Yöntem makalesi

Taze pankreas dokusundan kemik iliği mezenkimal kök hücresinden türetilen adacığığı organoid-benzeri yapıların oluşturulması

DOI:

10.3791/70717

⸱

5 Haziran 2026

 ,  , 
1Department of Histology and Embryology, School of Basic Medicine Science, Guangxi Medical University, 2Department of Surgical Nursing, Nursing College of Guangxi Medical University, 3Department of Human Anatomy, School of Basic Medical Sciences, Guangxi Medical University, 4Key Laboratory of Human Development and Disease Research, Education Department of Guangxi Zhuang Autonomous Region, Guangxi Medical University

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, kemik iliği mezenkimal kök hücrelerini (BMSC) pankreas adacığı organoidi benzeri yapılara ayırmak için domuz pankreas pankreas dokusu lizatı kullanılarak bir protokol sunuyoruz. Organoid benzeri yapılar 22 gün sonra oluşur. Bu basit ve maliyet etkin yöntem, in vitro çalışmalar ve ilaç taraması için pankreas adacığına morfolojik olarak benzer yapılar üretir.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dünya genelinde yaygın bir kronik hastalık olan diyabet (DM), vücutta glikoz dengesinin bozulmasıyla işaretlenir. Tip 1 diyabet hastasında (T1DM), otoimmün yanıtlar pankreas β hücrelerini tamamen yok eder ve bu da toplam insülin yetersizliğine yol açar. Bu duruma sahip hastalar ömür boyu ek insülin tedavisine ihtiyaç duyar. Mevcut çalışma, kemik iliği mezenkimal kök hücrelerinden (BMSC) pankreas adacığı organoidi benzeri yapılar oluşturmak için güvenilir ve ekonomik bir kültür platformu oluşturmayı amaçlamaktadır. Bu platform, nakil için donör adacığı eksikliğini hafifletmekle kalmaz, aynı zamanda diyabetle ilgili araştırmalar için in vitro bir model olarak hizmet eder.

Domuz pankreas dokusu lizatının hazırlanma süreci optimize edilerek (12.000 rpm'de 30 dakika boyunca 4 °C'de santrifüj, ardından sterilizasyon için 0,22 μm filtrasyon), BMSC'ler pankreas adacığı organoidi benzeri yapılara başarıyla farklılaşarak indüksiyona getirildi. Morfolojik doğrulama, yalnızca indüklenmiş BMSC'lerin kompakt, dolgun ve son derece şeffaf adacık benzeri agregalar oluşturduğunu, indüklenmemiş BMSC'lerin ise anlamlı vakuolizasyon ve azalmış şeffaflık sergilediğini doğruladı.

Dinamik izleme, hücre agregalarının (50–100 μm çapında) kültürün 16. gününde oluştuğunu ve 22. güne kadar kapsül benzeri yapılara (çapı 200–300 μm) dönüştüğünü gösterdi. Bu yöntem kullanımı basit, maliyet etkilidir ve karmaşık ekipman gerektirmez. Ortaya çıkan organoidler, pankreas adacığına morfolojik olarak benzer olup, in vitro çalışmalar ve ilgili ilaç taraması için bir araç sağlar.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Üç boyutlu (3D) in vitro model sistemleri olarak, pankreas adacığı organoidi benzeri yapılar, diyabet araştırmalarında ve rejeneratif tıpta hayati araçlar olarak ortaya çıkmıştır; çünkü çok hücreli yapıyı ve mekansal yapıyı doğal pankreasadacıklarının yapısını yakından taklit edebilmektedir 1. Bu tür modeller, sadece adacığı gelişim biyolojisini ve diyabetin patolojik mekanizmalarını anlamak için benzersiz bir platformsağlamakla kalmaz 2,3 aynı zamanda hücre replasman tedavileri ve ilaç tarama sistemlerinin geliştirilmesini destekler4. Diyabetin küresel yaygınlığı artmaya devam ederken—özellikle tip 1 diyabette geri döndürülemez β hücre hasarının neden olduğu mutlak insülin eksikliği—geleneksel insülin replasman tedavisi semptomları kontrol edebilir ancak hastalığı iyileştiremez. Bu arada, adacığı nakli ciddi bir bağışçı eksikliğiyle karşı karşıya, ölçeklenebilir alternatif adacik kaynaklarının geliştirilmesini acil bir öncelikhaline getiriyor 1,5. Pluripotent kök hücrelerin veya yetişkin kök hücrelerin yönlendirilmiş farklılaşma potansiyelinden yararlanarak, pankreas adacığı organoidi benzeri teknoloji bu sınırlamayıgidermeye yardımcı olabilir 6,7,8.

Son yıllarda, insan embriyonik kök hücreleri (hESC'ler) ve indüklenmiş pluripotent kök hücreler (iPSC'ler)9 temelli pankreas adacık organoidi benzeri kültür sistemlerinde önemli ilerlemeler kaydedilmiştir. Birçok çalışma, indüksiyon protokollerini ve kültür koşullarını optimize ederek kök hücrelerin glikoza duyarlı insülin salgılanma fonksiyonlarına sahip adacık benzeri hücrelereayrılabileceğini doğrulamıştır 10. Kimyasal yeniden programlama teknolojisindeki atılımlar, genetik manipülasyon olmadan hiPSC'lerin üretilmesini mümkün kılmış ve translasyonpotansiyelini artırmıştır 11. Kültür sistemleri açısından, 3B kültür, belirli ekstrasellüler matriks ve büyüme faktörü kombinasyonlarıyla birleştiğinde, adacığı öncü hücrelerin α, β ve δ hücrelerinden oluşan organoid yapılara kendi kendini organize etmesiniteşvik edebilir 12. Ancak mevcut teknolojiler, istikrarsız farklılaşma verimliliği, yetersiz fonksiyonel olgunluk ve damar ağları ile bağışıklık mikroçevresinin eksikliği gibi birçok zorlukla karşı karşıyadır—bunlar daha geniş uygulamayı kısıtlayan temel sınırlayıcıfaktörler 13 .

Pankreas adacığı organoidi benzeri yapı araştırmalarındaki ilerlemelere rağmen, bu alandaki birkaç kritik bilimsel sorun hâlâ elealınmamış 14. Birincisi, standart organoid tanımlarının ve yapım prosedürlerinin eksikliği, farklı laboratuvarlar arasında sonuçları doğrudan karşılaştırmayızorlaştırıyor 15. İkinci olarak, mevcut kültür sistemleri, doğal pankreas adaciklerinin karmaşık hücresel bileşimini ve hassas mekansal düzenini tam olarak kopyalayamaz16. Üçüncüsü, uzun vadeli organoid kültüründe fonksiyonel stabilite ve nakil sonrası hayatta kalma gibi temel sorunlar yeterince tanımlanmamaktadır17. Ayrıca, mevcut protokollerin çoğu hâlâ hayvan kaynaklı matriks malzemelerine dayanır; bu malzemeler tanımlanmamış bileşim ve büyük partiler arası varyasyonlarla klinik uygulamalar için kalite kontrolünü engeller18. Bu bilgi ve teknik boşluklar, pankreas adacığı organoidi benzeri yapıların temel araştırmadan klinik uygulamaya geçişini ciddi şekilde engellemektedir.

Bu protokol, kemik iliği mezenkimal kök hücreleri (BMSC) kullanılarak pankreas adacığı organoidi benzeri yapılar üretmek için stabil, uygun fiyatlı ve tekrarlanabilir bir yaklaşım oluşturmak üzere tasarlanmıştır. Yerleşik yöntem, laboratuvar deneysel araştırmaları ve preklinik ilaç tarama uygulamaları için tasarlanmıştır. BMSC kaynaklı adacığı farklılaştırma için mevcut stratejiler, aşırı maliyetler, tutarsız operasyonel standartlar ve sınırlı uygulama gibi birçok sınırlamaya sahiptir. Mevcut indüksiyon sistemlerinin çoğu, pahalı rekombinant sitokinler, profesyonel kültür matrisleri ve yüksek hassasiyetli kültür cihazlarına dayanır ve bu da yaygın kullanımlarını büyük ölçüde kısıtlar. Bu eksiklikleri çözmek için mevcut protokol, çekirdek indüksiyon faktörü olarak domuz pankreas dokusu lizatını benimsemektedir. Bu optimize edilmiş ve basitleştirilmiş kültür stratejisi, BMSC'lerin sadece rutin laboratuvar ekipmanları ve koşullarıyla adacık benzeri yapılara verimli şekilde ayırt edilmesini sağlar.

hESC, iPSC veya yüksek maliyetli büyüme faktörü kokteyllerine dayanan geleneksel yöntemlerle karşılaştırıldığında, mevcut yöntem birkaç belirgin pratik avantaj sunmaktadır. Pahalı reaktifler ve karmaşık kültür kurulumlarına olan ihtiyacı ortadan kaldırır, deneysel maliyetleri azaltır ve minimum partiler arası değişkenlikle tutarlı sonuçlarsağlar 10,11,12,13. Ksenojenik matriks tabanlı sistemlerin aksine, bu protokol basitleştirilmiş bir doku lizatı kullanır ve laboratuvarlar arasında deneysel kontrol edilebilirliği ve tekrarlanabilirliğiartırır 15,16,17,18. Ayrıca, BMSC'ler kolayca erişilebilir, kültürde stabil ve pluripotent kök hücrelerle ilgili etik kısıtlamalardan arınmıştır; bu da bu yaklaşımı rutin laboratuvar kullanımı için özellikle uygun kılmaktadır.

Mevcut araştırma yaklaşımları pankreas organoid modellemesi alanında kutuplaşmıştır: klinik dönüşüm için gelişmiş organoid platformlar maliyetli ve teknik olarak karmaşıktır, basitleştirilmiş alternatif modeller ise derinlemesine fonksiyonel analizi destekleyemez. Bu çalışmada önerilen protokol, standartlaştırılmış, ara teknik bir şema sunarak bu araştırma boşluğunu kapatır. Bu yaklaşım, pankreas adacığının temel fizyolojik özelliklerini korur ve geleneksel temel laboratuvar ortamlarıyla tamamen uyumludur. Özellikle rutin hücre kültürü altyapısına sahip ancak profesyonel kök hücre kültürü platformlarından yoksun ekipler için adacığın gelişim mekanizmaları, diyabet hastalığı modellemesi ve ön ilaç adayı değerlendirmesi üzerine odaklanan araştırmacılar için pratik bir araç olarak hizmet vermektedir. Bu yöntem, belirli ileri araştırmalar için tam damarlanmış veya immünolojik olarak yetkin organoidler üretemese de, ön deneysel tarama, mekanik keşif ve adacığığı biyolojik araştırmalarında akademik eğitim için oldukça uygundur.

Bu çalışma, pankreas adacığı organoidi benzeri yapılar için ekonomik ve standartlaştırılmış bir kültür sistemi inşa etmeye odaklanmakta olup, diyabetle ilgili çalışmalar için güvenilir üç boyutlu bir araştırma modeli sunmayı amaçlamaktadır. Bu araştırma, çeşitli indüksiyon rejimlerinin ve kültür ortamlarının organoid oluşum verimliliği ve morfolojik özellikleri nasıl etkilediğini sistematik olarak analiz ederek, bu alandaki ilerlemeyi engelleyen büyük teknik engelleri aşmayı amaçlamaktadır. Temel araştırma hedefleri üç temel unsuru kapsar: gelişmiş aletler olmadan sıradan temel laboratuvarlara uygulanabilir evrensel bir kültür protokolü oluşturmak, organoid kalitesini değerlendirmek için nicel değerlendirme standartları oluşturmak ve organoidlerin uzun vadeli kuluçka sırasında morfolojik ve fonksiyonel stabilitesini sürdürmek için kültür stratejilerini optimize etmek. Bu çalışmanın bulguları, in vitro deneysel araştırmalar için sağlam teknik destek sağlarken, adacığı gelişim mekanizmaları ve hipoglisemik ilaçların taraması üzerine pratik ve güvenilir bir model inşa eder.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tüm deneysel prosedürler, Guangxi Tıp Üniversitesi Etik Komitesi tarafından onaylanan laboratuvar hayvan refahı yönergelerine (Onay No.: SYXK 2014-0003) uydu ve Uluslararası Tıp Bilimleri Konseyi (CIOMS) tarafından formüle edilen Hayvanları İlgili Biyomedikal Araştırmalar İçin Uluslararası Rehber İlkeler'de belirtilen hayvan bakımı ve kullanım etik kodlarına uydu.

Tüm doku işleme ve reaktif hazırlama işlemleri, kontaminasyonu önlemek için Sınıf II biyogüvenlik kabininde yapılmalıdır. Taze doku işleme ve pankreas adacığı benzeri organoid benzeri yapı indüktör hazırlığını tamamlamak için en az 8 saat bekleyin. Tüm örnekleri ve reaktifleri deney boyunca buz üzerinde tutun.

1. Deneysel hazırlık

  1. 7 günlük Sprague Dawley (SD) emziren sıçanları servikal dislokasyon yoluyla ötenazi yapın. Ev domuzlarını 20 mg/kg dozda damar içi pentobarbital sodyum enjeksiyonuyla anestezi yapın ve pedal çekilme refleksinin ve stabil solunum hızının ortadan kalkmasıyla yeterli anestezi doğrulanın.
  2. Domuz pankreas dokusunu steril koşullarda Sınıf II biyogüvenlik dolabında işleyin. Taze domuz pankreas dokusunu toplandıktan sonra 24 saat içinde işleyin. Toplanan doku örneklerini tam DMEM ortamında 4 °C sıcaklıkta ( Tablo 1'de gösterildiği gibi) depolayın ve işlemeye kadar.
  3. Soğutmalı santrifüjü 4 °C'ye önceden ayarlayın ve hücre hazırlıklarına zarar vermemek için düşük hızlı santrifüj modunu seçin. 1000 μL pipet uçları, 200 μL pipet uçları ve 50 mL santrifüj tüplerini deneyde kullanılana kadar −20 °C sıcaklıkta dondurucuda saklayın. Yeterli 0,22 μm steril filtre ve 20 mL tek kullanımlık steril şırıngalar hazırlayın. Oftalmik makas makineleri, kavisli forsepsler, cam Petri kapları ve ampulları yüksek sıcaklıkta otoklavlama ile sterilize edin (121 °C, 20 dakika).
  4. Deneysel kullanımdan önce, tam hazırlanmış pankreas dokusu lizatını alümin. Optimal deneysel tutarlılık için, homojenatın 100 μL porsetini ayrı depolama ve sonraki kullanım için 1,5 mL mikrosantrifüj tüplerine pipet edin.

2. Pankreas adacığı organoidi benzeri yapı indüktörünü hazırlamak için taze pankreas dokusunun işlenmesi

  1. Taze domuz pankreas örnekleri toplayın ve doku biyoaktivitesini sürdürmek için hemen kuru buza aktarın. Edinilen dokular önce pipetleme yoluyla steril normal tuzlu suyla tekrar tekrar durulanır. İlk temizlik adımlarının ardından, kalan kan lekeleri ve doku kirleticileri tamamen ortadan kaldırmak için 3 mL steril fosfat-tamponlu tuzlu (PBS) daha kapsamlı yıkama için kullanılır.
  2. Steril kültür plakalarından kalan sıvıyı çıkarıp at, ardından plakalara 2 mL DMEM ortamı ekleyin. Önceden işlenmiş pankreas dokuları, steril oftalmik makasla uniform 1 mm³ parçalara doğranır (Şekil 1A,B). Tüm kıyma doku parçaları 50 mL'lik bir santrifüj tüpüne toplanır ve ardından homojen karışım için 10 kez nazikçe yukarı-aşağı pipetleme yapılır.
  3. Doku homojenizasyonu steril cam havanla yapılır (Şekil 1C). Öğütme işlemi sırasında, pankreas dokusu parçaları DMEM ortamıyla 1:1 hacim oranında eşit şekilde karıştırılır. Tamamen homojenleştirilmiş doku süspansiyonu, 50 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarılır ve 4 °C koşullarında 30 dakika boyunca 21.600 × g yüksek hızlı soğutucu santrifüjle geçirilir.
  4. Santrifüjlemeden sonra, temizleştirilmiş süpernatan steril pipetle yavaşça çıkarılır. Toplanan süpernatant, küçük doku kalıntıları ve çözünmemiş safsızlıklar gidermek için 0,22 μm steril filtreden geçirilir (Şekil 1D). Arıtılmış sıvı, sonunda kapalı koruma ve sonraki deneyler için tüp başına sabit hacmi 100 μL olan 1,5 mL mikrosantrifüj tüplerine bölünür (Şekil 1E).
  5. Pankreas adacığı organoidi benzeri yapı indüktörünü −20 °C'de saklayın.
    NOT: İndüktör, uygun depolama koşullarında 1 yıl boyunca stabil kalır. Hazırlanan lizatın indüksiyon aktivitesini görsel inceleme ve fonksiyonel indüksiyonla değerlendirin. Aktif lizatı belirgin ve açık pembe görünümüyle tanımlayın; Görünür yağıntı ve tipik adacığığı organoid oluşumunu tetiklememesiyle aktivite kaybını tanıma.

3. İndüksiyon ortamının hazırlanması

  1. Hücre kültürü işlemlerinden hemen önce indüksiyon ortamını taze hazırlayın. Kendi hazırlanan pankreas adacık organoid indüktörü, %10 fetal sığır serumu (FBS-H-DMEM) içeren yüksek glikozlu DMEM ortamı ile Tablo 1'de listelenen orana tam olarak uygun olarak birleştirin.
  2. Kültürlenmiş pankreas organoid örneklerini, sürekli yetiştirme için %5 CO₂ doygunluğu ile sabit 37 °C sıcaklıkta tutulan bir hücre kuluçka makinesine yerleştirin.

4. Organoidlerin morfolojik gözlemi ve büyüme izlemesi

  1. Mikroskobik gözlem, kültür dönemi boyunca planlanan zaman noktalarında yapılır; hücre tohumlamadan sonraki 1, 3. gün, 7. gün, 10. ve 15. gün dahil.
  2. Her tespit seansında pankreas organoidi benzeri yapıların morfolojik değişikliklerini, büyüme koşullarını ve hücresel canlılığını izlemek için ışık mikroskobu benimseniyor ve böylece yapıların dinamik büyüme özellikleri kaydediliyor.

5. Organoidlerin geçişi ve kriyokonserasyonu

  1. Tohum geçişi 3 BMSC, 1 × 10,5 hücre yoğunluğunda, 6 delikli kültür plakalarında ve tam ortamda gece boyunca kültür ile indüksiyondan önce hücre tutunmasına izin verilebilir.
  2. Kültür sistemine %0,02 EDTA içeren 1 mL tripsin ekleyin. Kültür kabının yüzeyini 5–8 kez nazikçe pipetleyerek pankreas organoidlerini tabaktan ayırın.
  3. Tripsin sindirimini sonlandırmak için %10 H-DMEM-F12 ortamı 2 mL ekleyin. Karışımı 1.500 × g sıcaklığında 5 dakika boyunca 4 °C'de soğutulmuş santrifüj ile santrifüjleyin. Santrifüjleme sonrası süpernatantı aspire edin ve atın.
  4. Hücre pelletine taze %10 FBS-H-DMEM ortamının iki katı hacmi eklenerek 1:2 geçiş oranı elde edilir.
  5. Organoid kültürlerin kriyo-korumasını şu şekilde gerçekleştirin: Elde edilen hücre pelletini 1 mL serumsuz kriyo-koruma çözeltisiyle yeniden askıya alın. Yeniden askılanan organoidleri kısa süreli (1 yıla kadar) korumak için −80 °C'de ve uzun süreli depolama için sıvı azotta depolayın.
    NOT: Farklı geçiş oranları elde etmek için taze ortamın hacmini ayarlayın. Örneğin, 1:1 pasaj için başlangıç hacimiyle aynı medium hacmini kullanın veya 1:3 pasaj için başlangıç hacminin 3 katını ekleyin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pankreas adacığı organoidi benzeri kültürlerin büyüme dinamiklerinin zaman içinde kaydedilmesi, özellikle kültürün ilk birkaç haftasında çok önemlidir; çünkü kültür sisteminin sonraki deneylerde performansını tahmin etmeye olanak tanır. Şekil 2, 7 günlük emziren sıçanların kemik iliğinden verimli şekilde izole edildiği ve pankreas adacığı organoidi benzeri yapılar oluşturmak için başarılı bir şekilde kullanıldığı 22 günlük kültür örneğini g...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diyabet, esas olarak tip 1 diyabet (T1DM) ve tip 2 diyabet (T2DM) olarak sınıflandırılan küresel bir metabolik bozukluktur. T1DM, pankreas β hücrelerinin seçici olarak yok edilmesi ve mutlak insülin eksikliğine yol açan otoimmün birhastalıktır 19. Hastalar ömür boyu dış insülin tedavisi gerektirir ancak yine de şiddetli hipoglisemi ve mikrovasküler komplikasyon riskleriyle karşıkarşıya kalırlar 20. Adacık nakli, şu anda endogen insülin salg...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların beyan edecek çıkar çatışmaları yoktur.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, Guangxi Tıp Üniversitesi'nin Üstün Genç Yetenekler Eğitim Programı ve Guangxi Tıp Üniversitesi Gençlik Bilimleri Vakfı (GXMUYSF202307), birinci sınıf disiplin yapısı—Preklinik Tıp (DC2300011025) tarafından desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
0.22 μ m Steril FiltreMerck MilliporeSLGP033RBPankreas dokusu lizatının steril filtrasyonu, safsızlıkları ve kalıntıları gidermek için
%0,25 Tripsin (%0,02 EDTA içinde)Wisent325-043-CLGeçiş operasyonu için pankreas adacığı organoidlerinin hafif dissosiyasyonu
1,5 mL mikrosantrifüj tüpleriCorning AxygenAXY-20-1500Pankreas dokusu lizatının (100 μ L tüp başında)
10 μ L Pipet UçlarıEppendorf22491653Antikorlar ve küçük hacimli enzim çözeltileri için sıvı transferi
1000 μ L Pipet UçlarıEppendorf22491651Reaktifler ve hücre süspansiyonları için sıvı transferi
-20 ve derece; dondurucuHaierHYC-326Reaktiflerin (örneğin, FBS, tripsin) ve pipet uçlarının depolanması
200 μ L Pipet UçlarıEppendorf22491652Küçük hacimli reaktifler için hassas sıvı transferi (örneğin, lizat aliquoteing)
10 μ L Pipet UçlarıHaierDW-86L626Pankreas dokusu lizat ve kriyokonseran organoidlerin uzun süreli depolanması
50 mL Santrifüj TüpleriCorning430829Pankreas dokusu lizat ve hücre süspansiyonunun yüksek hızlı düşük sıcaklıklı santrifüjlenmesi
6-Kuyu Kültür PlakalarıCorning3516Pankreas adacığığı organoidleri ve BMSC'lerin kültürü
Sınıf II Biyogüvenlik KabiniHaierHR40-IIA2Domuz pankreas dokusunun steril işlemesi ve organoid kültür işlemleri
CO2 Kuluçka MakinesiThermo Fisher Scientific3111Pankreas adacığı organoidlerinin 37° derecede kuluçkası; C, %5 CO2 ortamı
Eğimli PensŞanghay Huaqi Tıbbi Aletler A., Ltd.HQ-1302İşlem sırasında pankreas dokusunun işlenmesi, yüksek sıcaklıkta sterilize edilmiş
DMEM ortamı (yüksek glikoz)Wisent318-025-CLPankreas adacığı organoid indüksiyon kültürü için kullanılır
DMEM ortamı (düşük glikoz)Wisent319-015-CLBMSC kültürü ve doku işleme için bazal ortam
Fetal Sığır Serumu (FBS)Gibco (Termo Balıkçı Bilimci)10099141CHücre kültürü ve sindirim sonlandırması için %10 hacim oranında DMEM'e eklendi
H-DMEM-F12 ortaWisent315-080-CLOrganoid geçişi sırasında tripsin sindirimini sonlandırmak için kullanılır
Yüksek Sıcaklık OtoklavıHaierGR80DAAletlerin sterilizasyonu (121&derece; c, 20 dakika) ve cam eşyaları
Işık MikroskobuOlympusCX43Pankreas adacığı organoidlerinin farklı büyütmelerde (& zamanlarında; 4, & Times; 10, & Times; 20)
Oftalmik MakasŞanghay Huaqi Tıbbi Aletler A., Ltd.HQ-1201Domuz pankreas dokusunu 1 mm ve sup3 olarak kesmek; yüksek sıcaklıkta otoklavlama ile sterilize edilmiş parçalar
Penisillin-Streptomisin ÇözeltisiThermo Fisher Scientific15140122Kültür ortamında bakteriyel kontaminasyonu önlemek için %1 hacim oranında kullanılır
Fosfat-tamponlu tuzlu (PBS)Gibco (Termo Balıkçı Bilimci)10010023Domuz pankreas dokusu ve hücresel durulama için yıkama tamponu
Soğutmalı SantrifüjEppendorf5810R4° derecede yüksek hızlı santrifüj; C pankreas lizat hazırlama ve hücre pellet toplama için
Serumsuz Kriyokoruma ÇözümüSuzhou Xinsaimai Biyoteknoloji Şirketi, Ltd.#C40050Pankreas adacığı organoidlerinin kriyo-koruması için, hücre pelletlerini -80 dereceden önce yeniden süspansiyonda kullanılır; C depolama

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Mezenkimal K k H crelerAdac k OrganoidleriDiabetes MellitusPankreatik Adac klarOrganoid Olu umuH cre DiferansiyasyonuIn Vitro ModelDoku Lizat Haz rlama

İlgili makaleler