Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Araştırma makalesi

Spontan intraserebral kanamadan sonra nozokomial akciğer enfeksiyonu ile ilişkili sitokinler ve inflamatuar gen polimorfizmleri

27 görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/70761

⸱

4 Ağustos 2026

 ,  ,  , 
1Department of Clinical Laboratory, Affiliated Hospital of Jiaxing University, The First Hospital of Jiaxing

Bu makalede

Özet

Bu retrospektif çalışma, erken hastane sonrası kan alımı, serum sitokinleri ve Toll-benzeri reseptörlerin ölçümü, inflamatuar gen polimorfizmlerinin genotiplenmesi ve spontan intraserebral kanaması olan hastalarda enfeksiyon riski değerlendirmesi için tekrarlanabilir bir iş akışı sunmaktadır.

Özet

Nozokomial akciğer enfeksiyonu, spontan intraserebral kanamadan sonra sık görülen bir komplikasyondur ve nörolojik iyileşmeyi kötüleştirebilir, hastanede yatışı uzatabilir ve klinik yükü artırabilir. Bu retrospektif klinik-laboratuvar çalışması, primer spontan intraserebral kanamadan sonra nozokomial akciğer enfeksiyonu ile ilişkili inflamatuar biyobelirteç ve konak bağışıklık genetik profillerini değerlendirmek için tekrarlanabilir bir iş akışı sunmaktadır. Hastalar, hastaneye kabul edildikten sonra nozokomial akciğer enfeksiyonu olup olmadığına göre sınıflandırılır. Periferik venöz kan, standart önce-analitik koşullarda erken doğum sonrası dönemde toplanır. Serum ayrılır, alkotlenir ve IL-1β, IL-6, IL-10, IL-17, IFN-γ, TNF-α, TLR2, TLR4 ve TLR9 enzim bağlantılı immünosorbent testi ölçümü için saklanır. Paralel olarak, antikoagüllenmiş tam kandan genomik DNA çıkarılır ve seçilmiş sitokin ve Toll benzeri reseptörle ilişkili lokusların polimeraz zincir reaksiyon-krestriksiyon parça uzunluğu polimorfizmi genotipi için kullanılır. İş akışı ayrıca örnek işleme, tekrarlanan ELISA ölçümleri, DNA saflığı değerlendirmesi, genotip çağrısı ve tekrar genotipleme için kalite kontrol prosedürlerini içerir. İstatistiksel analiz, klinik özellikler ve biyobelirteç seviyelerinin gruplar arası karşılaştırılması, Hardy-Weinberg denge testi, genotip ve allel ilişkileri için lojistik regresyon analizi, ilgili klinik kovaryatlar için ayarlama ve çoklu genetik karşılaştırmalar için yanlış keşif oranı düzeltmesini içerir. Bu birleşik klinik, iltihaplayıcı ve bağışıklık genetik iş akışı, spontan intraserebral kanamadan sonra enfeksiyon risk profillerinin karakterize edilmesine yardımcı olabilir, ancak rutin klinik uygulamadan önce prospektif çok merkezli doğrulama gereklidir.

Giriş

Kendiliğinden beyin içi kanama (ICH), beyin damarlarının travmatik olmayan yırtılması sonucu oluşan ağır bir inme alt tipidir ve nörolojik ölüm ve engelliliğin önemli bir kaynağı olmaya devam eder. Klinik olarak, ICH genellikle birincil veya ikincil olarak sınıflandırılır. Birincil ICH çoğu vakayı oluşturur ve esas olarak hipertansif arteriopati veya serebral amiloid anjiyopatiile ilişkilidir 1. Buna karşılık, ikincil ICH yapısal veya hematolojik nedenlerle ilişkilidir; bunlar arasında anevrizmalar, arteriyovenöz malformasyonlar, Moyamoya hastalığı ve pıhtılaşma bozuklukları bulunur. ICH, tüm inme olaylarının iskemik felmeden daha küçük bir oranını oluştursa da, orantısız derecede yüksek kısa vadeli ölüm oranı ve uzun vadeli fonksiyonel yük taşır 2,3,4,5.

ICH sonrası hastanedeki başlıca komplikasyonlar arasında nozokomial akciğer enfeksiyonu özellikle sıkça ve klinik olarak önemlidir. Önceki çalışmalar, inme veya beyin içi kanamadan sonra hastaneye yatırılan hastaların önemli bir kısmında akciğer enfeksiyonun meydana gelebileceğini ve bunun daha uzun hastanede yatış, daha büyük tıbbi yük, daha kötü nörolojik iyileşme ve artan ölüm oranı ile ilişkili olduğunu göstermiştir 6,7,8. Bu komplikasyonun klinik önemi sadece solunum yönetiminin ötesine geçmektedir. Bilinç azalması, yutma ve öksürük reflekslerinin bozulması, immobilizasyon, mekanik hava yolu desteği ve invaziv drenaj prosedürleri, ICH sonrası akut evrede enfeksiyon riskini artırabilir. Aynı zamanda, akciğer enfeksiyonu sistemik iltihabı daha da kötüleştirebilir, oksijen dağıtımını bozabilir ve nörokritik bakımı karmaşıklaştırarak ikincil yaralanma süreçlerini artırabilir.

Bu ilişki biyolojik olarak makul çünkü ICH sadece fokal bir serebrovasküler olay değil, aynı zamanda sistemik bağışıklık düzensizliğinin tetikleyicisidir. Akut beyin kanaması, inflamatuar zincirleri aktive edebilir, doğuştan gelen bağışıklık sinyallerini değiştirebilir ve nöroinflamasyon ile periferik konak savunması arasındaki dengeyi bozabilir. Bu bağlamda, benzer klinik yönetim altında bile bazı hastalar hastanede edinilmiş enfeksiyonlara karşı daha yatkın hale gelebilir. Bu nedenle, ICH sonrası akciğer enfeksiyonu yalnızca yatak başı maruziyeti veya destekleyici bakım sonucu olarak görülmemelidir; Ayrıca konak inflamatuar aktivasyonu ve bağışıklık tepkisi farklılıklarını da yansıtabilir.

Bu komplikasyonun klinik önemine rağmen, erken risk tabakalaştırması için pratik yaklaşımlar sınırlıkalmaktadır 9. ICH sonrası akciğer enfeksiyonu için mevcut klinik risk tabakalaştırma yaklaşımları genellikle nörolojik şiddet, yaş, yutma bozukluğu, eşlik hastalıkları, invaziv işlemler ve cihaz maruziyeti süresi gibi yatak başı ve yatışla ilgili değişkenlere dayanır. Bu araçlar acil durum, yoğun bakım veya nörokritik bakım ortamlarında hızla uygulanabildikleri için klinik olarak faydalıdır. Ancak, yalnızca klinik değişkenler karşılaştırılabilir nörolojik şiddete ve benzer bakım maruziyetine sahip hastaların neden farklı enfeksiyon sonuçları gösterdiğini tam olarak açıklayamayabilir. Bu nedenle, inflamatuar biyobelirteçler ve konak bağışıklık genetik faktörleri, özellikle erken yatırılma sonrası dönemde, önleyici gözetim ve solunum yönetimi kararları alınırken biyolojik yatkınlık hakkında ek bilgi sağlayabilir.

Sitokinler, bağışıklık ve inflamatuar yanıtların merkezi aracılarıdır ve Toll-benzeri reseptör (TLR) yolları patojenin tanınması ve doğuştan gelen bağışıklık aktivasyonunda önemli roller oynar. Serum sitokin ve TLR protein ölçümleri, erken sistemik inflamatuar aktivasyonun anlık görüntüsünü sağlayabilirken, seçilmiş bağışıklık gen polimorfizmaları sitokin üretimi, reseptör sinyalleri veya inflamatuar düzenlemede daha stabil konak farklarını yansıtabilir. Sadece klinik değerlendirmeyle karşılaştırıldığında, birleşik bir biyobelirteç ve polimorfizm iş akışı hem mevcut inflamatuar durumu hem de her hastanın altta yatan bağışıklık yanıtını yakalayabilir. Bu yaklaşım, yatak başı klinik değerlendirmenin yerini almak için değil, spontan ICH sonrası daha yakın enfeksiyon gözetimi gerektiren hastaları tanımlamaya yardımcı olabilecek laboratuvar ve konak genetik bilgileri ekleyerek bunu tamamlamak için tasarlanmıştır.

Bu temelde, spontan ICH'li ve nozokomial akciğer enfeksiyonu geliştiren hastaların, enfeksiyondan uzak kalan hastalara kıyasla seçilmiş bağışık genetik polimorfizmlerin farklı dağılımıyla belirgin bir inflamatuar profil sergileyeceğini varsaydık. Bu hipotezi test etmek için, mevcut retrospektif klinik-laboratuvar çalışması, erken başvuru sonrası serum sitokinlerini, TLR2, TLR4 ve TLR9 serum protein seviyelerini analiz etti ve primer spontan ICH olan hastalarda seçilmiş inflamatuar gen polimorfizmlerini analiz etti. Bu iş akışı, akut hastanede yatış sırasında toplanan periferik kan, ELISA tabanlı protein ölçüsleme, PCR-RFLP tabanlı genotipleme ve nozokomial akciğer enfeksiyonu olan ve olmayan hastalar arasında istatistiksel karşılaştırma kullanır. Amaç, enfeksiyon riskiyle ilişkili inflamatuar ve konak-genetik profilleri karakterize etmek için tekrarlanabilir bir çerçeve sağlamak, böylece akut hastane ortamında yüksek riskli hastaların daha erken tanınmasını desteklemekti.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Bu çalışma, Çin, Zhejiang, Jiaxing, Jiaxing Birinci Hastanesi, Jiaxing Bağlı Hastanesi Etik Komitesi tarafından onaylandı (Onay No. 2025-LP-599). İnsan katılımcıları içeren tüm prosedürler, kurumsal gereksinimler ve Helsinki Bildirgesi'nin ilkelerine uygun olarak yürütülmüştür. Kan toplama ve veri kullanımı için yazılı bilgilendirilmiş onay, örnek toplamadan önce tüm katılımcılardan ve/veya yasal olarak yetkili temsilcilerinden alınmıştır.

Bu iş akışında kullanılan tüm ticari kitler, reaktifler, tüketim malzemeleri, aletler, yazılım, üreticiler, katalog numaraları ve temel işletim spesifikasyonları Malzemeler Tablosu'nda listelenmiştir.

Çalışma kapsamı, uygunluk ve hasta grupları

Bu çalışma, Mayıs 2019 ile Eylül 2024 arasında Çin, Jiaxing Üniversitesi Bağlı Hastanesi, Jiaxing Birinci Hastanesi'nin Acil ve Kritik Bakım Merkezi veya Yoğun Bakım Ünitesi'ne yatırılan primer spontan intraserebral kanaması (ICH) olan hastalarda tek merkezli retrospektif klinik-laboratuvar kohort analizi olarak gerçekleştirilmiştir. ICH tanısı, Çin Beyin Kanaması Tanı ve Tedavisi Kılavuzları (2019)10'a uygun olarak kraniyal bilgisayar tomografisi veya manyetik rezonans görüntüleme ile doğrulandı.

Hastalar, görüntüleme ile doğrulanmış primer spontan ICH'i varsa, semptomların başlangıcından 3 gün içinde kabul edildikleri ve tam ana klinik değişkenleri ile inflamatuar biyobelirteçlerin ölçümü ve genetik analiz için mevcut periferik kan örnekleri varsa uygun sayılırlardı. Travmatik intrakraniyal kanama, ikincil ICH, hastaneye kabul öncesi veya 48 saat içinde akciğer enfeksiyonu, tıbbi tavsiyeye karşı taburcu veya 48 saat içinde ölüm varsa, malignite veya otoimmün hastalık öyküsü ya da eksik klinik, laboratuvar veya genotipleme kayıtları varsa hastalar hariç tutuluyordu. Taramadan sonra, 360 hasta uygunluk kriterlerini karşıladı ve nihai analize dahil edildi. Bunlardan 180'i hastanede nozokomial akciğer enfeksiyonu geliştirmiş, 180 hasta ise gelişmemiştir. Hastalar, hastaneye kabul edildikten sonra nozokomial akciğer enfeksiyonu oluşup oluşmadığına göre akciğer enfeksiyonu grubuna veya akciğer enfeksiyonu olmayan gruplara atandı.

Son gruplandırmadan önce, görüntüleme tanısı, kabul süresi, enfeksiyon zamanı, kan örneği bulunabilirliği ve klinik ile laboratuvar kayıtlarının tamlığı kontrol edildi. Bu adım, yanlış sınıflandırmayı azaltmak ve dahil edilen tüm vakaların klinik karşılaştırma, inflamatuar biyobelirteçlerin ölçümü ve genotipleme için tam verilere sahip olmasını sağlamak amacıyla kullanıldı.

Nozokomial akciğer enfeksiyonunun tanımı

Nozokomial akciğer enfeksiyonu, radyolojik kanıtlar ile klinikkriterler 11 birleştirilerek tanımlanmıştır. Radyolojik doğrulama için göğüs radyografisi veya bilgisayar tomografisinde yeni veya ilerleyici infiltratif, konsolidatif veya zemin cam lezyonu gereklidir. Ayrıca, aşağıdaki kriterlerden en az ikisinin bulunması gerekiyordu: vücut sıcaklığı > 38 °C, irin solunum salgıları veya anormal periferik beyaz kan hücresi sayısı, WBC < 4 × 109/L veya 10 × 109/L >.

Yatıştan önce var olan veya yatırıldıktan sonraki ilk 48 saat içinde teşhis edilen akciğer enfeksiyonu, nozokomial akciğer enfeksiyonu olarak sınıflandırılmamıştır. Enfeksiyon sınıflandırması, radyolojik raporlar, vücut sıcaklığı kayıtları, solunum salgılarının dokümantasyonu, periferik kan sayısı sonuçları ve klinik tanı kayıtları kullanılarak doğrulandı.

Biyogüvenlik ve atık bertaraf

İnsan kanı, serum ve kan kaynaklı DNA'sı standart biyogüvenlik seviye 2 önlemleri altında işlendi. Laboratuvar personeli kan kontrolü, serum alikotlama, ELISA testi, DNA çıkarımı, PCR hazırlığı, jel elektroforezi, krestriksiyon sindirimi ve UV görselleştirme sırasında eldiven, laboratuvar önlüğü, maske ve koruyucu gözlük taktı. Kan tüpleri işlemeden önce sızıntı veya kırılma açısından kontrol edildi. Santrifüjleme, kapalı borular veya mevcut olduğunda kapalı santrifüj kovaları kullanılarak gerçekleştirilirdi.

Keskin silahlar hemen onaylı keskin kutulara atıldı. Kanla kirlenmiş tüpler, pipet uçları, eldivenler, ELISA plakaları ve diğer tek kullanımlık tüketim malzemeleri biyolojik laboratuvar atıkları olarak atıldı. Sıvı biyolojik atık, bertaraftan önce kurumsal prosedürlere uygun olarak dezenfekte edilmiştir. Agaroz jelleri, poliakrilamid jelleri, boyama reaktifleri ve elektroforezle ilgili malzemeler, kurumsal kimyasal ve laboratuvar atık gereksinimlerine uygun olarak elden çıkarıldı.

PCR reaktif hazırlanması, DNA şablonu eklemesi, amplifikasyon ürün kullanımı, restriksiyon sindirimi ve jel elektroforezi mümkün olduğunca ayrılarak kontaminasyonu azaltmıştır. PCR ve DNA işlemlerinde aerosol dirençli pipet uçları kullanıldı. UV görselleştirme yalnızca koruyucu bir kalkan veya jel dokümantasyon sistemi ile yapıldı ve doğrudan göz veya cilt UV ışığına maruz kalmadan kaçınıldı.

Çevresel kan toplama ve örnek işleme

Ön analitik varyasyonu azaltmak için, en az 12 saat boyunca bir gece oruçundan sonra hastaneye kabul sonrası sabah saat 08:00'de 10 mL periferik venöz kan toplandı. 5 mL kan serum hazırlığı için düz bir vakum tüpüne çekildi, kalan 5 mL ise genomik DNA çıkarımı için hepparinize tüpe alındı.

İşlemden önce, her tüpte hasta tanımlayıcısı, toplama süresi, tüp tipi, kan hacmi, sızıntı, görünür pıhtılaşma ve büyük hemoliz açısından kontrol edildi. Yanlış etiketleme, yetersiz kan hacmi, tüp sızıntısı veya antikoagüllenmiş tüpte görünür pıhtılaşma olan örnekler sonraki analizden dışlandı. Düz tüpteki kan, oda sıcaklığında 60 dakika pıhtılaşmasına izin verildi, ardından 1.500 × g ile 10 dakika boyunca 4 °C'de santrifüj edildi. Serum süpernatantı hücre tabakasını rahatsız etmeden steril, düşük protein bağlayan polipropilen tüplere aktarıldı, 0,5 mL fraksiyonlara alkotasyon yapıldı ve analiz ile kadar −80 °C'de depolandı.

Görünür orta veya şiddetli hemoliz gösteren örnekler ELISA tabanlı nicel belirlemeden hariç tutuldu. Hafif hemolizlenmiş örnekler kaydedildi ve birincil sitokin analizinde kullanılmadı. Görünür bulanıklık, belirgin lipemi, yetersiz kalıntı hacmi veya tekrar tekrar donma-çözülme maruziyeti olan örnekler test öncesi işaretlendi. Hiçbir serum aliquotu analiz öncesi birden fazla donma-erime döngüsünden geçmemiştir.

ELISA ile sitokin niceliklendirmesi

IL-1β, IL-6, IL-10, IL-17, IFN-γ ve TNF-α serum konsantrasyonları, serum örnekleri için doğrulanmış ticari olarak mevcut insan sandviç ELISA kitleri kullanılarak ölçüldü. Serum aliquotları çözüldü, nazikçe karıştırıldı ve yüklenmeden önce hemoliz, bulanıklık, lipemi, yetersiz hacim ve donma-çözülme geçmişi açısından kontrol edildi.

Standartlar, boş kuyular ve serum örnekleri çift olarak yüklendi. Kit talimatlarına göre standart konsantrasyonlarda seri seyreltmeler ve boş kontrol kullanılarak her plakada standart eğriler oluşturuldu. Optik yoğunluk, kalibre edilmiş bir mikroplaka okuyucu kullanılarak 450 nm'de ölçüldü, referans düzeltmesi ise 570 nm'de yapıldı. Konsantrasyonlar dört parametreli lojistik eğri uyumu ile hesaplandı.

Test sonuçları ancak standart eğri uygun bir konsantrasyon-yanıt deseni gösterdiğinde, boş kuyular düşük arka plan gösterdiğinde ve tekrarlanan örnek varyasyon katsayısı %10 ≤ olduğunda kabul edildi. Tekrarlanan CV >% 10'a sahip örnekler, yeterli hacim bulunduğunda orijinal serum aliquotundan yeniden analiz edildi. Güvenilir standart eğri aralığı dışındaki örnekler, kit talimatlarına göre seyreltildi veya tekrarlandı. Tutarsız standartlar, aşırı arka plan veya belirgin kenar efektleri gösteren plakalar tekrar edildi.

Veri kabulü için kullanılan daha düşük analitik tespit sınırları IL-1β için 2.0 pg/mL, IL-6 için 1.5 pg/mL, IL-10 için 2.0 pg/mL, IL-17 için 3.0 pg/mL, IFN-γ için 4.0 pg/mL ve TNF-α için 2.5 pg/mL idi. Son sitokin değerleri, istatistiksel analizden önce örnek tanımlayıcıları, levha haritaları, tekrarlı okuma kayıtları ve örnek kalitesinde notlarla kontrol edildi.

Serum TLR2, TLR4 ve TLR9'un ELISA tarafından nicelendirilmesi

Serum TLR2, TLR4 ve TLR9 protein seviyeleri, serum örnekleri için doğrulanmış ticari olarak mevcut insan ELISA kitleri kullanılarak ölçüldü. Serum örnekleri eritildi, nazikçe karıştırıldı ve sitokin ölçümüne uygulanan aynı örnek kalitesi kriterleriyle incelendi.

Standartlar, boş kuyular ve serum örnekleri çift olarak analiz edildi. Plakalar 450 nm'de okundu, referans düzeltmesi 570 nm'de yapıldı ve konsantrasyonlar dört parametreli lojistik regresyon kullanılarak hesaplandı. Standart eğri geçerli olduğunda, boş kuyular beklenen arka plan aralığında olduğunda ve tekrarlanan CV %10 ≤olduğunda sonuçlar kabul edildi. Bu tekrarlanan CV eşiğini aşan örnekler, yeterli numune kaldığında tekrar test edildi.

Sonuç kabulü için kullanılan daha düşük analitik tespit sınırları TLR2 için 0.10 ng/mL, TLR4 için 0.12 ng/mL ve TLR9 için 0.15 ng/mL idi. Son TLR2, TLR4 ve TLR9 değerleri, istatistiksel analizden önce örnek tanımlayıcılar, levha haritaları, tekrar-okuma kayıtları ve örnek kalitesinde notlarla kontrol edildi.

Genomik DNA çıkarımı

Genomik DNA, silika sütunu tabanlı kan genomik DNA çıkarma kiti kullanılarak heparin-antikoagülasyonlu tam kandan çıkarıldı. Ekstraksiyondan önce, antikoagüllenmiş kan örnekleri doğru etiketleme, yeterli hacm, görünür pıhtılaşma, sızıntı ve depolama koşulları açısından kontrol edildi.

DNA saflığı ve konsantrasyonu spektrootometri ile değerlendirildi. Sadece A260/A280 oranı 1.80 ile 2.00 arasında olan örnekler aşağı akış PCR amplifikasyonu için kabul edildi. Bu aralık dışındaki örnekler nazik karıştırmadan sonra yeniden ölçüldü. Anormal saflık oranı devam ederse, yeterli tam kan kaldığında DNA çıkarımı tekrarlanırdı.

DNA, nükleazsız suyla 50 ng/μL çalışma konsantrasyonuna kadar seyreltildi ve PCR amplifikasyonuna kadar -20 °C'de saklandı. PCR kurulumundan önce, her DNA örneği konsantrasyon, saflık, örnek tanımlayıcı ve donma-çözülme geçmişi açısından kontrol edildi.

PCR-RFLP genotiplendirmesi ve genotip çağrısı

IL-1B +3954 C/T, IL-10-1082 G/A, IL-10-819 T/C, TNF-α-308 G/A, TLR2-196 to-174 ins/del, TLR4 Asp299Gly, TLR4 Thr399Ile, TLR9 rs187084, IFN-γ γ +874 A/T ve IFN- +2108 A/G için polimeraz zincir reaksiyon kısıtlama parça uzunluğu polimorfizmi (PCR-RFLP) kullanılarak genotiplendirilmiştir. Locus-spesifik primer dizileri, beklenen amplikon boyutları, krestriksiyon enzimleri ve genotipe özgü sindirim kalıpları Ek Tablo 1'de sunulmaktadır.

PCR amplifikasyonu, 2,5 μL 10 × tampon, 2,0 μL dNTP karışımı 2,5 mM, 10 μM'de 1,0 μL ön primer, 10 μM'de 1,0 μL ters primer, 5 U/μL 0,25 μL Taq DNA polimeraz, 50 ng/μL 2,0 μL genomik DNA içeren 25 μL nihai reaksiyon hacminde gerçekleştirildi. ve 16,25 μL nükleazsız su. PCR ana karışımı, temiz bir ön PCR alanda hazırlandı ve DNA şablonu en son eklendi. Her PCR denemesinde şablonsuz negatif kontrol uygulanıyordu.

Termal profil, ilk denatürasyondan oluşuyordu ki 95 °C'de 5 dakika süreli, ardından 35 döngü denaturasyon, 95 °C'de 30 saniye boyunca tavlama, primer çiftine bağlı olarak 30 saniye boyunca 58–62 °C'de tavlama, 30 saniye boyunca 72 °C'de uzatma ve 7 dakika boyunca 72 °C'de son uzatma. PCR ürünleri ilk olarak %1,5 agaroz jeliyle doğrulandıktan sonra kısıtlama sindirimi yapıldı.

PCR amplifikasyonu yalnızca beklenen amplikon bandı görünürken kabul edildi ve şablonsuz kontrol amplifikasyon göstermedi. Zayıf bantlar, özgül olmayan amplifikasyon, primer-dimer girişimi veya negatif kontrolde kontaminasyon gösteren reaksiyonlar orijinal DNA şablonundan tekrarlandı.

PCR ürünleri, üreticinin talimatlarına göre 37 °C'de toplam sindirim hacmi 15 μL olan 37 °C'de ilgili restriksiyon endonükleazı ile sindirildi. Sindirilmiş parçalar çoğu lokus için %2,5 agaroz jeliyle çözüldü. TLR2-196'dan -174 inç/del lokusa kadar değişen bölge, parça ayırımını artırmak için %8 poliakrilamid jel ile çözüldü.

Kısıtlama sindirimi yalnızca parça desenleri beklenen genotipe özgü sindirim profiliyle eşleştiğinde kabul edildi. Eksik sindirim, bulaşmış bantlar, beklenmedik parça boyutları veya belirsiz ayrım belirtileri tekrarlandı. Bantlar, nükleik asit boyama sürecinden sonra ultraviyole aydınlatma altında görselleştirildi. Jel görüntüleri örnek tanımlayıcısı, lokus adı, çalışma tarihi ve jel numarasıyla kaydedildi.

Genotip atama, iki kör laboratuvar araştırmacısı tarafından bağımsız olarak gerçekleştirildi. Uyumsuz veya belirsiz genotip çağrıları orijinal jel görüntüsüyle incelendi ve gerektiğinde PCR amplifikasyonundan tekrarlandı. Rastgele seçilmiş örneklerin yüzde onu kalite kontrolü için yeniden genotiplendi ve uyum oranı %99,2 idi. Son genotip verileri, örnek tanımlayıcıları, lokus isimleri, genotip çağrıları ve kalite kontrol kayıtları kontrol edildikten sonra analiz veri setine girildi.

İstatistiksel analiz

İstatistiksel analizler uygun bir istatistiksel analiz yazılımı kullanılarak gerçekleştirildi. Klinik, ELISA ve genotip veri setleri, kimliği çıkarılmış hasta kodları kullanılarak birleştirildi. Hasta kodları analiz öncesinde tekrarlama, uyumsuzluk ve eksik değerler açısından kontrol edildi. Tüm dahil edilen hastaların önemli klinik, iltihaplayıcı ve genotipleme verilerine sahip olması nedeniyle tam vaka stratejisi kullanıldı.

Uygun bir istatistiksel analiz yazılımında, pulmoner enfeksiyon durumu gruplama değişkeni olarak kodlanmış, akciğer enfeksiyonu olmayan grup referans kategorisi olarak kullanılmıştır. Sürekli değişkenler normallik açısından ilk olarak Shapiro-Wilk testi kullanılarak test edildi. Normalde dağılımlı sürekli değişkenler ortalama ± standart sapma olarak ifade edildi ve bağımsız örneklemli Student's t testi kullanılarak karşılaştırıldı. Normal dağılım olmayan sürekli değişkenler, interquartil aralıklı medyanlar olarak rapor edildi ve Mann-Whitney U testi kullanılarak karşılaştırıldı. Kategorik değişkenler sayılar ve yüzdeler olarak ifade edildi ve uygun olduğunda ki-kare testi veya Fisher'ın tam testi kullanılarak karşılaştırıldı.

Akciğer enfeksiyonu olmayan gruptaki genotip dağılımları, Hardy-Weinberg dengesi için ilişki analizinden önce değerlendirildi. Genotip ve allel frekansları n (%) olarak özetlenmiştir. Pulmoner enfeksiyon riski için olasılık oranları ve %95 güven aralıkları, çok değişkenli lojistik regresyon modelleri kullanılarak tahmin edilmiştir. Pulmoner enfeksiyon durumu bağımlı değişken olarak girildi. Genotip, allel veya biyobelirteç değişkenleri, her analiz için belirlendiği gibi bağımsız değişkenler olarak girildi.

Yaş ve cinsiyet, birincil modele önceden girildi. BMI, kronik obstrüktif akciğer hastalığı, kalp hastalığı, beyin omurilik sıvısı sızıntısı, drenanın kalma süresi ve kabul Glasgow Koma Ölçeği kategorisi, klinik olarak ilgili veya gruplar arasında başlangıç dengesizliği gösterdiği için aynı anda tam ayarlanmış modele girildi. Çok kollinearlık varyans enflasyon faktörleri (VIF) kullanılarak değerlendirildi ve VIF'ler <5.0 kabul edilebilir olarak değerlendirildi.

Birden fazla polimorfizm test edildiği için, Benjamini-Hochberg yanlış keşif oranı düzeltmesi genetik ilişkianalizlerine uygulanmıştır 12. Genetik ilişki testlerinden elde edilen P değerleri en küçükten en büyüğe doğru sıralandı ve düzeltilmiş anlamlılık Benjamini-Hochberg prosedürüne göre belirlendi. Tüm testler iki taraflıydı ve P <0.05, çoklu karşılaştırma düzeltmesinden sonra aksi belirtilmedikçe istatistiksel olarak anlamlı olarak kabul edildi.

Son çıktılar, kaynak veri seti, ELISA kalite kontrol kayıtları, genotip çağıran kayıtlar ve tablo değerleri ile karşılaştırıldığında analiz edildi. Sonuçlar, nedensel etkiler yerine ilişkilendirmeler olarak yorumlandı çünkü çalışmada geriye dönük gözlemsel bir tasarım kullanıldı.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Klinik göstergeler

Başlangıç klinik özellikleri Tablo 1'de özetlenmiştir. Son analizde toplam 360 spontan intraserebral kanama hastası dahil edildi; bunların 180'i hastanede yatış sırasında nozokomial akciğer enfeksiyonu geliştiren ve 180'i gelişmemiş hastalardı. Gruplar arasında yaş (62,4 yıl ± 6,8 yaş vs 63,6 yıl ± 7,0, P >0,05), cinsiyet dağılımı (142/180, %78,9 vs 137/180, %76,1, P > 0,05), sigara geçmişi...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Kendiliğinden beyin içi kanama (ICH), inme alt tiplerinin en şiddetli örneklerinden biri olmaya devam etmekte ve önemli erken ölüm ve uzun vadeli engellilik yükü oluşturmaya devametmektedir 13. Klinik uygulamada, ICH hastaları hastane komplikasyonlarına özellikle hassastır; çünkü nörolojik yaralanma hava yolu korumasını zayıflatabilir, öksürük etkinliğini azaltabilir, hareketliliği kısıtlayabilir ve invaziv destekleyici işlemlere maruziyeti artırabilir. Bu komplik...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar, bu çalışmayla ilgili herhangi bir rekabet eden finansal çıkarları veya diğer çıkar çatışmaları olmadığını belirtmektedir.

Teşekkürler

Yazarlar, hasta bakımında yer alan klinik personele ve literatür buluşması ile veri organizasyonunda yardımcı olan kişilere teşekkür etmektedir. Bu çalışma, Jiaxing Şehri Sağlık Bilimi ve Teknolojisi Planlama Projesi (Hibe No. JWKJ-25005).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Human TNF-α ELISA KitInvitrogen / Thermo Fisher ScientificKHC3011Serum içinde insan TNF-α miktarının kantitatif ölçümü için ELISA kiti.
Human TLR2 / Toll-like Receptor 2 ELISA KitSigma-Aldrich / MerckRAB0744-1KTSerum veya plazma örneklerinde insan TLR2 ölçümü için 96 kuyuluk ELISA kiti.
Human TLR4 ELISA Kit, colorimetricNovus Biologicals / Bio-TechneNBP3-11807Serum, plazma veya diğer biyolojik sıvılarda insan TLR4 ölçümü için colorimetric sandviç ELISA kiti.
Human TLR9 ELISA Kit, colorimetricNovus Biologicals / Bio-TechneNBP2-76574Serum örneklerinde insan TLR9 ölçümü için colorimetric ELISA kiti.
Absorbance microplate readerAgilent BioTek800 TSELISA optik-yoğunluk ölçümü için 450 nm'de ve referans düzeltme 570 nm'de olan mikroplate okuyucu.
QIAamp DNA Blood Mini KitQIAGEN51104Antikoagüle edilmiş tam kandan genomik DNA ekstraksiyonu için silika membran tabanlı kit.
NanoDrop One Microvolume UV-Vis SpectrophotometerThermo ScientificND-ONE-WDNA konsantrasyonu ve A260/A280 saflık değerlendirmesi için mikrovolume spektrofotometre.
SimpliAmp Thermal CyclerApplied Biosystems / Thermo Fisher ScientificA24811PCR-RFLP genotiplemesi için son nokta PCR amplifikasyonunda kullanılan termal siklistir.
PCR Master Mix, 2XThermo ScientificK0171Taq DNA polimeraz, dNTP'ler, MgCl2 ve reaksiyon tamponu içeren önceden karıştırılmış PCR reaktifi; geleneksel PCR amplifikasyonu için kullanılır.
Recombinant Taq DNA PolymeraseThermo ScientificEP0401Ayrı PCR bileşenleri kullanılırken 2X master mix yerine lokusa özgü PCR reaksiyonları için alternatif enzim kaynağı.
Nuclease-free waterThermo ScientificR0581PCR kurulumu, DNA seyreltme ve şablonsuz kontroller için moleküler biyoloji sınıfı su.
Custom DNA primersSangon BiotechCustom synthesisPCR-RFLP genotiplemesi için lokusa özgü primerler; primer dizileri Ek Tablo S1'de listelenmiştir.
Restriction endonucleases for PCR-RFLPThermo Scientific / New England BiolabsEk Tablo S1'de listelenen lokusa özgü enzimlerPCR ürünlerinin genotip özgü sindirilmesi için kullanılan kısıtlama enzimleri. Her lokus için seçilen enzim, Ek Tablo S1'de listelenen sindirim kalıbına uygun olmalıdır.
Agarose I, molecular biology gradeThermo Scientific17850PCR ürünlerini ve çoğu RFLP fragmanını çözmek için kullanılan 1.5% ve 2.5% jellerin hazırlanması için agarose.
GeneRuler 50 bp DNA LadderThermo ScientificSM0371PCR amplikonları ve RFLP fragman boyutu tahmini için DNA boyutu işaretçisi.
SYBR Safe DNA Gel StainInvitrogen / Thermo Fisher ScientificS33102Agarozda veya akrilamid jellerinde DNA görselleştirmesi için nükleik asit jeli leke maddesi; etidyum bromür yerine düşük riskli alternatif olarak kullanılır.
Horizontal agarose gel electrophoresis systemBio-RadMini-Sub Cell GT system / 1704360 basePCR ve RFLP ürünlerinin agarose jeli ile ayrılması için elektroforez sistemi.
Vertical PAGE electrophoresis systemBio-RadMini-PROTEAN Tetra Cell / 1658001Daha yüksek çözünürlüklü fragman ayrımı gerektiren 8% poliakrilamid jeli ayrılması için dikey elektroforez sistemi.
Gel documentation system with UV or blue-light transilluminationBio-Rad / equivalent laboratory systemGel Doc XR+ or equivalentJel elektroforezi sonrasında lekeli DNA bantlarının belgelenmesi için görüntüleme sistemi. Mevcutsa UV koruma veya mavi ışık modunu kullanın.
Refrigerated centrifugeEppendorf / equivalent laboratory centrifuge5424 R or equivalentSerum ayrımı için 1.500 × g ve 4 °C'de kullanılan buzdolabında soğutmalı santrifüj.
−80 °C ultra-low temperature freezerThermo Scientific / equivalent laboratory freezerForma 900 Series or equivalentELISA analizinden önce serum alikotlarının depolanması.
IBM SPSS StatisticsIBMVersion 25.0Tanımlayıcı istatistikler, normallik testi, grup karşılaştırmaları, lojistik regresyon ve model çıktısı ihraç için kullanılan istatistik yazılımı.
Spreadsheet softwareMicrosoftExcel for Microsoft 365Veri kontrolü, plaka haritası organizasyonu, çoğaltılmış değer incelemesi ve SPSS analizinden önce birleştirilmiş analiz dosyalarının hazırlanması için kullanılır.

Kaynaklar

  1. O'Carroll CB, Brown BL, Freeman WD. Intracerebral hemorrhage: a common yet disproportionately deadly stroke subtype. Mayo Clin Proc. 2021;96(6):1639-1654.
  2. Hostettler IC, Seiffge DJ, Werring DJ. Intracerebral hemorrhage: an update on diagnosis and treatment. Expert Rev Neurother. 2019;19(7):679-694.
  3. Al-Kawaz MN, Hanley DF, Ziai W. Advances in therapeutic approaches for spontaneous intracerebral hemorrhage. Neurotherapeutics. 2020;17(4):1757-1767.
  4. Garg R, Biller J. Recent advances in spontaneous intracerebral hemorrhage. F1000Res. 2019;8:F1000 Faculty Rev-302.
  5. Kuohn LR et al. Cause of death in spontaneous intracerebral hemorrhage survivors: multistate longitudinal study. Neurology. 2020;95(20):e2736-e2745.
  6. Maramattom BV et al. Pulmonary complications after intracerebral hemorrhage. Neurocrit Care. 2006;5(2):115-119.
  7. Wilson RD. Mortality and cost of pneumonia after stroke for different risk groups. J Stroke Cerebrovasc Dis. 2012;21(1):61-67.
  8. Hinduja A et al. Nosocomial infections in patients with spontaneous intracerebral hemorrhage. Am J Crit Care. 2015;24(3):227-231.
  9. Ji R et al. Risk score to predict hospital-acquired pneumonia after spontaneous intracerebral hemorrhage. Stroke. 2014;45(9):2620-2628.
  10. Cao Y et al. Chinese Stroke Association guidelines for clinical management of cerebrovascular disorders: executive summary and 2019 update of clinical management of intracerebral haemorrhage. Stroke Vasc Neurol. 2020;5(4):396-402.
  11. Kalil AC et al. Management of adults with hospital-acquired and ventilator-associated pneumonia: 2016 clinical practice guidelines by the Infectious Diseases Society of America and the American Thoracic Society. Clin Infect Dis. 2016;63(5):e61-e111.
  12. Benjamini Y, Hochberg Y. Controlling the false discovery rate: a practical and powerful approach to multiple testing. J R Stat Soc Series B Methodol. 1995;57(1):289-300.
  13. van Asch CJJ et al. Incidence, case fatality, and functional outcome of intracerebral haemorrhage over time, according to age, sex, and ethnic origin: a systematic review and meta-analysis. Lancet Neurol. 2010;9(2):167-176.
  14. Alsumrain M et al. Predictors and outcomes of pneumonia in patients with spontaneous intracerebral hemorrhage. J Intensive Care Med. 2013;28(2):118-123.
  15. Lindner A et al. Early predictors for infectious complications in patients with spontaneous intracerebral hemorrhage and their impact on outcome. Front Neurol. 2019;10:817.
  16. Grossmann I et al. Stroke and pneumonia: mechanisms, risk factors, management, and prevention. Cureus. 2021;13(11):e19912.
  17. Yan J et al. ICH-LR2S2: a new risk score for predicting stroke-associated pneumonia from spontaneous intracerebral hemorrhage. J Transl Med. 2022;20(1):193.
  18. Grimes DA, Schulz KF. Bias and causal associations in observational research. Lancet. 2002;359(9302):248-252.
  19. Tapia-Pérez JH et al. Assessment of systemic cellular inflammatory response after spontaneous intracerebral hemorrhage. Clin Neurol Neurosurg. 2016;150:72-79.
  20. Yu T, Liu H, Liu Y, Jiang J. Inflammatory response biomarkers nomogram for predicting pneumonia in patients with spontaneous intracerebral hemorrhage. Front Neurol. 2023;13:1084616.
  21. Smith AJ, Humphries SE. Cytokine and cytokine receptor gene polymorphisms and their functionality. Cytokine Growth Factor Rev. 2009;20(1):43-59.
  22. Kawai T, Akira S. Toll-like receptors and their crosstalk with other innate receptors in infection and immunity. Immunity. 2011;34(5):637-650.
  23. Sepahi S et al. Haplotype analysis of interleukin-10 gene promoter polymorphisms in chronic hepatitis C infection: a case control study. Viral Immunol. 2014;27(8):398-403.
  24. Areeshi MY et al. IFN-gamma +874 A>T (rs2430561) gene polymorphism and risk of pulmonary tuberculosis: a meta-analysis. Arch Med Sci. 2021;17(1):177-188.
  25. Teuffel O, Ethier MC, Beyene J, Sung L. Association between tumor necrosis factor-alpha promoter -308 A/G polymorphism and susceptibility to sepsis and sepsis mortality: a systematic review and meta-analysis. Crit Care Med. 2010;38(1):276-282.
  26. Ollier WE. Cytokine genes and disease susceptibility. Cytokine. 2004;28(4-5):174-178.
  27. Moons KGM et al. Prognosis and prognostic research: what, why, and how? BMJ. 2009;338:b375.
  28. Collins GS, Reitsma JB, Altman DG, Moons KG. Transparent reporting of a multivariable prediction model for individual prognosis or diagnosis: the TRIPOD statement. BMJ. 2015;350:g7594.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

T pSay 234Say 234Spontan intraserebral kanama SKnflamatuar fakt rlerGenetik polimorfizmlerEnfeksiyon duyarl l
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.