Yöntem makalesi

Drosophila melanogaster'da FlyTrDT Hattı Kullanılarak Motor Sağlık Süresi ve Yaşam Süresi Analizlerinin Yarı Otomatik Entegrasyonu

8 görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/70697

⸱

30 Ekim 2026

 ,  ,  ,  , 
1Amrita School of Biotechnology, Amrita Vishwa Vidyapeetham, Amrita University campus

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Drosophila melanogaster, yaşlanma araştırmaları için güçlü bir model organizma görevi görür. Bu protokol, hem yaşam süresinin hem de fonksiyonel sağlık süresinin popülasyon tabanlı ve tekrarlanabilir bir ölçümünü oluşturmak için gereken adımları detaylandırmaktadır.

Özet

Yaşlanma, progresif fonksiyonel gerileme ve kısalmış yaşam süresi ile karakterize edilir; deneysel çalışmalarda bu iki parametre genellikle birbirinden bağımsız olarak değerlendirilir. Drosophila melanogaster üzerinde, yaşlanmayı ve nörodejenerasyonu incelemek için yaygın olarak yaşam süresi analizleri ve negatif jeotaksis tabanlı lokomotor ölçümler kullanılır. Ancak, erken dönem motor performansı ile uzun vadeli sağkalımı niceliksel olarak entegre eden standartlaştırılmış çerçeveler eksiktir. Burada, yaşam süresi analizini yaşlanan sineklerdeki motor sağlık süresinin objektif kuantifikasyonu ile birleştiren, tekrarlanabilir ve yarı otomatik bir iş akışını tanımlıyoruz.

Protokol; kontrollü sinek yetiştirme koşullarını, mortalite hesaplamalarını ve standartlaştırılmış MP4 kayıtları (minimum 1280 × 720 çözünürlük, 30 frames/s) kullanılarak gerçekleştirilen video tabanlı negatif geotaksi analizlerini entegre etmektedir. Lokomotor performans, Python 3.12.1 sürümünde OpenCV 4.9.0, NumPy 1.26.4, Pandas 2.2.0 ve Matplotlib 3.5.2 ile uygulanan özel bir Python tabanlı boru hattı kullanılarak nicelleştirilir. İş akışı, kare kare merkez nokta (centroid) tespiti gerçekleştirir ve motor fonksiyonun sürekli bir metriği olarak aktif tırmanma eğimini (pixels/s) çıkarır. Sağkalım yörüngeleri, sağkalım fraksiyonu hesaplanarak ve eğri altında kalan sağkalım alanını (AUC) elde etmek için trapezoidal nümerik entegrasyon uygulanarak analiz edilir. Erken motor performansının normalizasyonu, fonksiyonel gerileme ile genel uzun ömür arasında doğrudan karşılaştırma yapılmasına olanak tanır.

İş akışı, hem kontrol hem de amyloid-β eksprese eden sineklerde yarı otomatik tırmanma eğimi ölçümleri ile geleneksel manuel uç nokta skorlaması karşılaştırılarak değerlendirilmiş ve her iki yöntem de yaşa bağlı motor gerilemeyi tespit etmiştir. Temsili veri setleri, Canton S kontrollerinde tekrarlanabilir yaşam süresi yörüngelerini ve nörodejeneratif modelde ölçülebilir erken motor bozulmasını göstermiştir. Bu yöntem gözlemci yanlılığını minimize etmekte, tekrarlanabilirliği artırmakta ve düşük maliyetli video kayıt sistemleriyle uyumlu kalmaktadır. İş akışı; genetik modellere, farmakolojik müdahalelere ve nörodejeneratif paradigmalara kolayca uyarlanabilir olup Drosophila için entegre yaşlanma fenotiplemesinde ölçeklenebilir bir platform sunmaktadır.

Giriş

Yaşlanma, yalnızca yaşam süresinin kısalmasıyla değil, aynı zamanda fizyolojik ve davranışsal fonksiyonların kademeli azalmasıyla da karakterize edilir1. Nörodejeneratif durumlarda, motor koordinasyondaki erken bozulmalar genellikle belirgin mortalite öncesinde meydana gelir ve temelindeki nöronal disfonksiyonu yansıtır2,3. Meyve sineği Drosophila melanogaster, kısa yaşam süresi, genetik olarak işlenebilirliği ve iyi yapılandırılmış davranışsal analizleri sayesinde yaşlanma ve nörodejenerasyon çalışmalarında güçlü bir model sistem olarak ortaya çıkmıştır4. Drosophila'da yaşam süresi analizi, organizma sağkalımının güçlü bir ölçümünü sağlarken, negatif jeotaksi analizleri lokomotor fonksiyonu ve yaşa bağlı motor gerilemeyi değerlendirmek için yaygın olarak kullanılır5,6. Ancak, bu iki veri genellikle bağımsız olarak analiz edilmekte ve bu durum, erken fonksiyonel bozulma ile uzun vadeli sağkalım yörüngeleri arasındaki nicel ilişkiyi kurma yeteneğini sınırlamaktadır. Motor sağlık süresi ve yaşam süresinin entegre analizi, müdahalelerin yaşlanma hızını, hastalık ilerlemesini veya belirli fizyolojik sistemleri etkileyip etkilemediğine dair mekanistik içgörüler sağlayabilir. Bu yaklaşım, özellikle erken lokomotor eksikliklerin belirgin mortaliteden önce geldiği genetik, farmakolojik ve nörodejeneratif modeller için uygundur ve gözlemlenebilir sağkalım farklılıkları ortaya çıkmadan önce fonksiyonel gerilemenin hassas bir şekilde tespit edilmesine olanak tanır.

Geleneksel negatif geotaksi analizleri, belirli bir zaman aralığında tanımlanmış bir yüksekliğe ulaşan sineklerin oranı gibi uç nokta tabanlı puanlamalara dayanır. Basit ve düşük maliyetli olmasına rağmen, manuel puanlama gözlemci yanlılığına yol açabilir ve motor kinetikteki ince farkları gözden kaçırabilir. Sürekli yörünge türevli ölçümler, geleneksel uç nokta tabanlı puanlama yaklaşımlarına kıyasla, hafif lokomotor bozuklukların tespit edilmesindeki hassasiyeti artırabilir. Benzer şekilde, yaşam süresi analizleri, tekrarlanabilirliği sağlamak için titiz bir mortalite takibi ve çevresel standardizasyon gerektirir7. Aynı kohort içinde fonksiyonel sağlık süresi metriklerini sağkalım verileriyle entegre eden, erişilebilir ve tekrarlanabilir yaklaşımlara ihtiyaç duyulmaktadır.

Burada, standartlaştırılmış yaşam süresi analizini, yaşlanan Drosophila'daki motor performansın video tabanlı kantifikasyonu ile birleştiren yarı otomatik bir iş akışını tanımlıyoruz. Açık kaynaklı hesaplama araçları kullanılarak, motor fonksiyonun sürekli bir metriği olarak tırmanma eğimini (pixels/s) çıkarmak için kare kare centroid tespiti gerçekleştirilir. Sağkalım verileri, sağkalım fraksiyonu hesaplanarak ve eğri altındaki sağkalım alanını (AUC) elde etmek için trapezoidal sayısal entegrasyon uygulanarak işlenir. Erken dönem motor performansı normalize edilip sağkalım AUC ile entegre edilerek, bu protokol fonksiyonel gerileme ile genel uzun ömür arasında doğrudan karşılaştırma yapılmasına olanak tanır. Bu yaklaşım, motor sağlık süresini yaşam süresi sonuçlarıyla ilişkilendirmek için objektif ve maliyet etkin bir çerçeve sunar ve Drosophila'daki yaşlanma yörüngelerinin kapsamlı fenotiplendirilmesini sağlar (Şekil 1).

Protokol

Tüm deneyler Drosophila melanogaster kullanılarak ve kurumsal laboratuvar  yönergelerine uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Çalışma omurgasız organizmaları içerdiği için etik onay gerekmemiştir. Tüm prosedürleri, omurgasız araştırmaları için kurumsal hayvan bakım yönergelerini takip ederek sürdürün.

NOT: Deneysel gıdaları 4 °C'de saklayın ve kuru kaldıkları sürece 1 hafta içinde kullanın. Sinekleri 25 °C'de, 12:12 sa cinsinden ışık-karanlık döngüsü ve yaklaşık %60 bağıl nem altında inkübe ederek standart çevresel koşulları koruyun.

1. Standart sinek yeminin hazırlanması

  1. Temel besin hazırlama
    1. 100 mL distile su içeren bir kapta 6 g mısır nişastası, 5 g maya, 4 g D-glukoz, 3 g sakkaroz, 1 g maya özütü, 1 g agar ve 0,25 g malt özütünü birleştirin.
    2. Homojen bir süspansiyon oluşana kadar içeriği bir spatula yardımıyla iyice karıştırın.
    3. Karışımı bir indüksiyon ocak üzerinde; ≥500 mL hacimler hazırlarken 12–15 dk, 100–400 mL arası hacimler hazırlarken ise 5–10 dk boyunca yaklaşık 85–100 °C'ye ısıtın. Isıtma sırasında sürekli karıştırın.
    4. Isıtılmış karışımı standart laboratuvar sterilizasyon prosedürlerine göre otoklavlayın.
    5. Otoklavlanmış besiyerinin soğumasını bekleyin. Bir termometre kullanarak sıcaklık 50–55 °C'ye ulaşana kadar takip edin.
    6. Soğumuş besiyerine 600 µL propiyonik asit ve 1 mL %100 etanol içinde 100 mg benzoik asit ekleyin ve iyice karıştırın.
    7. DİKKAT: Her iki kimyasal da uçucu olduğundan ve solunması veya ciltle teması durumunda tahrişe neden olabileceğinden, propiyonik asit ve etanolle eldiven ve koruyucu gözlük takılıyken iyi havalandırılan bir alanda çalışılmalıdır.
    8. 10 cm uzunluğunda ve 20 mm çapındaki her bir steril viyale 5 mL besin paylaştırın.
    9. Viyalleri oda sıcaklığında en az 5–6 saat boyunca ağzı açık bırakın. Dışarıdan sinek girmesini önlemek için üzerlerini peçete ile örtün. Besiyeri hazırlama ve saklama koşullarındaki farklılıklardan kaynaklanan yaşam süresi ölçümleriyle ilgili değişkenliği en aza indirmek için bu adımı uygulayın.
  2. İlaçlı besin hazırlama
    1. Adım 1.1.1–1.1.5'te açıklandığı şekilde küçük bir miktar yetişkin besini hazırlayın.
    2. Besinin 50–55 °C'ye soğumasını bekleyin.
    3. Distile su veya dimetil sülfoksit (DMSO) gibi uygun bir taşıyıcı kullanarak, test bileşiğinin istenen konsantrasyonda bir stok çözeltisini hazırlayın. Konsantre bir stok çözelti oluşturmak için test bileşiğini seçilen taşıyıcıda çözün ve tedavi ve kontrol grupları arasında aynı taşıyıcı konsantrasyonlarını koruyarak istenen nihai konsantrasyona ulaşmak için stoğu soğumuş besine (50–55 °C) ekleyin.
    4. Homojen dağılımı sağlamak için iyice karıştırın.
    5. İlaç içeren besinden 2 mL'yi, önceden katılaştırılmış baz besinin yüzeyine tabaka halinde ekleyerek her bir deney viyaline paylaştırın.
    6. Baz besin üzerine eklenen besine, yalnızca eşdeğer hacimde taşıyıcı (örneğin, tedavi gruplarında kullanılan aynı nihai konsantrasyonda distile su veya DMSO) ekleyerek kontrol viyalleri hazırlayın.
    7. Sinekleri yerleştirmeden önce, tabaka halindeki besinin oda sıcaklığında tamamen katılaşmasını bekleyin.
      NOT: Besin taşıma ve saklama: Besin akşam hazırlanırsa, viyalleri gece boyunca oda sıcaklığında peçete ile örtülü bırakın ve ertesi sabah pamuk tıpaları yerleştirin. Viyalleri kullanmadan önce daima yıkayın, dekontamine edin ve otoklavlayın. Pamuk rulo parçalarını tıpalamadan önce ayrı olarak otoklavlayın. Pamuk tıpaları yalnızca besin en az 5–6 saat boyunca tamamen donduktan sonra yerleştirin.

2. Amyloid-β ekspresyonu yapan D. melanogaster üretimi

  1. Bakire sürücü dişilerin toplanması ve doğrulanması
    1. Bakire toplama işleminden önce, sürücü sinek hattını 25 °C'de 12 sa:12 sa ışık-karanlık döngüsü altında tutun.
    2. Yeni çıkmış dişi sinekleri sürücü hattından, kısa süreli karbondioksit anestezisi kullanarak günde iki kez, bir kez sabah ve bir kez öğleden sonra toplayın.
    3. Çiftleşmeyi önlemek için toplanan dişileri toplama işleminin hemen ardından taze tek cinsiyetli viallere aktarın.
    4. Bakirelik doğrulaması için vialleri 25 °C'de 48 sa daha inkübe edin.
    5. Larva varlığı için vialleri günlük olarak kontrol edin.
    6. Yumurta veya larva soyunun yokluğunu doğrulayarak bakirelik durumunu onaylayın.
    7. Genetik çaprazlamalarda kullanmak üzere sadece larva üretimine dair kanıt göstermeyen dişileri saklayın.
  2. Genetik çaprazlama kurulumu
    1. Çaprazlama kurulumu gününde, kısa süreli karbondioksit anestezisi kullanarak yeni çıkmış erişkin UAS-APPE693G erkeklerini toplayın.
    2. 20 bakire elav-GAL4 dişisini 10 UAS-APPE693G erkeği ile birlikte taze besiyerli bir viale yerleştirerek çaprazlamaları kurun.
    3. Çaprazlama viallerini kontrollü nem altında, 25 °C'de ve 12 sa:12 sa ışık-karanlık döngüsünde inkübe edin.
    4. Sineklerin 48 sa boyunca çiftleşmesine ve yumurtlamasına izin verin.
    5. Ek soy gerekirse erişkinleri taze viallere aktarın.
    6. Aşırı kalabalıklaşmayı ve kuşakların örtüşmesini önlemek için yumurtlamadan sonra ebeveyn sinekleri çıkarın.
    7. Soyun, çıkış gerçekleşene kadar standart koşullar altında erişkinliğe gelişmesine izin verin.
    8. Nöronlarda amyloid-β eksprese eden F1 erişkin sineklerini sonraki yaşam süresi ve sağlık süresi deneyleri için kullanın.
      NOT: elav-GAL4 sürücüsü, E693G Arctic mutasyonunu taşıyan insan amiloid öncü proteininin pan-nöronal ekspresyonunu sağlar. Ekspresyon, standart yetiştirme koşulları altında gelişimin tamamında ve erişkinlikte gerçekleşir. Yaşlanma deneyleri için tutarlı genetik arka planlar ve uygun kontroller kullanın. Her bir
      deneyde tutarlı sıcaklık koşullarını koruyun. Erişkinlik öncesinde transgenle ilişkili patolojiyi
      geciktirmek için gelişim sırasında 18 °C gibi daha düşük inkübasyon sıcaklıkları kullanılabilir.

3. Sinek toplama

  1.  Negatif jeotaksi deneyi için sinek toplama
    1. Deney düzeneğinden önce tüm sinek stoklarını standart sinek besiyerinde, 25 °C'de, yaklaşık %60 bağıl nemde ve 12 sa:12 sa ışık-karanlık döngüsünde tutun.
    2. Kısa süreli karbondioksit anestezisi kullanarak, yeni çıkmış yetişkin erkek sinekleri 2–3 günlük bir pencere içerisinde toplayın.
    3. Erkek sinekleri, deneysel koşula bağlı olarak ilaç içeren besiyeri tüplerine veya kontrol besiyeri tüplerine aktarın.
    4. Besiyerini her 3 günde bir veya besiyeri kalitesi bozulursa daha erken değiştirin.
    5. Sinekleri, negatif jeotaksi değerlendirmesi için belirlenen yaşlara gelene kadar bu koşullar altında tutun.
      NOT: Lokomotor performans ve yaşlanmadaki cinsiyete özgü farklılıklardan kaynaklanan değişkenlikten kaçınmak için negatif jeotaksi deneyinde sadece erkek sinekler kullanılır.
  2. Yaşam süresi deneyi için sinek toplama
    1. Küçük sinek gruplarını bir anestezi pedi üzerinde kısa süreli olarak anesteziye alın.
    2. Yumuşak bir boya fırçası kullanarak erkek sinekleri ayırt edin.
    3. Yaşam süresi ölçümlerini etkileyebilecek uzun süreli fizyolojik etkileri önlemek için ayıklama sırasında karbondioksit maruziyetini en aza indirin.
    4. Deneysel tasarıma bağlı olarak, her taze besiyeri tüpüne 1:1 cinsiyet oranıyla 10 erkek ve 10 dişi sinek yerleştirin.
    5. Ayıklama ve paylaştırma işlemini grup başına 3–4 dakika içinde tamamlayın.
    6. Toplam anestezi maruziyetinin 9–10 dakikayı geçmediğinden emin olun.
    7. DİKKAT: Operatör maruziyetini en aza indirmek ve sineklerde anestezi kaynaklı uzun süreli fizyolojik stresi önlemek için karbondioksit anestezisi, uygun regülatörler ve yeterli laboratuvar havalandırması kullanılarak uygulanmalıdır.
    8. Her deneysel koşul için 4–6 replika tüp oluşturulana kadar Adım 3.2.1–3.2.6'yı tekrarlayın.

4. Uzun ömür deneyi

  1. Sinek aktarımı ve bakımı
    1. Sinekleri standart koşullar altında tutun.
    2. Aşırı kalabalıklaşmayı, larval kontaminasyonu ve besin bozulmasını önlemek için sinekleri düzenli aralıklarla taze besin içeren flakonlara aktarın.
    3. Sinekleri her 3 günde bir taze besine aktarın.
    4. Flakonda larval büyümeyi önleyerek beslenme koşullarının bozulmasını en aza indirmek için bu aktarım sıklığını kullanın.
    5. Tüm aktarımları anestezi uygulamadan gerçekleştirin.
      NOT: Yaşam süresi deneyleri sırasında anesteziden kaçının çünkü anestezi, özellikle yaşlı sineklerde akut ölüme yol açabilir.
  2. Aktarımlar sırasında mortalite değerlendirmesi
    1. Her aktarımda kohortun yaşını gün cinsinden kaydedin.
    2. Eski flakonu dikkatlice inceleyin.
    3. Eski flakonda kalan ölü sineklerin sayısını sayın ve kaydedin.
    4. Yeni flakona taşınan ölü sineklerin sayısını sayın ve kaydedin.
    5. Çift sayımı önlemek için bu değerleri ayrı ayrı kaydedin.
    6. Her aktarım için toplam ölüm sayısını aşağıdaki denklemle hesaplayın:
      Toplam ölümler = eski flakondaki ölü sinekler + yeni flakona taşınan ölü sinekler.
    7. Önceki aktarımda "taşınan" olarak kaydedilen sinek sayısını mevcut aktarımdaki toplam ölümlerden çıkararak, önceki aktarımdan bu yana gerçekleşen yeni ölüm sayısını belirleyin.
    8. Flakonlar arasında taşınan sineklerin birden fazla kez sayılmadığından emin olmak için bu hesaplamayı kullanın.
  3. Yaşayan ancak inaktif sineklerin tanımlanması
    1. Yaşlı sinekler hareketsiz göründüğünde veya sırt üstü yattığında, bir sineği ölü olarak işaretlemeden önce flakonun yan tarafına hafifçe vurun.
    2. Herhangi bir hareket olup olmadığını gözlemleyin.
    3. Uyarılma üzerine hareket gösteren sinekleri canlı kabul edin.
    4. Uyarılma üzerine hareket gösteren sinekleri ölü olarak kaydetmeyin.
    5. Eski flakonda besin yüzeyine yapışmış olan canlı sinekleri yerinden oynatmak için flakona hafifçe vurun.
    6. Yerinden oynayan canlı sinekleri yeni flakona aktarın.
    7. Yerinden oynayan canlı sinekleri ölü olarak işaretlemeyin.
      NOT: Yaşamın geç evrelerinde ölü ve inaktif sineklerin doğru şekilde ayırt edilmesi kritik öneme sahiptir. Ölüm durumu atanmadan önce her zaman hafif mekanik stimülasyon uygulanmalıdır.
  4. Sansürleme kriterleri
    1. Bir sinek; flakondan kaçma, kazara yaralanma veya uygulama sorunları nedeniyle doğal ölümden önce deneyden çıkarsa, bu sineği sağdan sansürlenmiş (right-censored) olarak değerlendirin.
    2. Sansürlenen sinekleri, sineğin deneyden çıktığı gün ayrı bir sütuna kaydedin.
    3. Sansürlenen sinekleri ölü olarak kaydetmeyin.
    4. Sağkalım analizindeki mortalite sayımlarında sansürlenen sinekleri hariç tutun.
    5. Sansürlemeyi ihtiyatlı bir şekilde kullanın çünkü aşırı sansürleme deneysel yanlılığa yol açabilir.
      NOT: Veri girişi sırasında "ölü" ve "taşınan" sineklerin ayrılması, mortalite sayılarının şişmesini önler ve doğru sağkalım eğrisi rekonstrüksiyonunu sağlar.
  5. Analizin devamı
    1. Deney boyunca Adım 4.1–4.4'ü tekrarlayın.
    2. Analizi, hayatta kalan son sinek ölene kadar sürdürün.

5. Negatif jeotaksi deneyi

  1. Sineklerin hazırlanması
    1. Sinekleri, CO₂ anestezisi uygulamadan deneysel besin şişelerinden toplayın.
    2. Kaçışları önlemek için küçük bir huni kullanarak sinekleri nazikçe temiz bir tırmanma tüpüne veya negatif jeotaksi tüpüne aktarın.
    3. Deneye başlamadan önce sineklerin test odasında 5 dk boyunca aklimatize olmasını sağlayın.
    4. Sirkadiyen değişkenliği en aza indirmek için tüm tırmanma deneylerini günün aynı saatinde (örneğin öğleden sonra) gerçekleştirin.
      NOT: Işık yoğunluğu lokomotor davranışı değiştirebileceğinden, test sırasında doğrudan güneş ışığından kaçının.
  2. Tırmanma tüpü kurulumu
    1. 12 cm yüksekliğinde ve 2 cm çapında şeffaf silindirik bir tırmanma tüpü kullanın.
    2. Tüpün tabanından 10 cm yukarıya yatay bir çizgi işaretleyin.
    3. Video takibini kolaylaştırmak için tüpü düz beyaz bir arka plan önünde dikey olarak konumlandırın.
    4. Bir akıllı telefonu veya dijital kamerayı sabit bir standa monte edin.
    5. Tüpün tamamının kadraj içinde olduğundan emin olun.
  3. Deney prosedürü
    1. Tüm sineklerin aynı anda tabana düşmesi için tüpü, sert bir yüzeye yerleştirilmiş bir köpük ped veya mouse pad üzerine üç kez kuvvetlice vurun.
    2. Hemen ardından yaklaşık 30 kare/sn hızında 10–12 sn boyunca video kaydına başlayın.
    3. Sineklerin 10 sn boyunca serbestçe tırmanmasına izin verin.
    4. Şişe başına en az üç bağımsız deneme kaydedin.
    5. Denemeler arasında 10 dk dinlenme süresi bırakın.
    6. Deneyi kontrol, ilaçla tedavi edilmiş ve çözücü kontrol grupları gibi her deneysel koşul için uygulayın.
    7. 10 sn içinde 10 cm işaretine ulaşan veya bu işareti geçen sineklerin sayısını sayın.
    8. 10 cm'ye ulaşan sinek sayısı olarak E değerini kaydedin.
    9. Test edilen toplam canlı sinek sayısı olarak T değerini kaydedin.
    10. Yüzde tırmanma aktivitesini (E/T) × 100 şeklinde hesaplayın.
    11. Üç deneme üzerinden değerlerin ortalamasını alın.
    12. Değerleri ortalama ± SD olarak raporlayın.
  4. Python betiği kullanılarak yarı otomatik tırmanma analizi
    1. Video edinimi
      1. Negatif jeotaksi deneylerini, 12 cm yüksekliğinde ve 2 cm çapındaki şeffaf bir tırmanma tüpüne dik olarak konumlandırılmış bir akıllı telefon kamerasıyla kaydedin. Videoları, bir akıllı telefon veya dijital kamera kullanarak yaklaşık 30 kare/sn hızında ve minimum 1280 × 720 piksel çözünürlükte kaydedin. Kamerayı tırmanma tüpünden yaklaşık 15–20 cm sabit bir mesafeye yerleştirin ve tüm kayıtlarda aynı edinme geometrisini koruyun. Piksel tabanlı ölçümler için dahili uzamsal kalibrasyon referansı olarak bilinen tüp yüksekliğini (12 cm) kullanın.
      2. Tüpü düz beyaz bir arka plan önüne yerleştirin.
      3. Videoları 10–12 sn boyunca kaydedin.
      4. Tüm kayıtlarda aydınlatma koşullarını sabit tutun.
      5. Tüm kayıtlarda kamera mesafesini sabit tutun.
      6. Tüm kayıtlarda tüp konumlandırmasını sabit tutun.
      7. Ağırlık merkezi tespitindeki değişkenliği en aza indirin.
      8. Kaydedilen videoları .mp4 formatında kaydedin.
      9. Analiz için kaydedilen videoları bir masaüstü bilgisayara aktarın.
    2. Python tabanlı video işleme
      1. Ek Dosya 1 olarak sağlanan özel bir kurum içi Python betiğini kullanarak videoları analiz edin. Tüm analizleri Python 3.12.1; OpenCV (cv2) versiyon 4.9.0, NumPy versiyon 1.26.4, Pandas versiyon 2.2.0, Matplotlib versiyon 3.5.2 ve Scikit-learn versiyon 1.4.2 ile gerçekleştirin.
        1. Betiği bir Python ortamından veya komut satırı arayüzünden çalıştırmadan önce, Ek Dosya 1 içindeki girdi video yolunu ve çıktı dizinini belirtin.
        2. VIDEO_PATH ve OUTPUT_CSV değişkenlerini düzenledikten sonra betiği python climbing_analysis.py komutuyla çalıştırın.
      2. Kare işleme ve nesne tespiti için OpenCV veya cv2 kullanın.
      3. Sayısal hesaplamalar için NumPy kullanın.
      4. Veri dışa aktarımı için Pandas kullanın.
      5. Görselleştirme için Matplotlib kullanın.
      6. Her videoyu kare kare işleyin.
      7. Videoyu OpenCV'nin VideoCapture fonksiyonu ile okuyun.
      8. Tekil kareleri sırayla işleyin.
      9. Kareleri gri tonlamaya dönüştürün.
      10. Arka plan gürültüsünü azaltmak için Gauss bulanıklaştırma uygulayın.
      11. Sinekleri arka plandan ayırmak için ikili ters modda Otsu eşikleme yöntemini uygulayın.
      12. Küçük artefaktları gidermek ve kontur boşluklarını doldurmak için morfolojik açma ve kapama işlemleri gerçekleştirin.
      13. Arka plan artefaktlarını ve küçük gürültü parçacıklarını hariç tutmak için 60 piksel2 minimum kontur alanı eşiğini aşan konturları tanımlayın.
      14. Her geçerli kontur için uzamsal momentleri hesaplayın.
      15. Her geçerli kontur için x ve y ağırlık merkezi koordinatlarını belirleyin.
      16. Bir karede birden fazla sinek tespit edildiğinde ağırlık merkezi koordinatlarının ortalamasını alın.
      17. Kare başına tek bir ortalama kohort konumu elde edin.
    3. Kalite kontrol değerlendirmesi
      1. Tespit edilen konturların kayıt boyunca görünür sineklere karşılık geldiğini doğrulayarak başarılı sinek segmentasyonunu teyit edin.
      2. Düz beyaz bir arka plan ve sabit aydınlatma koşulları kullanarak sinekler ve arka plan arasında yeterli kontrast olduğundan emin olun.
      3. Aşırı parlama, gölgeler, tüp hareketi, ciddi sinek örtüşmesi veya eksik tüp görünürlüğü içeren videoları hariç tutun.
      4. Ağırlık merkezi takibinin kaydın önemli bölümlerinde başarısız olduğu veya eşiklemenin kalıcı arka plan artefaktları oluşturduğu videoları analiz için uygunsuz kabul edin.
    4. Tırmanma metriklerinin çıkarılması
      1. Tırmanma skorunu Adım 5.3.7'de açıklandığı gibi manuel olarak hesaplayın.
      2. Tırmanma yüksekliğini piksel cinsinden, başlangıç ve bitiş dikey ağırlık merkezi konumları arasındaki fark olarak hesaplayın.
      3. Ortalama hızı piksel/sn cinsinden, toplam yörünge uzunluğunun kayıt süresine bölünmesiyle hesaplayın.
      4. Tepe hızını piksel/sn cinsinden, ardışık kareler arasındaki maksimum anlık yer değiştirme olarak hesaplayın.
      5. Yörünge uzunluğunu piksel cinsinden, kareler boyunca kat edilen kümülatif mesafe olarak hesaplayın.
      6. Yörünge alanını piksel2 cinsinden, tüm ağırlık merkezi konumlarını çevreleyen konveks gövdenin alanı olarak hesaplayın.
      7. Dönüş sayısını, yatay yön değişimlerinin sayısı olarak hesaplayın.
      8. Durma sayısını, ardışık kareler arasındaki ağırlık merkezi yer değiştirmenin 3 piksellik durma mesafesi eşiğinin altında kaldığı karelerin sayısı olarak hesaplayın.
      9. Aktif tırmanma performansının objektif bir ölçümünü elde etmek için dikey konumu zamanın bir fonksiyonu olarak grafikleyin.
      10. Kaydın aktif tırmanma aşaması sırasında, hareketli 1 saniyelik doğrusal regresyon penceresi kullanarak saniye başına piksel cinsinden tırmanma eğimini hesaplayın.
      11. Sağkalım analizi ile entegrasyon için eğim değerini birincil motor performans metriği olarak kullanın.
      12. Tırmanma yüksekliği, ortalama hız, tepe hızı, yörünge uzunluğu, yörünge alanı, dönüş sayısı, durma sayısı ve tırmanma eğimi dahil olmak üzere nicelleştirilmiş lokomotor metrikleri .csv dosyaları olarak dışa aktarın. Eğim görselleştirme grafiklerini, kalite doğrulama ve ileri analizler için .png görüntü dosyaları olarak kaydedin.

6. Erken motor sağlık ve sağkalım analizinin entegrasyonu

  1. Sağkalım verilerini; grup, gün ve hayatta kalan sinek sayısını içeren sütunlarla bir .csv dosyası olarak dışa aktarın.
  2. Hayatta kalan sinek sayısını başlangıçtaki kohort boyutuna bölerek, her bir grup için her zaman noktasındaki sağkalım oranını hesaplayın.
  3. Sağkalım oranına karşı zamanın trapezoidal sayısal entegrasyonunu kullanarak, eğri altındaki sağkalım alanını (AUC) hesaplayın.
  4. Motor performans verilerini, her grup için 7. Gün tırmanma eğimini içeren bir .csv dosyası olarak dışa aktarın.
  5. Her grubun 7. Gün eğim değerini karşılık gelen kontrol eğimine bölerek, 7. Gün motor performansını kontrol grubu olan Canton S'ye göre normalize edin.
  6. Normalize edilmiş 7. Gün motor değerlerini, her genotip için karşılık gelen sağkalım AUC değerleri ile birleştirin.
  7. Erken motor gerileme ile sağkalım sonuçları arasındaki ilişkiyi değerlendirmek için normalize edilmiş 7. Gün motor performansı ve sağkalım AUC'sinin tanımlayıcı karşılaştırmasını gerçekleştirin.
  8. Normalize edilmiş 7. Gün motor performansı ve sağkalım AUC değerlerinin grafiksel görselleştirmesini oluşturun (Ek Dosya 2).
    NOT: Tüm sağkalım-motor entegrasyon analizlerini, Ek Dosya 2 olarak sağlanan özel Python betiğini kullanarak gerçekleştirin. Veri işleme ve veri seti birleştirme için Pandas'ı, trapezoidal sayısal entegrasyon için NumPy'yi ve grafiksel görselleştirme için Matplotlib'i kullanın.

7. İstatistiksel analiz

  1. Lokomotor ve sağkalım ölçümlerini, biyolojik replika tüplerden elde edilen temsilci veri setleri olarak sunun.
  2. Lokomotor ölçümleri, bağımsız tırmanma denemeleri üzerinden ortalaması alınmış ortalama değerler olarak raporlayın.
  3. Motor performans ve sağkalım sonuçları arasındaki temsilci ilişkileri göstermek için tırmanma eğiminin (pixels/s) ve sağkalım AUC değerlerinin grafiksel görselleştirmesini kullanın.

Sonuçlar

Standart yetiştirme koşulları altında tekrarlanabilir yaşam süresi profilleri
Sinekler, taze hazırlanmış standart yem kullanılarak kontrollü çevresel koşullar altında (25 °C, %60 nem, 12 s:12 s ışık–karanlık döngüsü) tutulduğunda, kontrol kohortları bağımsız deneyler boyunca tutarlı sağkalım seyirleri sergilemiştir. Canton S kontrol sinekleri, maksimum sağkalımın 75 güne kadar uzandığı, yaklaşık 65–72 günlük bir medyan yaşam süresi göstermiştir (Şekil 2). Yaşam süresi deneyleri, her biri 20 sinek içeren, koşul başına 2 biyolojik replika ile gerçekleştirilmiştir. Standart çevresel ve beslenme koşulları altında elde edilen temsili sağkalım seyirleri, kontrol kohortlarında tekrarlanabilir yaşam süresi profilleri ortaya koymuştur.

Buna karşılık, pan-nöronal amyloid-β eksprese eden sinekler, Drosophila Alzheimer hastalığı modellerinde daha önce rapor edilen nörodejeneratif fenotiplerle uyumlu olarak, Canton S kontrollerine kıyasla azalmış sağkalım sergilemiştir4,5,6.

Yiyecek kalitesi kötüleştiğinde veya uygulama koşulları tutarsız olduğunda, suboptimal yaşam süresi sonuçları ortaya çıkabilir. Bu koşullar altında, ilk 7–10 gün içinde erken mortalite artışları ve tüpler arası değişkenlikte artış (>25%) tespit edilmiştir; bu durum, deneysel tekrarlanabilirliğin bozulduğunu ve biyolojik tekrarlar arasındaki tutarlılığın azaldığını göstermektedir.

Yarı Otomatik Tırmanma Analizi ile Tespit Edilen Yaşa Bağlı Motor Gerileme
Konvansiyonel manuel negatif jeotaksi skorlaması, amyloid-β eksprese eden sineklerde Canton S kontrollerine kıyasla yaşa bağlı lokomotor gerilemeyi tespit etmiştir (Şekil 3). 7. günde, tırmanma performansı gruplar arasında genel olarak benzer kalırken, 28. güne gelindiğinde amyloid-β eksprese eden sinekler, kontrol sineklerine kıyasla azalmış tırmanma aktivitesi sergilemiştir. Kontrol kohortları, yaşlanma zaman noktaları boyunca nispeten stabil bir tırmanma performansı sürdürmüştür. Manuel olarak skorlanan bu davranışsal eğilimler, yarı otomatik FlyTrDT hattından elde edilen tırmanma eğimi değerlerindeki azalmalarla örtüşmüş ve konvansiyonel bitiş noktası skorlaması ile hesaplamalı takip iş akışına benzer yaşa bağlı eğilimler göstermiştir (Şekil 4). Amyloid-β eksprese eden sineklerde gözlemlenen lokomotor gerileme, konvansiyonel negatif jeotaksi deneyleri kullanan Drosophila nörodejenerasyon modellerinde bildirilen yerleşik yaşa bağlı davranışsal bozuklukla tutarlıdır6,7.

FlyTrDT kullanılarak yapılan yarı otomatik tırmanma analizi, kontrol sineklerinde erken motor fonksiyonların korunduğunu ortaya koymuştur. 7. Günde, kontrol sinekleri aktif tırmanma evresi boyunca süregelen yukarı yönlü yer değiştirmeyi yansıtan 86,64 pixels/s ortalama tırmanma eğimi sergilemiştir (Şekil 4). 28. Güne gelindiğinde, eğim yaşa bağlı yavaşlama ile uyumlu olarak sıfıra yaklaşmıştır (−1,50 pixels/s).

Buna karşılık, amyloid-β eksprese eden sineklerde erken dönem motor bozulma görülmüştür. 7. Günde, tırmanma eğimi 34,25 pixels/s değerine düşmüş olup bu, normalizasyon sonrası kontrol performansının yaklaşık %39'unu temsil etmektedir. 28. Güne gelindiğinde, tırmanma eğimi −72,25 pixels/s değerine önemli ölçüde gerileyerek yukarı yönlü lokomotor performansın bozulduğunu göstermiştir.

Eğim tabanlı metrik, aktif tırmanma segmentini yakalar; başlangıçtaki irkilme gecikmesi, plato evreleri ve stokastik hareket artefaktlarından gelen katkıları azaltır. Pozitif eğimler net yukarı yönlü lokomosyonu, sıfıra yakın eğimler sınırlı dikey yer değiştirmeyi ve negatif eğimler net aşağı yönlü yer değiştirmeyi belirtir. Bu temsili trajektoriler, amyloid-β eksprese eden sineklerde yaşa uygun kontrollere kıyasla ilerleyici motor gerilemeyi göstermektedir.

Optimal kayıt koşulları altında, FlyTrDT hattı, kararlı kontur segmentasyonu ve tutarlı dikey yer değiştirme profillerine sahip sürekli sentroid yörüngeleri oluşturmuştur (Şekil 4A). Amiloid-β eksprese eden sineklerdeki azalmış lokomotor performans, daha az sürdürülebilir yukarı yönlü yörüngeler ve daha düşük eğim değerleri ile yansımıştır (Şekil 4B–D). Aşırı parlama, dengesiz tüp konumlandırması, tutarsız aydınlatma veya yetersiz arka plan kontrastı ile kaydedilen videolar, kesintili sentroid yörüngeleri ve aralıklı izleme artifaktları oluşturmuş olup kalite kontrol değerlendirmesi sırasında hariç tutulmuştur.

Erken motor performans ile sağkalım sonuçları arasındaki ilişki
Erken motor performans ile sağkalım sonuçları arasındaki ilişkileri incelemek için, normalleştirilmiş 7. Gün tırmanma eğimi değerleri, genotipler genelinde sağkalım AUC (eğri altındaki alan) ile karşılaştırılmıştır (Şekil 5). Erken motor performansı korunan kontrol sinekleri (normalleştirilmiş motor indeksi = 1,0) daha yüksek sağkalım AUC değerleri (48,2) sergilerken, erken motor performansı azalmış amiloid-β eksprese eden sinekler (normalleştirilmiş motor indeksi = 0,395) daha düşük sağkalım AUC değerleri (24,65) göstermiştir. Temsili lokomotor veri setleri, koşul başına 2 biyolojik replikat şişeden oluşturulmuştur. Bu temsili veri setleri, amiloid-β hastalık modelinde azalmış erken motor performans ile kısalmış sağkalım arasında bir ilişki olduğunu göstermektedir. Sadece iki temsili genotip analiz edildiği için, bu bulgular istatistiksel olarak güçlendirilmiş öngörücü bir korelasyon yerine tanımlayıcı olarak sunulmuştur.

Transgenik Drosophila tırmanma testi; Alzheimer hastalığı çalışması için kutu grafiği ve Kaplan-Meier eğrisi.
Şekil 1: Lokomotor sağlık süresi metriklerini sağkalım analiziyle entegre eden yarı otomatik FlyTrDT iş akışının genel görünümü. İş akışı; standartlaştırılmış sinek yetiştirme ve yaşam süresi analizini, manuel ve yarı otomatik negatif geotaksi değerlendirmesini, tırmanma videolarından kare bazlı centroid çıkarımını, tırmanma eğimi (pixels/s) hesaplamasını, eğri altındaki alan (AUC) sağkalım analizini ve motor performansın sağkalım sonuçlarıyla entegrasyonunu içerir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

CS kontrol ve Aβ gruplarını karşılaştıran sağkalım analizi grafiği; günlere göre olasılık.
Şekil 2: Canton S kontrol ve amyloid-β eksprese eden sineklerin Kaplan–Meier sağkalım analizi. Sağkalım eğrileri, standardize edilmiş çevresel ve diyet koşulları altındaki yaşam süresi seyirlerini göstermektedir. Canton S kontrol sinekleri, yaşlanma zaman noktaları boyunca kısalmış yaşam süresi sergileyen pan-nöronal amyloid-β eksprese eden sineklere kıyasla uzamış bir sağkalım göstermiştir. Veriler, koşul başına 2 biyolojik replika tüpten elde edilen temsili sağkalım seyirlerini temsil etmektedir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayınız.

Drosophila tırmanma deneyi sonuçları; kutu grafikleri 7. ve 28. günlerde CS ile elav-Gal4/UAS-Aβ42'yi karşılaştırmaktadır.
Şekil 3: Kontrol ve amiloid-β eksprese eden sineklerde 7. ve 28. gündeki manuel negatif geotaksi performansı. Kutu grafikleri, 10 saniye içinde 10 cm eşiğini geçen sineklerin yüzdesi olarak ifade edilen temsili tırmanma aktivitesi ölçümlerini göstermektedir. Canton S (CS) kontrol sinekleri yaşlanma zaman noktaları boyunca nispeten stabil bir tırmanma aktivitesi sergilerken, amiloid-β eksprese eden sinekler 28. güne gelindiğinde azalmış tırmanma performansı göstermiştir. Her bir nokta, tek bir flakon ölçümünü temsil etmektedir. Temsili veri setleri, her koşul için 2 biyolojik replika flakondan oluşturulmuştur. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tırmanma yüksekliği analizi; A-D grafikleri piksel/sn eğimlerini göstermektedir; zaman ve yükseklik grafikleri; veri trendleri.
Şekil 4: Kontrol ve amyloid-β eksprese eden sineklerde tırmanma yörüngelerinin ve aktif tırmanma eğiminin yarı otomatik çıkarımı. Temsili ortalama dikey konum yörüngeleri, FlyTrDT takip hattı kullanılarak negatif jeotaksis videolarından çıkarılmıştır. Mavi izler, tespit edilen sineklerin zaman içindeki kare bazlı ortalama dikey merkez konumlarını temsil eder ve kırmızı bölümler, hareketli doğrusal regresyon penceresi kullanılarak belirlenen temsili bir aktif tırmanma segmentini belirtir. Eğim değerleri pixels/s cinsinden ifade edilmiştir. (A) 7. gün Canton S kontrol sinekleri. (B) 7. gün amyloid-β eksprese eden sinekler. (C) 28. gün Canton S kontrol sinekleri. (D) 28. gün amyloid-β eksprese eden sinekler. Temsili yörüngeler, her koşul için 2 biyolojik replika şişeden oluşturulmuştur. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Erken motor sağlık ile sağkalım grafiği; eksenler normalize edilmiş 7. gün motor sağlığını ve sağkalım AUC değerlerini göstermektedir.
Şekil 5: Bir amyloid-β toksisitesi Drosophila modelinde erken motor performans ile sağkalım sonuçları arasındaki ilişki. Canton S (CS) kontrol sinekleri ve amyloid-β eksprese eden (AD) sinekler (n = 2) için normalize edilmiş 7. gün tırmanma eğimi değerleri, sağkalım eğri altı alanına (AUC) karşı grafiğe dökülmüştür. Kontrol sinekleri, amyloid-β eksprese eden sineklere kıyasla daha yüksek erken motor performans ve artmış sağkalım AUC değerleri sergilemiştir. Bu temsili veri setleri, erken lokomotor performans ile sağkalım sonuçları arasındaki bir ilişkiyi örneklendirmektedir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Dosya 1: Negatif geotaksi videolarından yarı otomatik lokomotor kantifikasyon için kullanılan Python tabanlı FlyTrDT tırmanma analizi betiği. Betik; kare kare görüntü işleme, sentroid tespiti, yörünge çıkarımı ve tırmanma eğimi, hız, yörünge uzunluğu, yörünge alanı, duraklama sayısı ve dönüş sayısı dahil olmak üzere tırmanma metriklerinin hesaplamasını gerçekleştirir.Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Dosya 2: Motor sağlık ömrü ve yaşam süresi verilerinin entegrasyonu için Python betiği. Betik; sağkalım oranı hesaplaması, yamuk alan-altındaki-eğri (AUC) analizi, 7. Gün tırmanma eğimi değerlerinin normalizasyonu, veri seti birleştirme ile motor performans ve sağkalım sonuçlarının grafiksel görselleştirmesini gerçekleştirir.Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

Burada, Drosophila melanogaster'da yaşam süresi analizini yarı otomatik motor sağlık süresi nicelendirmesi ile entegre eden bir protokol sunuyoruz. Yaşam süresi ve lokomotor ölçümlerin güvenilir entegrasyonu; çevresel tutarlılığa, yem kalitesine ve biyolojik tekrarlar arasında standartlaştırılmış uygulama prosedürlerine güçlü bir şekilde bağımlıdır7. Yem kuruluğundaki değişkenlik, gecikmiş transferler veya tutarsız mortalite hesaplamaları, erken mortalite sıçramalarına ve tüpler arası varyasyonun artmasına neden olarak sağkalım eğrilerinin yeniden oluşturulmasını ve yaşlanma fenotiplerinin ardıl yorumlanmasını etkileyebilir.

Negatif jeotaksi testi sırasında, video işleme sürecinde güvenilir sentroid tespiti sağlamak için tutarlı ışıklandırma koşulları, kamera konumlandırması ve tüp hizalaması gereklidir. Anestezi hem ömrü hem de lokomotor performansı etkileyebileceğinden, ayıklama sırasındaki aşırı CO₂ maruziyeti en aza indirilmelidir. Aynı kohorttan tekrarlanan davranışsal ölçümler gerçekleştirilirken, sirkadiyen değişkenliği azaltmak için testler günün aynı saatlerinde yapılmalıdır. Yetersiz arka plan kontrastı veya tutarsız aydınlatma, otomatik analiz sırasında eşikleme ve kontur tespitini bozabilir. Video işleme sırasında kontur fragmantasyonu veya kararsız sentroid yörüngeleri gözlemlenirse, arka plan kontrastını artırın, parlamayı azaltın, kamera konumlandırmasını sabitleyin ve kayıtlar boyunca tek tip aydınlatmayı koruyun. Kalıcı eşikleme artefaktları, kayıt açısının ayarlanması, gölgelerin azaltılması veya tırmanma tüpünün tamamının çerçeve içinde sürekli görünür olduğundan emin olunarak en aza indirilebilir. Tüp içindeki aşırı sinek kümelenmesi, doğru sentroid tahminini bozabilir ve deneyler boyunca tutarlı kohort boyutları korunarak en aza indirilmelidir.

Geleneksel negatif jeotaksi analizleri, genellikle sabit bir zaman aralığında önceden belirlenmiş bir yüksekliğe ulaşan sineklerin oranını nicelleştirir ve yaşlanma ile nörodejenerasyon sırasındaki lokomotor gerilemeyi değerlendirmek için yaygın olarak kullanılır5,6. Buna karşın, mevcut yarı otomatik iş akışı, yukarı doğru hareketin aktif tırmanma fazını ayıklar ve kare bazlı centroid yörüngelerinden aktif tırmanma eğimini (pixels/s) hesaplar. Centroid konumları her kare içindeki tespit edilen tüm sinekler üzerinden ortalandığı için, bireysel lokomotor yörüngeler ve sinekten sineğe davranışsal heterojenlik çözümlenemez. Bu yaklaşım; ürkme latansı, geçici duraksamalar ve uç nokta tabanlı manuel puanlamayı etkileyen kümelenme davranışından kaynaklanan etkileri azaltır. Konvansiyonel uç nokta tabanlı puanlamanın aksine, mevcut iş akışı aynı zamanda yaş ve genotip boyunca motor gerilemenin nicel karşılaştırmasına olanak tanıyan sürekli, yükselen eğim (pixels/s) ölçümleri sağlar. Benzer hesaplamalı izleme yaklaşımları, otomatik lokomotor nicelleştirme platformları kullanılarak Drosophila davranış analizlerinde nesnellik ve tutarlılığı artırmak için giderek daha fazla uygulanmaktadır8,9,10,11,12.

Birkaç ek kısıtlamanın daha göz önünde bulundurulması gerekir. Piksel tabanlı tırmanma eğimi ölçümleri (piksel/s), deneyler boyunca tutarlı kamera kalibrasyonuna ve kayıt geometrisine bağlıdır. Kamera mesafesi veya çözünürlüğündeki farklılıklar mutlak eğim değerlerini etkileyebilir ve bu durum, dahili kontrollere göre normalizasyonu zorunlu kılar. Ayrıca, burada sunulan amiloid-β modelinde erken motor gerileme niteliksel olarak azalmış sağkalım ile ilişkili olsa da; ek genotipler, müdahaleler veya farmakolojik tedaviler genelinde yapılacak daha kapsamlı bir doğrulama, motor performans ile sağkalım sonuçları arasındaki ilişkinin yorumlanmasını güçlendirecektir. Burada sunulan temsili veri setleri, hastalık bağlamlarında genel bir öngörü modeli oluşturmaktan ziyade, iş akışı uygulamasını ve yorumlamasını göstermeyi amaçlamaktadır.

Bu sınırlamalara rağmen, bu protokol, yaşlanma çalışmalarında fonksiyonel sağlık süresi metriklerini hayatta kalma sonuçlarıyla ilişkilendirmek için tekrarlanabilir ve maliyet etkin bir çerçeve sunmaktadır. Yöntem; genetik manipülasyonlara, ilaç tarama paradigmalarına ve fonksiyonel gerilemenin mortaliteden önce geldiği nörodejenerasyon modellerine kolayca uyarlanabilir. Tırmanma eğiminin (pixels/s) objektif nicelendirmesini standardize edilmiş sağkalım analiziyle entegre eden bu yaklaşım, Drosophila'da yaşlanma seyirlerinin kapsamlı fenotiplemesini kolaylaştırmaktadır. Ek nörodejeneratif genotipler, farmakolojik müdahaleler ve boylamsal davranışsal veri setlerini içeren gelecek çalışmalar, iş akışının entegre sağlık süresi analizi için faydasını daha da artırabilir13,14.

Açıklamalar

Yazarların beyan edecek herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

Bu çalışma, Amrita School of Biotechnology, Amrita Vishwa Vidyapeetham, Amritapuri tarafından sağlanan fonlarla desteklenmiştir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
AgarHimedia GRM666Katılaştırıcı ajan
Benzoik asitHimediaGRM488Antimikrobiyal koruyucu
Canton-SBloomington Drosophila Stock CenterBDSC #1Yabani tip referans suşu
Tırmanma tüpüÖzel yapımN/AŞeffaf silindirik tüp, 12 cm yükseklik × 2 cm çap, şeffaf plastik veya cam
Mısır unuYerel tedarikçi N/ASinek besini hazırlama
Masaüstü/Dizüstü bilgisayarHerhangi bir üreticiKullanıcı tanımlıMinimum çift çekirdekli işlemci, ≥8 GB RAM, Python 3.x uyumlu işletim sistemi
D-glukozHimediaMB037Sinek besini bileşeni
elav-GAL4Bloomington Drosophila Stock CenterBDSC #458Pan-nöronal GAL4 sürücüsü
MatplotlibAçık kaynaklı kütüphaneVersion 3.5.2Grafik çizimi ve görselleştirme
NumPyAçık kaynaklı kütüphaneVersion 1.26.4Sayısal hesaplamalar
OpenCVAçık kaynaklı kütüphaneVersion 4.9.0Video işleme
PandasAçık kaynaklı kütüphaneVersion 2.2.0Veri işleme
Propiyonik asitHimediaGRM3658Antifungal koruyucu
PythonPython Software Foundation Version 3.12.1Analiz ortamı
Scikit-learnAçık kaynaklı kütüphaneVersion 1.4.2Lineer regresyon analizi
Akıllı telefon kamerası / Dijital kameraHerhangi bir üreticiKullanıcı tanımlıMinimum 30 kare/s kayıt, sabit odak, dik konumlandırma, minimum 1280 × 720 çözünürlük
SükrozHimediaGRM601Sinek besini bileşeni
UAS-APP.Aβ.E693GBloomington Drosophila Stock CenterBDSC #33774İnsan APP Arctic mutasyon modeli
MayaHimediaRM027Besin takviyesi

Kaynaklar

  1. López-Otín C, et al. The hallmarks of aging. Cell. 2013;153(6):1194-217.
  2. Caligiore D, Giocondo F, Silvetti M. The Neurodegenerative Elderly Syndrome (NES) hypothesis: Alzheimer and Parkinson are two faces of the same disease. IBRO Neurosci Rep. 2022;13:330-43.
  3. Buchman AS, Bennett DA. Loss of motor function in preclinical Alzheimer’s disease. Expert Rev Neurother. 2011;11(5):665-76.
  4. Sivanantharajah L, Mudher A, Shepherd D. An evaluation of Drosophila as a model system for studying tauopathies such as Alzheimer’s disease. J Neurosci Methods. 2019;319:77-88.
  5. Jones MA, Grotewiel M. Drosophila as a model for age-related impairment in locomotor and other behaviors. Exp Gerontol. 2011;46(5):320-5.
  6. Gargano JW, Martin I, Bhandari P, Grotewiel MS. Rapid iterative negative geotaxis (RING): a new method for assessing age-related locomotor decline in Drosophila. Exp Gerontol. 2005;40(5):386-95.
  7. Linford NJ, Bilgir C, Ro J, Pletcher SD. Measurement of lifespan in Drosophila melanogaster. J Vis Exp. 2013;(71):50068.
  8. Spierer AN, Yoon D, Zhu CT, Rand DM. FreeClimber: automated quantification of climbing performance in Drosophila. J Exp Biol. 2021;224(2).
  9. Taylor MJ, Tuxworth RI. Continuous tracking of startled Drosophila as an alternative to the negative geotaxis climbing assay. J Neurogenet. 2019;33(3):190-8.
  10. Cao W, et al. An automated rapid iterative negative geotaxis assay for analyzing adult climbing behavior in a Drosophila model of neurodegeneration. J Vis Exp. 2017;(127):56507.
  11. Liu H, et al. Automated rapid iterative negative geotaxis assay and its use in a genetic screen for modifiers of Aβ42-induced locomotor decline in Drosophila. Neurosci Bull. 2015;31(5):541-9.
  12. Rhodenizer D, et al. Genetic and environmental factors impact age-related impairment of negative geotaxis in Drosophila by altering age-dependent climbing speed. Exp Gerontol. 2008;43(8):739-48.
  13. Tsintzas E, Niccoli T. Using Drosophila amyloid toxicity models to study Alzheimer’s disease. Ann Hum Genet. 2024;88(5):149-65.
  14. O’Keefe L, Denton D. Using Drosophila models of amyloid toxicity to study autophagy in the pathogenesis of Alzheimer’s disease. Biomed Res Int. 2018;2018:5195416.

Yeniden basım ve izinler

Daha fazla makale keşfet

Negatif JeotaksiLokomotor PerformansSağkalım TrajektörleriVideo Tabanlı AnalizSentroid TespitiTırmanma EğimiNörodejeneratif Model

Bu makale yayımlandı

Video yakında

Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.