Bitki Özleri, Mantar Filtratları ve Bakteriyel Kültürler Kullanılarak Altın ve Gümüş Nanopartiküllerinin Yeşil Sentezi

Özet

Bu protokol, bitki özleri, mantar filtratları ve bakteriyel kültürler kullanılarak altın ve gümüş nanopartiküllerinin üretilmesi için tekrarlanabilir yeşil sentez yöntemlerini açıklar; ardından ultraviyole görünür spektroskopi ve iletim elektron mikroskopisi ile nanopartikül teyit edilir.

Özet

Biyolojik sistemlerle metal nanopartiküllerin (NP) yeşil sentezi, geleneksel kimyasal üretim yöntemlerine sürdürülebilir bir alternatif sunar. Bu protokol, azaltıcı ve stabilize edici olarak bakteriyel kültürler, mantar filtratları ve bitki yaprağı özleri kullanılarak altın (Au) ve gümüş (Ag) NP'lerin sentezi için tekrarlanabilir deneysel ve analitik prosedürler sunmaktadır. AgNP'ler, Psidium guayaquilensis, Acanthophora spicifera ve Earliella sp. ekstraktları kullanılarak sentezlendi ve 405 ile 425 nm arasında karakteristik ultraviyole görünür (UV–Vis) emilim bantları gösterdi ve bu da NP oluşumunu doğruladı. Shewanella oneidensis ve Cupriavidus metallidurans tarafından AuNP'lerin sentezi üzerindeki oksijen koşulları, pH, Au konsantrasyonu, hücre konsantrasyonu, elektron donör tipi ve sıcaklık gibi çevresel faktörlerin etkisini değerlendirmek için deney tasarımı yaklaşımı uygulanmıştır. İdeal koşullarda (0,2 mM Au ve pH 5), S. oneidensis ağırlıklı olarak küresel AuNP'ler üretir; ortalama boyutları 43,6 ± 11,0 nm ve karakteristik soğurma zirvesi 520 nm'dir. NP oluşumu ve morfolojisi UV–Vis spektroskopisi ve iletim elektron mikroskopisi kullanılarak doğrulandı. Bu iş akışı, biyojenik NP sentezi için tekrarlanabilir bir platform sağlar ve biyosensörleme, biyoremediasyon ve antimikrobiyal teknolojilerdeki uygulamaları destekler.

Giriş

Metalik nanopartiküller (NP'ler), yüksek yüzey alanlarıyla ilişkili benzersiz fizikokimyasal özelliklere sahiptir; bunlar arasında ayırt edici elektronik, manyetik ve katalitik davranışlar ile yüksek reaktivite bulunur. Bu özellikler, hastalık teşhisi ve ilaç dağıtımı için tıp ^1,2,3,4,5,6, güneş kremi formülasyonları için kozmetik⁷, transistör ve güneş hücreleri için elektronik⁸, su arıtımı için çevre^{mühendisliği 2,9,10} dahil olmak üzere birçok alanda uygulanmasını teşvik etmiştir, ve gübre ile pestisitler için tarım ^11,12. NP uygulamalarının disiplinler arasında sürekli genişlemesi, son yıllarda bildirilen artan ilgili yayınlarda^{da yansımaktadır (13,14}).

Metalik NP'ler için sentetik yöntemler, parçacık boyutu, morfolojisi ve kararlılık gibi önemli özellikler üzerinde hassas kontrol sağlar ve bu da sentez sürecini NP performansının kritik belirleyicisi yapar. Geleneksel kimyasal sentez yöntemleri kapsamlı şekilde optimize edilmiştir; ancak genellikle toksik reaktifler, yüksek enerji tüketimi ve yüksek üretim maliyetleri içerir^14,15. Bu sınırlamalar, daha yeşil ve sürdürülebilir alternatiflerin geliştirilmesini teşvik etmiştir. Yeşil sentez yaklaşımları, bitki ^{özleri 16,17}, mantar ve bakteriler dahil^{mikroorganizmalar (18}) ve algler¹⁹ gibi biyolojik sistemleri doğal indirgeme ve stabilize etkenleri olarak kullanır. Bu süreçler sırasında, metal tuzlar sıfır değerli formlara indirgenerek, çevre dostu ve maliyet etkin yollarla NP'ler üretir. Ayrıca, biyolojik olarak sentezlenen NP'ler genellikle biyolojîk uyumludur ve bu da tıbbi, tarımsal ve çevresel uygulamalarda kullanımlarını^{kolaylaştırır 8,14}.

NP sentezi için uygun biyolojik bir yolun seçimi, amaçlanan uygulamaya ve mevcut altyapı ile operasyonel gereksinimlere bağlıdır. Bitki bazlı sentez, genellikle hızlı ve düşük maliyetli NP üretimi için tercih edilir çünkü minimal steril işlem gerektirir; Ancak, ekstrakt bileşimindeki değişkenlik,^{tekrarlanabilirlik} 20,21'i etkileyebilir. Mantar aracılı sentez, yüksek NP verimleri ve NP stabilizasyonunu ve sonraki işlemeyi iyileştiren hücre dışı enzimler sağlayabilir; ancak bu yaklaşım daha uzun yetiştirme süreleri ve kontrollü büyüme koşulları gerektirir²². Buna karşılık, bakteriyel sistemler tanımlanmış metabolik koşullar altında ayarlanabilir sentezi ve hızlı biyokütle üretimini mümkün kılarak mekanik çalışmalar ve NP ile ilgili uygulamalar için uygundur²². Ancak, bakteriyel sentezde genellikle sıkı aseptik müdahale, kontrollü biyoreaktör koşulları ve hücre içi NP'ler elde edildiğinde ek aşağı akış işlemleri gerektirir^21,22.

Bahsedilen avantajlara rağmen, yeşil sentez yöntemleri tekrarlanabilirlik ve standartlaştırma ile ilgili zorluklarla karşı karşıya kalmaya devam etmektedir. Ayrıca, metalik NP'lerin yeşil sentezi için ayrıntılı görsel adım adım protokoller sınırlı^{kalıyor 23} ve bu da araştırmacıların mevcut metodolojileri başarılı şekilde yeniden üretme ve uygulama yeteneğini kısıtlamaktadır. Bu çalışmanın amacı, bitki özleri, mantar filtratları ve bakteriyel kültürler kullanılarak altın (Au) ve gümüş (Ag) NP'ler için tekrarlanabilir yeşil sentez protokolleri sunmaktır. Özellikle, Psidium guayaquilensis ve Acanthophora spicifera'dan sulu ekstraktlar, Earliella sp.'den ekstrahücresel mantar filtratları ve Shewanella oneidensis ile Cupriavidus metallidurans'ı içeren bakteri sistemler NP sentezi için kullanılmıştır. Sunulan protokoller, biyolojik ekstrakt hazırlanması, NP sentezi ve ön NP karakterizasyonundaki kritik adımları vurgulamaktadır. Ayrıca, iş akışı deney tasarımı, standartlaştırılmış hazırlık prosedürleri ve hatır içi karakterizasyonu entegre ederek tekrarlanabilir ve optimize edilebilir biyojenik NP sentezini destekler.

Protokol

Araştırma, Escuela Superior Politécnica del Litoral (ESPOL, Ekvador Kurumu) kurumsal yönergelerine uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Bu çalışmada kullanılan bitki, alg ve mantar biyokütlesi erişilebilir ortamlardan toplanmış ve korunan türler veya kısıtlı alanlar içermemiştir. Kurumsal ve ulusal düzenlemelere göre, bu koşullar altında serbest bulunan biyokütle toplamak için özel bir izin gerekmemektedir. Bitki, alg, mantar ve bakteri biyolojik sistemler kullanılarak AgNP ve AuNP'lerin yeşil sentezi için kullanılan entegre deneysel iş akışı için Şekil 1'e bakınız.

Şekil 1: Biyolojik sistemler kullanılarak gümüş (Ag) ve Altın (Au) nanopartiküllerinin (NP) yeşil sentezi için entegre iş akışı. Bitki, alg, mantar ve bakteri sistemleri kullanılarak AgNP ve AuNP'lerin yeşil sentezi için deneysel iş akışının şeması. İş akışı, biyolojik kaynak seçimini, özet veya biyokütle hazırlamayı, metal öncülleriyle reaksiyonu (AgNO₃ veya HAuCl₄) ile reaksiyonu, reaksiyon koşullarını ve NP oluşumunu gösterir. Biyolojik sistemler arasında Psidium guayaquilensis yaprak öztü, Acanthophora spicifera alg özlü, Earliella sp. hücredışı filtrat ve Shewanella oneidensis MR-1 bakteri kültürleri yer alır. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

NOT: Kimyasallar ve biyolojik malzemelerle çalışırken tüm kurumsal laboratuvar güvenlik yönergelerine uyun. Kullanımdan önce tüm reaktifler için güvenlik veri sayfalarına bakın.

1. P. guayaquilensis yaprakları kullanılarak AgNP'lerin Sentezi

1. Yaprak Koleksiyonu
   1. Kuru mevsimde Guayaquil, Guayas Eyaleti, Ekvador'da (2°10′G, 80°0′B) P. guayaquilensis taze yapraklarını toplayın.
      NOT: Bu endemik türün kupon örnekleri GUAY Herbaryumu, Guayaquil Üniversitesi Doğa Bilimleri Fakültesi, Ekvador'da ve New York Botanik Bahçesi (NYBG) STEERE HERBARIUMU'NDA New York, ABD'de depolanmıştır. Ek bilgiler şu adresten mevcuttur: http://sweetgum.nybg.org/science/vh/specimen-details/?irn=2602207
2. Yaprak Özünün Hazırlanması
   1. Taze bitki malzemesini damıtılmış suyla iyice yıkayın.
      NOT: Yüzey safsızlıklarının tamamen temizlenmesinden emin olun.
   2. Yaprakları 40°C'de zorunlu hava akışıyla bir tepsi kurutucuda kurutun.
      NOT: Düşük kurutma sıcaklıkları, Ag⁺ indirgemesinde yer alan termolabile organik bileşiklerin bozulmasını en aza indirir.
   3. Kurutulmuş malzemeyi el değirmeniyle öğüterek ince bir toz elde edin.
   4. 200 mL damıtılmış suya 10 g toz malzeme askıya alın.
   5. Süspansiyonu 70°C'de sürekli karıştırarak 1 saat ısıtın.
   6. Ekstraktın oda sıcaklığına (RT, ~28°C) soğumasına izin verin.
   7. Ekstraktı vakumda, nitelikli filtre kağıdı (1. sınıf, gözenek boyutu 11 μm, çapı 110 mm) üzerinden filtreleyin.
      NOT: Bitkisel materyalden tüm katı kalıntıları çıkarın.
   8. Filtrelenmiş ekstraktı 4°C sıcaklığında kehribar şişelerde daha fazla kullanıma kadar saklayın.
3. Yaprak Özleri Kullanılarak Fitojenik AgNP'lerin Üretimi
   NOT: Optimizasyon deneyleri sırasında, kalan parametreleri sabit tutarken her testte bir parametre değiştirin. Gümüş nitrat (AgNO₃) konsantrasyonu (1–5 mM), ekstrakt fraksiyonu (%10–%50 v/v), reaksiyon süresi (0,5–1 saat) ve sıcaklık (25°C–80°C) değerlendirin. Merkezi bileşik DoE'ye dayalı yanıt yüzeyi metodolojisi kullanarak sentez parametrelerini optimize edin. Her faktörü beş seviyede (-α, -1, 0, +1 ve +α) inceleyin. Yüzey plazmon rezonansı (SPR) zirvesinin (λ_SPR) dalga boyunu, NP boyutuyla korelasyon, yanıt^{değişkeni 24} olarak kullanılır. Deneysel tasarım, 16 faktöryal nokta, 8 eksenel nokta ve 5 merkez noktası replikasyonundan oluşur ve toplamda 29 deney elde edilir.
   1. _{AgNO 3} çözeltilerini, uygun AgNO₃ kütlesini damıtılmış suda çözerek 1 ile 5 mM arasında konsantrasyon elde ederek hazırlayın.
      DIKKAT: AgNO₃ aşındırıcı ve cilt ile göz tahrişine neden olabilecek güçlü bir oksitleyici maddedir. Eldiven ve göz koruma gibi uygun kişisel koruyucu ekipman giyin. Tışığa maruz kalmaktan kaçının ve Ag içeren atıkları kurumsal güvenlik yönergelerine uygun olarak bertaraf edin.
   2. AgNO₃ çözeltisini bitki özeti ile karıştırarak ekstrakt fraksiyonları %10 ile %50 (v/v) arasında elde edilir.
   3. Reaksiyon karışımını seçilmiş sıcaklıkta (25°C–80°C) istenen reaksiyon süresi (0,5–1 saat) boyunca ısıtın ve karıştırın.
   4. Reaksiyon karışımının RT pozisyonunda 24 saat beklemesine izin verin.
   5. Kahverengi reaksiyon karışımını 1660 × g ile RT'de 15 dakika boyunca santrifüjleyin. Üst reaksiyayı atın ve katı fraksiyonu toplayın.
   6. Kurtarılan NP'leri 60°C'de fırında kurutun.

2. A. spicifera alg özleri kullanılarak AgNP'lerin sentezi

1. Alg Koleksiyonu
   1. Ekvador'un Santa Elena Eyaleti, Valdivia'da (1°57′23.91′′B, 80°43′51.33′′B) A. spicifera algleri toplanır.
2. Alg Ekstraktının Hazırlanması
   1. Alg ekstraktını Adım 1.2'de tarif edilen prosedürü takip ederek hazırlayın. Bitki yapraklarını A. spicifera alg biyokütlesiyle değiştirin.
3. Alg Ekstraktları Kullanılarak Fikojenik AgNP'lerin Üretimi
   NOT: Kalan parametreleri sabit tutarken bir parametreyi değiştirerek 12 deney serisi gerçekleştirin. AgNO₃ konsantrasyonu (1–5 mM), ekstrakt fraksiyonu (%5–%25 v/v), reaksiyon süresi (1–4 saat) ve sıcaklık (25°C–70°C) değerlendirin.
   1. _{AgNO 3} çözeltileri ve alg ekstraktını Adım 1.3.1 ve 2.2'de açıklandığı şekilde hazırlayın.
   2. AgNO₃ çözeltisini alg özeti ile karıştırarak %5–%25 (v/v) ekstrakt fraksiyonu elde edinin. Reaksiyon karışımını seçilmiş sıcaklıkta (25°C–70°C) istenen reaksiyon süresi (1–4 saat) boyunca ısıtıp karıştırın.
   3. Çözeltiyi 24 saat boyunca RT olarak soğut. Santrifüjlemeden sonra katı fraksiyonu toplayın ve Adımlar 1.3.5 ve 1.3.6'da açıklandığı gibi fırında kurutulun.

3. Earliella sp. kullanılarak AgNP'lerin Sentezi.

1. Kültür Koleksiyonu ve Bakımı
   1. Earliella sp.'nin aktif olarak büyüyen miselyal parçalarını Patates Dekstroz Agar plakalarına aktarın.
      NOT: Bu çalışmada kullanılan mantar suşu, ESPOL kampüsünde toplanan çevresel örneklerden izole edilmiştir. İzolat, morfolojik özelliklere dayanarak taksonomik olarak tanımlanmış ve Ekvador Biyoteknoloji Araştırma Merkezi'nin (CIBE, ESPOL) kültür koleksiyonunda E2 iç kodu altında korunmuştur. Bu suş kurumsal bir koleksiyonda tutulduğu ve uluslararası bir depoya depolanmadığı için RRID veya harici erişim numarası mevcut değildir.
   2. Plakaları 28°C'de 48 saat kuluçka edin.
   3. Bir miselyal parçayı Patates Dekstroz Buloruna aktarın ve kültürü 5 gün boyunca 150 rpm'de sürekli çalkalama altında kuluçka yapın.
      NOT: Bu adım, biyokütle üretimini ve hücre dışı metabolitlerin salgılanmasını teşvik eder.
   4. Mantar kültürünü steril filtre kağıdından filtreleyerek miselel biyokütlesini hücre dışı çorbadan ayırın. Sonraki NP sentezi için filtratı toplayın.
      NOT: Hücre dışı çorba, AgNP sentezi sırasında indirgeci ve stabilize edici ajan olarak işlev gören biyomoleküller içerir.
2. Mikojenik AgNP'lerin Üretimi
   NOT: Mantar suyu ile_{AgNO 3} çözeltisi arasında sabit hacim oranlarını koruyarak her test başına bir parametreyi değiştirerek 14 deneysel koşul oluşturun. _{AgNO 3} konsantrasyonu (1–10 mM), pH (HCl veya NaOH ile ayarlanmış 4–10), reaksiyon süresi (1–4 saat) ve sıcaklık (25°C–70°C) değerlendirin.
   DIKKAT: Hidroklorik asit (HCl) ve sodyum hidroksit (NaOH) son derece aşındırıcı özelliklere sahiptir. Uygun kişisel koruyucu ekipman giyin ve sürekli karıştırma altında pH ayarlamalarını yavaş yapın, böylece sıçrama ve yerel aşırı ısınmayı önleyin. pH ayarlaması sırasında 1 M asit veya baz çözeltisi kullanın.
   1. Mantar ekstrasellüler suyunu, istenen konsantrasyonda (1–10 mM) AgNO₃ çözeltisiyle karıştırın; hacim oranı %2,5 ile %10 (v/v) arasında bir oran kullanılarak nihai reaksiyon hacmi 50 mL elde edilir. Test edilen deneysel koşullara göre son reaksiyon hacmini ayarlayın.
   2. Reaksiyon karışımını seçilen sıcaklıkta (25°C–70°C) istenen reaksiyon süresi (1–4 saat) boyunca karıştırın. Çözeltiyi 24 saat boyunca RT olarak soğut. Santrifüjlemeden sonra katı fraksiyonu toplayın ve Adımlar 1.3.5 ve 1.3.6'da açıklandığı gibi fırında kurutulun.

4. C. metallidurans ve S. oneidensis kullanılarak AuNP sentezi

1. Kültür Koleksiyonu ve Bakımı
   1. %20 gliserolde −80°C'de C. metallidurans CH34 veya S. oneidensis MR-1 ile korunan donmuş hücre stokları, aerobik koşullarda triptik soya agar plakalarına aşılanmıştır. Plakaları 28°C'de 24 saat kuluçka edin.
   2. Her plakadan ayrı bir koloni seçin ve aerobik koşullarda 250 mL triptik soya suyu çorbasına aşılayın. Kültürü 28°C'de 120 rpm'de çalışan döner sallayıcıda kuluçka edin.
   3. Hücreler, 72 saatlik kuluçkadan sonra, optik yoğunluğun 610 nm (OD₆₁₀) yaklaşık 1'e ulaştığı sabit fazda hasat edilir. Kültürleri 10000 × g sıcaklığında ~20°C'de 10 dakika boyunca santrifüj yapın.
   4. Toplanan pelletleri steril %0,9 (w/v) NaCl çözeltisiyle iki kez yıkayın. Yıkanmış hücreleri yaklaşık 7 OD₆₁₀ değerine konsantre edin.
   5. Süspansiyonları gazdan ayırarak ve başlık boşluğunu N₂ gazla doldurarak anoksik konsantre hücre stokları üretin.
2. Bakteriyojenik AuNP'lerin Üretimi
   NOT: AuNP sentezi üzerindeki çevresel faktörlerin etkisini değerlendirmek için kesir-faktörel matris kullanın²⁵. Matrisi önceki çalışmalara göre seçilen 2 seviyede 7 faktör kullanarak oluşturun^26,27. Deneyleri ortogonal bir matrikste düzenleyin ve deneme kombinasyon yanlılığını en aza indirmek için deneysel sırayı rastgele yapın. Ortaya çıkan deneysel sıra, şu şekilde sunulmaktadır: Tablo 1.
   1. Altın klorür trihidratı (HAuCl₄) deyonize suda çözerek 5 g L⁻¹ seviyesinde stok çözeltisi hazırlanır.
      DIKKAT: HAuCl₄ toksiktir ve güçlü bir oksitleyicidir. Tüm çözeliyleri, uygun kişisel koruyucu ekipman takarak sertifikalı kimyasal bir duman kapasonu içinde kullanın; bu ekipman laboratuvar önlüğü, eldiven ve koruyucu gözlükler dahil. Organik malzemelerle temas kurmaktan kaçının ve atıkları kurumsal tehlikeli atık protokollerine uygun olarak bertaraf edin.
   2. Deneysel reaktörleri, stok çözeltisini hedef konsantrasyona %0,9 (w/v) NaCl çözeltisinde seyreltirerek ve pH ayarlamasını Tablo 1'de listelenen deneysel koşullara göre ayarlayarak hazırlayın.
   3. Hazırlanan metal çözeltiyi 50 mL temiz 120 mL serum şişelerine dağıtın. Her şişeyi hemen bütil kauçuk stoper ile kapatın.
   4. Stopperi alüminyum bir sıkma contası ve elde taşınan bir sıkma makinesiyle sabitleyin. Kapalı serum şişelerini 121°C'de 21 dakika otoklavlayarak sterilize edin.
   5. Şişelerin RT'ye kadar soğumasına izin verin ve her şişede yağıntı olup olmadığını görsel olarak inceleyin.
      NOT: Görünür yağıntı gösteren şişeleri atın ve yedek reaktörleri hazırlayın.
   6. Anoksik Koşulların Oluşması
      1. Her sterilize serum şişesini, yüksek saflıkta azot (_{N 2}) kaynağı ve vakum pompası ile donatılmış bir gaz manifold sistemine bağlayın.
      2. Anoksik koşullar gerektiren her reaktör için ardışık 21 arındırma döngüsü uygulayarak Tablo 1'e göre anoksik bir headspace oluşturun. Her döngü sırasında, iç basınç yaklaşık atmosfer basıncına (~1 atm) dönene kadar yaklaşık 30 saniye boyunca vakum uygulanır ve ardından azot dolgusu uygulanır.
         NOT: Anoksik koşulların doğrudan doğrulanması zorunlu değildir; Ancak, gerekirse oksijen çıkarımı doğrulamak için gaz kromatografisi gibi baş boşluğu gaz analizi kullanılabilir.
         DIKKAT: Azot gazı, kapalı alanlarda oksijeni yerinden geçirebilir ve boğulma tehlikesi yaratabilir. Yeterli laboratuvar havalandırmasını sağlayın ve kullanmadan önce güvenli gaz hattı bağlantılarını kontrol edin.
      3. Son temizlik döngüsünden sonra reaktörleri hafif pozitif N₂ basıncı altında tutun.
      4. Reaktörleri deneysel sıraya göre 1–8 arası etiketleyin. Örneğin, beşinci deneysel koşulu R5 olarak etiketleyin.
   7. Elektron Donörlerinin Eklenmesi ve Aşılama
      1. Tablo 1'e göre belirlenen reaktörlerin sıvı fazına gerekli hacmi steril bir şırınga ve iğne ile enjekte etmek üzere sodyum laktat gibi steril anoksik sıvı elektron donör çözeltisi.
      2. Gaz geçirmez bir şırınga ile H₂ gibi gaz halindeki elektron donörü hacmini, belirlenen reaktör baş boşluğuna enjekte edin.
      3. Tüm biyotik reaktörleri, gerekli yoğunlaştırılmış anoksik mikrobiyal stok kültürünün aseptik enjekte edilmesiyle sıvı faza aşılanın.
         NOT: Yoğun stok kültürlerini aşılamadan önce 4°C'de saklayarak hücre canlılığını koruyun.
   8. Kontrol Deneylerinin Kurulumu
      1. Mikrobiyal inokulumu eşdeğer miktarda steril anoksik kültür ortamı veya tampon ile değiştirerek Adım 4.2'de açıklanan tüm adımları takip ederek abiotik kontrol hazırlayın.
      2. Otoklavlama ile sterilize edilmiş bir aşı kullanarak Adım 4.2'de açıklanan tüm adımları takip ederek öldürülmüş hücre kontrolü hazırla.
         NOT: Kontrolleri abiotik metal indirgemesi ve biyosorpsiyonu hesaba katmak için kullanın. Aktif mikrobiyal mekanizmaların katkısını değerlendirmek için 121°C'de 21 dakika boyunca canlı hücre stoklarını otoklavlayarak öldürülmüş hücre kontrolünü hazırlayın.
   9. Kuluçka ve Tepki Süresi
      1. Tüm serum şişelerini sıcaklık kontrollü kuluçka makinelerine yerleştirin.
      2. Kuluçka sıcaklığını, Tablo 1'de belirtilen deneysel koşullara göre ayarlayın.
      3. İnkübatörleri döner sallayıcı platformlara yerleştirin ve reaktörleri 120 rpm'de kuluçka yapın.
      4. Reaksiyonların 72 saat boyunca devam etmesine izin verin.
         NOT: Kuluçkadan sonra deneyi durdurun ve serum şişelerini örnek işlemeye kadar 4°C'de saklayın.
         NOT: Metal çıkarma verimliliğini değerlendirmek ve NP oluşumunu çözünmüş türlerden ayırmak için indüktif bağlı plazma optik emisyon spektroskopisi kullanarak NP biyosentezinden sonra kalıntı çözünmüş metali nicelikle niceleştirebilirsiniz.
3. Optimal Koşulların Çoğaltılması
   1. Birincil tarama ve veri analizinden sonra maksimum metal çıkarımı ile ilişkili reaktör durumunu belirleyin.
   2. Seçilen optimal koşulu üç bağımsız reaktör şişesinde çoğaltarak tekrarlanabilirliği doğrulayın.
   3. Üçlü doğrulama deneyleri için hazırlık, reaktör kurulumu ve kuluçka prosedürlerini Adımlar 4.1 ve 4.2'ye göre gerçekleştirin.
      NOT: Deneyler tamamlandıktan sonra, çözünmüş tüm çözeltileri geçici olarak sulu atık olarak depolayın ve ulusal Organik Çevre Kodu ve kurumsal teknik yönergeler doğrultusunda sertifikalı atık yönetim şirketleri tarafından bertaraf edilene kadar etiketleyin.

Reaktör / Bakteri	Sıcaklık (°C)	Atmosfer	Elektron bağışçısı	Optik yoğunluk (OD610)	pH	[Altın] (mM)
1 / CMC	37	N2	H2	0.5	1	2
2 / CMC	28	N2	C3H5O3−	1	1	0.2
3 / SOM	37	O2	C3H5O3−	0.5	1	0.2
4 / CMC	28	O2	H2	1	1	2
5 / SOM	37	N2	H2	1	5	0.2
6 / CMC	37	O2	C3H5O3−	1	5	2
7 / SOM	28	N2	C3H5O3−	0.5	5	2
8 / CMC	28	O2	H2	0.5	5	0.2

Tablo 1: Bakteriyojenik AuNP sentezi için kullanılan kesiri faktöryal deneysel tasarım. Bu tablo, S. oneidensis MR-1 (SOM) veya C. metallidurans CH34 (CMC) kullanılarak AuNP sentezi için değerlendirilen deneysel koşulları özetlemektedir. Değişkenler arasında kuluçka sıcaklığı, headspace atmosferi, elektron donörü, inokulum optik yoğunluğu (OD₆₁₀), çözelti pH ve başlangıç Au³⁺ konsantrasyonu yer alıyordu.

5. AgNP ve AuNP'lerin Karakterizasyonu

NOT: Yüzey plazmon rezonansı yoluyla NP oluşumunu doğrulamak için ultraviyole görünür (UV–Vis) spektroskopiyi erişilebilir bir yöntem olarak kullanın. NP morfolojisini ve boyutunu doğrudan değerlendirmek için transmisyon elektron mikroskopisi (TEM) kullanın. Daha kapsamlı karakterizasyon gerektiğinde boyut dağılımı, kristallik, yüzey kimyası ve element bileşimi değerlendirilmek için dinamik ışık saçılması (DLS), X-ışını kırınımı (XRD), Fourier dönüşümü kızılötesi (FTIR) spektrostroskosi ve enerji dağılım X-ışını spektroskopisi (EDS) gibi tamamlayıcı teknikler kullanılarak ek fizikokimyasal karakterizasyon^{yapılabilir 28,29}.

1. UV–Vis Spektroskopisi
   1. Enstrüman Kurulumu
      1. UV–Vis spektrofotometresini açın ve sinyal stabilitesini sağlamak için cihazın en az 15 dakika ısınmasına izin verin.
      2. Spektral tarama modunu seçin ve dalga boyu aralığını 1 nm veri aralığı kullanarak 300 ile 800 nm arasında yapılandırın.
2. Örnek Hazırlama
   1. Yeni sentezlenmiş AgNP veya AuNP askıya alma asarlarını toplayın. Gerekirse örnekleri damıtılmış suyla seyrelterek doğrusal algılama aralığında soğurma değerlerini koruyun.
3. NP'lerin UV–Vis Ölçümü
   1. Boş çözelti olarak damıtılmış su kullanarak temel düzeltme yapın.
   2. Hazırlanan örneği bir küvete aktarın, küveti numune tutucuya yerleştirin ve UV–Vis spektrumunu 300–800 nm aralığında kaydedin.
   3. NP oluşumuna karşılık gelen SPR bandını belirleyin.
      NOT: AgNP'ler genellikle 405 ile 425 nm arasında SPR bantları gösterirken, AuNP'ler genellikle 520 ile 550 nm arasında SPR bantları gösterir.
4. Geçirim Elektron Mikroskopisi
   NOT: 80 kV'da çalışan ve yüksek çözünürlüklü dijital kamera ile donatılmış TEM kullanarak NP morfolojisi ve boyutunu analiz edin.
   1. 1.5 mL NP süspansiyonunu santrifüj tüpüne aktarın ve 5000 × g ile 5 dakika RT'de santrifüj yapın.
   2. Süpernatantı atın ve pelleti kalın.
   3. 0,1 M kakodilat tamponunda hazırlanmış %4 paraformaldehit ve %5 glutaraldehit içeren 1 mL fiksasyon çözeltisi pellete ekleyin. Örneği RT'de 25 saat kuluçka edin. Sonra pelleti gece boyunca 0.1 M sodyum kakodilat tamponu ile yıkayın.
   4. Örneği 5000 × g ile 5 dakika boyunca santrifüjle yapın ve süpernatantı atın.
   5. 3 saat fiksasyon için 0,1 M sodyum kakodilat tamponunda hazırlanmış 1 mL %1 (w/v) osmiyum tetroksit (OsO₄) ekleyin.
      DIKKAT: OsO₄ son derece toksik ve değişkendir. Tüm çözümleri yalnızca sertifikalı kimyasal bir duman kapasonu içinde kullanarak, laboratuvar önlüğü, eldiven ve koruyucu gözlük gibi uygun kişisel koruyucu ekipmanları takın.
   6. Örneği 5000 × g ile 5 dakika boyunca santrifüjle yapın ve süpernatantı atın.
   7. Numuneyi derecelendirilmiş etanol serisi kullanarak kurutun. %50 etanol ekleyin, 15 dakika kuluçka yapın. İşlemi %70 ve %90 kullanarak ardışık olarak tekrarlayın. Her kuluçka başına 30 dakika boyunca ardışık üç mutlak etanol kuluçka ile tam dehidrasyon.
   8. Üreticinin talimatlarına göre peleti RT'de epoksi reçinesine gömül.
   9. Yarı ince kesitler (~1 μm) hazırlayın ve ön gözlem için bölümleri toluidin mavisiyle boyanın.
   10. Ultra ince kesimler (~60 nm) elmas bıçakla kesin ve bölümleri uranil asetat ile boyan, ardından kurşun sitratla boyan.
   11. Bölümleri TEM ızgaralarına monte edin ve iletim elektron mikroskobuna yükleyin.
   12. NP morfolojisini ve boyutunu değerlendirmek için TEM görüntüleri edinin.

Sonuçlar

AgNP'ler, farklı biyolojik indirgeme ajanları kullanılarak yeşil ve biyosentetik yollarla başarıyla sentezlendi ve her yöntem için ideal sentez koşulları belirlendi. P. guayaquilensis yaprak özdünün aracılık ettiği yeşil sentezde, optimal koşullar 5 mM AgNO₃ konsantrasyonu, %25 (v/v) ekstrakt-metal çözelti oranı, 80°C reaksiyon sıcaklığı ve 60 dakikalık çalkalanma süresi ile 24 saat dinlenme süresinden oluşuyordu. Bu koşullar altında, UV–Vis spektroskopisi 416 ile 425...

Tartışma

Değerlendirilen sentez yollarını fizibilite, NP boyut kontrolü, işletme maliyeti, tekrarlanabilirlik ve genel süreç verimliliği açısından karşılaştırıldığında, P. guayaquilensis yaprak özdünün kullanıldığı bitki aracılı sentez, incelenen AgNP sentez yöntemleri arasında en elverişli dengeyi göstermiştir. Bu protokol, uzun süreli biyolojik yetiştirme olmadan ılıman koşullarda çalışırken sistematik optimizasyon ve doğrudan mikroskobik karakterizasyon yoluyla NP boyutunun daha iyi k...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Absolute ethanol	Merck	E7023	TEM dehidrasyon serisi
Alüminyum sızdırmazlık contaları	Dwk Wheaton	224178-01	Serum şişeleri için
Kestane rengi cam şişeler	Duran	2180154	Işığa karşı korunmuş depolama
ATR-FTIR spektrometre	Thermo Scientific	Nicolet iS10	Spectral range: 300–3600 cm-1
Otoklaf	Yamato	SM300	121 °C'de sterilizasyon
Butil kauçuk tıkaçlar	Dwk Kimble	73827-21	Gaz geçirmez sızdırmazlık
Santrifüj	BIOBASE	BKC-TH20RL	Tezgah üstü santrifüj
Kloroaurik asit trihidrat (HAuCl4·3H2O)	Sigma-Aldrich	27988-77-8	Altın öncüsü
Elmas bıçak	Aurion	Dyatom 45	Ultra ince TEM kesimi
Damıtılmış veya deionize su	Methrom	N/A	Çözelti hazırlama
Epoksi reçine (EMBED 812/Epon)	Aurion	EMBED 812	TEM gömme ortamı
Filtre kağıdı, nitelikli Grade 1	Merck Whatman	WHA1001110	Gözeni boyutu: 11 µm; çapı: 110 mm
Fourier dönüşümlü kızılötesi spektrometre (FTIR)	Thermo Scientific	Nicolet iS10	Spectral range: 300–3600 cm-1
Gaz manifold sistemi	Özel yapım	N/A	Temizleme döngüleri için
Gaz geçirmez şırınga	Hamilton	1001 RN	1 mL
Glutaraldehit	VWR	219859510	0.1 M Sodyum Kakodilat Tamponunda %5 Glutaraldehit, %4 paraformaldehit
Gliserol	Sigma-Aldrich	G5516	%20 stok koruma
Elde taşınabilir sızdırmazlık aleti	Biomed	USYGQ-20Z	Serum şişelerinin sızdırmazlık sızdırmazlığı
El değirmeni/öğütücü	Corona	L10000	Bitki biyokütlesi öğütme
Hidroklorik asit (HCl)	Merck	320331	pH ayarı
Hidrojen (H2) gazı	Linde	Endüstriyel sınıf	Elektron donör gazı
ICP-OES sistemi	Varian	Vista-MPX	Metal kantifikasyonu
İnkübatör	Memmert	SM 400	Sıcaklık kontrollü inkübasyon
Laboratuvar fırını	Barnstead	M100	Nanopartiküllerin kurutulması
Kurşun sitrat	Merck	7398	TEM boyama
Nitrit asit (HNO3)	Chem-Lab	CL00.0125	Asit reaktifi
Azot (N2) gazı	Linde	Endüstriyel sınıf	Anoksik koşullar
Osmiyum tetroksit (OsO4)	Merck	201030	TEM fiksasyonu
Paraformaldehit	VWR	101176-014	0.1 M Sodyum Kakodilat Tamponunda %5 Glutaraldehit, %4 paraformaldehit
Patates Dekstroz Agar (PDA)	Merck	110130	Mantar yetiştirme
Patates Dekstroz Broth (PDB)	Merck	P6685	Mikrobiyolojik ortam
Döner şekerleyici	JoanLab	OS-20Pro	Kontrollü çalkalama ile inkübasyon
Serum şişeleri (120 mL)	Wheaton	223748	Borosilkat cam
Gümüş nitrat (AgNO3)	Sigma-Aldrich	209139	ACS reaktifi, ≥99.0%
Sodyum kakodilat tamponu	VWR	11650	0.1 M Sodyum Kakodilat Tamponunda %5 Glutaraldehit, %4 paraformaldehit
Sodyum klorür (NaCl)	Carl Roth	3957.1	%0.9 yıkama çözeltisi
Sodyum hidroksit (NaOH)	Sigma-Aldrich	S5881	pH ayarı
Sodyum laktat	Sigma-Aldrich	L7022	Elektron donör/karbon kaynağı
Steril şırınga ve iğneler	BD	Çeşitli	Steril sıvı kullanımı
Kısık ateş plaka karıştırıcı	Biologix	01-310X	Isıtma ve çalkalama
Toluidin mavisi	EMS	DcU-10	Yarı ince kesit boyama
Geçiş elektron mikroskobu (TEM)	FEI	Tecnai Spirit Twin G20	Yüksek çözünürlüklü dijital kamera ile donatılmış
Zorunlu hava akımlı tepsi kurutucu	El yapımı	N/A	40 °C'de biyokütle kurutma
Triptik Soya Agar (TSA)	Oxoid	CM01301	Mikrobiyolojik ortam
Triptik Soya Broth (TSB)	Carl Roth	X938.1	Mikrobiyolojik ortam
Uranil asetat	Sigma-Aldrich	94260 Fluka	TEM boyama
UV–Vis spektrofotometre	Thermo Scientific	Genesys 10S	UV–Vis spektral analizi
Vakum pompası	KNF veya eşdeğeri	N 820 G	Anoksik koşullar için
Biyolojik Malzemeler
Biyolojik Malzeme	Kaynak	Kimlik	Yorumlar/Açıklama
Acanthophora spicifera	Yerel koleksiyon	N/A	Deniz alal biyokütlesi
Cupriavidus metallidurans CH34	SCK-CEN	LMG 1195	B