epitel hücresi genleşme ortamını 50 nM sentetik ışık stabil retinoik asit ve 10 ng/mL rekombinant insan epidermal büyüme faktörü (rhEGF) ile takviye edin.
   12. HBEC (2. geçiş) üst kanala tohum (~35 μL; 1.2 × 10⁵ hücre/kanal) eklenin.
   13. %5 CO₂ ile 37 °C'de 4 saat kuluçka yapın (Şekil 4).
   14. Her iki kanalda da ortamı değiştirin.
   15. Gece boyunca (ON) %5 CO₂ ile 37 °C sıcaklıkta statik koşullarda kuluçka yapın.
       NOT: Bu adımdan itibaren tüm adımlarda sadece gazlı ortam kullanın. Gazlaştırma, çipte baloncuk oluşumu riskini en aza indirmek için vakum sistemine bağlı bir Steriflip ünitesiyle yapılmalıdır.
5. Akışla bağlantı
   1. Üst giriş rezervuarına, sentetik ışığı dayanıklı retinoik asit ve rhEGF ile takviye edilen sıcak (37°C) hava yolu epitel genleşme ortamı ekleyin.
   2. Alt giriş rezervuarına sıcak (37°C) EC büyüme ortamı ekleyin.
   3. Her giriş rezervuarını 3 mL malzeme ile ve her çıkış rezervuarını 300 μL ile doldurun.
   4. Taşınabilir modülleri kültür modülüne yerleştirin (Şekil 5).
   5. Döner kadran kullanarak "Prime" döngüsünü seçmek için düğmeye basın.
   6. Döngüyü başlatmak için düğmeye basın.
   7. Döngünün çalışmasına izin verin (~1 dakika).
   8. Her modülün alt kısmında, dört akışkan portunda damlacık olup olmadığını kontrol edin.
   9. Damlalar görünmüyorsa "Prime" döngüsünü tekrarlayın.
   10. Her iki çip kanalını da uygun ortamla bir kez yıkayın.
   11. Her giriş ve çıkış portunda bir damla bırakarak baloncuk oluşumunu önleyin.
   12. Çipi baskın elde tutarken, diğer elde taşınabilir modülü tutun.
   13. Çipi tamamen oturana kadar raylara kaydırın.
   14. Monte edilen birimi kültür modülüne yerleştirin.
   15. Her iki kanal için akış hızını döner kadran kullanarak 30 μL/s'ye ayarlayın.
   16. Sıvı–sıvı arayüzü (LLI) koşullarını koruyun.
   17. Modül çiplerini sıvı-sıvı arayüzü (LLI) altında tutarak, böylece epitel ve endotel tabakası düz oluşmasını sağlar
   18. Orta seviyeyi her 3 günde bir değiştirin. Çıkış rezervuarlarından aspirasyon ortamı. Her giriş rezervuarına 3 mL taze ortam ekleyin.
       NOT: Mikroskop altında baloncukları izleyin. Varsa, çipi ayırın, kanalları orta ile temizleyin ve tekrar bağlayın.
6. Epitel hücre farklılaşması ve havada sıvı arayüz kültürü
   1. Hücreleri her gün mikroskop altında izleyin.
   2. Boşluksuz homojen bir epitel hücre tabakasının oluşmasını doğrulayın (genellikle 3–5 gün sürer).
   3. Hava-sıvı arayüzünü (ALI) oluşturun.
   4. Üst giriş ve çıkış rezervuarlarından aspirasyon ortamı kullanın.
   5. Döner kadran kullanarak akış hızını 600μL/s'ye çıkararak üst kanaldan kalan ortamı temizlemek
   6. Üst çıkış rezervuarlarından hızlı aspirasyon ortamı kullanın.
   7. Alt giriş rezervuarlarından aspirasyon ortamı kullanın.
   8. 3 mL epitel farklılaşma ortamı eklenerek 10 ng/mL vasküler endotel büyüme faktörü (VEGF) ve 1 μg/mL C vitamini eklenin.
   9. Üst kanalı döner kadran kullanarak "hava" olarak ayarlayın.
   10. Alt kanal akış hızını 30 μL/h olarak ayarlayın.
   11. ALI kültürünü 2 hafta boyunca sürdür.
   12. Epitel farklılaşmasının mikroskop altında gelişimini gözlemleyin.
   13. Pseudostratifikasyona sahip epitelin oluşumunu doğrulayın. Silia atma ve mukus üretimini izleyin.
   14. Giriş ve çıkış bölgelerinde endotel hücre morfolojisini izleyin.

Şekil 1: Mikrofluidik akciğer-bir çip platformu. İki kanallı mikrofluidik akciğer çip üzerindeki cihazın kesit (sol) ve üst görünümü (sağ). Şematik çizimler yalnızca örnekleme amacıyla sunulmuştur. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Çipin çip beşiğine konumlanması. Çip beşiğinin doğru yönünü ve çipin yerleşimini gösteren temsil edici görüntü. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Mikrofluidik çipte endotel hücre tohumlanması. Tohumlamadan hemen sonra (A) ve 2 saatlik kuluçkadan (B) sonra akciğer mikrovasküler endotel hücrelerinin temsil parlak alan görüntüleri. Ölçek çubuğu: 100 μm. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: Mikrofluidik çipte hava yolu epitel hücresi tohumlanması.
Tohumlamadan hemen sonra (A) ve 4 saatlik kuluçkadan (B) sonra hava yolu epitel hücrelerinin temsil parlak alan görüntüleri. Ölçek çubuğu: 100 μm. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 5: Mikrofluidik akciğer-çip üzerinde sistemin konfigürasyonu.
Resmin üst kısmı, orta su ve atık su toplama için kullanılan dört rezervuarlı taşınabilir modülü (iki giriş ve iki çıkış) göstermektedir. Mikrofluidik cihaz, akış oranlarını düzenleyen bir kültür modülüne ve gaz, hava ve güç sağlayan bir hub modülüne bağlıdır. Şematik temsil yalnızca gösterim amaçlı sunulmaktadır. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

2. Bariyer bütünlüğünün değerlendirilmesi

Bariyer bütünlüğü iki şekilde değerlendirildi: birincisi, fonksiyonel olarak, floresan etiketli deksrana zaman içinde geçirgenlik değerlendirilerek (ALI'den önce ve 10 gün sonra) ve ikincisi olarak, niteliksel olarak, bronş epitelinde Zonula Occludens-1 (ZO-1) ve pulmoner vasküler endotelde Vasküler Endotelyal-kadherin (VE-kadherin) immünotespitsifikasyonu ile değerlendirildi.

1. Bariyer fonksiyonu
   1. Laminar akış altında, hava yolu kanalının üst giriş rezervuarına VEGF ve C vitamini takviyesi olan ve 100 μg/mL floresan işaretli deksran içeren 1 mL epitel farklılaşma ortamı eklenin. Aynı zamanda, damar kanalının alt giriş rezervuarına 1 mL izsiz ortam ekleyin.
   2. İzleyiciyi içeren ortamı üst kanala sokun. Döner kadranı kullanarak, her iki kanalda da akış hızını 3 dakika boyunca 600 μL/s'e ayarlayın, ardından hem üst hem de alt çıkış rezervuarlarından aspirasyon ortamı alın.
   3. Çipi, taşınabilir modüle bağlı olarak, kültür modülüne geri yerleştirin. Döner kadran kullanılarak, her iki kanalı da 45 μL/s akış hızına ayarlayın ve bu akış hızını 3 saat boyunca koruyun.
   4. Üst ve alt çıkış rezervuarlarından 100 μL ortam toplayın ve bir plaka okuyucu kullanarak floresans yoğunluğunu ölçün.
   5. Geçirgenlik denklemini kullanarak görünen geçirgenlik (Papp) hesaplayın:
      
      burada SA, ortak kültür kanalının yüzey alanını (0,17 cm²) temsil eder, Q_R ve_{Q D} sırasıyla dozlama ve alıcı kanallardaki sıvı akış hızlarını (cm³/s) gösterir ve_{C R,0} ve C_D,0 sırasıyla dozlama ve alıcı kanallarda geri kazanılan konsantrasyonlara karşılık gelir.
      NOT: Papp değeri 1 x ^10-6 cm/s'nin altında olursa, epitel tabakasının izleyiciye düşük geçirgenliğini yansıtan güçlü bariyer bütünlüğünü gösterir. Bu eşik sistem üreticisi tarafından dahili kalite kontrol ölçümü olarak belirlenir.
2. Sıkı ve yapışkan bağlantıların immünotespiti
   1. 2 hafta ALI yaptıktan sonra, çipi dikkatlice taşınabilir modülden çıkarın.
   2. Hücreleri, RT'de 20 dakika boyunca her iki kanala 50 μL %4 paraformaldehit (PFA) ekleyerek düzeltin.
      DIKKAT: PFA toksiktir; Tüm adımları sertifikalı kimyasal buhar davlumbazında yapın.
   3. Her iki kanalı da 200 μL DPBS (-/-) ile iki kez yıkayın ve parçaları boyalanana kadar 4 °C'de saklayın.
   4. Hücreleri 5 dakika boyunca 5 dakika boyunca %0,1 Triton X-100 DPBS (-/-) ekleyerek permeabilize edin. Sonra kanal başına RT'de 1 saat boyunca DPBS içinde %10 keçi serumu içeren 50 μL 0.1% Triton X-100 ile blok yapın.
   5. Üst (bronşiyal epitelal) kanalı 50 μL fare monoklonal anti-insan anti-insan ZO-1 birincil antikoru (1:100) ile ve alt (pulmoner vasküler endotelyal) kanalı 50 μL tavşan monoklonal anti-insan anti-insan VE-kadherin birincil antikoru (1:600) ile inkübe yapın.
   6. Her iki antikoru antikor çözeltisinde (%0,1 Triton X-100 PBS (-/-) ile %1 keçi serumu ile) seyreldin ve ON'u statik koşullarda 4°C'de inkübe edin.
   7. Çipleri 200 μL DPBS (-/-) ile üç kez yıkayın. Daha sonra her kanalı RT'de 1 saat boyunca uygun florofor ile konjuge edilmiş ikincil antikorlarla (1:500) antikor çözeltisinde seyreltilmiş şekilde inkübe edin: üst kanalda keçi anti-fare ikincil antikoru ve alt kanalda keçi anti-tavşan ikincil antikoru.
   8. Her iki kanalı da 200 μL DPBS (-/-) ile üç kez yıkayın. Her kanal için 50 μL ile 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI, DPBS'de 1 μg/mL (-/-)) ile 10 dakika RT hızında nükleer boyama işlemi yapıldı.
   9. 200 μL DPBS (-/-) ile son yıkamayı yapın ve çipi DPBS (-/-) içinde 4°C'de, karanlıkta saklanana kadar depolayın.
   10. Çipleri, dönen disk modülü, yüksek hassasiyetli kamera ve 20X objektif (NA 0.8) ile donatılmış ters floresan mikroskobu kullanarak (20x60 mm, 0,16-0,19 mm kalınlığında) örtü kapaklarında görüntüleyin. Sonradan işlem için uygun görüntü edinme ve analiz yazılımı kullanın.

3. Fenotipleme

1. Çip kesitlerinin hazırlanması
   1. Çipleri %4 PFA ile düzeltin, bölüm 2.2.2'de açıklandığı gibi.
   2. Çevresindeki polidimetilsiloksanı (PDMS) çipten bir jilet ile kesin.
   3. Her iki kanalı da DPBS'de %2 düşük eriyen agaroz 50 μL ile doldurun ve agarozun RT'de katılaşmasına izin verin.
   4. Çipi jilet bıçağı ile enine ikiye kesin, her iki yarısını optimal kesme sıcaklığı (OCT) göme ortamına gömüp −80 °C'de saklayın.
2. Kryobölüm
   1. Bir kriyostat hazırlayın ve çip yarılarından 200 μm kriyoseksiyon kesin.
   2. Çip kesitlerini cımbızla DPBS (-/-) ile doldurulmuş 48 kuyu tabaklı kuyulara toplayın ve 4 °C'de koruyun, ta ki bağışıklık boyamaya kadar.
3. İmmünofluoresan boyama
   NOT: 48 kuyu plakasında her adımı 400 μL referans hacmi kullanarak gerçekleştirin.
   1. Hücreleri permeabilize eder ve daha önce bölüm 2.2.4'te tanımlandığı gibi spesifik olmayan bağlanmayı engeller.
   2. Her bölümü 4°C sıcaklığında epitel silial hücrelere özgü primer antikorlarla (β-tubulin IV, 1:2000) veya endotel hücrelere (CD31, 1:25) özgü antikorlarla kuluçka edin; antikor çözeltisinde seyreltilir (DPBS'de %0,1 Triton X-100 ve %1 keçi serumu ile).
   3. Bölümleri DPBS (-/-) ile üç kez yıkayın.
   4. RT'de 1 saat boyunca uygun florofor-konjuge edilmiş keçi anti-fare antikorları (1:500) ile β-tubulin IV ve CD31 ile inkübe kesitleri ile inkübe yapın; antikor çözeltisi ile seyreltirilmiş ve ışıktan korunur.
   5. Bölümleri DPBS (-/-) ile üç kez yıkayın ve DAPI (DPBS'de 1 μg/mL (-/-)) ile RT'de 10 dakika boyunca nükleer boyama işlemi yapıldı.
   6. Montajdan önce bölümleri bir kez DPBS (-/-) ile yıkayın.
   7. Cimbizle, her mikroskop slaytına bir ara parça yerleştirin, ardından ortaya bir bölüm yerleştirin. 1–2 damla montaj malzemesi ekleyin ve dairesel bir kapak koyun.
   8. RT'de karanlıkta ONURUMDA kurumasına izin verin, sonra kapak kenarlarını şeffaf oje ile kapatın.
   9. Slaytları 4°C sıcaklığında karanlıkta tutun, görüntülemeye kadar kullanın.
   10. Çip bölümlerini, dönen disk modülü, yüksek hassasiyetli kamera ve 40X objektif (NA 1.25) ile donatılmış ters floresan mikroskop ile görüntüleyin. Görüntüleri uygun mikroskopi yazılımı ile işleyin.

4. RNA çıkarımı ve niceliklendirme

1. Laminar akış altında çiplerden hücrelerin toplanması
   1. 2 haftalık ALI kültüründen sonra, çipleri taşınabilir modüllerden ayırın ve her iki kanalı da 37 °C'de önceden ısıtılmış 200 μL DPBS (-/-) ile iki kez yıkayın.
   2. Alt kanaldaki endotel hücrelerine %0,25 Tripsin-EDTA (1X) 35 μL ekleyin ve RT'de yaklaşık 30 saniye kuluçka yapın.
   3. Hücreleri mikroskop altında inceleyerek tam ayrılmayı doğrulayın. Sonra hücre süspansiyonunu bir tüpe toplayın ve RT'de 5 dakika boyunca 900 × g seviyesinde santrifüj yapın.
   4. Hücre pelletini 50 μL fenol bazlı RNA izolasyon reaktifine yeniden süspansiyona alın ve RNA ekstraksiyonuna kadar -80 °C'de depolayın.
   5. Epitel hücrelerini lizize etmek için doğrudan üst kanala 50 μL fenol bazlı RNA izolasyon reaktifi ekleyin, portları uçlarla kapatın ve 3-4 dakika buzda kuluçka yapın.
   6. Tam lizisi sağlamak için nazikçe pipet yapın, lizat bir tüpe toplayın ve RNA çıkarımı ile -80 °C'de saklayın.
   7. Her iki kanalı mikroskop altında inceleyerek tam hücre toplandığını doğrulayın.
2. RNA çıkarımı
   1. Kloroform ekleyin (lizis için kullanılan fenol bazlı RNA izolasyon reaktifine her 1 hacim için 0,2 hacim; örnek başına 10 μL), tüpleri iyice karıştırarak karıştırın ve 2-3 dakika boyunca buzda kuluçka yapın.
   2. 12.000 × g sıcaklıkta 15 dakika boyunca 4 °C'de santrifüj yapın; böylece fazlı ayırın ve üst sulu fazı dikkatlice yeni bir tüpe aktarılır, böylece ara faz rahatsız edilir. Sonra, sulu faza taşıyıcı olarak 5 μg RNA-sız glikojen eklenir.
   3. İzopropanol ekleyin (1 hacim lizis reaktifi başına 0,5 hacim; örnek başına 25 μL), örnekleri 4 °C'de 10 dakika kuluçka yapın ve 12.000 × g'de 4 °C'de 10 dakika santrifüj yapın.
   4. Süpernatantı atarak RNA pelletini koruyun.
3. RNA'nın yıkaması ve yeniden süspansiyonu
   1. RNA pelletini %75 etanol (1 hacim liziz reaktivi başına 1 hacim; örnek başına 50 μL) yıkayıp kısa bir girdap ile yıkayın ve 7.500 × g sıcaklıkta 4 °C'de 5 dakika boyunca santrifüj yapın.
   2. Üst yüzeyi atın ve pelletin 5–10 dakika boyunca hava kurumasına izin verin.
   3. RNA'yı nazik pipetle 30 μL RNase içermeyen suya geri alın ve RNA'yı -80 °C'de depolayın, daha sonra kullanılana kadar.
   4. Mikrofluidik çip tabanlı nükleik asit ayırma sistemi kullanarak RNA bütünlüğünü ve niceliğini değerlendirin.

Sonuçlar

Çip üzerinde akciğer ortak kültür modellerinin kurulması

Brightfield görüntülemesi, akciğer-çip ko-kültür sisteminde hücre yapışmasını ve büyümesini ortaya koydu. Bronşiyal hava yolu epitel hücreleri, sıvı-sıvı arayüzünde (LLI) suyun altında kalmış kültürde çoğalarak üst kanal boyunca uniform bir tabaka oluşturdu (Şekil 6A), pulmoner vasküler endotel hücreleri ise tüm alt kanalı kaplayarak birleşen bir monotabaka oluşturdu (Şekil 6B).

Ortak kültür kurulduktan sonra, endotel hücreleri alt kanalın giriş ve çıkış bölgelerinde izlendi; bunlar mikroskobik inceleme için erişilebilen tek alanlardır. Şekil 7'de gösterildiği gibi, endotel hücreleri canlı kalmış ve akış yönüne uygun uzun bir morfoloji sergilemiştir. 14 gün ALI kültüründen sonra, hem sağlıklı hem de KOAH modellerinde epitel tabakası belirgin siliyer atımı gösterdi (Ek Video). Beklendiği gibi, KOAH modeli sağlıklı modele kıyasla belirgin şekilde artan mukus üretimi gösterdi (Şekil 8) ve KOAH patolojisinin temel özelliklerini özetledi.

Şekil 6: Mikrofluidik cihazda hava yolu epitelyal ve endotel hücrelerinin birlikte kültürü.
Sıvı-sıvı arayüzü (LLI) koşullarında, gözenekli membranın üst yüzeyinde (A) birincil bronşiyal epitel hücrelerinin ve alt yüzeyinde (B) primer pulmoner mikrovasküler endotel hücrelerinin temsil görüntüleri. Ölçek çubuğu: 100 μm. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 7: Hava-sıvı arayüzü sırasında alt mikrofluidik kanalda endotel hücreleri.
Hava-sıvı arayüzü (ALI) sırasında alt kanalın giriş (üst) ve çıkış (alt) bölgelerinde akciğer mikrovasküler endotel hücrelerini gösteren temsil parlak alan görüntüleri. Ölçek çubuğu: 100 μm. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 8: Hava yollarında mukus birikimi.
Sağlıklı (A) ve KOAH (B) ortak kültür modellerinde 14 gün hava-sıvı arayüzü (ALI) sonrası mukus üretimini gösteren temsil eden görüntüler. Hava yolu bölmesindeki kahverengi tabaka birikmiş mukusu temsil eder. Ölçek çubuğu: 100 μm. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Bariyer bütünlüğünün nicel değerlendirmesi

Bariyer bütünlüğünün fonksiyonel değerlendirmesi, hem sağlıklı hem de KOAH modellerinde pozitif kontrol (hücresiz ECM kaplamalı çip) kıyasla daha düşük görünen geçirgenlik (Papp) gösterdi (Şekil 9).

Hücreler yoksa, yüksek Papp değerleri minimal bariyer oluşumunu gösterirdi. Buna karşılık, epitel ve endotel tabakalarının varlığında, floresan dekstran izleyici ECM'yi geçmedi, bu da geçirgenliğin belirgin şekilde azalmasına ve güçlü bir bariyerin işaretine yol açtı. Bu etki hem ALI öncesinde hem de 10 gün sonrasında gözlemlenmiş, bu da bariyer fonksiyonunun farklılaşma sırasında erken ortaya çıktığını göstermiştir.

Şekil 10'da gösterildiği gibi, sağlıklı modelde ALI'den önceki ortalama Papp değerleri, sağlam bariyer bütünlüğü eşiğinin (1 × 10⁻⁶ cm/s) altında olmuş ve ALI kültüründe daha da azalmıştır. KOAH modelinde, ortalama Papp değerleri ALI'den önce güçlü bariyer aralığındaydı ve 10 gün sonra biraz artmış olsa da, bariyer bütünlüğü sağlam kaldı.

Şekil 9: Çip üzerinde akciğer modelinde bariyer fonksiyonu değerlendirmesi.
Görünür geçirgenlik (Papp), hücresiz ECM kaplı çiplerde (sızıntı için pozitif kontrol; siyah) ve sağlıklı (pembe) ve KOAH (yeşil) ko-kültür modellerinde hava-sıvı arayüzünden (ALI) önce ve sonra 10 gün önce ölçülmüştür. Her nokta bireysel bir çipi temsil eder. Sağlıklı model ayrı bağışçılardan alınan hücreleri içerirken, KOAH modeli tek bir hastadan türetilen hücreleri kullanır. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 10: Sağlıklı ve KOAH modellerinde bariyer fonksiyonunun karşılaştırılması.
Hava-sıvı arayüzü (ALI) öncesi ve sonrası hava-sıvı arayüzü (ALI) öncesi ve sonrası sağlıklı (sol) ve KOAH (sağda) ortak kültür modellerinde görünen geçirgenlik (Papp) ölçüldü. Her nokta bireysel bir çipi temsil eder. Değerler SD ± ortalamadır. KOAH modeli üç hastanın hücrelerini içerirken, sağlıklı model farklı bağışçılardan gelen hücreleri birleştirir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Sıkı ve yapışkan bağlantıların immünotespiti

İmmünoflüoresans analizi, birleşim proteinlerinin yapısal organizasyonunu doğruladı. ZO-1, bronşiyal epitel hücre sınırları boyunca sürekli lokalizasyon gösterdi ve bu da sağlam bir epitel bariyerini gösteriyor (Şekil 11A). Benzer şekilde, VE-kadherin boyama, birleşen endotel monokatmanıyla uyumlu olan endotel birleşimlerinde eşit dağılım gösterdi. Endotel hücreleri, akış yönüne uygun uzun bir morfoloji sergilemiştir (Şekil 11B).

Sıkı ve yapışkan bağlantı proteinlerinin lokalizasyonunda sağlıklı ve KOAH modelleri arasında herhangi bir fark gözlemlenmedi. Bu bulgular, fonksiyonel bariyer verileriyle tutarlıdır ve her iki modelde de birleşim bütünlüğü korunmuş, fizyolojik olarak ilgili epitelyal–endotel arayüzünün varlığını destekler.

Şekil 11: Akciğer-çip üzerinde ortak kültür modelinde birleşim protein ifadesi.
14 gün hava-sıvı arayüzü (ALI) sonrası elde edilen üstten görünüş immünoflüoresans görüntüleri, hava yolu epitel bölmesinde (A) ZO-1 lokalizasyonunu ve endotel bölmesinde (B) VE-kadherin lokalizasyonunu gösteriyor. Çekirdekler DAPI ile boyanmıştır. Ok akış yönünü gösterir. Ölçek çubuğu: 100 μm. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Fenotipleme

Çip kriyoseksiyonlarının immünofluoresan boyamasında membranın apikal tarafında β-tubulin IV-pozitif hücreler ortaya çıktı; bu, hava yolu epitel hücrelerinin silial hücrelere ayrıldığını ve olgun bronşiyal epitelin tanımlayıcı özelliğini gösterir (Şekil 12A). CD31 boyama, membranın bazal tarafında birleşen bir endotel monotabakasının varlığını doğruladı (Şekil 12B). Bu sonuçlar, ortak kültür sisteminin her iki modelde de fizyolojik olarak ilgili epitel ve endotel fenotiplerinin oluşmasını desteklediğini göstermektedir.

Şekil 12: Çip üzerindeki akciğer kesitlerinin immünoflüoresans görüntüleri. 14 gün hava-sıvı arayüzü (ALI) sonrası çip kesitlerinde temsil immünofluoresan boyama ile hava yolu epitel bölmesinde (A) β-tubulin IV ekspresyonu ve endotel bölmesinde (B) CD31 ekspresyonu görülüyor. Çekirdekler DAPI ile boyanmıştır. Ölçek çubuğu: 50 μm. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

RNA çıkarımı ve nicelendirme

Hava yolu epitel hücrelerinden izole edilen RNA, her iki modelde de 59 ila 135 ng/μL arasında konsantrasyonlar vermiş, RNA Bütünlük ^{Sayıları (RIN)11} 7.4–9.6 arasındayken, mikrovasküler endotel hücrelerinden alınan RNA 12 ila 46 ng/μL arasında değişiyordu ve her iki modelde de RIN değerleri 9.6–10 arasındaydı. Veriler, her iki modelin de aşağı akış moleküler analizleri için uygun yüksek kaliteli RNA miktarları elde ettiğini gösterdi.

Ek Tablo 1: Bronşiyal hava yolu epitel hücreleri için donör bilgileri. Tablo, sağlıklı modelde kullanılan bronşiyal hava yolu epitel hücrelerini temsil etmektedir. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Tablo 2: Pulmoner mikrovasküler endotel hücreleri için donör bilgileri. Sağlıklı modelde kullanılan akciğer mikrovasküler endotel hücreleri için donör bilgileri. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Tablo 3: Hasta bilgileri. Tablo, KOAH modelinde kullanılan hava yolu epitelyal ve pulmoner mikrovasküler endotel hücreleri için bilgileri sunmaktadır. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Tablo 4: Protokolde kullanılan anahtar reaktifler ve kültür ortamlarının genel görünümü.Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Video 1: Hava kanalında siliar atma (sağlıklı model).
14 gün hava-sıvı arayüzü (ALI) sonrası siliar atmayı gösteren temsilli video. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Video 2: Hava kanalında siliar vuruşu (KOAH modeli).
14 gün hava-sıvı arayüzü (ALI) sonrası siliar atmayı gösteren temsilli video. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

Bu çalışma, ticari olarak mevcut bronşiyal epitelyal ve pulmoner mikrovasküler endotel hücreleri kullanarak sağlıklı bir model üretmek ve eksimplant akciğerlerden hasta türeyi hücreler kullanarak KOAH modeli oluşturmak için akciğer-üzerinde çip ko-kültür sistemi kurmak için ayrıntılı bir protokol sunmaktadır. Her iki modelde de, iki hücre tipi, hücre tipine özgü ekstraselüler matriks (ECM) ile kaplanmış gözenekli, gerilebilir bir zarla ayrılmıştır; bu da in vivo akciğere daha çok benzeyen bir mikro ortam sağlar. Protokol ayrıca bariyer bütünlüğünü, hücre fenotiplemesini ve her bölmeden RNA çıkarımını değerlendirme yöntemlerini içerir. Her iki model de dinamik perfüzyon ve hava-sıvı arayüzü (ALI) koşullarında başarıyla korundu; bu da fizyolojik olarak ilgili epitelyal–endotel bariyeri ve tamamen farklılaşmış psödostratifikasyona sahip bir hava yolu epitelini ortaya çıkardı. Endotel hücreleri, in vivo olarak akış yönüne hizalandı ve her iki bölmeden yüksek kaliteli RNA elde edildi.

Bu ortak kültür sisteminin başarılı bir şekilde kurulması için birkaç kritik adım gereklidir. Uniform kapsama sağlamak için hassas epitel hücre tohumlaması gereklidir; çünkü düzensiz dağılım, yüzey örtüsünün eksik olmasına ve bariyer oluşumunun bozulmasına yol açabilir. Bu durumlarda, apikal bölme nazikçe aspirasyon edilmeli ve epitel hücreleri yeniden tohumlanmalıdır. ALI'nin oluşumu yalnızca epitel ve endotel tabakaları sürekli monotabakalar oluşturduğunda yapılmalıdır; çünkü erken ALI maruziyeti, vasküler ortamın hava yolu bölmesine sızmasına ve farklılaşmanın bozulmasına yol açabilir. Birleşme sağlanmazsa, ALI kurulması gecikmelidir.

Apikal ortamın eksik olarak çıkarılması veya tutarsız ALI maruziyeti, heterojen epitel olgunlaşmaya yol açabilir. Üst kanaldaki kalıntı ortam, akış hızını 3–4 dakika boyunca 600 μL/s'e çıkararak çıkarılabilir. Perfüzyonu bozan ve hücre canlılığını etkileyen baloncuk oluşumu, yeterli denge eksikliği nedeniyle meydana gelebilir. Baloncuklar, akışı geçici olarak 300μL/s'ye 3-4 dakika boyunca artırarak veya devam ederse çipi ayırıp pipet ile manuel olarak çıkarılarak çıkarılabilir. KOAH modelinde, aşırı mukus üretimi hava yolu kanalını tıkayabilir ve perfüzyonu bozabilir; bu durumlarda, DPBS ile nazik yıkama ve ardından ALI'nin yeniden tesis edilmesi önerilir.

Hava yolu epitelyal ve pulmoner endotel hücrelerini birleştiren mevcut ortak kültür sistemlerinin çoğu, ticari olarak bulunan birincil hücrelere ve kollajen veya fibronektin ^10,12 gibi genel ECM kaplamalarına dayanır. Bunlar yapışmayı desteklerken, hava yolu–damar arayüzünün biyokimyasal ve mekanik özelliklerini yalnızca kısmen yeniden üretirler. Buna karşılık, mevcut sistem hücre tipine özgü ECM kaplamaları kullanır ve insan akciğer dokusunu daha yakından taklit eden bir mikro ortam^{sağlar 13}.

Bariyer fonksiyonu genellikle transepitelyel/transendotel elektriksel direnç (TEER) kullanılarak değerlendirilir, ancak bu yöntem epitel çok katmanlı organizasyon¹⁴ tarafından da etkilenebilir. Bu çalışmada, fonksiyonel bütünlüğün değerlendirilmesinde dekstran geçirgenliği kullanıldı. Gözlemlenen Papp değerleri, güçlü bariyer bütünlüğü eşiğinin (1 × 10⁻⁶ cm/s) altındaydı; bu da sağlam bir epitelal–endotel arayüzü göstermektedir. Hava yolu epitelinde, siliar atma ve mukus üretimi gibi farklılaşma özellikleri ile hücre birleşimlerinde ZO-1 ve VE-kadherinin sürekli lokalizasyonu görüldü. Ayrıca, her iki bölmeden de tutarlı olarak yüksek kaliteli RNA elde edilmiş, bu da hücre tipine özgü aşağı akış analizleri yapılmasını sağlamıştır.

Bu çalışmanın önemli ilerlemelerinden biri, aynı hastadan hem epitel hem de endotel hücrelerinin türetildiği KOAH akciğer-a-çip modelinin geliştirilmesidir. Son zamanlarda bildiğim kadarıyla, böyle hasta eşliğinde bir ortak kültür daha önce bildirilmemiştir. Önceki çalışmalar, KOAH kaynaklı epitel^{hücrelerini 7,8} dahil etmiş ancak ticari kaynaklı endotel hücrelerine dayanarak hastalık spesifik epitelal–endotel etkileşimlerinin araştırılmasını sınırlamıştır. Mevcut model, hastaya özgü hücresel etkileşimleri koruyarak bu sınırlamayı aşmaktadır.

KOAH modeli, sıvı üretiminin artması gibi temel hastalık özelliklerini^{özetledi 3}, akış altında endotel hizalanması ve birleşim bütünlüğünü korudu. Önemli olarak, hastadan kaynaklı epitel ve endotel hücrelerin birlikte kültürü, artan mukus üretimine rağmen bariyer fonksiyonunu veya canlılığı bozmadı. Sistem, ALI koşulları ve sürekli perfüzyon altında stabil kaldı ve uzun vadeli çalışmalar için kullanımını destekledi. Ayrıca, platform mekanik esneme imkanı verir ve fizyolojik önemini daha da artırır.

Bu iş akışının önemli bir gücü ise, aynı platform içinde sağlıklı ve KOAH durumlarını karşılaştırılabilir deneysel parametreler altında değerlendirebilme yeteneğidir. Bu, epitel farklılaşma, endotel fonksiyonu ve bariyer bütünlüğünde hastalıkla ilişkili farklılıkların doğrudan değerlendirilmesini sağlar. Modeller, araştırma sorusuna bağlı olarak bağımsız olarak da kullanılabilir. Sağlıklı model mekanik çalışmalar ve yol modülasyonu için uygundurken, KOAH modeli terapötik değerlendirme ve ilaç testi için bir platform sağlar. Her bölmeden ayrı ayrı yüksek kaliteli RNA çıkarabilme yeteneği, hücre tipine özgü moleküler profilleme imkanını daha da mümkün kılar. KOAH modelinde hasta uyumlu hücrelerin kullanılması, ilişkisiz hücre kaynaklarının birleştirildiğinde kaybedilecek hastalıkla ilgili etkileşimleri korur.

Bu avantajlara rağmen, birkaç sınırlama göz önünde bulundurulmalıdır. Çip üzerinde akciğer sistemlerinin kullanımı özel ekipman ve teknik uzmanlık gerektirir, bu da erişilebilirliği sınırlayabilir. Ayrıca, model şu anda patojenlere ve ilaçlara yanıtları etkileyebilecek bağışıklık veya stromal hücreler gibi diğer ilgili akciğer hücre tiplerini içermemektedir. Ancak, platform dolaşımdaki bağışıklık hücrelerini dahil edecek şekilde uyarlanabilir ve bu hücrelerin epitel ve endotel bölmeleriyle etkileşimlerinin incelenmesini mümkün kılar. Hasta kaynaklı KOAH materyaline erişim de sınırlı olabilir ve hastalar arası değişkenlik tekrarlanabilirliği etkileyebilir. Ayrıca, aşırı mukus üretimi perfüzyonu etkileyebilir.

Döngüsel mekanik esnemenin etkisi bu çalışmada araştırılmadı ancak önemli bir gelecek yönünü temsil etmektedir. Esnenebilen zar, hücresel fonksiyon, onarım ve homeostazı etkilediği bilinen solunumla ilişkili mekanik kuvvetlerin^{simülasyonuna olanak tanır 15,16}. Önceki çalışmalar, mekanik gerilmenin nanoparçacık alımını ve epitel bariyerinden taşınmayı^{artırabileceğini göstermiştir 10}.

Sonuç olarak, burada sunulan sağlıklı ve KOAH akciğer-a-çip modelleri, sağlık ve hastalıkta epitelyal-endotel etkileşimlerini incelemek için fizyolojik olarak ilgili bir platform sağlar. Sistemin dinamik yapısı, akış koşullarının hassas kontrolünü sağlar ve ilaç testi ile patojen maruziyeti çalışmaları gibi uygulamaları destekler. Bu protokol, geleneksel in vitro ve hayvan modellerine sağlam bir alternatif sunar ve translasyonel solunum araştırmalarını ilerletmek için değerli bir araçtır.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
0.25% trypsin-EDTA (1X)  (for endothelial cells)	Gibco	25200-056	Pulmonary microvascular endotel hücrelerinin enzimatik olarak çıkarılmasında kullanılır.
120 mm x 120 mm kare hücre kültürü kabı	VWR	688161	Yonga hazırlama ve kullanımı sırasında yonga tutucusu taşımak için kullanılır.
2100 Bioanalyzer	Agilent	G2939A	RNA kalitesini ve bütünlüğünü değerlendirmek için kullanılır.
2-propanol	Sigma-Aldrich	I9516	Ekstraksiyon sırasında RNA'yı çökeltmek için kullanılır.
4′,6-diamidino-2-fenilindole (DAPI)	Invitrogen	D1306	İmmünfloresan boyama sırasında hücre çekirdeklerini boyamak için kullanılır.
50 mL konik tüpler	Cellstar	227261	Hücre toplama, santrifüjleme ve hücre süspansiyonlarının hazırlanması için kullanılır.
Agilent RNA 6000 Nano Kit	Agilent	5067-1511	Bioanalyzer ile RNA kalitesi analizi için kullanılır.
Amphotericin B	Gibco	15290-026	Hücre kültürü sırasında mantar kontaminasyonunu önlemek için kullanılır.
Otomatik hücre sayacı	NanoEntek	EVE PLUS	Eklenmeden önce hücre konsantrasyonunu ve canlılığını belirlemek için kullanılır.
Hücre kültürü çoklu kuyu plakası, 48 kuyu, steril	Falcon	353078	Boyama prosedürleri sırasında kesitleri tutmak için kullanılır.
Santrifüj	Hettich	320R	Eklenmeden önce hücreleri pelet halinde toplamak için kullanılır.
Chip Cradle	Emulate	support@emulatebio.com	Yonga yüzeyinin aktivasyonu, kaplanması ve hücre eklenmesi sırasında çiplerin desteklenmesi ve tutulması için kullanılır.
Kloroform	Sigma-Aldrich	366927	RNA ekstraksiyonu sırasında faz ayrımı için kullanılır.
Cicero döner disk modülü	CrestOptics S.p.A.		Yüksek hızlı konfokal floresan görüntüleme gerçekleştirmek için kullanılır.
Kaplama camları	Epredia	BB02400600AC13MNZ0	Konfokal görüntüleme sırasında çiplerin desteklenmesi için kullanılır. Açıklama: 24 x 60 mm, #1.5
Kriost	Thermo Fisher Scientific	NX70	OCT gömülü örneklerin kesilmesi için kullanılır.
Kültür modülü (Zö-CM)	Emulate	support@emulatebio.com	Mikrooflüidik sistem içinde hücre kültürü için çevresel koşulları kontrol etmek için kullanılır.
Tanımlamalı tripisin inhibitörü (DTI)	Thermo Fisher	R007100	Epitel hücre ayırma sonrasında tripisin aktivitesini nötralize etmek için kullanılır.
Dextran Cascade Blue 3KDa	Thermo Fisher	D7132	Bariyer geçirgenliğini değerlendirmek için floresan izleyici olarak kullanılır.
Endotelyal hücreler Büyüme Ortamı MV2 kiti	PromoCell	C-22022	Pulmonary mikrovasküler endotelyal hücrelerin bakımı ve çoğaltılması için kullanılır.
ER-1  yüzey aktivasyon reaktifi (ışığa duyarlı aktivasyon reaktifi tozu)	Emulate	support@emulatebio.com	Yonga yüzeylerini sonraki kaplama için aktivasyon etmek için kullanılır.
ER-2  yüzey aktivasyon reaktifi (tampon)	Emulate	support@emulatebio.com	Yonga yüzeyinin aktivasyonu sırasında tampon olarak kullanılır.
Etanolüt	Thermo Fisher Scientific	437433T	Ekstraksiyon sırasında RNA peletlerini yıkamak için kullanılır.
Floresan plaka okuyucu	Agilent	BioTek Sinergy H1 mikroplakla okuyucu	Geçirgenlik testleri için floresan şiddetini ölçmek için kullanılır.
Boğa derisi jelatin	Sigma-Aldrich	G9391	Endotel hücre yapışmasını teşvik etmek için kültür yüzeylerini kaplayan olarak kullanılır.
Goat Anti-Mouse Alexa Fluor 488 (ZO-1 ve β-tubulin IV için)	Thermo Fisher	A11001	Yeşil floresans ile fare birincil antikorlarını tespit etmek için kullanılır.
Goat Anti-Mouse Alexa Fluor 594 (CD31 için)	Thermo Fisher	A11005	Kırmızı floresans ile fare birincil antikorlarını tespit etmek için kullanılır.
Goat Anti-Rabbit Alexa Fluor 555 (VE-kaderhin için)	Thermo Fisher	A21429	Turuncu-kırmızı floresans ile tavşan birincil antikorlarını tespit etmek için kullanılır.
Hub modülü (Orb-HM)	Emulate	support@emulatebio.com	Kültür modülüne gaz ve güç sağlamak için kullanılır.
İnsan Bronşiyal Epitel Hücreleri (HBEC)	Lonza	CC-2540S	Sağlıklı eş-kültür modelini kurmak için hava yolu epitel hücreleri olarak kullanılır.
İnsan Kollajen  IV	Sigma	C5533	Epitel hücre yapışmasını teşvik etmek için T25 flakonlarını kaplayan olarak kullanılır.
İnsan Kollajen Tip I	Advanced Biomatrix	5007	Yonga kaplanması için ekstrasellüler matris çözeltisinin bir bileşeni olarak kullanılır.
İnsan Fibronektin	Sigma-Aldrich	F0895	Yonga kaplanması için ekstrasellüler matris çözeltisinin bir bileşeni olarak kullanılır.
İnsan Laminin