Ağ Farmakolojisi ve Deneysel Doğrulama, Sinnamomi Korteksini Femur Başında Steroid Kaynaklı Osteonekroza Karşı Keşfetmek İçin

Özet

Bu çalışma, ağ farmakolojisi, moleküler dinamik simülasyonları ve hayvan deneylerini entegre ederek femoral başının osteonekrozu tedavisinde Cinnamomi Korteks'in potansiyel mekanizmalarını incelemeyi amaçlamaktadır.

Özet

Femur başın steroid kaynaklı osteonekrozu (SONFH) şiddetli ağrıya ve sınırlı hareket kabiliyetine yol açar ve hastaların yaşam kalitesini önemli ölçüde düşürür. Cinnamomi Korteksi (CC) bu durumu etkili bir şekilde hafiflettiği gösterilmiştir, ancak etki mekanizması hâlâ belirsizdir. Bu çalışma, CC'nin aktif bileşiklerini tanımlamayı ve SONFH'deki mekanizmalarını incelemeyi amaçlamaktadır. Aktif bileşenler HERB 2.0, PubChem ve SwissADME veritabanları kullanılarak taranmış ve karşılık gelen hedefler İsviçre Hedef Tahmin Veritabanı kullanılarak tahmin edilmiştir. SONFH hedefleri, GEO, DisGeNET, GeneCards ve OMIM veritabanlarından kesişen hedeflerin bileşik ile ilgili hedeflerle kesişmesiyle belirlendi. STRING veritabanı kullanılarak bir protein-protein etkileşimi (PPI) ağı oluşturuldu ve GO ile KEGG zenginleştirme analizleri DAVID veritabanı üzerinden gerçekleştirildi. En umut vadeden bileşik-hedef etkileşimleri moleküler kenetlenme (MD) ve moleküler dinamik simülasyonlarıyla doğrulandı. Araştırmacılar, AKT1, HIF-1α ve STAT3'ün merkezi düğümler olarak hizmet verdiği 61 SONFH ile ilgili hedef dahil olmak üzere 563 potansiyel hedef tespit etti. KEGG zenginleştirme analizi, HIF-1α sinyal yolunun önemli bir mekanizma olarak öne çıktığını gösterdi. Ayrıca, hayvan deneyleri, SONFH ile yapılan bir fare modelinde aktif CC fraksiyonunun femoral başlık yapısal hasarını etkili bir şekilde azalttığını göstermiştir. Bulgular, CC'nin hipoksi adaptasyonunu koordine ederek ve anjiyogenez ile osteogenezi düzenleyerek SONFH'yi iyileştirebileceğini öne sürüyor.

Giriş

Femur başın steroid kaynaklı osteonekrozu (SONFH), çeşitli 1. Kemik hücrelerinin ve kemik iliği bileşenlerinin ölümü, femoral başta yapısal hasara ve kalça ekleminin işlevsel bozulmalarına^{yol açar 2}. Klinik olarak, hastalar genellikle kalça ağrısı ve sınırlı hareket kabiliyeti^{ile ortaya çıkar 3}. Etkili tedavi olmadan, SONFH hastalarının %80'i femur kafa çöküşüne ilerleyerek total kalça^{protezi gerektiriyor 4}. Bu, hastalar üzerinde ciddi bir psikolojik baskı ve ağır ekonomik bir^{yük oluşturur 5}. Klinik uygulama, SONFH tedavisinde antikoagülantlar, fibrinolitik ilaçlar, vazodilatatörler ve lipid düşürücü ilaçların kombinasyonunun kullanılmasını önerir; bu ilaçlar bazı klinik potansiyel göstermiş ancak genellikle sınırlı terapötik etkilidir⁶.

Geleneksel Çin tıbbı (TCM), SONFH^7'nin tedavisinde giderek daha fazla olumlu etkisini göstermiştir. TCM, semptomların hafiflemesi, hastalık kontrolü ve eklem hareketliliği ile hastaların yaşam kalitesi açısından potansiyel^{gösterir 8}. Klinik olarak, CC ve bileşenleri SONFH'nin iyileştirilmesinde yaygın olarak kullanılmış ve dikkat çekici bir etkinlik^{göstermiştir 9}. CC'de bulunan çok sayıda biyoaktif madde, anti-inflamatuar, antioksidan, anjiyogenez teşvik edici ve mikro dolaşım iyileştirici özellikler dahil olmak üzere çeşitli biyolojik etkilere^{sahiptir 10}. Kemik dokusu mühendisliği ve metabolizmasındaki önceki araştırmalar, CC'nin başlıca aktif bileşeni olan sinnamaldehitin, kemik yenileme ile ilgili sinyal yollarını modüle edebildiğini^{ortaya koymuştur 11}. İlk çalışma, Yougui Haplarının (YGP) anjiyogenezi teşvik ederek ve iltihap yanıtlarını güçlendirerek SONFH için terapötik potansiyele sahip^{olduğunu göstermiştir 12}. YGP'lerde egemen ilaç olarak CC, yang'ı ısıtabilir, qi'ye fayda sağlayabilir ve meridyenleri bloktan çıkararak SONFH¹³ üzerinde faydalı terapötik etkiler yaratır. Buna rağmen, etkinliğinin tam olarak yatan mekanizmaları belirsizdir. CC'nin SONFH'yi iyileştirmek için kullandığı çoklu hedefli düzenleyici ağı netleştirmek, sadece farmakolojik doğasını anlamaya yardımcı olmakla kalmaz, aynı zamanda mantıklı klinik kullanımını ve ilgili iyileştirmelerin oluşturulmasını da teşvik eder. Biyoinformatiğin ağ farmakolojisi ile entegre edilmesi, etki mekanizmalarını aydınlatmak için etkili bir yaklaşım^{sunar 14}.

Ağ farmakolojisi, bitkilerdeki biyoaktif bileşenleri tanımlayabilir ve bu ilaç bileşenleri ile gen hedefleri arasındaki ilişkileri tahmin^{edebilir 15}. MD, aday aktif bileşikler ile ana terapötik hedefler arasındaki bağlanma etkileşimlerini doğrulamak için kullanılır. Moleküler dinamik, hareket simülasyonu yoluyla ligand-reseptör bağlanma kararlılığını ve esnekliğini değerlendirmek için Newton^{mekaniğini kullanır 16}. Yazarlar, CC'nin SONFH üzerindeki potansiyel etkilerini ağ farmakolojisi, MD ve moleküler dinamik simülasyonları kullanarak kapsamlı bir şekilde araştırdılar. Bu bulgular, CC'nin farmakodinamik malzeme temeli ve SONFH'nin iyileştirilmesinde mekanizması üzerine gelecekteki derinlemesine araştırmalar için bir referans sağlar. Çalışma akış şeması Şekil 1'de gösterilmiştir.

Protokol

Tüm deneysel protokoller, Zhejiang Çin Tıp Üniversitesi Hayvan Deneysel Etik Komitesi (IACUC-20240708-22) tarafından onaylanmış ve Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından yayımlanan Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Rehberi'ne uyguluyordu. Bu deneyde, 20 ila 22 g ağırlığında yirmi 10 haftalık dişi C57BL/6J fare kullanıldı. Bu fareler Zhejiang Çin Tıp Üniversitesi'nin hayvan merkezinden elde edilmiştir. Bu protokolte kullanılan tüm reaktifler, ekipman ve yazılımların listesi için Materyal Tablosu'na bakınız.

CC'nin aktif bileşikleri ve hedeflerinin taraması
CC'nin kimyasal bileşikleri, Herb 2.0¹⁷ kullanılarak "CC" anahtar kelimesi kullanılarak tanımlanmıştır. PubChem kimliği olmayan veya aynı kimyeliğe sahip kimyasallar filtrelendi. Daha sonra CC'ye karşılık gelen hedef siteleri elde etmek için kopyaları birleştirip kaldırın. Lipinski'nin beş kuralı (Mw ≤ 500, miLogP ≤ 5, nOHNH ≤ 5, nOH ≤ 10)¹⁹ üzerinden PubChem veritabanı¹⁸ kullanılarak ilk tarama yapılacaktır. Yazarlar, her kimyasal bileşik için SMILES temsilini belirlemek için PubChem veritabanını kullanırlar. SwissADME veritabanını kullanarak, yazarlar "Yüksek" GI emilimi kısıtlaması ve^{Druglikeness 20'de} ≥2 "Evet" değerine sahip bileşikleri seçtiler. İsviçre-Hedef Tahmin^{Veritabanı 21'i} kullanarak sıfırdan yüksek olasılıklara sahip hedef proteinleri çıkarabilirsiniz. Sonra CC'ye karşılık gelen hedef siteleri elde etmek için kopyaları birleştirip kaldırın.

SONFH ile ilişkili gen hedeflerinin derlenmesi
SONFH ile ilgili hedefler şu veritabanlarından alındı: DisGeNET^{veritabanı 22}; GeneCards^{veritabanı 23}; OMIM^{veritabanı 24} ve GEO^{veritabanı 25}. Yazarlar, OMIM ve DisGeNET veritabanlarından SONFH genlerini indirip deduplicate ettiler. GeneCards veritabanından kopyalar çıkarıldıktan sonra toplam 233 hastalıkla ilgili hedef alındı. Alınan tüm hedeflerin alaka puanları 0'dan büyüktü ve sonraki analizler için dahil edildi. Alınan genler arasında minimum önemlilik puanı 6,48 idi. SONFH ile ilgili farklı ekspreslenen genler (DEG), GEO veritabanındaki GPL15207 platformundaki GSE123568 serisinden elde edilmiştir. Parti etkileri R'deki limma paketi kullanılarak düzeltildi ve farklı ekspresyon genler (DEG) |logFC| > 1 ve P < 0.05²⁶. ggplot2 paketi, DEG'lerin dağılımını görselleştirmek için bir volkan grafiki oluşturmak için kullanıldı ve bulguları sunmak için bir ısı haritası hazırlandı. SONFH hastalık hedef kütüphanesi, R'deki Venn paketi kullanılarak tekrarlanan hedeflerin kaldırılmasıyla oluşturuldu.

PPI ağının kurulması
CC ve SONFH ile ilgili hedeflerin aktif bileşenlerinin öngörülen hedeflerine dayanarak, Venny 2.1.0²⁷ tarafından bir Venn diyagramı oluşturuldu. PPI verilerini elde etmek amacıyla yazarlar hedefleri STRING^{veritabanına 28} aktardılar. Organizmanın tarama kriterinin sınırlaması "Homo sapiens" idi ve güven indeksi ≥0.4 idi. Yazarlar, PPI ağ anahtar hedeflerini belirlemek için Cytoscape 3.7.2 kullandılar. Derece merkeziyeti (DC), PPI ağ anahtar hedeflerini incelemek için kullanıldı. Parametre filtresi medyan değerin iki katından fazladır. Ana hedefleri daha ayrıntılı olarak belirtmek amacıyla Cytoscape eklentisi kullanıldı.

Zenginleştirme analizleri, gen ontolojisi (GO) ve Kyoto genler ve genom ansiklopedisi (KEGG) veri tabanları kullanılarak gerçekleştirildi
CC ve SONFH'nin ortak hedefleri, DAVID^{veritabanı 29} üzerinden GO ve KEGG zenginleştirme analizleri için analiz edilmiştir. En iyi 10 GO terimini ve ilk 20 KEGG yolunu görselleştirmek için, Wei Sheng Xin³⁰ kullanılarak zenginleştirme nokta balon tablosu çizildi.

Ağ inşaatı
CC'nin SONFH'yi iyileştirmedeki moleküler mekanizmaları, bitki-bileşik hedefi (H-C-T) ve bileşik hedef-yolu (C-T-P) ağları aracılığıyla açıklandı. Cytoscape 3.10.3 yazılımı ağları gösterdi. H-C-T ağı, CC'den alınan aktif bileşikler ve ortak hedefleri kullanılarak geliştirilmiştir. Sonra Analyze Network aracını kullanın. Yollar, bileşikler ve hedefler arasındaki ilişkilerin anlaşılmasını artırmak için, en iyi 20 yol, ilgili hedefler ve bileşiklerle birlikte, Network Tools tarafından bir C-T-P ağı olarak organize edildi.

MD doğrulaması
Temel hedefler: HIF-1α, STAT3, ESR1, AKT1, SRC, ERBB2, CASP3 ve EGFR PPI analizinden elde edildi. Hedef, İnsan sınırlaması ile Uniport^{veritabanı 31} tarafından aranmış ve RCSB PDB^{veritabanı 32} tarafından incelenmiştir. Görece yüksek çözünürlüklü insan protein yapıları seçildi. Aktif maddeler C-T-P ağından tespit edilmiştir. İlgili 3D yapıları PubChem veritabanından mol2 formatında indirildi. Her dosya Chem3D'de açıldı ve enerji en aza indirildi. Daha sonra yazarlar, AutoDockTools³³ yazılımını kullanarak kurutma, hidrojenasyon ve reseptör proteininin Gasteiger yüklerini hesapladılar. Hem ligandlar hem de reseptörler PDBQT formatında tutuldu. Mekânsal konum ve bağlanma yeteneğine dayanarak, yazarlar kenetlenmenin fizibilitesini ve kararlılığını değerlendirirler. AutoDock Vina aracılığıyla, kenetleme ızgara kutusu ve makromolekül tahmin edildi. Bu araştırmada, ligandın tüm dönebilir bağları serbestçe dönmesine izin verildi, reseptörler ise sert olarak ayarlandı. Bağlanma skoru, reseptör ile ligand arasındaki bağlanma afinitesini gösterir; Puan ne kadar düşükse, bağlanma eğilimi o kadar yüksek olur. Bu ilke doğrultusunda, yazarlar ligandların proteinlerle bağlanma etkileşimlerini incelemek için en uygun bağlanma enerjisine sahip konformasyonları seçerler. Görsel sonuçlar PyMOL tarafından sergilendi.

Moleküler dinamik simülasyonu
Moleküler dinamik simülasyonları GROMACS³⁴ ile CHARMM36 kuvvet alanı kullanılarak gerçekleştirildi. Protein-ligand kompleksi, minimum çözünen kutusu mesafesi 1.0 nm olan kübik periyodik simülasyon kutusunda merkezlendi ve sistem SPC216 su modeliyle çözüldü. Sistem, uygun Na⁺ ve Cl⁻ karşılıkları eklenerek etkisiz hale getirildi. Enerji minimizasyonu, en dik iniş algoritması ve ardından konjuge gradyan yöntemiyle sıralı olarak gerçekleştirilerek olumsuz atomik temasları ortadan kaldırdı. Uzun menzilli elektrostatik etkileşimler, parçacık ağı Ewald (PME) yöntemiyle 10 şkesme mesafesi ile hesaplandı. Hidrojen atomlarını içeren tüm kovalent bağlar LINCS algoritması kullanılarak kısıtlanmıştır. Sıcaklık V-yeniden ölçekleme termostatı kullanılarak 300 K seviyesinde tutuldu ve izotropik bağlantılı Berendsen barostat ile basınç 1 barda kontrol edildi. Dengeleme aşamasında ligand'a 1000 kJ·mol⁻¹·nm^⁻2 kuvvet sabiti ile pozisyon kısıtlamaları uygulandı. Enerji minimizasyonundan sonra, sistem 2 ns NVT ve 2 ns NPT simülasyonlarıyla dengelendi, ardından 2 fs zaman adımıyla 100 ns üretim moleküler dinamik simülasyonu yapıldı. Atomik koordinatlar, sonraki yörünge analizi için her 10 ps kaydedildi.

SONFH fare modelinde deneysel doğrulama
Hayvanlar ve SONFH model kuruluşu
Zhejiang Çin Tıp Üniversitesi hayvan merkezinden 10 haftalık ve 20-22 g ağırlığında yirmi dişi C57BL/6J faresi alındı. Fareler kontrollü bir ortamda 7 günlük bir uyum sürecinden geçti ve sınırsız yiyecek ile suya erişim sağladı. Tüm fareler rastgele olarak gruplara (n = 5 grup başına yerleştirildi): kontrol grubu, SONFH grubu, SONFH + CC düşük dozlu (CC-Düşük, 7,5 g/kg/gün) ve SONFH + CC yüksek dozlu (CC-Yüksek, 15 g/kg/d) grup. SONFH modeli, daha önce tanımlandığı gibi kuruldu. Kısaca, SONFH, SONFH + CC-Low ve SONFH + CC-High gruplarındaki farelere 0. günde iki damar içi lipopolisakkarit (LPS; 20 μg/kg) enjeksiyonu verildi. Daha sonra, LPS enjeksiyonlarından 24 saat sonra 24 saat arayla üç kas içi metilprednizolon (MPS; 40 mg/kg) enjeksiyonu uygulandı. Tedavi gruplarındaki farelere, son MPS enjeksiyonu gününden itibaren 6 hafta boyunca günlük oral garaj yoluyla CC ekstraktı verildi. Kontrol grubu fareleri, karşılık gelen zaman noktalarında eşdeğer miktarda tuzlu su aldılar.

Örnek toplama ve hazırlık
6 haftalık tedavi süresinin sonunda fareler ötenazi edildi. İki taraflı femur başları dikkatlice diseksiye edilip hasat edildi. Her hayvan için, sol femur başı 48 saat boyunca 4 °C'de sabit tutuldu ve ardından kalsifikasyon ve parafin gömülmesi yapıldı. Sağ femur başı sabitlendi ve ardından dekalsifikasyon olmadan doğrudan Mikro-BT taraması için kullanıldı.

Histolojik analiz (ABH Boyama)
Dekalsifikasyon ve parafin gömülmesinden sonra, femur kafa bölümleri osteonekroz değişikliklerini değerlendirmek için Alcian Blue/Hematoxylin (ABH) protokolü kullanılarak boyandı. Kısa süreliğine, bölümler %1 Alcian Blue (pH 2.5) ile 30 dakika boyandı, duruldu ve ardından Harris hematoksilin ile karşı boyandı. Susuz bırakıldıktan ve montaj edildikten sonra, slaytlar ışık mikroskobu altında görüntülendi. Osteonekrozun nicelendirilmesi, ImageJ yazılımı kullanılarak iki kör gözlemci tarafından gerçekleştirildi. Boş boşlukların oranı, subkondral bölgede her örnek başına rastgele seçilmiş üç yüksek güçlü alanda (boş boşluk sayısı/toplam boşluk sayısı) × %100 olarak hesaplandı. Piknotik çekirdeklerin oranı da benzer şekilde belirlendi.

Mikro-bilgisayarlı tomografi (Mikro-BT) analizi
Femur başının üç boyutlu kemik mikroyapısı, yüksek çözünürlüklü mikro-BT tarayıcı kullanılarak analiz edildi. Sabit örnekler 10 μm (70 kV, 114 μA) çözünürlükte tarandı. Birincil ağırlık taşıyan bölgeyi kapsayan standart bir küresel ilgi hacmi (VOI) CTAn yazılımı kullanılarak yeniden inşa edilip analiz edildi. Aşağıdaki morfometrik parametreler nicelendirilmiştir: Kemik Hacmi/Toplam Hacm (BV/TV), Trabeküler Kalınlık (Tb.Th) ve Trabeküler Ayrılma (Tb.Sp).

İmmünofluoresans (IF) boyama
Kemik mikro ortamını değerlendirmek için, parafin kesitlerinde immünoflüoresans boyama yapıldı. Antijen toplama ve bloklamadan sonra, bölümler gece boyunca 4 °C'de aşağıdaki birincil antikorlarla kuluçka edildi: tavşan anti-HIF-1α (1:200), tavşan anti-ALP (1:300) ve tavşan anti-VEGF (1:150). Yıkamadan sonra, bölümler florofor ile konjuge edilmiş ikincil antikor karışımıyla kuluçka edildi: Alexa Fluor 488 etiketli keçi anti-tavşan IgG, Alexa Fluor 555 etiketli keçi anti-tavşan IgG. Çekirdekler DAPI ile karşı boyanmıştı. Görüntüler, sürekli pozlama ayarlarında floresan mikroskobu kullanılarak çekildi. Her belirteç için göreli floresans yoğunluğu, ImageJ yazılımı kullanılarak her örnek için üç alan boyunca nicelendirildi.

İstatistiksel analiz
Tüm nicel veriler ortalama ± standart sapma (SD) olarak sunulur. Tek yönlü varyans analizi (ANOVA) ve ardından Tukey'nin sonradan yaptığı testi, gruplar arasında istatistiksel anlamlılığı belirlemek için GraphPad Prism yazılımı (sürüm 9.0) kullanılarak gerçekleştirildi. 0.05'in altında olan bir P-değeri istatistiksel olarak anlamlı olarak kabul edildi.

Sonuçlar

CC'nin aktif bileşenlerinin ve tahmin edilen hedeflerinin tanımlanması ve "H-C-T" ağının geliştirilmesi.
SONFH iyileştirmesinde CC'nin temel bileşenleri ve hedeflerinin mekanizmalarını incelemek için yazarlar, taranan tüm CC bileşenlerini belirlemek için HERB 2.0 veritabanını kullandılar. CC'nin 209 aday aktif bileşeninden 85 muhtemel biyoaktif bileşik bulundu (Ek Tablo 1). İsviçre Hedef Tahmin Platformu kullanılarak ve tekrarlanan ve geçersiz girişler ortadan kaldırıldığında, bu CC bileşenlerine karşılık gelen 563 varsayılan hedef elde edildi (Ek Tablo 2). Yazarlar, CC'nin aktif bileşenlerini ve hedeflerini belirlemiştir.

SONFH'nin başlangıcı ve ilerlemesinde rol alan moleküler mekanizmaları incelemek ve potansiyel biyobelirteç hedeflerini belirlemek. GEO veritabanındaki GSE123568 veri setinin analizi, SONFH ile ilişkili DEG'leri tespit etti; bunların arasında 207 yukarı regülasyon ve 216 aşağı regülasyona edilmiş gen bulundu. 425 DEG'nin volkan grafiki Şekil 2A'da gösterilirken, en üst 60 DEG'nin ifade desenleri ifade seviyesine göre sıralanmış olarak Şekil 2B'de ısı haritası olarak sunulmuştur; renk yoğunluğu log-dönüştürülmüş ifade değerlerini yansıtmaktadır. DisGeNET, OMID ve GeneCards veritabanları SONFH ile bağlantılı 711 hedef sağladı. GEO veritabanındaki 425 dereceyi birleştirerek toplam 1136 hedef SONFH'ye bağlanmıştır. Tekrarların ortadan kaldırılmasının ardından, Şekil 2C'de gösterildiği gibi 1115 SONFH ile ilgili hedef doğrulandı. Yazarlar, SONFH için önceden bir hastalık hedef kütüphanesi oluşturmuşlardır.

Hedefleri ve birincil bileşenleri belirlemek için, CC'nin 563 hedefi ile 1115 SONFH ile ilgili hedefler arasında bir kesişim analizi, 61 ortak hedef (Şekil 3A ve Ek Tablo 3) tespit etmiştir; bu hedefler Cytoscape 3.10.3'e getirilerek "H-C-T" ağını inşa etmiştir (Şekil 3B). Bu ağ, 147 düğüm ve 413 kenardan oluşuyordu. Topolojik analizler, protein hedefleriyle en yüksek bağlantıyı (s)-4-nonanalid (derece:16), izohomogenol (derece:15), neril asetat (derece:14), Melilotokarpan A (derece:14), 3-metoksisinnamaldehit (derece:13) göstermiştir.

PPI ağının geliştirilmesi ve topolojik değerlendirmesi.
CC'nin SONFH'nin geliştirilmesindeki hedeflerini daha fazla incelemek. Cytoscape 3.10.3, 61 aynı hedef STRING veritabanına eklendikten sonra PPI ağını görüntülemek için kullanıldı. Ağda 463 kenar ve 60 düğüm vardı. Şekil 4A'da, düğümler renk ve boyut olarak açık ve küçükten daha koyu ve daha büyük birine geçiş yapar; bu da derecenin alçaktan yükseke doğru arttığını gösterir. MCODE eklentisi, bu hedeflerin iki fonksiyonel modüle (Şekil 4A) kümelenmesini kolaylaştırdı; bunlar arasında küme 1 23 düğüm ve 216 kenar içeriyordu ve 19.636 puan aldı. Ağ mimarisini daha iyi tanımlamak için topolojik metrikler olarak DC, BC ve CC kullanılmıştır. Bu parametrelerin medyan değerleri kesme noktası olarak belirlendiğinde, yazarlar 8 aktif hedef belirlemiştir (Şekil 4B). CytoHubba eklentisi, düğümleri sıralamak için MCC algoritmasını kullandı ve en iyi 10 geni belirledi. (Şekil 4C).

GO zenginleştirme analizi
ONFH iyileştirmesinde CC mekanizmalarını daha fazla incelemek için, BP, CC ve MF kullanılarak 61 potansiyel hedef üzerinde GO zenginleştirme analizi yapılmıştır. Toplam 435 GO dönemi zenginleştirildi; bunların 293'ü BP, 41'i CC dönemi ve 101'i MF dönemi dahil olmak üzere. Bu bulgular, Ek Tablolar 4, 5 ve 6'da gösterilmiştir. Şekil 5A, balon grafik olarak ilk 10 zenginleştirilmiş BP, CC ve MF terimini bir balon grafik olarak sunmaktadır. Bulgular, BP terimlerinin esas olarak sinyal iletimiyle, RNA polimeraz II ile transkripsiyonun pozitif regülasyonu, apoptotik sürecin negatif regülasyonu, DNA şablonlu transkripsiyonun pozitif regülasyonu ve RNA polimeraz II tarafından transkripsiyonun negatif regülasyonu ile ilişkili olduğunu gösterdi. Analiz, MF terimlerinin esas olarak protein bağlanması, metal iyon bağlanması ve aynı protein bağlanmasında rol oynadığını ortaya koydu. CC sonuçları, hedeflerin çoğunun esas olarak sitoplazma, membran ve plazma zarında yer aldığını gösterdi.

KEGG analizi
CC'nin SONFH'yi iyileştirebileceği potansiyel biyokimyasal mekanizmalar hakkında bilgi vermek için, CC'nin SONFH'yi nasıl iyileştirebileceği biyokimyasal mekanizmaları aydınlatmak amacıyla KEGG yol zenginleştirme analizi yapıldı. P < 0.05 ve FDR < 0.05 tarama kriteri kullanılarak 48 KEGG zenginleştirme girişi tanımlandı (Ek Tablo 7). Kat Zenginleştirme ve sayımla belirlenen en önemli 20 zenginleştirilmiş yol, baloncuk ve çubuk grafikleri kullanılarak görselleştirildi (Tablo 1, Şekil 5B ve 5C). Cytoscape 3.10.3 kullanılarak, 167 düğüm ve 589 kenarlı bir C-T-P ağı oluşturuldu (Şekil 5D). CC'nin SONFH üzerindeki etkileri, GO fonksiyonel ve KEGG yol zenginleştirme analizlerinde belirtildiği gibi, Kaposi sarkomu ile ilişkili herpesvirüs enfeksiyonu, HIF-1 sinyal yolu ve Lipid ile ateroskleroz ile ilişkilidir.

MD Doğrulama
Aktif bileşikler ile ana hedefler arasındaki potansiyel etkileşimleri değerlendirmek için, C-T-P ağından anetol, melilotokarpan A, neril asetat, kaprilin asit, izohomogenol, 3-metoksisinnamaldehit, (s)-4-nonanolid, miristisin, borneol ve cinnamil asetat dahil olmak üzere 10 bileşik, ana hedefler AKT1, HIF-1α, STAT3, ESR1, CASP3, SRC ve EGFR ile birleştirildi. Tüm bileşik-hedef çiftleri için tam kenetlenme sonuçları Ek Tablo 8'de özetlenmekte olup, bileşikler, hedefler ve kenetleme parametreleri hakkında ayrıntılı bilgiler Ek Tablo 9'da sunulmaktadır. Şekil 6, bağlanma enerjisi dağılımının ısı haritasını sunmaktadır.

Genel olarak, birkaç bileşik hedef çifti nispeten olumlu bağlanma eğilimleri sergilemiş, daha düşük bağlanma enerjisi değerleri ise daha kararlı tahmin edilen etkileşimleri göstermiştir. Özellikle, kenetlenme sonuçları hem bileşikler hem de hedefler arasında bağlanma eğilimlerinde açık bir heterojenlik gösterdi. Melilotocarpan A gibi bazı bileşikler, birden fazla hedef arasında sürekli olarak nispeten güçlü bağlanma eğilimleri sergilerken, diğerleri daha orta veya zayıf etkileşimler göstermiştir; bu da farklı bileşiklerin tahmin edilen farmakolojik etkilere eşit olmayan katkı sağlayabileceğini göstermektedir.

Ayrıca, hedefler arasında değişkenlik de gözlemlendi. Örneğin, STAT3 ve EGFR gibi belirli hedefler, AKT1 veya SRC gibi hedeflere kıyasla çoklu bileşiklerle nispeten orta veya zayıf bağlanma eğilimleri göstermiş, bazı değerler ise -5.0 kcal/mol civarındadır. Bu desen, tüm çekirdek hedeflerin tanımlanan bileşiklerin doğrudan yüksek afiniteli bağlanma ortağı olarak işlev görmediğini ve bunun yerine etkileşim ağı içinde dolaylı düzenleyici roller oynayabileceğini gösterir. Bu farklılıklar, ligandlar ile protein bağlanma noktaları arasındaki yapısal uyumluluk farklılıkları ve hedeflerin doğal özellikleriyle ilgili olabilir.

Değerlendirilen çiftler arasında AKT1, melilotokarpan A ile en düşük bağlanma enerjisini gösterdi (-9.6 kcal/mol), bu da potansiyel olarak olumlu bir etkileşim olduğunu düşündürdü. Şekil 7, bu kompleksin öngörülen bağlanma modunu göstermektedir. Özellikle, AKT1'in SER205'i melilotokarpan A, anetol ve miristicin ile hidrojen bağları oluşturur. Ayrıca, melilotokarpan A'nın HIF-1α'nin GLY309, STAT3'ün LEU438 ve THR440, ESR1'in SER433 ve ARG412 ile SRC'nin ARG500 ve GLU510 ile hidrojen bağları oluşturduğu öngörülmüştür.

Temsilci aday bileşikleri belirlemek için, her hedef için en düşük bağlanma enerjisi kullanıldı ve nispeten stabil etkileşimleri göstermek için ≤ -5.0 kcal/mol bağlanma enerjisi eşiği belirlendi. Bu kriterlere dayanarak, melilotokarpan A, anetol ve miristisin potansiyel anahtar bileşikler olarak tanımlanmıştır. Genel olarak, CC'nin aktif bileşenlerinin çoğunda seçilen terapötik hedeflerle potansiyel etkileşimler gösterdi ve bazı bileşikler birden fazla hedefte nispeten daha güçlü bağlanma eğilimleri gösterdi. Ancak, MD'nin potansiyel etkileşimlerin ön tahminlerini sağlayan ve protein esnekliği ile karmaşık biyolojik ortamları tam olarak hesaba katmayabilecek basitleştirilmiş bir hesaplama yaklaşımı olduğu belirtilmelidir. Bu nedenle, bu sonuçlar temkinli yorumlanmalıdır ve gözlemlenen etkileşimler doğrudan bağlamanın kesin kanıtı oluşturmaz.

Moleküler dinamik simülasyonu
Komplekslerin kararlılığını daha fazla değerlendirmek için yazarlar, moleküler dinamik simülasyonları için AKT1-melilotokarpan A, HIF-1α-melilotokarpan A ve STAT3-melilotokarpan A komplekslerini seçtiler. Tahmin edilen hedefler arasında, STAT3 ve HIF-1α, PPI ağındaki merkezi rolleri ve SONFH patolojisiyle biyolojik önemi nedeniyle MD simülasyonları için seçildi. STAT3, PPI ağında en yüksek bağlantı derecelerinden birini gösterdi ve bu, birden fazla sinyal yolunda potansiyel bir düzenleyici rol olduğunu gösteriyor. HIF-1α, KEGG zenginleştirme analizinin HIF-1 sinyal yolunun osteonekrozda anjiyogenez ve hipoksi adaptasyonuyla ilişkili en önemli yollardan biri olduğunu belirlemesi nedeniyle seçildi.

Aynı zamanda, yazarlar güçlü ikenme puanları ve SONFH'nin patolojik özellikleriyle, özellikle hipoksi kaynaklı anjiyojenez ve kemik yenilenmesi ile doğrudan ilgisi nedeniyle AKT1'i temsil edici bir hedef olarak benimsediler. Hesaplama kaynak kısıtlamaları nedeniyle, ağ farmakolojisine dayalı moleküler simülasyon çalışmalarında yaygın olarak benimsenen strateji olan ayrıntılı MD simülasyonları için üç temsilci kompleks seçildi. Kök ortalama kare sapması (RMSD), protein-ligand komplekslerinin konformasyonel kararlılığını etkili bir şekilde değerlendirir; burada daha düşük değerler daha yüksek yapısal stabiliteyi gösterir. Şekil 8A'da gösterildiği gibi, AKT1-melilotocarpan A kompleksi ilk 12 ns içinde gevşemeyi tamamlamış ve ardından stabil bir platoya ulaşmış, sadece 50-55 ns civarında geçici bir dalgalanma gözlemlendikten sonra hızla dengeye geri dönmüştür. Simülasyon boyunca genel RMSD yaklaşık 0.369 nm idi. Şekil 8B, HIF1A-melilotocarpan A kompleksinin ilk 16 ns içinde gevşediğini ve ardından stabil bir plato korunduğunu göstermektedir. 38 ile 42 ns arasında kısa bir dalgalanma yaşandı, ardından hızlı bir yeniden stabilizasyon gözlemlendi. Bu kompleksin genel RMSD değeri 0.25 nm idi. Şekil 8C'de, STAT3-melilotokarpan A kompleksi 0,3 ns içinde gevşeme geçirmiş ve ardından stabil bir platoya ulaşmıştır. Kısa süreli dalgalanma 5 ns ile 80 ns arasında gerçekleşti. Genel simülasyon yaklaşık 0.21 nm idi. AKT1-melilotocarpan A'da gösterildiği gibi, HIF-1α-melilotokarpan A ve STAT3-melilotokarpan kompleksleri, belirgin değişiklikler olmadan stabiliteyi korudu ve bu da nispeten stabil bir kombinasyon olduğunu gösterdi.

Proteinlerdeki amino asit kalıntılarının esnekliği, kök ortalama kare dalgalanması (RMSF) kullanılarak değerlendirildi. Şekil 9A, ortalama küresel kalıntı dalgalanması yaklaşık 0,17 nm olup, stabilitenin esas olarak yapısal çekirdek ve bağlanma cepi tarafından korunduğunu göstermektedir. Daha yüksek esneklik, cep çekirdeği yerine terminal segmentler ve döngü bölgeleri gibi doğası gereği hareketli bölgelerle sınırlıydı. Bu bölgelerin esnek olduğu iyi bilinmektedir. Şekil 9B , kalıntıların yaklaşık %94'ünün RMSF değerlerinin 0,20 nm'nin altında olduğunu ve sadece %6'sının 0,30 nm'yi aştığını göstermektedir; bu da genel protein omurgası ve iç kalıntıların kararlı bir aralıkta dalgalandığını gösterir. Şekil 9C, ortalama küresel kalıntının yaklaşık 0,17 nm olduğunu göstermektedir. Verilerde 0,15 nm'yi aşan dalgalanmalar tespit edilmedi; bu da bağlanma cebinin simülasyon boyunca stabil bir konformasyonu koruduğunu gösteriyor. Hem AKT1-melilotocarpan A hem de HIF-1α-melilotocarpan A komplekslerinin güçlü ve kararlı etkileşime girdiği gösterilmiştir.

Hidrojen bağları, protein-ligand etkileşimlerini teşvik etmek için kritiktir. Şekil 10A , AKT1-melilotokarpan A komplekslerinin tipik olarak bir hidrojen bağı oluşturduğunu ve hidrojen bağlarının sayısının 0 ile 2 arasında değiştiğini göstermektedir. Melilotocarpan A ile HIF-1α arasında 0,35 nm'den daha az mesafe vardır. AKT1, sık sık melilotokarpan A ile yakın mesafede etkileşime girer. HIF-1α-melilotokarpan A kompleksleri, Şekil 10B'de gösterildiği gibi öncelikle bir hidrojen bağı olmak üzere 0 ila 2 hidrojen bağı oluşturur. Şekil 10 C'de, STAT3-melilotokarpan A kompleksinin hidrojen bağ sayısı sıfırdan dört'e kadardır. Çoğu zaman, melilotokarpan A ile HIF-1α arasındaki A atomları 0,35 nm'den daha az aralıkta bulunur. HIF-1α-melilotokarpan A kompleksleri 1-3 çift yakın temas ve bazen 7-9 çift bile oluşturur. Bu, küçük molekül ile hedef proteinler arasında etkili hidrojen bağları etkileşimlerini gösterir. Özetle, hem AKT1-melilotokarpan A hem de HIF-1α-melilotokarpan A kompleksleri stabilite ve dayanıklılık gösterir.

CC, SONFH farelerinin inflamatuar reaksiyonunu ve apoptozunu inhibe eder
ABH boyama ile histolojik analiz, SONFH grubunda belirgin osteonekrotik değişiklikler ortaya koymuştur; bu değişiklikler artan boş boşluklar, piknotik çekirdekler ve bozulmuş trabeküler mimariyle karakterize edilirken, bu patolojik özellikler CC tedavisinden sonra belirgin şekilde hafiflemiştir (Şekil 11A). Nicel analiz, CC ile işlenmiş gruplarda boş boşluklar ve piknotik çekirdeklerin oranlarının SONFH grubuna kıyasla anlamlı şekilde azaldığını doğruladı (Şekil 11B–C). Mikro-BT analizi, SONFH grubunda şiddetli trabeküler kemik kaybı gösterdi ve bu durum CC uygulamasıyla kısmen tersine çevrildi (Şekil 11D). Tutarlı olarak, CC tedavisi BV/TV ve TB'yi önemli ölçüde artırdı. Tb.Sp'nin SONFH grubuna göre azalması durumunda (Şekil 11E–G). İmmünoflüoresans boyama, SONFH grubunda HIF-1α ekspresyonunun yükseldiğini ve ALP seviyelerinin azaldığını ve VEGF ekspresyonunun değiştiğini gösterdi. CC tedavisi, HIF-1α ve VEGF ekspresyonunu modüle etti ve ALP sinyallerini artırdı; bu da kemik mikro ortamı ve osteojenik aktivitenin iyileşmesini gösterdi (Şekil 11H).

VERİ ERIŞILEBILIRLIĞI:
Mevcut çalışmada kullanılan veya analiz edilen veri setleri, şu bağlantıda mevcuttur: https://zenodo.org/records/19730455.

Şekil 1: SONFH'nin CC iyileştirilmesi için ağ farmakoloji çalışma stratejisinin akış şeması. Şekil 1, çalışmanın veri tabanından CC'den potansiyel hedefleri olduğunu, SONFH'nin temel hastalık olduğunu göstermektedir. Bunlar hastalıkla ilgili hedeflerle kesiştirildikten sonra, bir "bileşen–hedef–yol" ağı ve GO, KEGG terimleri oluşturuldu. Daha sonra moleküler kenetlenme ve moleküler dinamik simülasyonu kullanılarak ana bileşenler ile çekirdek hedefler arasındaki bağlanma yakınlığı değerlendirilir ve nihai doğrulama deneysel doğrulama yoluyla yapılır. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: SONFH ile ilişkili kesişen hedeflerin taraması. (A) Hastalık örneklerindeki farklı şekilde ifade edilen genlerin dağılımını gösteren volkan grafiki. Kırmızı noktalar yukarı düzenlenmiş genleri, mavi noktalar aşağı regülasyona sahip genleri, gri noktalar ise belirgin şekilde farklı ifadeye sahip olmayan genleri temsil eder. (B) 60 farklı şekilde ifade edilen genin ifade desenlerini gösteren ısı haritası; sütunlar örneklere karşılık gelir ve satırlar genlere karşılık gelir. (C) Farklı veritabanlarından elde edilen hastalıkla ilgili hedeflerin örtüşmesini gösteren Venn diyagramı. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: CC ve SONFH arasındaki kesişen hedeflerin taraması. (A) CC (sarı) ve SONFH ile ilişkili hastalık hedefleri (mor) olarak tahmin edilen aktif bileşikler hedefleri arasında paylaşılan 61 ortak hedefin dağılımını gösteren Venn diyagramı. (B) Bitki-Bileşik Hedef (H-C-T) ağı, bileşikler ile ilgili hedefler arasındaki etkileşimleri gösterir. Mavi kare düğüm hastalığı, yeşil kare düğümler aktif bileşikleri, turuncu kare düğümler ise ortak hedefleri gösterir. Kenarlar, bileşikler ile hedefleri arasındaki etkileşimleri ifade eder. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: PPI analiziyle aday hedef tanımlama. (A) PPI ağı MCODE eklentisiyle kümelenmiş. (B) PPI ağı içinde topolojik taramanın şematik iş akışı. (C) CytoHubba eklentisiyle PPI ağından çıkarılan anahtar genler. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 5: 61 ortak hedef için GO zenginleştirme analizi sonuçları ve KEGG yol zenginleştirme analizi. (A) BP, CC ve MF için en iyi 10 GO zenginleştirme analiz terimini gösteren balon grafiki. (B) Önemli ölçüde zenginleşmiş ilk 20 KEGG yolunu gösteren balon grafiki. (C) KEGG fonksiyonel sınıflandırmasına dayalı olarak en iyi 20 zenginleştirilmiş yolun dağılışı. (D) CC'nin femur kafanın osteonekrozunu iyileştirebileceği potansiyel mekanizmaları gösteren illüstrasyonel C-T-P ağı. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 6: CC'nin aktif bileşikleri ile ana hedefler (kcal/mol) arasındaki etkileşimlerin bağlanma enerjisi ısı haritası. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 7: Anahtar hedeflerin belirli aktif bileşiklerle bağlanma modları. AKT1-melilotokarpan A (A1), HIF-1α-melilotokarpan A (B1), STAT3-melilotokarpan A (C1), ESR1-melilotokarpan A (D1), CASP3-melilotokarpan A (E1), SRC-melilotokarpan A (F1), EGFR-melilotokarpan A (G1), AKT1-anetol (H1), AKT1-miristisin (I1). (A2), (B2), (C2), (D2), (E2), (F2), (G2) ve (H2) sırasıyla 2B bağlanma modlarını gösterir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 8: MD'nin RMSD'si. (A) AKT1-Melilotocarpan A kompleksleri için RMSD değerleri. (B) HIF-1α-Melilotokarpan A komplekslerinin RMSD değerleri. (C) STAT3-Melilotocarpan A komplekslerinin RMSD değerleri. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 9: MD'nin RMSF'si. (A) AKT1-Melilotocarpan A komplekslerinin RMSF değerleri. (B) HIF-1α-Melilotocarpan A komplekslerinin RMSF değerleri. (C) STAT3-Melilotocarpan A komplekslerinin RMSF değerleri. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 10: MD'nin H-bağları. (A) AKT1-Melilotocarpan A komplekslerinin H-bağ değerleri. (B) HIF1A-Melilotokarpan A komplekslerinin H-bağ değerleri. (C) AKT1-Melilotocarpan A komplekslerinin H-bağ değerleri. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 11: CC, femoral başta inflamatuar yanıt ve apoptozu inhibe eder, böylece SONFH'yi iyileştirir. (A) ABH ile boyanmış temsil femur baş bölümleri. Boş boşluklar siyah ok uçlarıyla, piknotik çekirdekler ise oklarla gösterilir. (B–C) Boş boşlukların (B) oranının ve piknotik çekirdeklerin (C) sayısının nicel analizi. n = 5. (D) Femur başlarının temsil üç boyutlu mikro-BT rekonstrüksiyonları. (E–G) Kemik hacmi fraksiyonu (BV/TV), trabeküler ayrım (Tb.Sp) ve trabeküler kalınlık (Tb.Th) dahil olmak üzere mikro-KT parametrelerinin niceliklendirilmesi. (H) Femur başı kesitlerinde HIF-1α, VEGF ve ALP'nin temsil immünoflüoresans boyaması; çekirdekler DAPI ile karşı boyandı. Veriler ortalama SD ± (n = 5) olarak sunulur. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Terim		Fold Zenginleştirme	P-Değeri	Kont	Kullanıcı Ismleri
Mesane kanseri		28.44	1.23E-07	7	CREBBP,CXCL8,NOS2,MMP2,STAT3,F2,PTGS2, HIF1A,ESR1,MMP9,EGFR,MTOR,VEGFA,CASP3, ERBB2,EP300,PPARG,NFE2L2,BCL2L1
HIF-1 sinyal yolu		16.66	6.56E-10	11	SRC,MMP2,STAT3,HIF1A,ESR1,MMP9,EGFR, MTOR,VEGFA,CASP3,ERBB2,KDR,PDCD4,PTPN6
EGFR tirozin kinaz inhibitörü direnci		16.66	3.84E-07	8	CCR1,CREBBP,CXCL8,SRC,CASP3,STAT3 ,EP300,TYK2,PTGS2,HIF1A,MTOR,VEGFA
Adherens kavşağı		12.54	1.64E-05	7	CREBBP,ABCB1,CASP3,ERBB2,STAT3,PDCD4, EP300,PTGS2,MMP9,EGFR,MTOR,VEGFA
Endokrin direnç		11.78	2.35E-05	7	CREBBP,NOS2,NOS3,ERBB2,STAT3, SERPINE1,EP300,HIF1A,EGFR,MTOR,VEGFA
Diyabet komplikasyonlarında YAŞ-ÖFKE sinyal yolu		11.55	2.63E-05	7	CCR1,CXCL8,SRC,CASP3,STAT3,CXCR2,PTGS2,EGFR,MTOR,VEGFA
Kanserde Proteoglikanlar		11.43	1.19E-10	14	CXCL8,SRC,NOS3,CASP3,STAT3,PPARG,MMP9,BCL2L1,NFE2L2
Rahatlama sinyal yolu		10.25	1.02E-05	8	OXTR,NOS2,NOS3,ERBB2,PTAFR,KDR,NOS1,EGFR,VEGFA
Kaposi sarkomu ile ilişkili herpesvirüs enfeksiyonu		10.20	1.45E-08	12	SRC,ERBB2,STAT3,KDR,EGFR,MTOR,BCL2L1,VEGFA
Tiroid hormonu sinyal yolu		9.56	7.64E-05	7	NOS2,SRC,NOS3,MMP2,NOS1,MMP9,EGFR,VEGFA
Sıvı kesme stresi ve ateroskleroz		8.21	0.000177	7	CREBBP,CXCL8,SRC,CASP3,STAT3,EP300,TYK2,MMP9
Hepatit B		8.18	4.41E-05	8	CREBBP,STAT3,EP300,PTPN6,TYK2,EGFR,MTOR,BCL2L1
JAK-STAT sinyal yolu		7.93	5.35E-05	8	SRC,VDR,STAT3,CYP3A4,ESR1,EGFR,MTOR,VEGFA
İnsan sitomegalovirüs enfeksiyonu		7.34	6.2E-06	10	CREBBP,CASP3,EP300,TYK2,PTGS2,EGFR,MTOR,VEGFA
Lipid ve ateroskleroz		6.94	0.000035	9	CXCL8,SRC,MMP2,ERBB2,MMP9,EGFR,VEGFA
Kanserde MikroRNA'lar		6.25	2.06E-06	12	CREBBP,SRC,ERBB2,EP300,PTPN6,PTPRF,EGFR
Kimyasal karsinogenez - reseptör aktivasyonu		6.14	0.000265	8	SRC,MMP2,ERBB2,ESR1,MMP9,EGFR,MTOR
Kanserde Yollar		5.94	6.64E-10	19	CXCL8,NOS3,CASP3,MMP2,STAT3,SERPINE1,VEGFA
Kalsiyum sinyal yolu		5.90	0.00011	9	KAT2B,CREBBP,SRC,EP300,HIF1A,ESR1,MTOR
İnsan papilloma virüsü enfeksiyonu		4.00	0.00324	8	SRC,NOS3,MMP2,KDR,MMP9,NFE2L2,VEGFA

Tablo 1: En İyi 20 Zenginleştirilmiş Yolun KEGG Zenginleştirme Sonuçları.

Ek Tablo 1: CC'deki aktif bileşiklerin temel bilgileri.Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Tablo 2: CC'deki 85 aktif bileşenin hedefleri.Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Tablo 3: 61 CC-SONFH ortak hedefi hakkında bilgi.Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Tablo 4: GO zenginleştirme analizinden biyolojik süreç kategorisi terimlerinin sonuçları.Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Tablo 5: GO zenginleştirme analizinden hücresel bileşen kategorize terimlerinin sonuçları.Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Tablo 6: GO zenginleştirme analizinden moleküler fonksiyon kategorisi terimlerinin sonuçları.Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Tablo 7: KEGG zenginleştirme analizinden elde edilen yolların sonuçları.Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Tablo 8: Bileşik hedef çiftlerinin moleküler kenetleme bağlanma enerjileri (kcal/mol).Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Tablo 9: Moleküler kenetlenme için hedefler ve bileşenlerin detayları.Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

Bu çalışmada yazarlar, CC'den çeşitli veri tabanlarından 85 biyoaktif bileşik elde ettiler ve ana kimyasal bileşenler arasında anetol, melilotokarpan A ve miristisin yer alan eleme yaptılar. Hedefleri belirlemek için yazarlar, 563 ilaç CC hedefi ile 1116 SONFH ile ilgili hedef kesiştirerek sonunda 61 hedef elde ettiler. Yazarlar, PPI ağı kurmak ve olası farmakolojik yolları incelemek için STRING ve DAVID veritabanlarına 61 yaygın hedef aktardılar. Sonuçlar, PPI ağında HIF-1α ve STAT3 dahil olmak üzere 10 önemli hedefi ortaya koydu. Iskemi ve hipoksi, SONFH'nin ana patojenik özelliklerinden ikisidir, önceki^{araştırmalara göre 35}. CC, anjiyogenez ve transkripsiyonel düzenleme dahil olmak üzere birçok biyolojik süreçle SONFH'de olumlu etkiler gösterebilir. KEGG zenginleştirme analizine göre, bu HIF-1α sinyal yolu, sıvı kesme stresi ve ateroskleroz, lipidler ve ateroskleroz, diyabetik komplikasyonlarda AGE-RAGE sinyal yolu ve diğer sinyal yolları aracılığıyla gerçekleştirilebilir. Bu, CC'nin bu ana hedefler ve ilgili yollar aracılığıyla SONFH üzerinde etkili olabileceğini gösteriyor. CC bileşenlerinin hedeflerle sıkı bağlantılı olup olmadığını daha da netleştirmek için, yukarıdaki ağ farmakoloji araştırma sonuçlarına, yani bileşik reçetesinin aktif bileşenlerinin tarama sonuçlarına ve PPI ağındaki hedeflerin tarama sonuçlarına dayanarak, yazarlar melilotokarpan A-AKT1, melilotokarpan A-HIF-1α'nin moleküler dinamik simülasyonlarını yaptılar. ve STAT3-melilotokarpan kompleksleri. Bu, melilotokarpan A'nın AKT1, HIF-1α ve STAT3'e düzenli olarak bağlandığını gösteriyor; bu nedenle CC bu ana hedeflere etki ederek gerçekten olumlu etkiler gösterebilir. Genel olarak, çok bileşenli, çok hedefli, çok yollu bir mekanizma sayesinde, CC SONFH hastalarının yaşam kalitesinde koruyucu etkiler yaratabilir.

Araştırma grubu, kemikle ilgili hastalıklarda YGP'lerin terapötik etkiler yaratma mekanizmalarını açıklamaya odaklanmıştır. Önceki araştırmalar, YGP'lerin kemik oluşumunu artırdığını ve β-katenin aktive ederek osteoklastogenezi inhibe ettiğini ve tavşan^{SONFH 36} sırasında osteogenezi teşvik ettiğini göstermiştir. Ayrıca, araştırmacılar YGP'lerin öncelikle iltihabı hafifletmek ve anjiyogenezi teşvik etmek yoluyla SONFH üzerinde terapötik etkiler^{yarattığını bulmuşlardır 12}. YGP'ler sadece SONFH'yi iyileştirmekle kalmaz, aynı zamanda osteoporozu da iyileştirebilir. IL-17/NF-κB sinyal yolunu inhibe ederek ve Th17 bağışıklık yanıtlarını azaltarak, YGP'ler ovariektomi kaynaklı kemik^{kaybını başarıyla durdurur.} Hayvan deneyleriyle araştırmacılar, YGP'lerin bileşenlerinden biri olan Cornus officinalis'in, inflamatuar aracıların salgılanmasını engelleyerek SONFH üzerinde etkili olduğunu ve kemik hücresi^{apoptozunu 38} incelediğini doğruladılar. Yang'ı ısıtabilen, qi'ye fayda sağlayabilen ve meridyenleri açabilen CC, YSN'lerin başlıca bitkisidir ve SONFH'nin iyileştirilmesinde ve hastaların acısını hafifletmede kritik rol oynar. Özetle, bu çalışmalar osteonekrozda YGP'lerin mekanizmalarını aydınlatmaya ve CC'nin SONFH'de mekanik araştırmaya değer ana bitki olarak belirlenmesine yönelik uzun süreli odaklanmayı yansıtmaktadır.

Tahmin edilen aktif bileşenler arasında anetolik, miristisin ve diğer bileşenler kemik kaynaklı hastalıklara karşı biyolojik etkinlik göstermiştir. Anetol, kemik rezorbsiyon belirteçlerinin yükselmesini engelleydiği gösterilmiştir. Anethol, nihayetinde osteoklastın farklılaşmasını ve rezorpsiyon fonksiyonunu aşağı akış yollarını ve ana düzenleyici faktörleri inhibe ederek^{azaltır 39}. Araştırmalar, anetolun insan kemik iliği mezenkimal kök hücrelerinde (hBMSC) anti-inflamatuar özellikler sergilediğini ve adipogenik farklılaşmayı engellediğini ^{göstermektedir.40}. Myristicin, iltihabı inhibe eder ve damar düz kas hücrelerini PI3K/Akt ile NF-κB^{yollarını baskılayarak korur 41}. Feroptoz, SONFH patogenezinin temel mekanizmalarından biridir. Ferropoz, demire bağlı lipid peroksidasyonu nedeniyle programlanmış bir hücre ölümü türüdür. Myristicin, ferroptozu önler, böylece osteoblast hücre zarlarının redoks homeostazını^{korur 42}. Borneol'ün diğer bileşeninin, hücre polarizasyonunu yansıtan osteoklastların reemme özelliği olan aktin halkalarının oluşumunu 30 dakika⁴³ içinde inhibe ettiği doğrulanmıştır. Bu bulgular, bu bileşenlerin SONFH'de CC'nin koruyucu etkisi için çok önemli olabileceğini ve daha fazla araştırılmaya değer olduğunu göstermektedir. Tüm bu bileşenler içinde, Melilotocarpan A, MD analizinde birden fazla çekirdek hedefe sahip en stabil bağlanma eğilimlerini gösterdiği için temsil ligand olarak seçildi. En üst sıralarda yer alan bileşikler arasında Melilotocarpan A, PPI ağındaki birkaç ana proteinle tutarlı güçlü bağlanma etkileşimleri gösterdi ve bu da CC'nin önemli bir biyoaktif bileşeni olabileceğini düşündürüyor.

Ayrıca, PPI ağının sonuçları, özellikle HIF-1α ve STAT3'ün temel hedefler olabileceğini ortaya koydu. HIF-1α, hücresel hipoksiye yanıtın merkezi aracısıdır. SONFH deneylerinde, HIF-1α'yi aktive etmek anjiyogenezi ve kemik onarımını artırır, böylece femoral kafa^{nekrozu 44'ü} hafifletmiştir. Ayrıca, araştırmalar HIF-1α'nin hipoksik koşullarda kıkırdak dokusu üzerinde koruyucu bir etki yaratabileceğini^{ortaya koymuştur 45}. HIF-1α'nin yukarı regulasyonu ferroptozu baskılar ve STAT3'ü aktive ederek kemik iliği monositlerinin osteoklastlara ayrılmasını^{hızlandırır. 46}. STAT3, bir sinyal iletimi ve transkripsiyon aktivatörüdür. HBMSC'ler, STAT3'ün p-STAT3'e dönüşümünü teşvik eder; böylece kondrositlerin çoğalması, göçü ve hipoksik koşullarda anti-apoptotik etkileri artırır⁴⁷. STAT3, hBMSC'lerin osteojenik farklılaşmasını ve anti-apoptotik etkilerini artırırken, kemik mikrovasküler rejenerasyonunu teşvik etmek için damar endotelial büyüme faktörü (VEGF) salgısını artırır⁴⁸. AKT1, anjiyogenez sinyalinin önemli aracı olarak görev yapan bir protein kinazdır. AKT1, kemik anjiyogenezi-osteogenez birleşmesi ve trabeküler kemik oluşumunda^{rol oynar 49}. Genel olarak, bu merkez hedefler anjiyogenez, hipoksi adaptasyonu, iltihaplanma ve kemik yeniden şekillendirilmesi üzerine birleşir; bu da CC'nin bu hedefleri ve ilişkili sinyal yollarını modüle ederek SONFH'ye karşı koruyucu etkiler oluşturabileceğini öne sürer.

SONFH'nin iyileştirilmesindeki CC mekanizmasını incelemek için araştırmacılar GO analizi ve KEGG zenginleştirme analizi yaptılar. GO sonuçları, hedef genlerin esas olarak hipoksiye yanıt, lipopolisakkarite hücresel yanıt ve anjiyogenezin pozitif düzenlenmesi gibi biyolojik fonksiyonlarla zenginleştiğini göstermektedir. KEGG zenginleştirme analizi, SONFH'deki CC'nin farmakolojik etkilerinin ağırlıklı olarak diyabetik komplikasyonlarda, HIF-1α sinyal yolu, Lipid ve ateroskleroz ve diğer sinyal yollarında AGE-RAGE sinyal yoluyla bağlantılı olduğunu göstermiştir. SONFH, femur kafaya giden kan akışının kesilmesiyle oluşur; bu da femur kafa için besin desteğinin yetersizliğine ve hücre^{apoptozu 50'yi} tetiklemesine yol açar. HIF-1, HIF-1α ve HIF-1β'dan oluşur; HIF-1α, hipoksik ve iskemik ortamlara transkripsiyonel yanıtta önemli^{bir rol oynar 47}. Önceki çalışmalar, VEGF/AKT/mTOR sinyal zinciri aracılığıyla HIF-1α'nin osteogenez ve anjiyogenezi koordine ettiğini, böylece yağdan kök hücrelerin osteojenik farklılaşmasını kritik şekilde artırdığını göstermiştir. Iskemi meydana geldikten sonra doku hipoksisi gelişir ve hücrelerde HIF-1α oranının belirgin bir yükselmesine yol açar. bu da VEGF ekspresyon seviyelerini artırır ve dolayısıyla damar onarımı ve rejenerasyonu^{destekler 51}. Hipoksî mitokondriyal enerji üretimini bozar ve reaktif oksijen türlerinin (ROS) oluşumunu artırır. Bu değişiklikler osteoklastogenezi teşvik eder, osteoblast aktivitesini engeller ve nihayetinde osteosit apoptozunu indükler. Yüksek HIF-1α ekspresyonu, hücresel enerji metabolizmasını oksidatif fosforilasyondan glikolize kaydırır, ROS üretimini azaltır ve böylece osteoblastlar ve osteositlerde apoptozu azaltır ^52,53. Söklöz kemik, kemik iliğinin hematopoietik işlevini destekler ve kalsiyum gibi mineralleri depolar. HIF-1α'nin artan aktivitesi, doğrudan kemik oluşumunu artırabilir⁵⁴. Ayrıca, HIF-1α hidroksen koşullarında kondrositlerin hayatta kalma ve homeostazını korur⁴⁵. Sonuç olarak, HIF-1α sinyal yolu ONFH için terapötik bir hedef haline gelmiş ve ONFH için potansiyel terapötik uygulama sunmaktadır.

AGE-RAGE sinyal yolunda, İleri Glikasyon son ürünleri (AGE'ler), karbonhidratların proteinler, yağlar veya diğer biyolojik makromoleküllerle enzimatik olmayan kovalent çapraz bağlanmasından^{kaynaklanır.} AGE'ler hücrelere ve dokulara inflamatuar ve oksidant hasar yoluyla zarar verebilir. Dört yol boyunca, sinyaller AGE-RAGE etkileşimiyle iletilir. Bunlar 1) JAK-2-STAT1, (2) PI3K-AKT, (3) MAPK-ERK ve (4) NADPH oksidaz-ROS^56'dır. Sonunda, fosforile edilmiş NF-κB çekirdeğe girerek proinflamatuar sitokinler, büyüme faktörleri, profibrotik sitokinler ve oksidatif stresin ekspresyonunu transkribe eder. Çalışma, AGE-RAGE'in MAPK sinyal yolu ve oksidatif stresin aktivasyonu yoluyla osteoblast apoptozunu teşvik ettiğini, endoplazmik retikülum stres sensörlerinin seviyelerini baskılayarak ve DNA metilasyonu/Wnt^{yolu 57} yoluyla osteojenik farklılaşmayı inhibe ettiğini göstermiştir. Ayrıca, çalışmalar AGE ve RAGE'lerin damar kalsifikasyonunda yer^{aldığını göstermiştir 58}.

Lipid ve ateroskleroz sinyal yolunda, oksitlenmiş lipidler PPARγ'yi aktive eder. Osteojenik farklılaşmayı engelleyen adipogenezin ana^{düzenleyicisidir 59}. Ayrıca, birçok çalışma lipidlerin osteoklastların ve osteoblastların farklılaşmasını ve olgunlaşmasını etkilediğini, böylece kemik^{homeostazını 60} bozduğunu göstermiştir. Birçok temel çalışma, apoptozun SONFH'nin fizyolojik ve patolojik mekanizmalarında önemli rol oynadığını göstermiştir. Sonraki in vivo hayvan deneyleri, CC'nin aktif fraksiyonunun SONFH'de apoptoz ve iltihabı etkili bir şekilde bastırdığını ve böylece hastalığın ilerlemesini azalttığını daha da doğruladı.

Bu bulgularla tutarlı olarak, ağ farmakolojisi ve deneysel analizler, CC'nin hipoksi adaptasyonunu koordine etmesi, anjiyogenezi düzenlemesi ve metabolik süreçleri modüle ederek SONFH'yi geliştirebileceğini göstermektedir. Nicel mikro-BT analizi, CC müdahalesinin kemik hacmi fraksiyonunu (BV/TV) anlamlı şekilde geri kazandığını, trabeküler ayrımı azalttığını (Tb.Sp, Tb.Th) ve kemik mikroyapısının iyileşmesini teşvik ettiğini ortaya koydu. KEGG zenginleştirme analizi, bu etkilerin temel bir mekanizması olarak HIF-1α sinyal yolunun daha da ortaya çıktığını ortaya koydu. Bu hayvan deneyleri, toplu olarak, CC'nin hipoksi ve iltihaplanma kaynaklı biyolojik süreçleri düzenleyerek SONFH'yi hafifletebileceğini ve anjiyogenez ile kemik yeniden yapılanmasını teşvik edebileceğini, potansiyel olarak HIF-1α sinyal yolu gibi önemli yollarla desteklediğini göstermektedir.

Bazı önemli ön bulgular elde edilmiş olsa da, bu çalışmanın hâlâ bazı sınırlamaları vardır. Yazarlar, CC'nin SONFH'deki rolünü araştırmak için yalnızca ağ farmakolojisi ve MD gibi modern biyoinformatik yöntemlere ve bazı hayvan deneylerine dayanmışlardır. Bu nedenle, tahminlerin güvenilirliği ve doğruluğu in vivo ve in vitro deneylerde daha fazla doğrulanmalıdır. Bu çalışma, CC'nin SONFH'yi nasıl iyileştirdiğine dair ön ipuçları sağlar ve bu da daha fazla deneysel doğrulama gerektirir. Ağ farmakolojisini MD ile entegre ederek, yazarlar SONFH'de aday biyoaktif bileşenleri, ana hedefleri ve zenginleştirilmiş CC yollarını sistematik olarak haritaladılar. Sonuç olarak, bu çalışma SONFH'de CC'nin potansiyel koruyucu etkilerini, entegre ağ farmakolojisi ve in vivo doğrulama yoluyla incelemiştir. Sonuçlar, mekanizmaların öncelikle HIF-1 sinyal yolunun modülasyonu ve osteojenik yenilenmenin teşviki ile ilişkili olduğunu göstermektedir. İlgili şekilde gösterildiği gibi, CC iyileştirmesi HIF-1α, VEGF ve ALP dahil kilit proteinlerin ifadesini doza bağlı olarak önemli ölçüde modüle etmiş ve hipoksi adaptasyonu, anjiyogenez ve osteojenik aktivitenin koordinasyonunda rolünü daha da desteklemiştir. Bu bulgular, CC müdahalesinin kemik hacmi fraksiyonunu etkili bir şekilde geri kazandığını ve trabeküler mikroyapıyı iyileştirdiğini gösteren mikro-BT analiziyle doğrulandı.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
%4 PFA	biosharp	BL539A
Mutlak etenol	Sinopharm Grubu Co.Ltd	10009218
Alcian Mavi Leke Kiti	Solarbio	G1563
ALP	Ariggo	ARG57422
AutoDock Vina	Scripps Araştırması		Sürüm 1.2.7
AutoDockTools	Scripps Araştırması		Sürüm 1.5.7
Biyoinformatik çevrimiçi platform			https://www.bioinformatics.com.cn
CHARMM36 Kuvvet Alanı			MD parametrizasyonu için kullanılanlar
CTD			https://ctdbase.org
Sitoscape	Sitoscape Konsorsiyumu		Sürüm 3.10.3; eklentiler: CytoHubba, CytoNCA
DAPI Boyama Çözeltisi	Beyotime Biotech Inc	C1006-50mL
DAVID	NCI		https://david.ncifcrf.gov
Discovery Studio Visualizer	BIOVIA		BIOVIA Discovery Studio 2020; Kenetlenme görselleştirmesi
DisGeNET			https://disgenet.com
EDTA Kireçlenme Giderme	Beyotime Biotech Inc	C0167-3L
Endojen Peroksidaz Bloke Çözeltisi	Beyotime Biotech Inc	P0100A
GeneCards			https://www.genecards.org
GEO (GSE123568)	NCBI		https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/
Keçi anti-tavşan IgG(H+L)(Alexa Fluor 488)	CST	4409
Keçi Serumu	Beyotime Biotech Inc	C0265
GraphPad Prizması	GraphPad (Dotmatics)		Versiyon 10; İstatistiksel analiz ve grafikleme
GROMACS	GROMACS		Sürüm 2022; CHARMM36 Kuvvet Alanı
Herb 2.0			http://herb.ac.cn/v2/
HIF-1α	Hangzhou Huaan	HA721997
Yüksek çözünürlüklü mikro-CT ekipmanları	Bruker	SkyScan
Lipinski Kural Filtresi			Mw ≤ 500; miLogP ≤ 5; HBD ≤ 5; HBA ≤ 10
lipopolisakkarit	Sigma-Aldrich	L4516
Metilprednizolon	Sinopharm Grubu Co.Ltd	CATOCCAD302504100MG
Nötr balsam	biosharp	BL704A
OMIM			https://www.omim.org
Parafin	Sinopharm Grubu Co.Ltd	C416770020
Parçacık Ağı Ewald (PME)			Uzun menzilli elektrostatik
PubChem	NIH		https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov
PyMOL	Schrö dinger		Protein görselleştirme ve hazırlama
R	CRAN		Sürüm 4.4.3
RCSB PDB			https://rcsb.org
STRING			https://string-db.org
SwissADME	İsviçre Enstitüsü		http://www.swissadme.ch
SwissTargetTahmini	İsviçre Enstitüsü		http://www.swisstargetprediction.ch
TIP3P su modeli			Çözümleme için kullanılır
UniProt			https://www.uniprot.org
VEGF	Hangzhou Huaan	ET1604-28
Weishengxin			https://www.bioinformatics.com.cn
Windows 11	Microsoft		Veri işleme, moleküler kenetlenme ve MD simülasyonları için kullanılır
Ksilen	Sinopharm Grubu Co.Ltd	10023418