Kültüre Dayalı Algılanmayan Büyüme Değerlendirmesi ve Taze Aloe Vera Jel Ekstraktının Antioksidan Profillenmesi

Özet

Bu protokol, taze Aloe vera iç jel ekstraktının aseptik hazırlanmasını, potansiyometrik pH ölçümünü, otomatik ABTS tabanlı kolorimetrik testle toplam antioksidan kapasite değerlendirmesini, tanımlanmış kuluçka koşullarında kültür bazlı, tespit edilemeyen büyüme değerlendirmesini ve 70:30 (v/v) Aloe vera'nın ön antimikrobiyal taramasını tanımlar./N-asetil-L-sistein test karışımı disk difüzyonu ve niteliksel iki katlı tüp seyreltme ile kullanılır.

Özet

Aloe vera (Aloe barbadensis Miller), topikal ve tamamlayıcı ilaç ürünlerinde yaygın olarak kullanılır. Ancak, toplam antioksidan kapasitesinin (TAC), pH davranışının, tanımlanmış koşullarda kültür bazlı tespit edilemez büyüme durumu ve ön antimikrobiyal taramanın eşzamanlı değerlendirilmesi için standartlaştırılmış laboratuvar iş akışları sınırlı kalmaktadır. Taze iç jel Aloe vera ekstraktı aseptik olarak hazırlandı ve %5, 10%, %15 ve %20 (w/v) oranlarında formüle edildi. pH potansiyometrik olarak ölçüldü ve TAC otomatik ABTS radikal katyon tabanlı kolorimetrik testle belirlendi. Kültür temelli, tespit edilmeyen büyüme değerlendirmesi, ekstraktın kan agarı, eozin metilen mavi agar ve Sabouraud dekstroz agara aşılanarak gerçekleştirildi; ardından aerobik kuluçka ve 24 saat, 48 saat ve 72 saat içinde görsel inceleme yapıldı. 70:30 (v/v) Aloe vera/N-asetil-L-sistein test karışımının antimikrobiyal taraması, standart referans suşlara karşı disk difüzyonu ve nitelikli iki katlı tüp seyreltme testleriyle gerçekleştirildi. TAC, gruplar arasında anlamlı farklılıklar gösterdi (Kruskal-Wallis, p = 0.014), en yüksek değerler %20 formülasyonunda gözlemlendi. Test edilen kültür koşullarında 72 saatlik gözlem süresi boyunca görünür bakteriyel veya mantar büyümesi gözlemlenmedi. Aloe vera/N-asetil-L-sistein test karışımı, 11 mm ile 17 mm arasında değişen inhibisyon bölgeleri üretmiştir; en büyük bölge ise Pseudomonas aeruginosa'ya karşı gözlemlenmiştir. Bu iş akışı, taze Aloe vera'nın hazırlanması ve ön karakterizasyonu için pratik bir laboratuvar yaklaşımı sunar.-erken aşama tamamlayıcı tıp araştırmaları için temelli formülasyonlar.

Giriş

Aloe vera, geleneksel tıpta uzun süredir kullanılması ve ilaçlar, biyomedikal, kozmetik ve gıda araştırmalarındaki artan önemi nedeniyle önemli bilimsel ilgi çekmeye devam^{etmiştir 1,2,3}. Bu tıbbi bitki, polisakkaritler, fenolik bileşikler, antrakinonlar, vitaminler, mineraller, enzimler ve diğer düşük moleküler ağırlıklı metabolitler dahil olmak üzere çeşitli biyolojik olarak aktif bileşenler içerir; bunlar terapötik ve fonksiyonel özelliklerine katkıda bulunabilir ^1,2,3. Bu bileşenler arasında, biyomateryal potansiyeli nedeniyle asemannan vurgulanmıştır ve doku onarımı, immünomodülasyon ve rejeneratif uygulamalardaki rolleri^{bildirilmiştir 4,5}. Paralel olarak, fenolik ve diğer antioksidan-aktif bileşikler, Aloe vera'nın serbest radikal temizleyen, koruyucu ve biyolojik destekleyici etkileriyle ilişkilendirilmiştir.^{preparatlar 2,3}.

Son yıllarda, Aloe vera'nın gelişmiş formülasyon sistemlerine ve biyoaktif malzemelere dahil edilmesine artan ilgi görülmektedir. Aloe vera bazlı hidrojeller, biyomateryal mürekkepleri, nanokompozitler ve üç boyutlu baskılı iskeleler, yüksek hidrasyon kapasitesi, biyouyumlulukları ve çok fonksiyonlu biyolojik özellikleri nedeniyle yara iyileşme ve doku destek uygulamaları için^{araştırılmıştır} 4,6,8,9,10,11. Deneysel çalışmalar, Aloe vera içeren malzemelerin nemli bir ortama katkıda bulunarak, formülasyonun fizikokimyasal özelliklerini iyileştirerek ve seçilmiş in vitro, in vivo ve formülasyona bağlı koşullarda antioksidan veya antimikrobiyal destek sağlayarak yara yönetimini^{destekleyebildiğini göstermiştir} 4,7,8,9,10,11. Ayrıca, Aloe vera gıda koruma ve formülasyon uygulamalarında da araştırılmıştır; burada jel bazlı kaplamalar ve ilgili sistemler daha iyi oksidatif stabilite, daha iyi duyusal kalite ve gelişmiş mikrobiyolojik performansla^{ilişkilendirilmiştir 12,13}. Bu gelişmeler, Aloe vera'nın giderek daha fazla geleneksel bir bitkisel ürün olarak değil, aynı zamanda geniş formülasyon odaklı potansiyele sahip çok işlevli bir doğal malzeme^{olarak da görüldüğünü göstermektedir} 2,3,12,13.

Aloe vera'nın biyolojik önemi, antimikrobiyal ve mikrobiyolojik odaklı uygulamalara da uzanır. Son çalışmalar, Aloe vera veya Aloe vera içeren preparatların klinik açıdan önemli mikroorganizmalar (bunlar arasında Propionibacterium acnes, Enterococcus faecalis, Candida türleri ve yara enfeksiyonlarından izole edilmiş klinik izolatlar 14,15,16,17) karşı inhibitör etkilerini tanımlamıştır. Daha önceki in vitro kanıtlar da iç jel Aloe vera'nın Helicobacter pylori referans suşları ve klinik izolatlara karşı etkinliğini^{göstermiştir 18}. Ayrıca, hibrit Aloe vera içeren sistemlerin birleşik antimikrobiyal, antioksidan ve yara iyileştirme yetenekleri sergilediği bildirilmiştir; bu da bu bitki kaynaklı malzemenin çok fonksiyonlu doğasını daha da destekler¹⁹. Ancak, Aloe vera'nın biyolojik performansı, kullanılan bitki fraksiyonu, ekstraksiyon prosedürü, konsantrasyon, kullanım koşulları, jelin tazeliği ve test edilen preparatın sadece iç jel içerip içermediği veya lateksle ilişkili^{bileşenler içerip içermediği gibi birkaç metodolojik değişkenden etkilenir. 2,20}. Bu faktörler özellikle önemlidir çünkü iç jel ve dış yaprak fraksiyonları hem bileşim hem de toksikolojik profil^{açısından farklılık gösterir 20}.

Artan literatüre rağmen, önemli metodolojik boşluklar hâlâ mevcuttur. Birçok yayımlanmış çalışmada, antioksidan davranış, fizikokimyasal özellikler, mikrobiyolojik değerlendirme ve antimikrobiyal performans genellikle tek bir entegre iş akışı içinde değil, ayrı ayrı değerlendirilir. Ancak formülasyon odaklı araştırmalarda bu parametreler birbirleriyle yakından ilişkilidir. Bir preparat, olumlu antioksidan aktivite gösterebilir ancak yine de daha fazla deneysel geliştirme için uygun kabul edilebilmek için dikkatli mikrobiyolojik değerlendirme ve fizikokimyasal karakterizasyon gerektirebilir. Bu nedenle, redoks ile ilgili değerlendirme, pH değerlendirmesi, kültür bazlı, tanımlanmış koşullarda tespit edilmeyen büyüme testi ve ön antimikrobiyal taramayı birleştiren laboratuvar iş akışları, taze Aloe vera'nın erken aşama karakterizasyonu için daha pratik ve bilgilendirici bir temel sağlayabilir. formülasyonlar.

Buna göre, bu çalışma, pH özellikleri, toplam antioksidan kapasitesi, kültür bazlı tespit edilemez büyüme durumu ve disk difüzyonu ile niteliksel iki katlı tüp seyreltme ile ön antimikrobiyal tarama açısından farklı konsantrasyonlarda hazırlanan taze iç jel Aloe vera ekstraktı formülasyonlarını değerlendirmeyi amaçladı. Bu değerlendirmeleri tek bir deneysel iş akışına entegre ederek, çalışma, Aloe vera'nın ön karakterizasyonu için pratik bir temel yaklaşım sunmak üzere tasarlandı.-tamamlayıcı tıp araştırmaları için tasarlanmış formülasyonlar.

Protokol

1. Aloe vera hazırlanması. Ekstrakt ve seyreltme serisi

1. Oda sıcaklığında yetiştirilen bir aloe vera bitkisinin olgun yapraklarını hasat edin ve kalıntıları çıkarmak için akan suyun altında iyice durulayın.
2. Biyogüvenlik seviyesi 2 (BSL-2) bir dolapta, yaprak yüzeyini steril eldivenlerle %70 etanol ile dezenfekte edin. %70 etanol uygulandıktan sonra, yaprak yüzeyinin aseptik kesi yapılmadan önce en az 2 dakika tamamen hava kurumasına izin verin.
3. Steril bir skalpel kullanarak, yaprakın distal ucunu ve kenarlarını çıkarın, sarı lateks eksüdatının yaklaşık 30 dakika boyunca tamamen boşalmasına izin verin, ardından yaprağı boylamasına fileye yapın. Dikkatlice ayırın ve sadece şeffaf iç jeli toplayın, dış kabuk ve kalan lateks tabakasından kaçının.
4. Aloe vera iç jelini dikkatlice steril bir kaba aktarın ve yaklaşık 2.500 rpm'de (veya eşdeğer orta-yüksek girdap ayarı) aralıklı girdap ile yaklaşık 5-10 dakika boyunca homojenleştirin; işlem oda sıcaklığında gerçekleştirilin, ancak belirli cihaz için sıcaklık kontrolü gerekmiyorsa.
5. Aseptik koşullarda, steril damıtılmış su kullanılarak 5%, 10%, %15 ve %20 (w/v) oranlarında taze Aloe vera iç jel ekstraktı formülasyonları hazırlanır; örneğin, %5 (w/v) jeli 5 g jeli olarak 100 mL nihai hacme getirilerek hazırlayın ve kalan konsantrasyonları benzer şekilde ayarlayın.

2. pH ölçümü

1. Her ölçüm serisinden önce NIST izlenebilirliğine sahip standart pH 4.01, 7.00 ve 10.01 tampon çözeltileriyle üç noktalı pH ölçer kalibrasyonu gerçekleştirin.
2. Oda sıcaklığında (20–25 °C) her konsantrasyon için pH ölçün; Her yoğunlaşma başına en az üç teknik kopya kaydedin.

3. Toplam antioksidan kapasitesi (TAC) ölçümü

1. TAC ölçümü için Step 1'de hazırlanan Aloe vera. ekstrakt formülasyonlarını (%5, 10%, %15 ve %20) kullanın.
2. Analitik tutarlılığı sağlamak için tüm reaktifleri ve örnekleri analiz öncesi oda sıcaklığına (20–25 °C) getirin.
3. Testi başlatmadan önce otomatik biyokimyasal analizörü (Rel Assay, Türkiye) üreticinin standart çalışma prosedürlerine göre kalibre edin.
4. Erel yöntemine dayalı toplam antioksidan kapasite (TAC) reaktiflerini analizör reaktif bölmelerine yükleyin.
5. Aloe vera'yı pipetleyin. Örnekleri kalibre edilmiş mikropipetlerle uygun numune bardaklarına veya reaksiyon kuyularına çıkarın. (Örnek hacmi: 5 μL)
6. Üretici tarafından belirtilen reaktif hacimleri ve kuluçka ayarlarını takip ederek ABTS radikal katyon tabanlı yöntem için analizörün programlanmış protokolünü kullanarak TAC testi çalıştırılması.
7. Reaksiyonun otomatik olarak ilerlemesine izin verin; bu sırada örnekteki antioksidanlar renkli ABTS radikal kationunu azaltır ve bu da emilimde azalmaya yol açar.
8. TAC yöntemiyle tanımlanan dalga boyunda absorbans değişimini spektrofotometrik olarak ölçer. (Dalga boyu: 660 nm)
9. Analiz cihazının yazılımını kullanarak örnek absorbans değişikliklerini Trolox-eşdeğer kalibrasyon eğrisi ile karşılaştırarak toplam antioksidan kapasite değerlerini hesaplayın.
10. Ekspres TAC sonuçları, mmol Trolox eşdeğeri / L olarak birim ekstra hacmi başına elde edilir.
11. Analitik güvenilirliği sağlamak için tüm ölçümleri ikili olarak yapın.

4. Aloe vera'nın kültür temelli, algılanamayan büyüme değerlendirmesi. İç jel.

1. Her ekstrakttan 10 μL kan agar, eozin metilen mavi agar ve Sabouraud dekstroz agarına kalibre edilmiş bir halka (10 μL) (koloni sayımı yöntemi) kullanılarak aşılanın.
2. Kültür temelli, tespit edilmeyen büyüme değerlendirmesi için, kalibre edilmiş mikropipet kullanılarak standartlaştırılmış 50 μL aliquot'u aseptik olarak kan agar, eozin metilen mavi agar ve Sabouraud dekstroz agar plakalarına dağıtın ve steril, tek kullanımlık bir halka (10 μL) ile nazikçe yayılmış (Doğrudan damlama yöntemiyle kültür tabanlı üreme değerlendirmesi).
3. Kan agarı ve eozin metilen mavi agar plakalarını 37 °C'de aerobik olarak, Sabouraud dekstroz agar plakalarını ise 25–28 °C'de aerobik olarak inkübe edin, ardından 24, 48 ve 72 saatte plakaların büyüme açısından görsel olarak incelen. Her ortamdan bir tane inokulasyon yapılmamış plakayı paralel olarak negatif kontrol olarak inkubasyon yapın.

5. Aloe vera test karışımının antimikrobiyal aktivite değerlendirmesi

1. Steril koşullarda, %70 steril Aloe vera iç jel ekstraktını %30 N-asetil-L-sistein çözeltisi (%10 w/v steril suda) karıştırarak homojen bir test çözeltisi hazırlayın.
   NOT: Bu karışım, yapraktan kazınan jelin yüksek viskozitesini azaltır ve daha sıvı bir kıvam elde eder. Bu kompozit formülasyonu ön eleme karışımı olarak düşünün. Bu nedenle, antimikrobiyal bulguları her iki bileşenin birleşik aktivitesini yansıtacak şekilde yorumlayın.
2. Homojenleştirilmiş karışımı iyice girdabla vurarak düzgün bir çözelti elde edilene kadar.
3. Enterococcus faecalis ATCC 29212, Staphylococcus aureus ATCC 29213, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 ve Escherichia coli'nin önceden kriyokorunmuş standart bakteri stoklarını alt kültüre alın. ATCC 25922, -80 °C'de saklanır, standart kan agari (Gram-pozitif bakteriler için) ve standart eozin metilen mavi agar (Gram-negatif bakteriler için) üzerine yerleştirilir ve 37 °C'de 18-24 saat kuluçka yapılır.
4. Kuluçka sonunda, antimikrobiyal duyarlılık testi için standart aşı hazırlama önerilerine uygun olarak, yetiştirilen kolonilerden steril tuzlu su kullanılarak 0,5 McFarland bulanıklığına ayarlanmış bakteriyel süspansiyonlar^{hazırlanır.}
5. Mueller-Hinton agar plakalarını, her standartlaştırılmış bakteri süspansiyonla steril bir sürüntüyle eşit şekilde aşılayın.
6. Her steril 6 mm antimikrobiyal diske kalibre edilmiş bir mikropipet kullanarak 15 μL standart hacimde steril Aloe vera/NAC test karışımı uygulanır. Aynı yükleme hacmi, emilim süresi (en az 2 dakika) ve hava kurutma süresi (yaklaşık 5 dakika) tüm disklere uygulanarak prosedürel tutarlılığı sağlanmıştır. Bu hacim, bitki ekstraktı tabanlı disk difüzyon taramasında 6 mm diskler için pratik yükleme miktarı olarak seçildi ve tüm deneyler için sabit tutuldu.
7. Ekstraktla emdirilmiş diskleri, aşılanmış agar plakalarının yüzeyine steril forseps kullanarak yerleştirin.
8. Plakaları aerobik koşullarda 18–24 saat boyunca 37 °C'de kuluçka altına alın.
9. İnkubasyondan sonra, her inhibitör bölgesinin çapını, disk çapı da dahil olmak üzere, bir cetvel kullanarak en yakın milimetreye kadar elle ölçün. Deneyi tek bir tanımlayıcı ölçüm olarak gerçekleştirin, kaydedilen bölge çaplarını bireysel olarak gözlemlenmiş değerler olarak bildirin. Standart disk difüzyon okuma önerilerine göre plakaları görsel olarak inceleyerek^{ölçümler yapın 38}.
10. Mueller-Hinton çorbasında 70:30 (v/v) Aloe vera/NAC test karışımının iki kat seri seyreltmelerini (1/2, 1/4, 1/8 ve 1/16) hazırlayın.
11. Her tüpü steril salin içinde hazırlanmış 500 μL uygun 0.5 McFarland standartlaştırılmış bakteri süspansiyon ile aşılayın. Her referans suş için ayrı bir seyreltme serisi hazırlayın ve aşlanmış tüpleri aşağıda belirtilen koşullar altında inkübe edin.
12. Aşılanan tüpleri 37 °C'de 18–24 saat boyunca kuluçka edin.
13. Mikrobiyal büyümeyi bulanıklık ile bulanıklığa göre görsel olarak değerlendirin; testi resmi bir MIC belirlemesi olarak değil, niteliksel olarak yorumlayın.
14. Aloe vera/NAC ile emdirilmiş disklerle paralel olarak pozitif kontrol olarak siprofloxacin diski (5 μg) kullanın. Aynı pozitif kontrol diskini Enterococcus faecalis ATCC 29212, Staphylococcus aureus ATCC 29213, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 ve Escherichia coli ATCC 25922 için de uygulayarak disk difüzyon koşullarında hassasiyeti doğrulayın.
    NOT: BSL-2 koşullarında tüm mikrobiyolojik işlemleri gerçekleştirin ve kuluçkadan hemen sonra tüm bölge çapı ve bulanıklık gözlemlerini kaydederek sonraki betimleyici analiz için kaydedin. Bu protokol, A. vera'nın aseptik prepreslerini birleştirir.topikal ve tamamlayıcı ilaç kullanımı için bitki bazlı formülasyonların geliştirilmesini desteklemek amacıyla tamamlayıcı biyokimyasal ve mikrobiyolojik testlerle ekstrakt olarak hazırlanmıştır. Bu iş akışı rutin laboratuvarlar için pratik olacak şekilde tasarlanmıştır: pH ve redoks taraması (TAC), sterillik kültürü ve yaygın kullanılan iki antimikrobiyal test (disk difüzyonu ve tüp seyreltme) ile birlikte yapılabilir.

Sonuçlar

Aloe Vera'nın pH değerleri. Farklı konsantrasyonlarda ekstrakt

pH profili, konsantrasyonlar arasında monoton olmayan bir desen gösterdi. Ortalama pH değerleri sırasıyla %5, 10, %15 ve %20 formülasyonları için 6.47, 6.60, 6.26 ve 6.28 idi. Genel grup farklılıkları anlamlıydı (p = 0.024). %5 ve %10 formülasyonlar nispeten daha yüksek pH değerleri gösterirken, %15 ve %20 formülasyonları daha düşük pH değerlerinde (p < 0,05) kümelenmiş (<...

Tartışma

Mevcut çalışma, pH ölçümü, toplam antioksidan kapasitesi (TAC) analizi, kültür temelli tespit edilemeyen büyüme değerlendirmesi ve tanımlayıcı antimikrobiyal taramanın birleştirilmesiyle taze iç jel Aloe vera ekstraktı formülasyonlarının ön karakterizasyonu için entegre bir laboratuvar iş akışı sunmaktadır. Taze iç jel Aloe vera'nın artan konsantrasyonları daha yüksek TAC değerleriyle ilişkilendirilmişken, tanımlanmış laboratuvar koşullarında kısa süreli kültür izleme s...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
(-)80 C Deep Freezer	Thermofisher/USA	Örnek depolama	TSX40086A
Vortex	Thermofisher/USA	Örnek hazırlama	88882010
Blood Agar	RTA/Turkey	Kültür inokülasyonu	2001
Eosine Methilene Blue Agar	RTA/Turkey	Kültür inokülasyonu	2010
SDA Agar	RTA/Turkey	Kültür inokülasyonu	2036
Müller Hinton Agar	RTA/Turkey	Kültür inokülasyonu	2022
Müller Hinton Broth	RTA/Turkey	Kültür seyreltme	1018
Pipettes	Thermofisher/USA	Örnek hazırlama	4642090N
Hanna pH Meters	Hitachi/JAPAN	Örnek analizleri	HI2211-02
Rel Assay Plate Reader	Rel Assay(Turkey)	Örnek TAC analizleri	M201 (Smart Model)
TAC Kits	Rel Assay(Turkey)	Kit	RL0017