Sıvı Kromatografi-Kütle Spektrometrisi ile Elit Boksörlerde Egzersizle Kaynaklı Metabolik Değişimleri Analiz Etmek İçin Standartlaştırılmış Metabolomik Protokolü

Summary

Bu protokol, elit erkek boksörlerde akut ve kısa vadeli iyileşme ile ilgili metabolik değişimlerin profilini almak için sıvı kromatografiye dayalı standart serum metabolomik iş akışını tanımlar; bu süreçte quadrupol uçuş süresi tandem kütle spektrometrisi (LC-QTOF-MS/MS) ve çok değişkenli veri analizi ile bağlantılıdır.

Abstract

Elit boks, geleneksel fizyolojik ölçümlerle tam olarak yakalanamayan hızlı metabolik değişiklikleri tetikler. Yedi elit erkek boksörde sparringden önce, hemen sonra ve 24 saat sonra toplanan örneklere sıvı kromatografi-quadrupol-uçuş zaman-uçuş tandem kütle spektrometrisi (LC-QTOF-MS/MS) dayalı standartlaştırılmamış hedefsiz serum metabolomik iş akışı uygulandı. İş akışı standartlaştırılmış örnek toplama, birleştirilmiş kalite kontrol izleme, metabolit profilleme, çok değişkenli istatistiksel analiz ve yol yorumlamasını içeriyordu. Akut sparring, glikoliz ve glukoneogenez ile ilgili metabolitlerdeki değişikliklerle ilişkilendirilirken, 24 saatlik zaman noktası kükürt metabolizmasıyla ilişkilendirildi.

Fosfatidilinositol PI(16:0/18:2(9Z,12Z)) sparring sonrası hemen durumda güçlü bir ayrım gösterdi ve tiyosülfat, 24 saatlik iyileşme durumuyla ilişkilendirildi. Bu bulgular, yedi elit erkek boksörden oluşan bu kohortta egzersizle ilgili metabolik değişikliklerin tekrarlanabilir profillenmesi için bu iş akışının kullanılmasını desteklemektedir. Protokol, akut egzersiz ve kısa süreli iyileşme üzerine kontrollü küçük grup çalışmaları için tasarlanmıştır ve tekrarlanabilir örneklem işlenmesi, birleştirilmiş kalite kontrol izleme ve yorumlanabilir analizleri vurgular.

Introduction

Elit boks, yüksek yoğunluklu üç raunt 2 dakikalık yüksek yoğunluklu sparringle karakterize edilir; anaerobik ve aerobik metabolizmanın birleşimine dayanır ve enerji substratlarında, oksidatif stres aracılarında ve doku onarımıyla ilgili metabolitlerde hızlı değişimleri tetikler. Geleneksel değerlendirmeler (kan laktatı ve kalp atışı) yalnızca izole fizyolojik uç noktaları yakalar; "sparring öncesi başlangıç çizgisi → sparring sonrası akut stres → 24 saat iyileşme arasındaki sistemik, birbirine bağlı metabolik değişiklikleri çözemez."

Sıvı kromatografi-quadrupol-uçuş süresi tandem kütle spektrometrisi ile mümkün kılılan hedeflenmemiş metabolomikler, biyolojik örneklerde küçük moleküllü metabolitleri kapsamlı profilleyerek bu sınırlamayı giderir. Genellikle binlerce metabolik zirveyi tespit eder ve özenle oluşturulmuş ^1,2,3 veritabanlarıyla entegrasyon yoluyla yüzlerce, binlerce metaboliti notlar. Bu yaklaşım, geleneksel yöntemlerin gözden kaçırdığı nüanslı metabolik dinamikleri ortaya çıkarabilir, ancak mevcut boks odaklı metabolom çalışmaları standartlaştırılmadan yoksundur: genellikle kontrollü sparring protokolleri, titiz kalite kontrol (QC) adımlarını veya uzun vadeli iyileşme zaman noktalarını atlar; bu da tekrarlanamaz sonuçlara ve sınırlı eğitim veya iyileşme stratejilerine çevrilmeye yol^{açar 4,5}.

Sıvı kromatografi-kuadrupol-uçuş süresi tandem spektrometrisine dayalı ve elit boksörler için optimize edilmiş standart bir metabolom iş akışı sunuluyor; bu çalışma hem akut egzersiz tepkilerini hem de gecikmeli iyileşmeyi yakalamak için sunuluyor. Protokol, geçici stresi sürekli^{adaptasyondan} ayırt etmek için üç önemli zaman noktası içerir (sparring öncesi [T0], hemen sparring sonrası [T1], sparring sonrası 24 saat [T2]). Kritik teknik özellikler şunlardır: (1) tutarlı egzersiz yoğunluğunu sağlamak için kontrollü sparring (%80–85 maksimum kalp atış^{hızı) 7,9}; (2) düşük bolluklu serum metabolitlerinin hassas^{tespiti için yüksek çözünürlüklü LC-QTOF 2,3,10}; (3) egzersize duyarlı metabolitleri belirlemek için ana bileşen analizi (PCA), ortogonal kısmi en küçük kare ayırt edici analiz (OPLS-DA) ve çift yönlü istatistiksel testler dahil olmak üzere çok değişkenli ve tek değişkenli^{analizler 6,8,11}; ve (4) sinyal kaygınlığına karşı enstrüman kararlılığını değerlendirmek için çoklu enjeksiyonlarla tek bir havuzlu serum QC örneği (çalışma örneklerinin eşit hacimde karıştırılması^).

Bu protokol, diğer yüksek yoğunluklu, kısa süreli sporlara (örneğin sprint ve güreş) uyarlanabilir, ancak bu aktarılabilirlik spora özgü gruplarda doğrulama gerektirir. Mevcut çalışmada, iş akışı elit erkek boksörlerde stres ve iyileşmenin metabolik belirteçlerini belirlemek için ön bir çerçeve sunmaktadır. Bu iş akışı, serum bazlı, hedeflenmemiş metabolomikler kullanan küçük, iyi karakterize edilmiş atletik gruplarda akut egzersiz ve kısa süreli iyileşme kontrollü çalışmaları için en uygundur. Diğer sporlara, kadın sporculara, daha büyük heterojen popülasyonlara veya ek doğrulama olmadan uzun vadeli adaptasyon çalışmalarına doğrudan ekstrapolasyon için daha az uygun olabilir.

Çalışma, elit boks sparringiyle indüklenen serum metabolik değişikliklerini karakterize etmeyi ve 24 saat iyileşme ile ilgili değişikliklerden akut sparring sonrası yanıtları ayırt etmeyi amaçladı. Akut sparringin ağırlıklı olarak enerji metabolizmasını etkileyeceği, 24 saatlik iyileşmenin ise redoks dengesi ve doku onarımıyla ilişkili metabolitlerle ilişkili olacağı varsayılmıştır. Genel iş akışı Şekil 1'de gösterilmiştir.

Protocol

Tüm prosedürleri Capital University of Physical Education and Sports İnsan Araştırmaları Kurumsal Etik Komitesi'nin onayına uygun olarak gerçekleştirmek (onay no. 2025A005).

DIKKAT: Tüm insan kan örneklerini potansiyel bulaşıcı olarak değerlendirin. Eldiven, laboratuvar önlüğü ve göz koruması takın. Kurumsal biyogüvenlik prosedürlerine uygun olarak venöz kan toplama, serum işlenmesi ve atık bertaraf edilmesini gerçekleştirin. Numune işlenmesinden sonra çalışma yüzeylerini dezinfekte edin.

DIKKAT: Metanol, asetonitril ve formik asit tehlikeli kimyasallardır. Çözücü hazırlama, ekstraksiyon ve yeniden yapılandırma adımlarını sertifikalı kimyasal bir buhar davlumbazında yönetin. Cilt temasından ve solumadan kaçının. Çözücü atıklarını onaylı kaplarda toplayın.

1. Çalışma katılımcılarının alınımı ve hazırlanması

1. 20–28 yaş arası ve 60–75 kg sıklet kategorilerinde yarışan yedi seçkin erkek boksörü işe alın.
2. Her katılımcının en az 5 yıllık profesyonel eğitim deneyimi olup metabolik hastalık geçmişi olmadığını doğrulamak.
3. Son 6 ayda kas-iskelet sistemi yaralanması olan katılımcıları hariç tutun.
4. Katılımcılara, test öncesi 3 gün boyunca %55 karbonhidrat, %25 protein ve %20 yağ içeren standart bir diyet uygulamalarını söyle.
5. Katılımcılara, testten önce 48 saat boyunca maksimum kalp atış hızının %60'ı veya üzerinde yoğun egzersizlerden kaçınmalarını talimat edin.
6. Katılımcılara kan almadan önce 12 saat oruç tutmalarını söyleyin. Oruç sırasında su içmesine izin verin.
7. Sparringden 1 hafta önce dereceli egzersiz testleriyle maksimum kalp atış hızını belirleyin.
8. Koşu bandı hızını her 3 dakikada bir 1 km/s artırın, ta ki bitene kadar. Ölçülen maksimum kalp atış hızını kullanarak sparring hedef yoğunluğunu belirleyin.

2. Sparring protokolü ve serum örneği toplama

1. Standart bir 6 × 6 m boks ringi, 16 oz eldiven ve göğüs kemeri ile bağlı bir kalp atış hızı monitörü hazırlayın.
2. Standart 10 dakikalık bir ısınma yapın; 5 dakika 8 km/s hızla koşu, 3 dakika dinamik esneme ve 2 dakika gölge boksundan oluşuyor.
3. Sparring protokolünü aşağıdaki şekilde yürütün.
   1. Her biri 2 dakikalık üç tur sparring yapın.
   2. Rakipleri ağırlık sınıfı ve teknik seviyelere göre eşleştirin.
   3. Turlar arasında 1 dakikalık bir dinlenme aralığı verin.
   4. Seans boyunca her 30 saniyede bir kalp atış hızını izleyin.
   5. Sparring yoğunluğunu MHR'nin %80–%85'i arasında tutmak için ayarlayın.
   6. Kalp atış hızı MHR'nin %90'ını aşarsa sparringi durdurun. Sadece kalp atış hızı hedef menzile döndükten sonra sparringe devam edin.
4. Serum örneklerini aşağıdaki gibi üç zaman noktasında toplayın.
   1. T0 için ısındıktan 30 dakika sonra antekubital venden 5 mL venöz kan toplayın; bir 8 mL serum ayırma tüpü (SST) ile alın.
   2. T1 için son turdan 5 dakika içinde yeni bir SST kullanarak 5 ml venöz kan toplayın.
   3. Yeni bir SST kullanarak T0 ile aynı saatte T2 için 5 mL venöz kan toplayın. Katılımcıların T0 için kullanılan aynı oruç ve aktivite kısıtlamalarına uyduklarından emin olun.
5. Kan örneklerini aşağıdaki şekilde işleyin.
   1. Her SST'yi 11000 × g. sıcaklıkta, toplandıktan sonra 1 saat içinde 4 °C'de 15 dakika boyunca santrifüj yapın.
   2. Üst serum katmanından 2–3 mL 1,5 mL kriyoviallere aktarın.
   3. Kryovialleri hemen -80 °C'de sakla.
   4. Her örneği en fazla iki donma-erime döngüsüyle sınırlayın.
6. Havuzlanmış bir kalite kontrol örneği hazırlayın.
   1. Tüm 21 çalışma serum örneğini (yedi katılımcıdan T0, T1 ve T2) buz üzerinde eriterek toplanan QC hazırlığı yapıldı.
   2. Her çalışma örneğinden eşit bir aliquot tek bir 1,5 mL tüpe aktarın.
   3. Her örnekten 20 μL aktararak 420 μL nihai toplanan kalite kontrol hacmi elde edilir.
   4. Havuzlanmış QC örneğini 10 saniye girdabla çalıştırın.
   5. LC-QTOF-MS analizi sırasında tekrar enjeksiyonlar için havuzlanmış QC örneğini kullanarak enstrümantal stabiliteyi ve sinyal kaymasını izleyin.

3. Serum örneklerinden metabolit ekstraksiyonu

1. Dondurulmuş serum örneklerini (T0, T1, T2 ve QC) -80 °C'den al. Örnekleri buzda 30 dakika eritin ve her örneği 10 saniye girdabla döndürün.
2. 100 μL serumu 1,5 mL düşük protein bağlayan mikrosantrifüj tüpüne pipetleyin. 500 μL metanol:asetonitril (1:1, v/v) içeren buz soğuğu ekstraksiyon çözücüsü ekleyin. 30 saniyelik vortex.
   1. Ekstraksiyon sırasında dahili bir standart eklemeyin. Nihai iş akışında dahili standart tabanlı çıkarma düzeltmesi veya aşağı akış normalizasyonu uygulamayın.
3. Tüpü 4 °C'de buzlu su banyosuyla, 300 W ve 40 kHz ile 10 dakika boyunca soniklendirin. Tüpü -20 °C'de 1 saat kuluçka altına alın ve protein çökelti.
4. Tüpü 13200 × g . sıcaklığında 4 °C'de 20 dakika boyunca santrifüjlendirin. Yaklaşık 450 μL süpernatan yeni bir mikrosantrifüj tüpüne aktarılır ve peleti tehlikeli biyolojik atık olarak atılır.
5. Üst yüzeyi 37 °C ve -0.09 MPa sıcaklıkta vakum konsantratöründe 45 dakika boyunca veya tam kuruyana kadar kurutun.
6. Kurutulmuş ekstraktı 100 μL asetonitril:su (1:1, v/v) içinde yeniden oluşturuyor. 30 saniyelik vortex.
   Not: Asetonitrile:water (1:1, v/v) bu iş akışında kullanılan ters faz kromatografi kolonuyla uyumlu olduğu ve ön testlerde görünür yağıntı üretmediği için kullanılmıştır.
7. Yeniden oluşturulmuş çözeltiyi 13200 × g . 'de 4 °C'de 15 dakika boyunca santrifüj yapın. Yaklaşık 90 μL süpernatantı 200 μL bir iç ile donatılmış bir LC-MS cam şişesine aktarın ve şişeyi mühürleyin.

4. Sıvı kromatografi-kütle spektrometrisi tespiti

1. Serum metabolomiklerine uygun ters faz kromatografi kolonu (bkz. Malzemeler Tablosu) sıvı kromatografi sistemine yerleştirin. Sütun fırınını 40 °C'ye ayarlayın.
2. Mobil faz A'yı ultra saf suda %0,1 (v/v) formik asit olarak hazırlayın. Mobil faz B'yi asetonitrile içinde %0,1 (v/v) formik asit olarak hazırlayın.
3. Her iki mobil fazı 0,22 μm bir zardan filtreleyin.
4. Akış hızını 400 μL/dakika ve enjeksiyon hacmini 5 μL olarak ayarlayın.
5. Aşağıdaki gradyanı uygulayın: 0,0–0,5 dakika, %95 A ve %5 B; 0,5–5,5 dakika, %50 A ve %50 B'ye doğrusal gradyan; 5,5–9,0 dakika, %5 A ve %95 B'ye doğrusal gradyan; 9,0–10,5 dakika, %5 A ve %95 B; 10,5–12,0 dakika, %95 A ve %5 B'ye dönüş ve yeniden dengeleme
6. Sıvı kromatografi sistemini, elektrosprey iyonizasyon kaynağı ile donatılmış yüksek çözünürlüklü bir kütle spektrometresine bağlayın.
7. Verileri ayrı çalışmalarda pozitif ve negatif iyon modlarında edinin.
8. Pozitif iyon modunda, kapiler voltajı 2500 V, koni voltajını ise 30 V olarak ayarlayın.
9. Negatif iyon modunda, kapiler voltajı -2000 V, koni voltajını ise 25 V olarak ayarlayın.
10. Çözülme gazı sıcaklığını 500 °C, çözünme gazı akışını 800 L/s ve konik gaz akışını 50 L/s olarak ayarlayın.
11. 0.2 saniye tarama süresiyle m/z 50–1200 arası veri alın.
12. 0 V'da düşük çarpışma enerjisi ve 10–40 V'da yüksek çarpışma enerjisi kullanarak tandem kütle spektrometrisi verilerini edinin.
13. Örnekleri şu sırayla çalıştırın: Bir boş enjeksiyon yeniden yapılandırıcı çözücü; Toplanan QC örneğinin ardışık üç enjeksiyonu; Her beş çalışma örneğinden sonra bir boş enjeksiyon ve bir QC enjeksiyonu içeren tüm çalışma örnekleri; Son bir QC enjeksiyonu; ve Son bir boş enjeksiyon
14. Her iki iyon modunda da veri kalitesini ve analitik kararlılığı, havuzlu kalite kalitesi korelasyon analizi ve ana bileşen analizi (PCA) kümeleme yoluyla değerlendirin.
15. 0.8'den büyük havuzlu-QC korelasyon katsayılarını, analitik dizide kabul edilebilir analitik kararlılığı gösteren olarak yorumlayın.

5. Veri ön işleme ve istatistiksel analiz

1. Ham sıvı kromatografi-kütle spektrometrisi dosyalarını veri işleme yazılımına aktararak tutma süresi hizalama, dekonvolüsyon, zirve hizalama ve özellik çıkarımı için (bkz. Materyal Tablosu).
   1. Hizalama referansı olarak ilk havuzlu-QC enjeksiyonunu seçin.
   2. Seçilen yazılımın varsayılan iş akışını kullanarak tutma süresi hizalama, dekonvolüsyon ve zirve hizalama gerçekleştirin. Tutma süresi toleransı ± 0,1 dakika ve kütle toleransı ± 5 ppm kullanın.
   3. En az bir grupta örneklerin %80'inde bulunan 1000'den fazla yoğunlukta özellikleri koruyup 1000'den fazla yoğunlukta özellikleri koruyun.
   4. Her iki iyon modunda da ek ön işlem sonrası normalizasyon uygulamayın.
   5. M/z, tutma süresi ve zirve alan değerlerini içeren işlenmiş özellik tablosunu dışa aktarın.
   6. Log2 dönüşümü tüm korunan zirve yoğunlukları içerir.
   7. Her özellik için eksik değerleri minimum pozitif değerin beşte biri ile atletin.
   8. Her özelliğin ortalaması ve çok değişkenli analizden önce standart sapmasına böl.
   9. Ana bileşen analizi (PCA), kısmi en küçük kare-ayırt analizi (PLS-DA), ortogonal kısmi en küçük kare-ayırt edici analiz (OPLS-DA), kümeleme ve korelasyon analizi için dönüştürülmüş ve ölçeklendirilmiş matrisi kullanın. Bolluk grafikleri için orijinal işlenmiş özellik yoğunluklarını kullanın.
2. Metabolitleri, İnsan Metabolom Veritabanı (HMDB), Kyoto Genler ve Genomlar Ansiklopedisi (KEGG) ve LIPID MAPS gibi kamuya açık metabolomik veritabanlarıyla eşleştirerek metabolitleri not edin.
   1. Her notasyonu öncül iyon kütle hatası, izotop dağılımı ve tandem kütle spektrometrisi parça eşleştirmesi ile puanlayın. Her kritere en fazla 20 puan atayın.
   2. 100 ppm ön-iyon kütle hatası penceresi ve 50 ppm parça-iyon kütle hatası penceresi uygulanır. Sabit bir tutma süresi penceresi uygulama.
   3. Toplam puan en az 60 üzerinden 40 olan notları koruyun. Düşük puanlı açıklamaları hariç tutun.
3. Karşılaştırma gruplarını açıkça şu şekilde tanımlayın: A = T0 (sparring öncesi), B = T1 (dövüşten hemen sonra) ve C = T2 (sparring sonrası 24 saat).
4. İstatistiksel hesaplama yazılımı ve ilgili analiz paketleriyle aşağı akış istatistiksel analizleri yapmak (bkz. Materyal Tablosu).
   1. Birim varyans ölçeklendirmesinden sonra ana bileşen analizini (PCA) çalıştırın ve skor grafiklerini görselleştirin.
   2. A ile B, B ile C ve A ile C arasında kısmi en küçük kareler-ayırt edici analiz (PLS-DA) ve ortogonal kısmi en küçük kare-ayırt edici analiz (OPLS-DA) modelleri oluşturun.
   3. Örnek sayısı en az 7 olduğunda 7 katlı çapraz doğrulama kullanın. Örnek sayısı 7'den küçükse, katlanma sayısını örnek sayısına eşit olarak ayarlayın.
   4. Model geçerliliğini değerlendirmek için 200 permütasyon testi yapın.
   5. Aşağıdaki eşikler uygulanarak diferansiyel metabolitleri ekranlayın: katlanma değişimi (FC) ≥ 2 veya FC ≤ 0.5, projeksiyonda değişken önemi (VIP) ≥1 ve t-testi P. < 0.05.
   6. Çift karşılaştırmalar için volkan grafikleri ve ilgili istatistiksel grafikler oluşturun.
   7. Log2 dönüşümlü ve birim varyans ölçekli matris kullanarak ısı haritaları oluşturun.
   8. P ≤ 0.05 anlamlılık eşiği olan korelasyon ısı haritaları oluşturun ve 20'ye kadar metabolit gösterin.
   9. K-means kümelenmesinden önce optimal küme sayısını belirleyin. Birim varyans ölçeklendirmesinden sonra k-means kümeleme gerçekleştirin.
   10. Orijinal işlenen özellik yoğunluklarından bolluk çubuk grafikleri oluşturun.
   11. İkili karşılaştırmalar arasındaki örtüşmeyi özetlemek için Venn diyagramları oluşturun.
   12. Seçilmiş metabolitler için alıcı çalışma karakteristikti (ROC) analizi yapın. Eğrinin altındaki alana göre tanı performansını değerlendirin (AUC).
5. Uygun bir biyoinformatik pakette bir yol zenginleştirme fonksiyonu kullanarak diferansiyel metabolitleri KEGG yollarına eşleyin (bkz. Materyal Tablosu).
   1. Yolları P. < 0.05 ile yorumlayın. Nihai analiz kaydında çoklu test düzeltmesi bildirilmedi.

Results

LC-QTOF-MS/MS Verilerinin Kalite Kontrolü (QC) Doğrulaması

Sinyal kararlılığını ve tekrarlanabilirliğini değerlendirmek için, havuzlanmış QC örneğinin tekrar edilen enjeksiyonları her iki iyon modunda da analiz edildi. Havuza alınmış QC enjeksiyonları arasındaki Spearman korelasyon katsayıları her iki iyon modunda da 0.8'i aştı ve bu da analitik dizide stabil bir enstrüman performansını gösterdi. Tüm çalışma örneklerinin ve QC enjeksiyonlarını...

Discussion

Bu standartlaştırılmış iş akışı, elit boks sparringi ve kısa süreli iyileşme ile ilişkili metabolit değişikliklerini küçük, kontrollü bir grupta karakterize etti. Havuzlu QC enjeksiyonları, QC tabanlı korelasyon analizi, PCA kümelenmesi ve çok değişkenli analizler birlikte kabul edilebilir analitik kararlılığı destekledi. Protokolün başarısı öncelikle dört faktöre bağlıydı: sparring yoğunluğunu maksimum kalp hızının %80–%85'i arasında tutmak, kan örneklerini topladıktan sonra 1 saat için...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reaktifler	Asetonitril	Merck	LC-MS derecesi, CAS 75-05-8
Reaktifler	Metanol	Merck	LC-MS derecesi, CAS 67-56-1
Reaktifler	Formik asit	TCI	LC-MS sınıfı, CAS 64-18-6
Tüketim Malzemeleri	VACUETTE TUBE CAT Serum Pıhtı Aktivatörü	Greiner Bio-One	8 mL serum pıhtı aktivatör tüpü
Tüketim Malzemeleri	Nalgene Kriyojenik Şişe	Thermo Fisher Scientific	1.5 mL, dış dişli
Tüketim Malzemeleri	Protein LoBind Tüpü	Eppendorf	Kedi. No. 0030108442, 1.5 mL
Cam Eşyaları	Vidalı kapaklı cam şişe ve iç kısmı	Çevik	2 mL şişe, 200 ve mu; L cam insert; Cat'i koy. No. 5183-2090
Tüketim Malzemeleri	Millex-GP Filtresi	Merck	Kedi. Hayır. SLGP033RS, 0.22 ve mu; m membranı
Enstrümanlar	Özel Boks Ringi 6x6 m	Muay Thai Sporu	6 & Times; 6 m antrenman ringi
Tüketim Malzemeleri	Pro Style 2 Boks Eldivenleri	Everlast	16 oz
Enstrümanlar	Polar H10	Polar	Göğüs kemeri kalp atış hızı sensörü
Enstrümanlar	kuasar	h/p/cosmos	Motorlu koşu bandı
Enstrümanlar	Santrifüj 5425 R	Eppendorf	Soğutmalı mikrosantrifüj
Enstrümanlar	Bransonic CPX2800	Emerson / Branson	40 kHz dijital ultrasonik banyo
Enstrümanlar	Savant SpeedVac SPD1030	Thermo Fisher Scientific	Entegre vakum konsantratör
Enstrümanlar	VWR Mini Vortex Mikser	Avantor / VWR	Kedi. No. 10153-688
Enstrümanlar	TSX ULT Dondurucu	Thermo Fisher Scientific	Model TSX50086A
Enstrümanlar	ACQUITY UPLC I-Class PLUS	Sular	UHPLC sistemi
Enstrümanlar	Xevo G2-XS QTof	Sular	QTOF kütle spektrometresi
Enstrümanlar	ACQUITY UPLC HSS T3 Sütunu	Sular	P/N 176001132, 1.8 μ m, 2.1 ve zaman; 100 mm
Yazılım	MassLynx	Sular	Sürüm 4.2
Yazılım	Progenesis QI	Sular	Sürüm 2.3
Yazılım	R	R İstatistiksel Hesaplama Vakfı	Sürüm 3.6.1
Yazılım	PRCOMP	taban R	R tabanı fonksiyonu
Yazılım	ropls	Biyoiletken	R paketi
Yazılım	Pheatmap haritası	CRAN	R paketi
Yazılım	Corrplot	CRAN	R paketi
Yazılım	kmeans	taban R	R tabanı fonksiyonu
Yazılım	NbClust	CRAN	R paketi
Yazılım	Venn	CRAN	R paketi
Yazılım	MetaboAnalystR	CRAN / Xia Laboratuvarı	Sürüm 1.0
Yazılım	pROC	CRAN	Sürüm 1.15.0
Yazılım	clusterProfiler	Biyoiletken	Biyoiletken paketi
Veritabanları	İnsan Metabolom Veritabanı (HMDB)	HMDB	Çevrimiçi veritabanı
Veritabanları	Kyoto Genler ve Genomlar Ansiklopedisi (KEGG)	KEGG	Çevrimiçi veritabanı
Veritabanları	LIPID HARITALARI	LIPID HARITALARI	Çevrimiçi veritabanı