Potansiyel Anti-TB Adaylarının Tanımlanması: Memeli Hücrelerinde Sentez, MIC Belirleme ve Sitotoksisite Değerlendirmesi için Adım Adım Rehber

Özet

Burada, fenotipik tarama yoluyla potansiyel anti-tüberküloz ilaç adaylarını belirlemek için bir protokol sunuyoruz; bu protokol 4-aminokinolin bileşiğinin kimyasal sentezini, Mycobacterium tuberculosis karşısında minimum inhibitör konsantrasyonunun belirlenmesini ve memeli hücre hatlarında sitotoksisitesinin değerlendirilmesini kapsıyor.

Özet

Tüberküloz (TB), dünya genelinde tek bir enfeksiyon ajanından ölüm nedenlerinden biri olmaya devam ediyor; ilaç direncinin artan oranları, yeni tedavi ajanlarının geliştirilmesini küresel bir sağlık önceliği haline getiriyor. Bu protokol, potansiyel anti-TB ilaç adaylarını üç entegre aşamada belirlemek için fenotipik bir tarama yaklaşımını tanımlar. İlk olarak, 4-aminokinolin sınıfından bir bileşik üç aşamalı bir yöntemle sentezlenir ve yüksek performanslı sıvı kromatografi (HPLC), nükleer manyetik rezonans (NMR) spektroskopisi ve yüksek çözünürlüklü kütle spektrometrisi (HRMS) ile tamamen karakterize edilir. İkinci olarak, bileşiğin antimikrobiyal aktivitesi, basit bir görsel renk değişimi okumasıyla minimum inhibitör konsantrasyonu (MIC) belirlenen kolorimetrik resazurin indirgeme mikroplaka testi (REMA) kullanılarak Mycobacterium tuberculosis ile değerlendirilir. Üçüncü olarak, bileşiğin sitotoksisitesi iki memeli hücre hattında, Vero (Afrika yeşil maymun böbreği) ve HepG2 (insan hepatosellüler karsinomu) üzerinde MTT testi (3-[4,5-dimetiltiazol-2-yl]-2,5-difenil tetrazolyum bromid ve nötr kırmızı alım (NRU) testi kullanılarak değerlendirilir. Bu iki tamamlayıcı test, farklı hücresel parametreleri ölçer ve sitotoksisite sonuçlarının çapraz doğrulanmasını sağlar. MIC ve sitotoksisite verileri, her bileşiğin terapötik potansiyelini değerlendirmek için bir seçicilik indeksi (SI) hesaplamasına olanak tanır. Bu protokol, erken evre anti-TB vuruş tanımlaması ve preklinik değerlendirme için tekrarlanabilir, adım adım bir çerçeve sağlar.

Giriş

Ağırlıklı olarak Mycobacterium tuberculosis (Mtb) bacillus tarafından neden olan tüberküloz (TB), insanlarda öncelikle akciğerleri hedef alan bulaşıcı bir solunum yolu hastalığıdır, ancak ekstrapulmoner varyantlar da ortaya çıkabilir. TB, aktif hastalığı olan bireyler tarafından salınan hava yoluyla Mtb baskülleri^{aracılığıyla yayılır 1}. Hastalığın ilerlemesine bağlı olarak, TB ile enfekte olan bir kişi hemen aktif tüberküloz bulabilir. Ancak genellikle, yeni enfekte olan bireyde, düşük metabolik aktiviteye sahip Mtb hücreleri^{granuloma 1,2} içinde hayatta kaldığı gizli tüberküloz gelişir. Gizli tüberkülozlu bir kişi, sonunda hastalığın aktif formunu geliştirebilir ve klinik^{belirtileri ortaya çıkarabilir 3}. Şu anda, dünya nüfusunun dörtte birinin gizli tüberküloz enfeksiyonu olduğu tahmin^{edilmektedir 4}.

Birçok ilerlemeye rağmen, TB dünya genelinde ciddi bir halk sağlığı sorunu olmaya devam etmektedir. En son Küresel Tüberküloz Raporu'ndan elde edilen veriler, 2024 yılında 10,7 milyon kişinin hastalığı geliştirdiğini gösteriyor. Aynı yıl içinde dünya genelinde 1,23 milyon TB ölüm kaydedildi ve TB, tek bir enfeksiyon ajanı nedeniyle ölüm nedenleri^{arasında önde geldi 5}. Mtb'nin patolojisi ve karmaşık biyolojisi dışında, yoksulluk ve yetersiz beslenme gibi sosyo-ekonomik yönler ile sigara, diyabet ve HIV ko-enfeksiyonu gibi sağlıkla ilgili faktörler hastalık kontrolünü daha da^{zorlaştırmaktadır.} Bu durum, TB'nin küresel bir sağlık sorunu olarak uzun süredir kalıcı olmasına katkıda bulunuyor.

Ayrıca, mevcut TB tedavilerinin hastalıkla mücadeleyi zorlaştıran sınırlamaları vardır. Mtb'nin hassas suşlarına karşı standart tedavi, 4 ilacın kombinasyon tedavisinden oluşur: izoniasid (INH), rifampisin (RIF), etambutol (EMB) ve pirazinamid (PZA). Bu antibiyotikler en az 6 ay uygulanır ve tedavi boyunca sıkı bir şekilde uygulanır. Bu terapötik rejim, çoğu vakada etkili olmasına ve yaklaşık %85 başarı oranına sahip olmasına rağmen, hâlâ birçok zorlukla karşı^{karşıya 5,6}. En büyük sorunlardan biri, yan etkiler ve uzun süredir ki bu da genellikle hastanın erken kesintisine yol açar. Bu üretimin kesilmesi ve antibiyotiklerin yanlış uygulanması, daha toksik, pahalı ve kapsamlı tedavi yöntemleri gerektiren dirençli Mtb türlerinin seçilmesini^{teşvik eder 7,8}.

Bu senaryo göz önüne alındığında, yeni, güçlü anti-TB ilaçlarının geliştirilmesi acildir. Bu protokol, fenotipik tarama kullanarak yeni ilaç adaylarının araştırılmasının erken aşamalarını özetlemektedir. Bu protokolün uygulanmasını göstermek için, değerlendirme için LABIO-17'den türetilen 4-aminokinolin bileşiği seçtik. LABIO-17, daha önce araştırma ekibimiz tarafından Mtb'deki enoyl-ACP-redüktaz (InhA) enziminin inhibitörü olarak tanımlanmıştı; bu enzim, isoniazid (INH)^9,10 ile aynı moleküler hedeftir. İnhA, M. tuberculosis'te mikolik asit biyosentezinde yer alır ve basillüsün hayatta kalması için hayati öneme sahiptir; bu da umut vadeden moleküler hedef olarak önemini^vurgular11

Protokol

1. Kimyasal Sentez ve Karakterizasyon

NOT: Kimyasal bileşiğin sentezi ve karakterizasyonu daha önce açıklandığı gibi^{yapılır 10}. 1.1'den 1.4'e kadar olan tüm adımlar, iyi havalandırılan bir buhar davlumbazında nitril eldivenlerle yapılmalıdır.

1. Reaktiflerin hazırlanması
   1. MeOH/CH₃CN (1:1) ile %0,1 formik asit ile hazırlanması
      1. Eşit miktarda metanol (MeOH) ve asetonitril (CH₃CN) ölçülerek 1:1 (v/v) karışımı (HPLC derecesi) hazırlanın.
      2. Çözücüleri temiz, kuru bir kapta (örneğin, hacimsel bir şişe) birleştirin. Formik asit ekleyin ve nihai konsantrasyon %0,1 (v/v) elde edilir (örneğin, 1 L çözücü karışımına 1 mL formik asit ekleyin).
      3. Nazikçe karıştırarak veya karıştırarak iyice karıştırın. Oda sıcaklığında, ışıktan korunaklı sıkıca kapalı bir kapta sakla.
   2. Ultrasaf suda %1 (v/v) Asetik Asit Hazırlanması
      1. Hacimli maşeyi Ultrapure suyla durulayın, sonra tezgaha koyun. Termosa son Ultrasaf su hacminin ~%80'ini ekleyin (yani, 100 mL şişe için 80 mL; 1 L şişe için 800 mL).
      2. Kalibre edilmiş pipet kullanarak, %1 (v/v) elde etmek için buzul asetik asit ekleyin: 100 mL nihai hacim için 1.0 mL asetik asit eklenin →; 1 L son hacim için 10,0 mL asetik asit →.
      3. Iyice karıştırarak veya karıştırarak karıştırın. Termosa son işarete kadar Ultrapure su ile doldurup karıştırın.
      4. Çözeltiyi ultrasonik temizleyici (tank frekansı ~40 kHz) kullanarak sonikasyon ile gazdan çıkarır; ortam sıcaklığında 20 dakika boyunca gaz geçirme moduna ayarlanır.
      5. Etiketli bir amber şişeye aktarın (etiket: içerik, konsantrasyon, çözücü kalitesi, tarih, hazırlayıcı). Oda sıcaklığında sıkıca kapalı şekilde sakla.
   3. Asetonitril Hazırlanması: Metanol (1:1, v/v), HPLC Derecesi
      1. Asetonitril ve metanolün eşit hacimlerini ölçmek: 100 mL nihai hacim için 50,0 mL asetonitril + 50,0 mL metanol → için; 1 L nihai hacim için → 500 mL asetonitril + 500 mL metanol.
      2. Çözücüleri temiz hacimsel bir şişe veya şişede birleştirin ve ters çevirerek veya karıştırarak karıştırın. Karışımı 0,45 μm filtreyle temiz bir kapta filtreleyin ve partikülleri çıkarın.
      3. Çözeltiyi ultrasonik temizleyici (tank frekansı ~40 kHz) kullanarak sonikasyon ile gazdan çıkarır; ortam sıcaklığında 20 dakika boyunca gaz geçirme moduna ayarlanır.
      4. Etiketli bir kehribar şişesine aktarın (etiket: bileşim, çözücü derecesi, tarih, hazırlayıcı). Oda sıcaklığında, sıcaklıktan ve ışıktan uzakta sıkıca kapalı şekilde sakla.
   4. Kolon kromatografisi için Heksan/Etil Asetat 7:3 (v/v) çözeltisi hazırlanması
      1. Son hacmin %70'ini heksan olarak ölçün. Örneğin: 100 mL nihai hacim için 70 mL heksan →.
      2. Son hacmin %30'unu etil asetat olarak ölçün. Örneğin: 100 mL nihai hacim için 30 mL etil asetat →.
      3. Her iki çözücüyü temiz, kuru bir kapta (örneğin, hacimsel şişe veya şişe) birleştirin.
      4. Homojen olana kadar ters çevirerek veya karıştırarak iyice karıştırın. Kabı bileşim, tarih, çözücü kalitesi ve hazırlayıcı ile etiketleyin.
   5. Kolon kromatografisi için Heksan/Etil Asetat 1:1 (v/v) çözeltisi hazırlama
      1. Son hacmin %50'sini heksan olarak ölçün. Örneğin: 100 mL nihai hacim için → 50 mL heksan için.
      2. Son hacmin %50'sini etil asetat ile ölçün. Örneğin: 100 mL nihai hacim için → 50 mL etil asetat.
      3. Her iki çözücüyü temiz, kuru bir kapta (örneğin, hacimsel şişe veya şişe) birleştirin. Homojen olana kadar ters çevirerek veya karıştırarak iyice karıştırın.
      4. Kabı bileşim, tarih, çözücü kalitesi ve hazırlayıcı ile etiketleyin.
   6. Doymuş Sodyum Bikarbonat (NaHCO₃) Çözeltisi Hazırlanır
      1. Fazla miktarda sodyum bikarbonat (NaHCO₃) (yaklaşık 100 mL su için 15–20 g) tartın.
      2. Sodyum bikarbonatı, bilinen bir hacimde damıtılmış su içeren temiz bir beaker'e ekleyin (örneğin 100 mL). Karışımı manyetik karıştırıcı veya cam çubukla oda sıcaklığında (20–25 °C) sürekli karıştırın.
      3. Karıştırmaya devam edin, ta ki daha fazla katı çözülmeyene ve alt kısımda az miktarda çözünmemiş sodyum bikarbonat kalana kadar — bu, çözeltinin doygun olduğunu gösterir.
      4. Çözünmemiş katının yerleşmesi için süspansiyonun 10–15 dakika dinlenmesine izin verin. Karışımı, fazla çözünmemiş bikarbonatı çıkarmak için kağıt filtre veya sinterlenmiş cam huni ile filtreleyin.
      5. Doymuş sodyum bikarbonat çözeltisi olan şeffaf filtratı toplayın.
      6. Çözeltiyi sıkıca kapalı bir şişede saklayın; bileşik adı, konsantrasyon (doymuş), hazırlanma tarihi ve baş harflerinizle düzgün etiketlenmiş.
      7. Çözeltiyi oda sıcaklığında tutun ve gerektiğinde taze hazırlayın, çünkü_CO2 zamanla yavaş kaçıp konsantrasyonu değiştirebilir.
2. 6-bromo-2-metilkinolin-4-ol sentezi (3)
   1. 4-bromoanilin (1,2 g, 7,3 mmol) ve susuz magnezyum sülfat (1,08 g, 9,0 mmol) içeren etanol (15 mL) içeren bir çözelti hazırlayın.
   2. Çözeltiye buzul asetik asit (0,33 mL) ve etil asetoasetat (1,8 mL, 14,1 mmol) ekleyin. Reaksiyon karışımını 90 °C'de 16 saat karıştırın.
   3. Reaksiyon karışımı, askıya alınmış magnezyum sülfatı çıkarmak için selüloz, 11 μm tutma ve nitelikli filtre kağıdı ile filtreleyin.
   4. Akrilat ara maddesini elde etmek için etanolü döner evaporatör kullanarak buharlaştırın.
   5. Reaksiyonu tamamlamak için arakesme sıvısı, yüksek performanslı sentetik ısı transfer sıvısı (bkz. Malzeme Tablosu) (15 mL) içeren uygun bir yağ banyosu ile 230–250 °C sıcaklıkta 15 dakika boyunca ısıtın.
   6. Karışımı oda sıcaklığına soğutun. Oluşan çökeltiyi filtreleyin ve heksan ile kloroform ile yıkayın.
   7. Son ürünü düşük basınç altında döner evaporatör kullanarak konsantre edin ve tüm kalıntı çözücüler çıkarılana kadar (bkz. Malzeme Tablosu).
3. 6-bromo-4-kloro-2-metilkinolin sentezi (4)
   1. 6-bromo-2-metilkinolin-4-ol (0,65 g, 2,8 mmol) içinde toluen (10 mL) bir çözelti hazırlayın. Çözeltiye fosfor(V) oksiklorür (0,65 mL, 6,9 mmol) ekleyin.
   2. Reaksiyon karışımını 110 °C'de 2 saat karıştırın. Fazla fosfor(V) oksiklorürü döner evaporatör kullanarak çıkarın.
   3. Kalıntıyı buz banyosunda soğutun. Reaksiyon karışımını doymuş sodyum bikarbonat çözeltisiyle nötralize edin.
   4. Ürünü etil asetat (3 x 50 mL) ile çıkarın. Organik fazları birleştirin ve susuz sodyum sülfat üzerinde kurutulun.
   5. Çözücüyü döner evaporatör kullanarak katı bir kalıntı elde edin. Ortaya çıkan katı parçayı döner bir evaporatör kullanarak kurutarak ham ürünü elde edin.
   6. Bileşeni, silika jel (35–70 ağ) üzerinde flaş kromatografi ile heksan:etil asetat (7:3) kullanarak elyont olarak saflaştırın.
4. 6-Bromo-2-metil-N-(4-(piperidin-1-il)fenil)kinolin-4-amin sentezi (6)
   1. İzopropanol (20 mL) içinde 6-bromo-4-kloro-2-metilkinolin (0,53 g, 2 mmol), 4-(piperidin-1-il)anilin (0,57 g, 3 mmol), piridin (0,24 mL) ve HCl %37 (0,2 mL) içeren bir reaksiyon karışımı hazırlayın.
   2. Reaksiyon karışımını 85 °C'de 16 saat karıştırın. Çözücüyü döner evaporatör ile çıkarın.
   3. Kalıntıyı doymuş sodyum bikarbonat çözeltisiyle işleyin.
   4. Ortaya çıkan katı selüloz, 11 μm tutma nitelikli filtre kağıdından geçirin ve kloroformda (50 mL) çözün.
   5. Kloroform çözeltisini suyla (3 x 15 mL) yıkayın. Organik fazı susuz sodyum sülfat üzerinde kurutun.
   6. Çözücüyü döner evaporatör kullanarak yeşil katı elde edin. Ürün, sıcak heksan (4 x 10 mL) ile ardışık yıkamalarla arındırın.
   7. Son arıtma, sıvı olarak heksan:etil asetat (1:1) kullanılarak silika jel (35–70 ağ) üzerinde flash kromatografi ile gerçekleştirilir.
5. İnce Katmanlı Kromatografi (TLC)
   1. Reaksiyon ilerleyişini TLC Silika jel 60 F254 plakalarında ince katmanlı kromatografi (TLC) ile izleyin.
   2. Reaksiyonu izlemek ve tüketimini değerlendirmek için başlangıç materyali 4'ü referans olarak kullanın.
6. Melting Point (milletvekili)
   1. Eritme noktası cihazına bileşiğin bir spatula ucunu ekleyin. Erime noktası aralığını kaydedin.
   2. Ölçülen değerlere herhangi bir düzeltme uygulamayın. Deneyi üçlü olarak yapın.
7. Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografi (HPLC)
   1. Ağırlığı 1–2 mg bileşik 6. Asetonitril/metanol içinde 1.0 mg/mL oranında bileşiğin stok çözeltisini hazırlayın (1:1, v/v).
   2. Stok çözeltiyi analiz için 0,5 mg/mL'ye seyreltin. Örnekleri, çift pompa, otomatik enjektör ve UV dedektörüyle donatılmış bir HPLC sistemi (bkz. Malzeme Tablosu) kullanarak analiz edin.
   3. Kromatografi veri toplama yazılımı kullanarak veri edinin ve işleyin (bkz. Materyal Tablosu).
   4. Kromatografik koşulları şu şekilde ayarlayın: ters faz C18 kolonu kullanın, 5 μm (250 x 4,6 mm) (bkz. Malzeme Tablosu). Akış hızını 1.5 mL/da'ya ayarlayın ve UV algılamasını 254 nm'de izleyin. Hareketli fazın 0 ila 7 dakika arasında %100 su (%0,1 asetik asit) olarak tutulması; 7 ila 15 dakika arasında %100 sudan (%0,1 asetik asit) %90 asetonitril/metanol'e (1:1, v/v) doğrusal bir gradyan uygular; 5 dakika boyunca %100 suya (%0,1 asetik asit) geri getirin ve ek 10 dakika bekleyin.
8. Nükleer Manyetik Rezonans (¹saat, ¹³C)
   1. 15–20 mg bileşik 6'yı bir NMR tüpüne tartın. Çözücü olarak DMSO-d₆ ekleyin.
   2. Standart darbe dizilerini kullanarak bir NMR spektrometresinde (bkz. Malzeme Tablosu) ¹H ve ¹³C NMR spektrumları edinin.
   3. Enstrümanı ¹H çekirdeği için 400 MHz ve ¹³C çekirdekleri için 100 MHz hızında çalıştırın. İç referans olarak tetrametilsilan (TMS) kullanın.
   4. Kimyasal değişimleri (δ) milyonda bir bölek (ppm) cinsinden ifade eder. Deneyden elde edilen FID dosyasını kullanarak NMR verilerini görselleştirip işleyin.
9. Yüksek Çözünürlüklü Kütle Spektrometrisi (HRMS)
   1. Ağırlığı 1–2 mg bileşik 6. Örneği, %0,1 formik asit içeren 1:1 oranında MeOH/CH₃CN karışımında hazırlayın.
   2. Analizi, lineer iyon tuzağı kütle spektrometresi ile Orbitrap kütle analizörü birleştiren yüksek çözünürlüklü bir Orbitrap kütle spektrometresinde (bkz. Materyaller Tablosu) gerçekleştirilir.
   3. Numune, elektrosprey iyonizasyon (ESI) kullanılarak pozitif iyon modunda 10 μL/dakika akış hızında doğrudan infüzyon ile tanıtın.
   4. Kütle spektrometrisi veri analiz yazılımındaki element bileşimi aracı kullanarak element bileşimini belirleyin (bkz. Materyal Tablosu).
10. Sütun Kromatografisi – Bileşik 4
    1. 60 ş(70–230 ağ, 0,063–0,200 mm) silika jel kullanarak bir silika jel sütunu hazırlayın. Kolonu uygun şekilde silika jeliyle paketleyin.
    2. Mobil faz olarak heksan/etil asetat (7:3, v/v) kullanın. Ham bileşik 4'ü kolona yükleyin. Bileşiği elyasyonla ve kesirleri toplayın.
    3. Kesirleri TLC ile izleyin ve saf ürün içerenleri birleştirin.
11. Sütun Kromatografisi – Bileşik 6
    1. 60 ş(70–230 ağ, 0,063–0,200 mm) silika jel kullanarak bir silika jel sütunu hazırlayın. Kolonu uygun şekilde silika jeliyle paketleyin.
    2. Mobil faz olarak heksan/etil asetat (1:1, v/v) kullanın. Ham bileşik 6'yı kolona yükleyin. Bileşiği elyasyonla ve kesirleri toplayın.
    3. Kesirleri TLC ile izleyin ve saf ürün içerenleri birleştirin.

Şekil 1. Reaktifler ve koşullar: i = MgSO₄, AcOH, EtOH, 90 °C, 16 saat; ii = C₁₂saat₁₀, C₁₂saat₁₀O, 230-250 °C, 15 dakika; iii =_{POCl 3}, Toluene, 110 °C, 2 saat; iv = Piridin, HCl, (CH₃)₂CHOH, 85 °C, 16 saat. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

2. Minimum Engelleyici Konsantrasyonun Belirlenmesi

1. Deneysel tasarım ve plaka düzeni
   1. Daha önce açıklandığı gibi Minimum Inhibitör Konsantrasyonu (MIC) belirlemek için kolorimetrik resazurin indirgeme mikroplaka testi (REMA) kullanılarak bileşiklerin M. tüberkülozis büyümesini engelleme yeteneklerini ^{değerlendirin.}
   2. Teknik kopyalar olmadan test edilen her bileşik için üç bağımsız deney (üç biyolojik kopya) gerçekleştirin (bileşik başına bir satır ve bir plaka).
   3. Test koşullarının büyüme engellemesine izin verdiğinden emin olmak için pozitif kontrol olarak çalışan bileşikleri test bileşikleriyle birlikte değerlendirin.
   4. Pozitif kontrol olarak İzoniazid (INH) ve Rifampisin (RIF) testi.
   5. Kontrol bileşikleri için A ve B satırlarını (sırasıyla INH ve RIF) atayın.
   6. Test bileşikleri için sonraki satırlar atanır ( Şekil 2'de A'dan F'ye bileşikler).
   7. 1'den 10'a kadar olan sütunları, kontrol ve test bileşiklerinin iki kat seri seyreltmeleriyle hazırlayın; her bileşik bir satırı kaplar; daha yüksek konsantrasyon 10. sütunda, daha düşük konsantrasyon ise 1. sütunda bulunur.
   8. Sütun 11'i, %2,5 nihai DMSO konsantrasyonu ile büyüme ortamı ve bakteri içeren bir canlılık kontrolü olarak hazırlayın; herhangi bir kontrol veya test bileşiği eklenmeden.
   9. Sütun 12'yi, bakteri hücresi olmayan büyüme ortamına seri seyreltme konsantrasyonunda kontrol veya test bileşikleri ekleyerek sterillik kontrolü olarak hazırlayın.
   10. MIC plakasının temsilci düzeni için Şekil 2'ye bakınız.
2. Reaktiflerin Hazırlanması
   1. Oleik asit, albümin, dekstroz ve katalaz (OADC) ile takviye edilen Middlebrook 7H9 Suyu hazırlanır.
      1. 90 mL ultrasaf su içeren 200 mL cam şişeye 0,47 g 7H9 tozu, 0,24 ml %85 gliserol ve 0,5 mL %10 Tween-80 ekleyin.
      2. Orta makineyi 121 °C ve 98,07 kPa ile 10 dakika boyunca otoklavla geçirin.
      3. Ortamın dokununca ısınana kadar soğumasına izin verin (yaklaşık 45–50 °C).
      4. 10 mL OADC ekleyin (ticari olarak mevcut OADC kullanıyoruz; detaylar için Malzeme Tablosu'na bakınız).
      5. 4 °C'de depolayın.
         NOT: Reaktiflerin oranlarını göz önünde bulundurarak deney için uygun miktarı hazırlayın.
   2. ADC ile Middlebrook 7H9 Çiorbasının Hazırlanması
      1. 90 mL ultrasaf su içeren 200 mL'lik cam şişeye 0,47 g 7H9 tozu ekleyin. Orta makineyi 121 °C ve 98,07 kPa ile 10 dakika boyunca otoklavla geçirin.
      2. Ortamın dokununca ısınana kadar soğumasına izin verin (yaklaşık 45–50 °C). 10 ml ADC ekleyin. 4 °C'de depolayın.
         NOT: Deney için uygun miktarı hazırlayın, reaktiflerin oranlarını koruyun.
   3. Bileşik Stok Çözeltilerinin Hazırlanması
      1. Her bileşiğin DMSO'da çözünmüş olarak 2 mg/mL seviyesinde bir stok çözeltisi hazırlanır.
      2. –20 °C'de saklanın.
         NOT: Deneyden önce, maksimum test konsantrasyonu çözünürlüğü değerlendirmesine dayanarak tanımlanır. Çözümlülük sınırını belirlemek için, kristallerin varlığı açısından çözeltileri görsel olarak inceleyin. Kristaller gözlemlenirse, aliquot önceki konsantrasyonun yarısına kadar daha da seyreltilsin. Bu değerlendirmeyi %5 DMSO ile yapın.
   4. Bileşik Çalışma Çözeltilerinin Hazırlanması
      NOT: Çalışma çözeltileri, deney sırasında stok bileşiklerin %10 ADC ile desteklenmiş 7H9 suyu içinde seyreltilerek taze hazırlanmalıdır. Çalışma çözeltisindeki nihai DMSO konsantrasyonu %5 olmalı ve bileşik konsantrasyonu en yüksek test konsantrasyonunun iki katı olmalıdır. Özellikle, analiz sırasında bakterilerin maruz kaldığı son DMSO konsantrasyonu %2,5'tir çünkü bakteriyel süspansiyon eklendikten sonra hacim iki katına çıkar (bkz. bölüm 2.3, adım 2.3.8).
      NOT: DMSO'nun %2,5'i laboratuvarımızda kullanılan bakteri suşları (M. tuberculosis H37Ra, H37Rv ve klinik izolatlar) tarafından tolere edilir. Diğer suşlar veya diğer bakteri türleriyle çalışıyorsanız, büyüme engellemesini teşvik etmeden kullanılabilecek en yüksek DMSO konsantrasyonlarını belirlemek için DMSO'yu test bileşiği olarak kullanan ön bir MIC deneyi yapın.
   5. Resazurin Çözeltisi Hazırlanma
      1. 1 mg resazurin 10 mL ultrasaf suda çözünerek %0,01 resazurin çözeltisi hazırlayın.
      2. Çözeltiyi 0.22 μm filtre ile sterilize edin.
         NOT: Filtreyle sterilize edilmiş resasurin 4 °C'de 1^{hafta 14} boyunca saklanabilir. Ancak, bu çözeltiyi standart uygulama olarak hemen kullanmadan önce hazırlayın.
3. Mikobakteri Hazırlanması
   1. M . tuberculosis'in tek bir kolonisini, %10 OADC, %0,2 gliserol ve %0,05 Tween-80 takviyesi içeren 10 mL 7H9 suyu içeren 50 mL'lik santrifüj tüpüne aşılayın.
   2. Kültür 600 nm (OD₆₀₀) sıcaklığında 0,6 ila 0,8 (yaklaşık 3 ila 4 hafta) optik yoğunluğa ulaşana kadar 37 °C'de sürekli sallanma (100 rpm) ile kuluçka yapın.
      DIKKAT: M. tuberculosis H37RV, Risk Grup 3 patojenek olarak sınıflandırılmıştır; hava yoluyla bulaşabilir ve insanlarda potansiyel ölümcül hastalıklara yol açabilir. Tüm manipülasyonları, uygun kişisel koruyucu ekipman (PPE) kullanarak bir biyogüvenlik seviyesi 3 (BSL-3) laboratuvarında sertifikalı bir biyogüvenlik kabininde gerçekleştirin.
   3. Bakteriyel kültürü, steril cam boncuklarla (1 mm) 3 dakika boyunca vortexing yaparak homojenleştirin.
   4. Süspansiyonun 15 dakika dinlenmesine izin verin, böylece kümeler yerleşsin.
   5. Üst gövdenin_{OD 600'ünü} ölçün ve aliquotları −80 °C'de saklayın.
      NOT: Deneyler için, bakteri süspansiyonunu teorik olarak 0.006 OD_600'e kadar seyreltin ve taze 7H9 çorbasıyla %10 ADC takviyesi yapın. Test sırasında her kuyunun başına 100 μL sıvıyı 96 kuyu plakalarına dağıtın.
4. 96 Kuyu Plakalarının Hazırlanması
   1. 12. sütuna %10 ADC ile takviye edilmiş 100 μL 7H9 suyu ekleyin.
   2. 11 ve 9'dan 1'e kadar olan kolonlara %10 ADC (%5 DMSO) ile takviye edilmiş 100 μL 7H9 suyu ekleyin.
   3. 10. sütuna 200 μL bileşik çözeltisi (test konsantrasyonunun iki katı ile hazırlanmış) ekleyin (bileşik başına bir satır atayın).
   4. 12. sütuna bileşik çözelti 100 μL ekleyin. İki kez seri seyreltme yapın: 100 μL 100 μL'yi sütun 9'a aktarın ve pipetle iyi karıştırın.
   5. 9. sütundan 1. sütuna kadar seri seyreltme devam eder. 1. sütundaki son 100 μL'yi atın.
   6. 11'den 1'e kadar olan sütunlara bakteriyel süspansiyondan 100 μL (teorik OD₆₀₀ 0.006) eklenir.
   7. Plakayı kapatın, parafilm ile mühürleyin ve 7 gün boyunca 37 °C'de kuluçka yapın.
      NOT: Şekil 2 , bir MIC plakasının temsil bir düzenidir. 2.3.1'den 2.3.9'a kadar olan adımları yorumlamak için bu şekle bakabilirsiniz.
5. Resazurin Eklenmesi ve Veri Analizi
   1. Plakanın her kuyusuna %0,01 resazurin çözeltisi 60 μL ekleyin. Plakayı kapatın, parafilm ile mühürleyin ve 37 °C'de 48 saat kuluçka yapın.
   2. Renk değişimini maviden (büyüme engelleme) pembe (bakteriyel büyüme) gözlemleyin.
      NOT: Bazı deneylerde, eksik renk değişimi mor bir kuyu ile sonuçlanır. Bunu bakteriyel büyüme olarak yorumlayın.

Şekil 2. Minimum Inhibitör Konsantrasyonun (MIC) belirlenmesi için kullanılan bir su suyu mikro seyreltme plakasının şematik temsili. Test edilen bileşiklerin iki kat seri seyreltmeleri 1–10 sütunlarına dağıtıldı, sonraki seyreltmeler 10. sütundan 1. sütuna kadar sıralı olarak gerçekleştirildi ve en yüksek bileşik konsantrasyonu 10. sütunda gerçekleşti. A ve B satırları, sırasıyla izoniazid ve rifampisin referans ilaçlarını içeren pozitif kontrollerle eşleşir. C–H satırları test edilen bileşiklere karşılık gelir. 11. sütun canlılık kontrolünü (%2,5 DMSO ve bakteriyel inokulum içeren ortam) temsil ederken, 12. sütun sterillik kontrolüne (bakteriyel inokulum yoksa bileşikleri içeren ortam) karşılık gelir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

3. Memeli Hücre Hatlarında Sitotoksisite Değerlendirmesi

NOT: Tüm hücre kültürü manipülasyonlarını steril koşullarda sertifikalı Sınıf II biyolojik güvenlik kabininde gerçekleştirin.

1. Memeli Hücre Hatlarının Hazırlanması
   1. Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamında (DMEM) insan karaciğer karsinomu (HepG2) ve Afrika yeşil maymun böbreği (Vero) hücre hatlarını kültürleyin.
   2. Ortamı 1,8 g/l sodyum bikarbonat, %10 fetal sığır serumu (FBS), %1 penisillin/streptomisin ve %0,1 amfoterisin B (tam ortam olarak adlandırılır) ile takviye edin.
   3. Hücre kültürlerini %5_CO2 içeren nemlendirilmiş bir atmosferde 37 °C'de kuluçka edin.
   4. Alt konfluent hücreleri (%70–%80) %0,25 tripsin-EDTA çözeltisi ile 5–10 dakika boyunca muamele ederek hasat edin.
   5. Tripsini eşit hacimde tam ortam ekleyerek nötralize edin. Hücre süspansiyonunu 15 mL'lik konik bir tüpe aktarın ve 200 x g hassasiyetinde 5 dakika boyunca santrifüj yapın.
   6. Süpernatantı atın ve hücre pelletini 10 mL taze tam ortamda yeniden askıya alın.
   7. Hücre konsantrasyonunu ve canlılığını otomatik hücre sayacı veya tripan mavisi dışlayıcı bir hemositometre kullanarak belirleyin.
      NOT: Tripan mavisi dışlanması için, 10 μL hücre süspansiyonunu %0,4 tripan mavisi çözeltisi ile 10 μL karıştırın ve hemositometreye (veya sayma slaytına) yükleyin. Ölü veya zar zayıf hücreler mavi görünürken, canlı hücreler lekesiz kalır. Yaşamlılık %canlılık = (lekelenmemiş hücreler / toplam hücreler) x 100 olarak hesaplan. Tohumlama işlemi sadece ≥ 90% varsa devam edin.
   8. Hücre askısını hedef tohumlama yoğunluğuna kadar seyreltin. 96 kuyuluğa sahip düz tabanlı plakanın 2 ila 12. sütunlarının her kuyusuna 100 μL hücre süspansiyonu tohumlanın.
      Tohumlama yoğunlukları: Vero hücreleri için 4.000 hücre/kuyruk; HepG2 hücreleri için 5.000 hücre/kuyu var.
      NOT: Bu yoğunlukları optimize ederek hücrelerin logaritmik büyüme aşamasında kalmasını ve 48 saatlik test son noktasından önce %100 birleşime ulaşmamasını sağlayın.
   9. 1. sütunu, soğurma ölçümleri için boşluk olarak kullanılacak şekilde 100 μL tam ortam (hücresiz) ile doldurun.
   10. Her hücre hattı için dört aynı plaka hazırlayın: iki adet MTT testi için, ikisi ise NRU testi için.
   11. Plakaları hücre tutunması için 37 °C, %5_CO2 sıcaklıkta 24 saat kuluçka yapın.
2. Bileşik Sulandırması ve Hücre Tedavisi
   1. Her test bileşiği için Dulbecco'nun Fosfat Tamponlu Tuzlu Sözü (DPBS) veya uygun bir çözücü (örneğin, dimetil sülfoksit; DMSO).
      NOT: Testten önce bileşiğin hücre kültür ortamında çözünür olduğunu ve çözücü konsantrasyonunun toksik olmadığını (örneğin, DMSO
   2. Plaka düzenini boşluklar, uygun kontroller ve teknik kopyalar içerecek şekilde tasarlayın. 8 konsantrasyonda 9'a kadar bileşiğin test edilmesi için temsil edici bir düzen Şekil 3'te gösterilmiştir.
   3. Test bileşiklerinin tam ortamda seri seyreltmelerini planlanan konsantrasyon aralığını kapsayacak şekilde hazırlayın. Tüm replikat plakalar için yeterli hacmin hazırlandığından emin olun.
      NOT: Bir çözücü (örneğin DMSO) kullanıyorsanız, son çözücü konsantrasyonunun tüm seri seyreltme serisi boyunca sabit kalması için seyreltme ortamını tamamlayın.
      NOT: Çözücü ile işlenmiş kuyular (araç kontrolü), fonksiyonel negatif kontrol görevi görür ve bileşik ile işlenmiş kuyuların normalleştirildiği %100 hücre yaşamını tanımlar. Analiz doğrulaması için, tam hücre ölümü (%0 canlılık) yarattığı bilinen bir konsantrasyonda (örneğin, %0,1 Triton X-100 veya 1 mM sodyum dodesil sülfat) bir sitotoksik referans bileşiği ekleyin. Bu pozitif kontrol kuyularındaki absorbans değerleri, boş kuyulardan anlamlı olarak farklı olmamalıdır ve %0 canlılık doğrulanmalıdır.
   4. 24 saatlik hücre yapışma süresinden sonra, hücrelerin birbirine bağlandığını, yayıldığını ve kuyu yüzeyinin yaklaşık %70–%80'ini homojen birleşimle kapladığını doğrulamak için plakaları ters mikroskop altında görsel olarak inceleyin. Kontaminasyon veya yetersiz bağlantı gösteren plakaları atın.
   5. Kültür ortamını pipet ucu kullanarak dikkatlice aspire edin, uç her kuyunun yanına doğru eğildiğinde hücre monotabakasını rahatsız etmemek için kullanın. Kurumayı önlemek için plakaları kesitler halinde işleyin.
   6. Hemen ilgili kuyruklara 100 μL uygun test bileşik seyreltme veya kontrol ortamı ekleyin.
   7. İşlenmiş plakaları 37 °C, %5_CO2 sıcaklıkta 48 saat kuluçka edin.
3. MTT Analiz Protokolü
   1. Serumsuz DMEM'de 0,5 mg/mL MTT çözeltisi hazırlayın. 0.22 μm bir şırınga filtresinden filtreleyin ve ışıktan koruyun.
   2. 48 saatlik tedaviden sonra, hücreleri görsel olarak inceleyerek beklenen tedavi etkilerini doğrulayın.
   3. MTT plakalarından ortamı dikkatlice aspire edin. Her kuyuya 50 μL 0.5 mg/mL MTT çalışma çözeltisi ekleyin.
   4. 37 °C'de, %5_CO2 sıcaklıkta, ışıktan korunarak 3 saat kuluçka yapın.
      NOT: 2–4 saat yaygın olsa da, Vero ve HepG2 hücreleri için genellikle 3 saatlik kuluçka yeterlidir. Gerekirse optimize et.
   5. Her kuyuya 100 μL %100 DMSO ekleyerek formazan kristallerini çözebilirsiniz. Plakaları 100 devirde yörge sallayıcısına 15 dakika boyunca yerleştirin, ışıktan korunarak. Kristalin tam çözülmesini sağlamak için kontrol kuyruklarını inceleyin. 570 nm'de mikroplaka okuyucu kullanarak absorbansı okuyorum. Varsa, 630–690 nm arasında referans dalga boyu ayarlayın.
4. Nötr Kırmızı Alım (NRU) Analiz Protokolü
   1. Serumsuz DMEM ve filtrede 40 μg/mL Nötr Kırmızı (NR) çözeltisi hazırlayın. NR Desorpsiyon Çözeltisini hazırlayın: %1 (v/v) buzul asetik asit, %49 (v/v) etanol ve %50 (v/v) ultrasaf su.
      DIKKAT: Buzul asetik asit aşındırıcıdır; Bir duman davlumbazında tutun.
   2. 48 saatlik tedaviden sonra hücreleri görsel olarak inceleyin. NRU plakalarından ortamı dikkatlice aspire edin.
   3. Her kuyuya 40 μg/mL NR çalışma çözeltisinden 100 μL ekleyin. 37 °C'de, %5_CO2'de 2 saat kuluçka yapın.
      NOT: Bu hücre hatlarında maksimum boya alımı için 2 saatlik kuluçka yeterlidir.
   4. NR çalışan çözümünü aspire edin. Her birini 150 μL steril PBS ile nazikçe bir kez iyice durulayın.
   5. Her kuyuya 150 μL NR Desorpsiyon Çözeltisi ekleyin. Boyayı çıkarmak için 150 rpm'de yörünge sallayıcısına 15 dakika koyun.
   6. Kontrol kuyularını inceleyerek tam boya çıkarımı sağlayışın. 540 nm'de mikroplaka okuyucu kullanarak absorbansı okuyun.
5. Veri Analizi
   1. Boş sütunların ortalama emilimini hesaplayarak ve bu değeri tüm kuyulardan çıkararak arka plan çıkarımı gerçekleştirin.
   2. Çözücü kontrol kuyruklarını işlenmemiş kontrollerle karşılaştırarak çözücü toksisite testi yapın. Eğer canlılık belirli bir eşik (örneğin, %80) altındaysa, çözücü sitotoksisitesini düşünebilirsiniz.
   3. Çözücü kontrol kuyularına göre yüzde kullanılabilirliği hesaplayın:
      % canlılık = (işlenmiş kuyunun emilimi / çözücü kontrolünün ortalama emiri) x 100.
   4. Bileşik konsantrasyonu (x ekseni)_log10'a karşı %'lik kullanılabilirlik (y ekseni) çizin. CC_50'yi belirlemek için doğrusal olmayan bir regresyon modeli (sigmoidal doz-yanıt, değişken eğim) kullanın.
   5. CC_50'yi MIC'e bölerek Seçicilik Indeksi (SI) hesaplayın.

Şekil 3. MTT/NRU hücre canlılık testi için plaka tasarımı örneği, 9 bileşike kadar sitotoksisiteyi test etmek için erken tarama kurulumu. (A) Plaka tasarım şeması. 1. sütun "boş" olarak atanan, hücresiz ve DPBS veya tam ortamla doldurulur. 2. ve 12. sütunlar hücrelerle tohumlanır ve tam ortam ("işlenmemiş kontrol") veya çözücü ile tam ortam ("solvent kontrolü") ile işlenir. 3'ten 11'e kadar olan sütunlar hücrelerle tohumlanır ve test edilen bileşiklerin seri seyreltmeleriyle işlenir; her bileşik başına bir replikat ile 9'a kadar bir bileşik bulunur. (B) 48 saatlik işlem ve son test adımlarından sonra Vero NRU plakası (yukarıda) ve Vero MTT plakasının (aşağıda) temsil eden fotoğrafları. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Sonuçlar

Sentez, hedef bileşik 6'yı açık yeşil katı olarak (0,53 g, %67 verim) elde etti. Bileşik 227–229 °C erime noktası ve %99 UHPLC saflığı (t_R = 14,11 dakika) olarak sergilenir (Şekil 4). Kimyasal yapı, nükleer manyetik rezonans (NMR) spektroskopisi ve yüksek çözünürlüklü kütle spektrometrisi (HRMS) ile doğrulandı. ¹H NMR spektrumu (Şekil 5), piperidin kısmına karşılık gelen sinyalleri 1.50 ile 3.13 ppm arasında göstermiştir. 2-pozisyondaki metil grubu, tipik bir singlet olarak 2.38 ppm ile ortaya çıktı. 3-pozisyondaki hidrojen ise 6.56 ppm'de bir singlet olarak ortaya çıktı. Fenil halkası 6.97 ve 7.17 ppm'de iki çift gösterdi ve 8.9 Hz bağlantı sabiti vardı. 7 ve 8 pozisyonlarındaki hidrojenler 7,63–7,75 ppm arasında çoklu bir grup oluştururken, kinolin çekirdeğinin 5-pozisyonundaki hidrojen 8,59 ppm'de (J = 2,0 Hz) bir çiftlik üretirdi. Amin hidrojen, 8.66 ppm'de singlet olarak gözlemlendi. ¹³C NMR spektrumu (Şekil 6), 2-pozisyondaki metil grubuna atfedilen 23,81 ppm sinyal gösterirken, 24,85 ile 49,70 ppm arasındaki sinyaller piperidin kısmına karşılık geliyordu. 3-pozisyondaki karbon 100,52 ppm olarak görüldü. Kalan aşağı saha sinyalleri kinolin çekirdeği ve fenil halka karbonlarına atfedildi. HRMS, bileşik 6'nın moleküler formülünü doğruladı ve m/z 396.1063 seviyesinde bir [M+H]⁺ iyonu gösterdi (C_{21H 23BrN 3}: 396.1070 için kalk).

Şekil 4. HPLC kromatogramı ve bileşik 6'nın UV spektrumları. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 5. Bileşik 6'nın ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d6) spektrumları. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 6. Bileşik 6'nın ¹³C NMR (101 MHz, DMSO-d6) spektrumları. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Bileşenin M. tuberculosis'e karşı inhibitör etkinliği, görünür bakteriyel büyümeyi tamamen engelleyen en düşük konsantrasyon olarak tanımlanan MIC belirlenerek değerlendirildi. REMA testinde, renk değişikliğinin olmaması (mavi kalması) büyüme engellemesini gösterirken, pembe kayma bakteriyel büyümeyi gösterir. İzoniasid (INH) ve rifampisin (RIF) uyuşturucu kontrolü olarak kullanıldı. Sonuçlar Şekil 7'de sunulmaktadır. Her plakada büyüme kontrolü (11. sütun, ilaç içermeden) ve sterillik kontrolü (12. sütun, mikobakterisiz) bulunuyordu. Bileşikler, 10. sütundan (en yüksek konsantrasyon) 1. sütuna (en düşük konsantrasyon) seri olarak seyreltildi. Şekil 7'de gösterildiği gibi, A satırındaki bileşik (izonyazid) için MIC değeri 4. sütunda gözlemlenirken, B satırlarındaki bileşiklerin (rifampisin) ve C (sentezlenmiş bileşik) için MIC değerleri 5. sütunda gözlemlenmiştir. Bizim elimizde, INH için MIC değerleri H37Rv suşu için 0.31 μg/mL ve H37Ra için 0.16 μg/mL'dir; RIF için ise H37Rv için 0.08 μg/mL ve H37Ra srüstemi için 0.01 μg/mL elde edilir.

Şekil 7. Mycobacterium tuberculosis'te minimum inhibitör konsantrasyonun (MIC) resazurin mikroplaka testi (REMA) kullanılarak belirlenmesi. A–C Satırları, sütunlar 1–10: İzoniazidin (A sırası), rifampisinin (B sırası) ve sentezlenmiş bileşiğin (C satırı) iki kez seri seyreltmeleri. Sütun 11: Canlı kontrol (%2,5 DMSO + bakteri içeren ortam). Sütun 12: Sterillik kontrolü (medium + bileşik). Mavi renk bakteriyel büyümenin inhibisyonunu gösterirken, pembe renk resazurinin resorufine indirgenmesiyle bakteriyel canlılığı gösterir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Hem NRU (Vero, üst) hem de MTT (Vero, alt) testleri için temsil eden bir 96 kuluk plaka Şekil 3B'de gösterilmiştir. MTT plakasında, yüksek bileşik konsantrasyonlarında şeffaf (canlı hücre yok) şeffaf (canlı hücre olmayan) düşük konsantrasyonlarda derin mora (yüksek hücre canlılığı) dönüşen net bir renk gradyanı görülür. Benzer şekilde, NRU plakası saydamlıktan koyu pembeye doğru bir gradyan gösterir; bu da nötr kırmızı boyanın canlı hücrelerin lizozomlarına alındığını gösterir.

Mikroskopi, 48 saatlik kuluçka süresinden sonra test durumunu görsel olarak doğrular (Şekil 8). Şekil 8A , sağlıklı, tedavi edilmemiş kontrol hücreleri (Vero ve HepG2) ile bileşiğin sitotoksik konsantrasyonuyla işlenmiş hücreleri karşılaştırmaktadır. İşlenen hücreler yuvarlak, kopuk ve canlı görünmüyor. Şekil 8B , son çözümleme aşamasından önce kritik bir görsel kontrol noktası sağlar. Her iki hücre tipinde de canlı hücreler içinde beklenen koyu mor formazan kristallerinin oluşumunu (MTT testi) ve lizozomlar içinde kırmızı boya birikmesini (NRU testi) göstermektedir.

Ham absorbans verileri araç kontrolüne normalize edildi ve protokol adımı 3.5'te detaylandırıldığı gibi doz-yanıt eğrileri oluşturmak için doğrusal olmayan regresyon ile analiz edildi. LABIO-17'den türetilen hedef bileşik 6 için bu analiz, NRU testinde 12,2 μM (Vero) ve 18,3 μM (HepG2) CC₅₀, MTT testinde her iki hücre hattı için CC₅₀ >20 μM elde etti. Bu, daha önce bildirildiği gibi 30,5 ile >50 arasında değişen Seçicilik Endeksi (SI) ile sonuçlandı^.

Şekil 8. Vero ve HepG2 hücrelerindeki sitotoksisite testlerinin temsil eden mikroskopik görüntüleri. Tüm görüntüler 100x büyütme ile çekildi. (A) 48 saatlik tedaviden sonra hücre morfolojisinin karşılaştırılması. Vero (üst) ve HepG2 (alt) hücreleri için tedavi edilmemiş kontrol kuyularında sağlıklı, birleşen bir monotabaka gösterilir. Buna karşılık, bir bileşiğin sitotoksik konsantrasyonuyla işlenmiş hücreler yuvarlak, küçülmüş ve plaka yüzeyinden ayrılmış görünür. (B) Reaktif eklendikten sonra ve çözünürmeden önce kritik görsel kontrol noktaları. MTT testinde (her hücre hattı için sol paneller), canlı hücreler görünür koyu mor formazan kristalleri içerir. NRU testinde (her hücre hattı için sağ paneller), canlı hücreler sağlam lizozomlar içinde kırmızı boya biriktiği görülür. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

İzole enzimler yerine tüm hücre aktivitesine dayanan fenotipik tarama yaklaşımı, M. tuberkülozis'e karşı aktif bileşikleri tanımlamak için etkili bir stratejidir. Burada, bu yaklaşımın ilk adımlarını açıkladık; aday bileşiğin kimyasal sentezini, minimum inhibitör konsantrasyon (MIC) belirleme yoluyla inhibitör aktivitesinin değerlendirilmesini ve memeli hücrelerinde (Vero ve HepG2) sitotoksisitesinin MTT ve NRU testleriyle değerlendirilmesini kapsadık.

Sentetik yol, operasyonel olarak basit dönüşümler kullanılarak hedef bileşiği yüksek saflıkta sağlayan üç ana adımdan (Şekil 1) oluşuyordu. Tekrarlanabilirlik ve verimlilik için belirleyici olarak birkaç kritik adım belirlendi. İlk yoğuşma, tam ara oluşumu sağlamak için hassas stoikiyometrik kontrol ve sürekli reflü gerektirir. Termal siklikleşmeden önce eksik çözücü çıkarılması, halka kapanma verimliliğini olumsuz etkileyebilir. Siklikleşme aşaması ise sıkı sıcaklık kontrolü gerektirir; yetersiz ısıtma eksik aromatizasyona yol açarken, aşırı veya uzun süreli ısıtma yan ürün oluşumunu teşvik edebilir. Klorlama sırasında, yan reaksiyonları en aza indirmek ve 4-pozisyonda seçici aktivasyonu sağlamak için reaksiyon sıcaklığının dikkatli kontrolü ve fosforil klorürün kademeli eklenmesi önerilir. Yöntem optimizasyonu sırasında, küçük prosedürel ayarlamalar sağlamlığı artırdı. Siklileşme sonrası eksik yağış durumunda, hızlı söndürme yerine kademeli soğutma katı geri kazanımı artırırdı. Eğer nükleofilik ikame aşamasında düşük verim gözlemlendiyse, reaksiyon süresinin uzatılması veya amin saflığının doğrulanması faydalı oldu.

Yöntemin ana sınırlamaları, yüksek sıcaklıklı siklleşme ve fosforil klorür gibi aşındırıcı klorlayıcı reaktiflere ihtiyaç duyulmasıdır; bu da özel laboratuvar altyapısı ve güvenliği gerektirir. Alternatif elektronik etkiler, farklı anilin veya aminler için yeniden optimizasyonu gerektirebilir ve adaptasyon olmadan geniş iskelet çeşitlendirmesini sınırlayabilir. Ancak Conrad–Limpach yaklaşımı, Skraup tipi sentezlerden (sert oksitleyiciler) veya geçiş metali katalizli protokollerden (özel katalizörler/inert atmosferler) operasyonel olarak daha basittir. Bu metalsiz strateji, tıbbi kimya için işlevselleştirilmiş kinolin ara maddeleri verimli bir şekilde üretir.

MIC'i belirlemek için kullanılan protokol, görsel incelemeye dayanan bir kolorimetrik testtir. Bu yöntemle ilgili olası bir zorluk, renk değişiminin eksik olmasıdır; bu da belirgin mavi (inhibition) veya pembe (büyüme) yerine mor bir kuyu elde eder. Eğer bu olursa, mikobakteriyel büyümeyi engelleyememe olarak yorumlanmalıdır. Ayrıca, bileşik seri seyreltme yoluyla değerlendirildiğinden, maksimum test edilebilir konsantrasyon bileşiğin çözünürlüğüne bağlıdır. Sonuç olarak, bazı durumlarda, maksimum çözünürken herhangi bir inhibisyon gözlemlenmezse sonuç kesin olmayabilir. Ayrıca, diğer laboratuvarların protokolün belirli adımlarını kendi özel koşullarına uyarlayabileceğinin ve bunun elde edilen sonuçlarda farklılıklara yol açabileceğini kabul etmek önemlidir. Veri verimliliğini artırmak için bu protokol otomasyona uyarlanabilir. 96 kuyuyla plaka hazırlama için sıvı işleme sistemlerinin uygulanması, pipetleme hatalarını azaltacak ve böylece doğruluk ve tekrarlanabilirliği artıracaktır.

Sitotoksisite değerlendirme protokolü, iki ayrı memeli hücre hattı (Vero ve HepG2) ve iki tamamlayıcı canlılık testi (MTT ve NRU) kullanır. Bu protokol içinde birkaç adım, veri tekrarlanabilirliği ve doğruluğunu sağlamak için kritiktir ve her laboratuvar kendi doğrulamasını gerçekleştirmelidir. Örneğin, aşırı birleşme temas inhibisyonuna ve metabolik durumların değişmesine yol açarak sonuçları karıştırabileceği için, ilk hücre tohumlama yoğunluğu dikkatlice optimize edilmelidir; bu da hücrelerin küçük hakaretlere karşı daha hassas olmasına yol açabilir ve toksisiteyi^{aşırı tahmin edebilir 15}. Ayrıca, test edilen en yüksek konsantrasyon genellikle bileşik çözünürlüğüyle sınırlıdır ve çökelme yanlış sonuçlara yol açabilir. Ayrıca, önerilen plaka düzeni (Şekil 3A) birincil tarama için tasarlanmıştır; teknik kopyalardan vazgeçip kenar etkilerini görmezden gelerek bağımsız biyolojik kopyalar yoluyla doğrulama yaparak test edilen bileşik sayısını maksimize eder.

Bu protokolün temel gücü hem MTT hem de NRU testlerinin paralel uygulanmasıdır. Her ikisi de iyi kurulmuş olsa da, farklı hücresel parametreleri ölçüyorlar. MTT testi, mitokondriyal dehidrojenazların metabolik aktivitesini nicelikle ölçüyor; bu genellikle hücre^{yaşamlılığı 16} ile ilişkilidir. Ancak, bu test, indirgeci veya oksitleyici özelliklere sahip veya mitokondriyal solunumu bozan bileşiklerden kaynaklanan parazitlere karşı hassastır ve bu da potansiyel yanlış sonuçlara yol^{açar 15}. NRU testini paralel çalıştırmak, bu tür artefaktların sorun gidermesine yardımcı olur. NRU testi, canlı hücrelerin lizozomal bütünlüğünü ve boya alımı için gereken pH gradyanlarını koruma^{yeteneğini ölçür 17}. MTT ve NRU sonuçları arasındaki tutarsızlıklar, mitokondriyal işlev bozukluğu gibi belirli toksisite mekanizmalarını ortaya çıkarabilir ve bu da daha fazla araştırma gerektirir.

Özetle, bu protokol potansiyel anti-tüberküloz ilaç adaylarının belirlenmesi için temel adımları özetlemektedir. Umut vadeden seçicilik ve güç gösteren bileşikler, daha sonra in vivo çalışmalar gibi daha karmaşık enfeksiyon modellerine de geliştirilebilir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
HÜCRE ÇİZGELERİ
HepG2 (insan hepatosellüler karsinom)	ATCC	HB-8065	İnsan karaciğer karsinom hücre hattı
Mycobacterium tuberculosis H37Ra	ATCC	25177
Mycobacterium tuberculosis H37Rv	ATCC	27294
Vero (Afrika yeşil maymun böbreği)	ATCC	CCL-81	Primat böbrek epitel hücre hattı
KİMyasallar – SENTEZ
4-(Piperidin-1-il)anilin	Sigma-Aldrich	TCI: P0887	Bileşik 5/6 için amin öncüsü
4-Bromoanilin	Sigma-Aldrich	108-67-8	Kinolin sentezi için başlangıç malzemesi
Asetik asit (glaziyali)	Sigma-Aldrich	695092	Sentez ve mobil faz hazırlama reaktifi
Asetonitrit (HPLC sınıfı)	Sigma-Aldrich	34967	HPLC mobil faz bileşeni ve NMR çözücü
Kloroform	Sigma-Aldrich	C2432	Ürün ekstraksiyonu için çözücü
DMSO-d6 (deutere)	Sigma-Aldrich	175641	NMR çözücü
Dowtherm A (ısı transfer sıvısı)	Sigma-Aldrich / Solutia	TBD	Termal siklizasyon için yüksek kaynama noktalı çözücü (230–250 °C); daha önce Dowtherm® A olarak listelenmiştir
Etanol (mutlak)	Sigma-Aldrich	459836	Conrad–Limpach adımı için reaksiyon çözücü
Etil asetat (HPLC sınıfı)	Sigma-Aldrich	270989	Kolon eluent bileşeni
Etil asetoasetat	Sigma-Aldrich	E12806	Kinolin halkası oluşumu için β-ketoester reaktifi
Formik asit (HPLC sınıfı)	Sigma-Aldrich	F0507	HPLC ve HRMS için mobil fazda %0,1'lik katkı maddesi
Cam boncuklar (1 mm, steril)	Sigma-Aldrich	G8772	M. tuberculosis kültürünün homojenizasyonu için
HCl (hidroklorik asit, %37)	Sigma-Aldrich	320331	Nükleofilik ikamede asit katalizörü
Hekzan (HPLC sınıfı)	Sigma-Aldrich	34859	Kolon kromatografisi için polar olmayan eluent
İzopropanol	Sigma-Aldrich	278475	Bileşik 6 sentezi için reaksiyon çözücü
Magnezyum sülfat (MgSO4, anhidrat)	Sigma-Aldrich	M7506	Kurutma maddesi ve reaksiyon katalizörü
Metanol (HPLC sınıfı)	Sigma-Aldrich	34860	HPLC mobil fazı ve NMR çözücü bileşeni
Fosfor(V) oksiklorür (POCl3)	Sigma-Aldrich	201170	Ara madde 4 için klorlama reaktifi
Piridin	Sigma-Aldrich	270970	Nükleofilik ikamede baz katalizörü
Flaşı kromatografi için silika jel (35–70 mesh)	Macherey-Nagel	815349	Flaşı kromatografi adımları için sabit faz
Kolon kromatografisi için silika jel 60 Å (70–230 mesh)	Macherey-Nagel	815381	Kolon kromatografisi için sabit faz
Sodyum sülfat (Na2SO4, anhidrat)	Sigma-Aldrich	239313	Organik faz için kurutma maddesi
TLC Silika jel 60 F254 plakaları	Merck	1.05554	İnce tabaka kromatografisi izleme
Tolüen	Sigma-Aldrich	244511	Klorlama aşaması için çözücü
Ultra saf su	Millipore / eşdeğer	N/A	Mobil faz hazırlamada kullanılır; daha önce metinde Milli-Q su olarak referans verilmiştir
EĞİTİM VE ALETLER
0,22 μm şırınga filtresi	Millipore / herhangi biri	SLGP033RS	Resazurin çözeltisini sterilize etme (2.1.4); MTT çalışma çözeltisini filtreleme (3.3); Nötr Kırmızı çalışma çözeltisini filtreleme (3.4)
0,45 μm şırınga filtresi	Millipore / herhangi biri	SLHA033SS	Mobil faz çözeltilerini filtreleme
15 mL konik tüp (steril)	Falcon / herhangi biri	352097 veya eşdeğeri	Trypsinizasyon sonrası hücre süspansiyonunun toplanması ve santrifüjlenmesi
96 kuyuluk plaka (düz taban, doku kültürü işlemi görmüş)	Corning / herhangi biri	3596	Sitotoksisite ve MIC analizleri için
Alüminyum folyo	Herhangi biri	—	MTT ve NRU inkübasyonu ve çalkalama adımlarında plakların ışıktan korunması
Otoklav	Herhangi biri	—	Ortamın sterilizasyonu (121 °C, 98,07 kPa, 10 dak)
Biyolojik güvenlik kabini (Sınıf II, sertifikalı)	Herhangi biri (BSL-3 sertifikalı)	—	M. tuberculosis manipülasyonları için gerekli (BSL-3)
Hücre sayacı (otomatik) veya hemositometr	örn., Bio-Rad TC20 / Neubauer	TBD	Hücre konsantrasyonu ve canlılık belirlemesi için
Santrifüj (200 × g'ye kadar yetkin)	Herhangi biri	—	Hücre peletleme adımı
CO2 inkübatörü (37 °C, %5 CO2, nemli)