Beş aromalı Sophora flavescens enterik kaplı kapsüller Deneysel Kolit ve Feroptoz ile İlgili Değişiklikleri Hafifletiyor

Özet

Ülseratif kolitin fare modelinde, beş aromalı Sophora flavescens enterik kaplı kapsüller, kolon hasarını hafifletmiş ve oksidatif stresi, inflamatuar sitokin dengesizliğini, JAK2/STAT3 sinyallerini ve ferroptoz ile ilgili belirteçlerdeki değişiklikleri iyileştirmiştir.

Özet

Ülseratif kolit, etkili ve hedefli tedavi seçenekleri sınırlı olduğu ve oksidatif stres, inflamatuar sinyal ile düzenlenmiş hücre ölüm yolları mukoza hasarına katkıda bulunabileceği için yönetimi zordur. Bu çalışma, beş aromalı Sophora flavescens enterik kaplı kapsüllerin (FSEC) deneysel koliti hafifletip hafifletmediğini değerlendirdi ve oksidatif stres, iltihap ve ferroptoz belirteçlerindeki ilgili değişiklikleri inceledi. Ülseratif kolitin fare modeli, %2,5 dekstran sülfat sodyuma döngüsel maruziyeti ve tümör nekroz faktörü alfa meydan okuması ile oluşturuldu. Fareler, pozitif kontrol müdahalesi olarak düşük, orta veya yüksek dozlu FSEC veya TLR4 antagonisti CRX-526 ile tedavi edildi. Kolon histopatolojisi hematoksilin ve eozin boyama ile değerlendirildi. Serum süperoksit dismutaz, katalaz, glutation, miyeloperoksidaz ve Fe²⁺ seviyeleri biyokimyasal testlerle ölçüldü. Kolon dokusu sitokinleri enzimle bağlantılı immünosorbent testi ile nicelendirildi, JAK2 ve STAT3 ekspresyonları immünohistokimya ile değerlendirildi ve GPX4, FTH1 ve ACSL4 ekspresyonları western blotting ile analiz edildi. FSEC tedavisi, kolonik mukoza hasarını ve iltihap hücre infiltrasyonunu azalttı, antioksidan indekslerini artırdı ve miyeloperoksidaz seviyelerini azalttı. FSEC ayrıca TNF-α ve IL-1α seviyelerini düşürdü, IL-13 seviyelerini kısmen geri getirdi ve zayıf JAK2 ve STAT3 immünboyama ile ilişkilendirildi. Paralel olarak, FSEC ferroptozla ilişkili belirteç değişikliklerini iyileştirdi; bunlar arasında Fe²⁺ ve ACSL4 seviyelerinin azalması ve GPX4 ile FTH1 ekspresyonu artışı da vardı. Bu bulgular, FSEC'in en azından oksidatif stres durumunu iyileştirerek, inflamatuar sinyalleri hafiflettiği ve ferroptozla ilişkili işaretleyici profillerini geri getirerek farelerde deneysel ülseratif koliti hafiflettiğini göstermektedir.

Giriş

Ülseratif kolit (UC), öncelikle kolon ve rektal mukozayı etkileyen kronik bir inflamatuar bozukluktur ve mukoza iltihaplanma, ülserasyon ve bariyer^{fonksiyonunun 1,2,3} bozulmalarıyla karakterize edilir. Genetik duyarlılık, çevresel faktörler, epitel bariyer işlev bozukluğu ve bağışıklık düzensizliği UC patogenezinde rol oynamış olsa da, kalıcı mukozal hasarın altında yatan mekanizmalar tam olarak anlaşılmamıştır. Mevcut farmakolojik tedaviler, aminosalisilatlar, kortikosteroidler, immünsupresantlar ve biyolojik ajanlar dahil olmak üzere birçok hastada hastalık aktivitesini azaltabilir; Ancak, tedavinin kesilmesinden sonra nüks etme, yan etkiler, yüksek maliyet ve eksik terapötik yanıtlar nedeniyle klinik kullanımları sınırlı^{olabilir 3}.

Ferroptoz, lipid peroksidasyonu ve değişen demir metabolizmasıyla karakterize edilen demire bağımlı bir hücre ölümü biçimi olup, bağırsak iltihabı ve UC ile ilişkili epitel ^hasarı 4,5,6,7,8 ile giderek ilişkilendirilmektedir. Paralel olarak, geleneksel Çin tıbbı formülasyonları, çoklu hedefli terapötik potansiyelleri nedeniyle UC tedavisinde tamamlayıcı yaklaşımlar olarak giderek daha fazla ilgi^çekmiştir9.

Beş aromalı Sophora flavescens enterik kapsulları (FSEC), geleneksel Çin tıbbı uygulamalarında hafif ila orta derecede aktif UC tedavisinde klinik olarak kullanılır. Önceki çalışmalar, FSEC'in çok bileşenli ve çok hedefli mekanizmalarla UC semptomlarını iyileştirebileceğini^{göstermektedir 10}. Ancak, FSEC'in oksidatif stres, inflamatuar sinyaller, JAK2/STAT3 aktivitesi ve deneysel UC'deki ferroptoz ile ilişkili değişiklikler üzerindeki etkileri hâlâ yeterince karakterize edilmemiştir.

Oksidatif stres ve inflamatuar sinyaller, UC'de bağırsak mukoza hasarına önemli katkı sağlamaktadır. Reaktif oksijen türlerinin aşırı üretimi epitel bütünlüğünü bozabilir, iltihaplayıcı hücre infiltrasyonunu teşvik edebilir ve antioksidan savunma sistemlerini zayıflatabilir. JAK2/STAT3 sinyalizasyonu gibi sitokin aracılı yollar, inflamatuar amplifikasyona ve doku hasarına^{katkıda bulunur} 11,12,13,14,15. Ayrıca, oksidatif stres ve ferroptoz, antioksidan savunmalardaki değişiklikler, demir metabolizması ve lipid peroksidasyonu 16,17,18,19,20 ile yakından bağlantılıdır. Bu nedenle, oksidatif stres indekslerinin, inflamatuar sitokinlerin, JAK2/STAT3 sinyallerinin ve ferroptozla ilişkili belirteçlerin eşzamanlı değerlendirilmesi, deneysel UC'de mukoza hasarı ve terapötik yanıtlar hakkında daha kapsamlı bir anlayış sağlayabilir.

Mevcut çalışmada, düşük, orta ve yüksek dozlu FSEC'in etkilerini değerlendirmek için döngüsel dekstran sülfat sodyum ve tümör nekroz faktörü alfa-zorluklu fare modeli kullanılmıştır. Bu tasarımın temel metodolojik gücü, histopatolojik değerlendirmenin serum oksidatif stres indeksleri, kolon dokusu sitokinleri, JAK2/STAT3 immünohistokimyası ve ferroptozla ilişkili proteinlerin western blot analizi ölçümleriyle tek bir deneysel çerçevede entegre edilmesidir. Bu yaklaşım, FSEC'in deneysel UC'yi hafifletip hafifletmediğini belirlemek ve oksidatif stres, inflamatuar sinyal ve ferroptoz ile ilişkili belirtici profillerindeki değişiklikleri karakterize etmek için kullanıldı. Genel deneysel tasarım ve analitik iş akışı Şekil 1'de özetlenmiştir.

Şekil 1: Fare modelinin deneysel iş akışı ve sonraki analizler. Kronik deneysel ülseratif kolit, deneysel protokolün son haftasında %2,5 dekstran sülfat sodyum (DSS) ile tümör nekroz faktörü alfa (TNF-α) mücadelesi ile siklik maruziyetle indüklenmiştir. Fareler normal kontrol, model, düşük dozlu FSEC, orta dozlu FSEC, yüksek dozlu FSEC ve CRX-526 pozitif kontrol gruplarına atandı. FSEC, 108, 216 veya 432 mg/kg vücut ağırlığı dozlarda intragastrik gavaj ile uygulandı. CRX-526 pozitif kontrol müdahalesi olarak kullanıldı. Son tedaviden sonra, histopatolojik değerlendirme, oksidatif stresle ilgili biyokimyasal testler, ELISA ile sitokin analizi, immünohistokimya ve western blot analizi için örnekler toplandı. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Protokol

Tüm hayvan prosedürleri Nanchang Tıp Fakültesi Hayvan Refahı ve Etik Komitesi tarafından incelenip onaylandı (onay no. NY2SC 20250407). Tüm deneyler, laboratuvar hayvanlarının bakımı ve kullanımı için kurumsal yönergelere uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Kimyasallar, reaktifler ve ekipmanlar Malzeme Tablosu'nda listelenmiştir.

1. Hayvanlar ve tedavi

Bu çalışmada erkek C57BL/6J fareleri (vahşi tipli, 8 haftalık) kullanıldı. Hayvanlar, kontrol edilen sıcaklık ve nem koşullarında standart laboratuvar koşullarında barındırıldı ve ücretsiz yiyecek ve suya erişim sağlandı. Aklimatizasyonun ardından, içme suyuna üç döngü boyunca %2,5 dekstran sülfat sodyum (DSS) verilerek kronik kolit indüklenmiştir. Her döngü 1 hafta sürdü ve düzenli içme suyu ile 2 haftalık bir iyileşme dönemi ile ayrıldı. Deneysel protokolün son haftasında, model ve tedavi gruplarındaki farelere tümör nekroz faktörü alfa (TNF-α; günde iki kez 10 μg/100 g vücut ağırlığı) verildi ve bu da kolonik hasarı daha da kötüleştirdi. Normal kontrol fareleri sadece araç aldı ve DSS veya TNF-α'ye maruz kalmadı.

Beş aromalı Sophora flavescens enterik kapsulları (FSEC), ticari olarak mevcut ve onaylı Çin patentli ilaç olarak kullanıldı. Formülasyon Sophora flavescens Aiton, Sanguisorba officinalis L., Indigo naturalis, Bletilla striata (Thunb.) içeriyordu. Rchb.f. ve Glycyrrhiza uralensis Fisch. ex DC. Aynı üretim partisinden kapsül içerikleri tartıldı ve steril damıtılmış suda askıya alınarak taze dozlama süspansiyonları hazırlandı. Her gavajdan önce süspansiyonlar iyice karıştırıldı ve böylece eşit dağılım sağlandı. Ürün kaynağı, onay numarası, ilaç spesifikasyonları ve kalite kontrol bilgileri Malzeme Tablosu'nda yer almaktadır. Ürün kalitesi, kapsül spesifikasyonları, görünüm, enterik salınım ve ayrışma gereksinimleri, mikrobiyal sınır gereksinimleri ve kalite kontrol standartları dahil olmak üzere üretici tarafından sağlanan bilgilere uygun olarak tanımlanmıştır.

FSEC ile tedavi edilen fareler, modellemenin son haftasında günde iki kez intragastrik gaaj ile düşük doz FSEC (108 mg/kg vücut ağırlığı), orta doz FSEC (216 mg/kg vücut ağırlığı) veya yüksek doz FSEC (432 mg/kg vücut ağırlığı) aldı. Doz seviyeleri, onaylanmış klinik doz, vücut-yüzey alanı dönüşümü ve ön doz aralığı değerlendirmelerine göre seçildi. Araçla tedavi edilen fareler de aynı miktarda steril damıtılmış su intragastrik garajla almıştır.

Pozitif kontrol grubu, modellemenin son haftasında kuyruk damarı enjeksiyonu yoluyla TLR4 antagonisti CRX-526'yı 1 mg/kg ile aldı. CRX-526, referans anti-inflamatuar müdahale olarak kullanıldı. Çalışmada altı grup (n = 6 grup başına 6) yer aldı: normal kontrol, model, düşük dozlu FSEC, orta dozlu FSEC, yüksek dozlu FSEC ve CRX-526 pozitif kontrol grupları. Fareler, son çalışma tedavisinden 24 saat sonra kurban edildi. Ötenazi, laboratuvar hayvanlarının bakımı ve kullanımı için kurumsal yönergelere uygun olarak, izofluran anestezi altında servikal dislokasyon ile gerçekleştirilmiştir.

2. Hematoksilin ve eozin boyama ile histolojik değerlendirme

Kolon dokuları, anüs ile ileosekal bölge arasındaki makroskopik olarak en çok etkilenen bölgeden toplandı. Her fare için, bu bölgeden bir temsilci kolon segmenti %10 nötr tamponlu formalin ile sabitlenmiş, parafine gömülü, kesitlenmiş ve hematoksilin ile eosin ile boyanmıştır. Histolojik değerlendirme için her hayvandan en az üç bölüm hazırlanmış ve her bölüm için örtüşmeyen beş yüksek güçlü alan incelenmiştir. Alanlar, yırtık, katlanmış veya kötü lekelenmiş alanlardan kaçınarak kesit bir kenardan diğerine taranarak rastgele seçildi. Histopatolojik değişiklikler, mukozal ülserasyon, bez yok oluşu, tıkanıklık ve iltihaplayıcı hücre infiltrasyonu gibi histopatolojik değişiklikler ışık mikroskopisi altında değerlendirildi.

3. Oksidatif stresle ilişkili biyokimyasal göstergelerin ölçümü

Kan örnekleri (0,5 mL) antikoagülan içeren tüplere toplandı ve yaklaşık 1160 × g sıcaklığında 4 °C'de 10 dakika boyunca santrifüj edildi. Süpernatant, üreticilerin talimatlarına göre Malzeme Tablosu'nda listelenen ilgili test kitleri kullanılarak serum demiri, süperoksit dismutaz (SOD), glutatyon (GSH), katalaz (CAT) ve miyeloperoksidaz (MPO) seviyelerini ölçmek için kullanıldı.

4. JAK2 ve STAT3'ün immünohistokimyasal analizi

Parafinle gömülü kolon dokusu kesitleri (5 μm) ksilen içinde deparafinize edildi, derecelendirilmiş etanol serisi ile yeniden hidratlandırıldı ve fosfatla tamponlanmış tuzlu suyla durulandı. Antijen toplama, mikrodalga ısıtma kullanılarak sitrat tamponunda (pH 6.0) gerçekleştirildi. Oda sıcaklığına soğuduktan sonra, endojen peroksidaz aktivitesi %3 H₂O₂ ile 10 dakika boyunca engellendi. Bölümler, oda sıcaklığında %5 normal keçi serumu ile 30 dakika boyunca bloklandı ve gece boyunca 4 °C'de JAK2 ve STAT3'e karşı birincil antikorlarla inkübe edildi; sırasıyla 1:50 ve 1:80 seyreltmelerde. Fosfatla tamponlu tuzlu yıkamaların ardından, bölümler üreticinin talimatlarına göre yaban turpu peroksidaz ile konjuge edilmiş ikincil antikor ile kuluçka yapıldı. İmmünoreaktif sinyaller 3,3′-diaminobenzidin kullanılarak görselleştirildi ve çekirdekler hematoksilin ile karşı boyandı. Bölümler susuz bırakıldı, monte edildi ve ışık mikroskobu altında incelendi.

5. Enzimle bağlantılı immünosorbent testi ile sitokin nicelenmesi

Kolon dokuları 2–3^{mm 3} parçaya kesildi, fosfatla tamponlanmış tuzlu sönümde buz üzerinde homojenleştirildi ve 12.000 × g sıcaklıkta 4 °C'de 15 dakika boyunca santrifüjlendi. Süpernatant toplandı ve TNF-α, IL-1α ve IL-13 konsantrasyonları, üreticilerin talimatlarına uygun olarak ilgili ELISA kitleriyle ölçüldü. Absorbans değerleri mikroplaka okuyucu kullanılarak ölçüldü ve sitokin konsantrasyonları her test için oluşturulan standart eğrilerden hesaplandı.

6. Ferropozla ilişkili proteinlerin Western blot analizi

Kolon dokularından toplam proteinler çıkarıldı ve protein konsantrasyonları bisinkoninik asit testi kullanılarak belirlendi. Her örnekten eşit miktarda protein SDS-PAGE ile ayrılarak membranlara aktarıldı. Oda sıcaklığında %5 yağsız süt veya eşdeğer bir bloklayıcı tampon ile 2 saat bloke edildikten sonra, membranlar Malzemeler Tablosu'nda listelenen GPX4, FTH1, ACSL4 ve yükleme kontrol proteini β-aktine karşı birincil antikorlarla 4 °C'de gece boyunca kuluçka geçirildi. Ertesi gün, zarlar oda sıcaklığında 2 saat boyunca karşılık gelen yaban turpu peroksidaz ile konjuge ikincil antikor ile yıkanıp kuluçka altına alındı. Protein bantları kemilyünesan bir alt alt yüzeyle görselleştirilmiş ve kemilyüminsans görüntüleme sistemi kullanılarak görüntülenmiştir. Bant yoğunlukları densitometri yazılımı kullanılarak nicelendirildi. GPX4, FTH1 ve ACSL4 ekspresyon seviyeleri β-aktine normalleştirildi ve istatistiksel analiz için göreceli protein ekspresyonu hesaplandı.

7. İstatistiksel analiz

Veriler ortalama ± standart sapma (SD) olarak sunulur. Birden fazla grup arasında karşılaştırmalar, varyansın tek yönlü analiziyle yapıldı, ardından normallik ve varyans homojenliği varsayımları sağlandığında Bonferroni'nin sonradan yaptığı test yapıldı. P < 0.05 değeri istatistiksel olarak anlamlı olarak kabul edildi.

Sonuçlar

FSEC, ülseratif kolitli farelerde histopatolojik hasarı hafifleter ve oksidatif stresle ilişkili indeksleri iyileştirir
Şekil 2'de gösterildiği gibi, normal kontrol grubu sağlam kolonik mukozal mimari, iyi organize bezler ve minimal inflamatuar hücre infiltrasyonu sergilemiştir. Buna karşılık, model grubunda epitel bozulması, mukoza ülserasyonu, bez yok oluşu, tıkanıklık ve belirgin iltihap hücre infiltrasyonu ile karakterize edilen şidde...

Tartışma

Bu çalışma, deneysel ülseratif kolit (UC) fare modelinde beş aromalı Sophora flavescens enterik kapsüllerinin (FSEC) etkilerini inceledi ve oksidatif-stresle ilişkili indeksler, inflamatuar sitokinler, JAK2/STAT3 sinyalizasyonu ve ferroptoz ile ilgili belirteçlerdeki değişiklikleri değerlendirdi. Ana bulgular, FSEC tedavisinin kolon histopatolojik hasarını hafifletti, antioksidanla ilişkili biyokimyasal indeksleri iyileştirdiği, TNF-α ve IL-1α seviyelerini azalttığı, IL-13 seviy...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
3,3′-Diaminobenzidine (DAB) substrate kit	ZSGB-BIO	ZLI-9018	HRP tabanlı immünohistokimya için kromojenik substrat.
ACSL4 antibody (F-4)	Santa Cruz Biotechnology	sc-365230	Western blot için fare monoklonal birincil antikoru; 1:500 olarak kullanılır; RRID: AB_10842002.
Antijen geri kazanım çözeltisi, sitrat tamponu, pH 6.0	Beyotime Biotechnology	P0081	Parafin kesit immünohistokimya için ısı ile indüklenen epitop geri kazanım tamponu.
BCA protein ölçüm kiti	Beyotime Biotechnology	P0012	Western blot öncesi protein niceliği.
C57BL/6J fareleri	Fujian Anburui Biotechnology Co., Ltd.	N/A	8 haftalık erkek SPF fareleri; sunulan etik onay belgeleriyle tutarlı hayvan kaynağı.
Kataliz (CAT) ölçüm kiti	Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute	A007-1-1	Serum CAT aktivite ölçümü için kolorimetrik kit.
ChemiDoc XRS+ görüntüleme sistemi	Bio-Rad Laboratories	1708265	Western blot tespiti için kimilüminesans görüntüleme sistemi.
CRX-526	TargetMol	T27090	Pozitif kontrol müdahalesi olarak kullanılan TLR4 antagonisti; CAS no. 245515-64-4.
Dekstran sülfat sodyum tuzu (DSS), kolit derecesi	MP Biomedicals	160110	DSS, kolit derecesi, 36.000–50.000 Da moleküler ağırlığı; içme suyunda %2,5 olarak kullanılır.
ECL kimilüminesan substrat	Bio-Rad Laboratories	1705061	HRP tabanlı western blot sinyal tespiti için Clarity Western ECL substratı.
ELISA kiti, fare IL-13	Abcam	ab219634	Fare IL-13 niceliği için kolorimetrik sandviç ELISA kiti; 450 nm okuma.
ELISA kiti, fare IL-1α	Abcam	ab199076	Fare IL-1α niceliği için kolorimetrik sandviç ELISA kiti; 450 nm okuma.
ELISA kiti, fare TNF-α	Abcam	ab208348	Fare TNF-α niceliği için kolorimetrik sandviç ELISA kiti; 450 nm okuma.
Etanol, mutlak	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	10009218	Dokunun işlenmesi, dehidrasyonu ve reaktif hazırlığı için kullanılır.
Demir iyon (Fe2+) ölçüm kiti	Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute	A039-2-1	Serum veya doku örneklerinde Fe2+ ölçümü için kolorimetrik kit.
Beş lezzetli Sophora flavescens enterik kaplı kapsüller	Beijing Zhonghui Pharmaceutical Co., Ltd.	NMPA onay no. Z20150002	Çin patent ilacı; 0.4 g/kapsül; formülasyon Sophora flavescens Aiton, Sanguisorba officinalis L., Indigo naturalis, Bletilla striata (Thunb.) Rchb.f. ve Glycyrrhiza uralensis Fisch. ex DC. içerir; ilaç özellikleri YBZ00152015
Glutation (GSH) ölçüm kiti	Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute	A006-2-1	Serum GSH ölçümü için indirgenmiş glutation ölçüm kiti.
GPX4 antikoru (E-12)	Santa Cruz Biotechnology	sc-166570	Western blot için fare monoklonal birincil antikoru; 1:500 olarak kullanılır; RRID: tedarikçi veri sayfasında listelenmemiştir.
Hematoksilin ve eozin boyama kiti	Solarbio	G1120	Parafin gömülü kolon doku kesitlerinin H&E boyaması.
At nalı yanı sıranın fare anti-IgG'sine bağlı horseradish peroksidaz	Santa Cruz Biotechnology	sc-2005	Western blot için ikincil antikor; 1:50.000 olarak kullanılır; RRID: AB_631736.
ImageJ yazılımı	National Institutes of Health	Sürüm 1.54	Western blot bant niceliği için görüntü analizi ve densitometre yazılımı.
İmmünohistokimya tespit kiti	ZSGB-BIO	PV-9018	Parafin kesit immünohistokimya için polimer tabanlı HRP tespit kiti.
JAK2 antikoru (D2E12)	Cell Signaling Technology	3230	Parafin kesitlerinde JAK2 immünohistokimyası için tavuk monoklonal birincil antikoru; RRID: AB_2128522.
Mikroplak okuyucu	BioTek Instruments	Synergy H1	450 nm'de ELISA absorbans ölçümü için plak okuyucu.
Miyeloperoksidaz (MPO) aktivite ölçüm kiti	Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute	A044-1-1	Serum MPO aktivite ölçümü için kolorimetrik kit.
Nötr tamponlu formalin, %10	Sigma-Aldrich	HT501128	Kolon dokusunun parafin gömülmeden önce fiksasyonu.
Normal keçi serumu	Solarbio	SL038	İmmünohistokimya için blokaj reaktifi.
Parafin	Leica Biosystems	39601006	Kolon dokusu işleme için gömme ortamı.
Fosfat tamponlu salin (PBS)	Solarbio	P1020	Dokunun homojenizasyonu, yıkanması ve immünosüsleme prosedürleri için tampon.
PVDF membran	MilliporeSigma	IPVH00010	Western blot için protein transfer membranı.
Rekombinant fare TNF-α proteini	R&D Systems	410-MT	Son hafta enflamatuar meydan okumada kullanılan rekombinant fare TNF-α.
SDS-PAGE ve transfer sistemi	Bio-Rad Laboratories	1658004	SDS-PAGE ve western blot transfer iş akışı için Mini-PROTEAN Tetra sistemi.
SPSS Statistics yazılımı	IBM	Sürüm 24.0	Tek yönlü ANOVA ve Bonferro