CD47- ve Integrin α4/β1–Modifiye Makrofaj Membranı Kaplı Poli(laktik-ko-glikolik asit) nanopartiküllerin İzolasyonu, Sentezi ve Karakterizasyonu

Summary

Bu protokol, hedefli ilaç dağıtım uygulamaları için CD47- ve integrin α4/β1–komodifiye makrofaj membranı kaplı poli(laktik-ko-glikolik asit) nanopartiküllerinin hazırlanması ve karakterizasyonunu sağlar.

Abstract

Ateroskleroz, kronik bir inflamatuar hastalıktır ve kardiyovasküler hastalık ile ölümlere büyük katkı sağlar. Anti-inflamatuar ajanların aterosklerotik bölgelere hedefli olarak gönderilmesi önemli bir zorluk olmaya devam etmektedir. Burada, CD47- ve integrin α4/β1–komodifiye makrofaj membranı kaplı kolşisin yüklü poli(laktik-ko-glikolik asit) nanopartiküllerin (MMM/COL NP'ler) hazırlanması ve karakterizasyonu için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz. Protokol, plazmid transfeksiyonu ve endoten-1 uyarısı ile makrofaj modifikasyonu, membran izolasyonu, NP üretimi ve zar kaplamasını içerir. Ortaya çıkan MMM/COL NP'leri, fizikokimyasal karakterizasyon, protein ifade analizi ve in vitro ile in vivo testlerle değerlendirilir. Fonksiyonel doğrulama, aktif endotel hücrelerle hücresel ilişkinin, makrofaj alımının, köpük hücrelerinde anti-inflamatuar etkilerin ve fare ateroskleroz modelinde biyodağılımın değerlendirilmesini içerir. Ayrıca, laboratuvarlar arasında tekrarlanabilirlik ve tutarlılığı sağlamak için temel deneysel parametreler ve kalite kontrol adımları vurgulanmaktadır. Bu protokol, ateroskleroz araştırmalarında hedefli ilaç teslimat uygulamaları için biyomimetik NP'ler üretmek için sağlam ve ölçeklenebilir bir yaklaşım sunar.

Introduction

Ateroskleroz, ölümcül kardiyovasküler olaylara ve arterial lümen stenozu ile dengesiz plak yırtılması yoluyla inme ile sonuçlanan kronik bir inflamatuar hastalıktır ve önemli bir küresel sağlık yükü^{oluşturur 1,2,3}. Aterosklerotik bölgedeki inflamatuar yanıtların aşağı regulasyonu ana terapötik^{hedeflerden biridir 4,5}. Güçlü bir anti-enflamatuar ilaç olan kolşisin, yan kardiyovasküler olayları azaltma konusunda umut vaat^{ettiğini göstermiştir 6,7}. Ancak, klinik faydası dar bir tedavi süresi ve sistemik yan etkiler nedeniyle sınırlıdır; bu da plak bölgesinde birikimi artıracak ve toksisiteyi en aza indiren hedefli dağıtım sistemleri^{gerektirir 8}.

Hücre zarı kaplı nanopartiküller (NP'ler), kaynak hücrelerin doğal biyolojik işlevlerinden yararlanarak hedefli ilaç teslimatı için güçlü bir platform olarak^{ortaya çıkmıştır 9,10,11}. Aterosklerozda yer alan hücre tipleri arasında makrofajlar kritik rol^oynar 12,13,14. Makrofajlarda eksprese edilen integrin α4/β1, aktive endotel hücrelerde (AK) ekspressyon edilen damar hücre adezyon molekülü-1'e (VCAM-1) bağlanarak aterosklerotik plaklara katılımı aracılık eder. CD47, "beni yeme" sinyali olarak, mononükleer fagosit sistemi^15,16 tarafından fagositozdan kaçınmayı mümkün kılar. Makrofaj zarlarının, bu proteinleri doğal makrofaj zarlarına kıyasla aşırı ekspresye yapacak şekilde mühendislik yapılmasıyla, integrin α4/β1–VCAM-1 etkileşimi ile artırılmış hedefleme ve CD47 aracılı sinyal yoluyla fagositoz azaltılmış^{NP'ler oluşturulabilir.} Çift modifikasyon stratejisi, aktif EC'lere hedefleme ve fagositik klirensi azaltarak aynı anda doğal membran kaplamalı NP'ler ve ligand tabanlı hedefleme sistemlerini geliştirir. Bu proteinlerin yalnızca temel seviyelerini ifade eden doğal makrofaj zarlarının aksine, mühendislik ürünü zarımız immünojenliği tetikleyebilecek sentetik hedefleme ligandları eklemeden gelişmiş işlevsellik sağlar.

Bu protokol, CD47- ve integrin α4/β1–komodifiye makrofaj zarlarıyla kaplanmış kolşisin yüklü poli(laktik-ko-glikolik asit) NP'lerin (COL NP'ler) hazırlanması ve karakterizasyonunu detaylandırır ve modifiye makrofaj membranı kaplı NP'ler (MMM/COL NP'ler) üretir. RAW 264.7 makrofajlarının genetik ve farmakolojik modifikasyonu, modifiye zarların izolasyonu, PLGA NP'lerin hazırlanması ve kaplaması ile kapsamlı in vitro ve in vivo fonksiyonel testler için yöntemleri tanımlıyoruz. Bu yöntem, ateroskleroz araştırmalarında hedefli ilaç teslimat uygulamaları için biyomimetik NP'lerin hazırlanması ve değerlendirilmesi için tekrarlanabilir bir çerçeve sağlar.

Protocol

Bu protokolde tanımlanan tüm hayvan prosedürleri, Nanjing Drum Tower Hastanesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanmış ve Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından belirlenen laboratuvar hayvanlarının bakımı ve kullanımı yönergelerine uyulmuştur.

1. RAW 264.7 makrofajlarının modifikasyonu

1. RAW 264.7 hücreleri hazırlayın, %10 fetal sığır serumu (FBS) ve %1 penisillin-streptomisin, CD47 aşırı ekspresyon plazmidi, Lipofectamine 3000 transfeksiyon reaktifi, endotelin-1 (ET-1), fosfatla tamponlu tuzlu su (PBS) ve steril doku kültürü malzemeleri ile takviye edilmiş Dulbecco's Modified Eagle Medium'u tamamlayın.
2. RAW 264.7 hücreleri, nemlendirilmiş bir kuluçka makinesinde, 37°C'de %5 CO₂ ile kültürlen ve hücreleri yaklaşık 4–5 × 10-5 hücreye ulaşana kadar 6 kuyu bir plakada koruyun.
3. CD47 modifikasyonunu gerçekleştir
   1. 2,5 μg plazmid DNA ile 5 μL P3000 reaktifini 125 μL Opti-MEM serumsuz ortamda karıştırarak plazmid DNA çözeltisi hazırlanın.
   2. Transfeksiyon reaktifini 125 μL serumsuz ortamda 3,75 μL transfeksiyon reaktifiyle seyreltileyerek hazırlayın.
   3. Bu hacimleri 6 kuyruklu bir plaka formatı için kullanın. Tüm bileşenleri diğer formatlar için orantılı olarak ölçeklendirin; DNA:P3000 oranı 1:2 (μg:μL) ve DNA:transfeksiyon reaktif oranı 1:1,5 (μg:μL) olarak korunur.
      NOT: Örneğin, 10 μg DNA, 20 μL P3000 ve 15 μL transfeksiyon reaktifi 10 cm çanaklar için kullanın.
   4. DNA çözeltisini transfeksiyon reaktif çözeltisiyle birleştirin ve 25°C'de 15 dakika kuluçka yapın.
   5. Transfeksiyon komplekslerini, yaklaşık 2–2,5 × 10 6 hücre aralığında antibiyotiksiz DMEM'deki hücrelere ekleyin; yaklaşık 2–2,5 10 6 hücre her 10 cm'lik tabak başında.
   6. Transfeksiyondan 6 saat sonra ortamı, antibiyotik içeren taze, tam ortamla değiştirin.
4. Integrin α4/β1 modifikasyonunu gerçekleştirin
   1. Transfekte edilmiş veya transfekte edilmemiş hücreleri, serumsuz ortamda 100 nM ET-1 ile 24 saat boyunca uyararak integrin α4/β1 ekspresyonunu yükseltmek için uyarın.
      NOT: CD47, integrin α4 ve integrin β1 için nicel polimeraz zincir reaksiyonu (qPCR) ve Western blot analiziyle modifikasyon verimliliğini doğrulayın.

2. Modifiye makrofaj zarının (MMM) izolasyonu

1. Değiştirilmiş RAW 264.7 hücrelerini hücre kazıyıcı kullanarak hasat edin.
2. Hücreleri 900 × g sıcaklığında 5 dakika boyunca 4°C'de santrifüj yapın.
3. Hücre pelletini soğuk 1× PBS ile üç kez yıkayın.
4. Hücre pelletini 2 mL önceden soğutmuş hipotonik lizin tamponu (10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 1 mM KCl, 1.5 mM MgCl₂ ve 1 mM fenilmetilsülfonil florür) içinde yeniden askıya alın ve süspansiyonu 15 dakika boyunca buz üzerinde kuluçka edin.
5. Süspansiyonu sıvı azotta 2 dakika dondurun, ardından 37°C su banyosunda 5 dakika eritin. Hücreleri tam olarak lizizlemek için donma-erime döngüsünü beş kez tekrarlayın.
   DIKKAT: Sıvı azot ciddi kriyojenik yanıklara neden olabilir. Uygun yalıtımlı eldivenler ve yüz koruyucu ile tutun.
6. Lizat 850 × g ile 4°C'de 10 dakika boyunca santrifüjlenerek çekirdekleri ve bozulmamış hücreleri çıkarabilir.
7. Toplanan süpernatantı 15.000 × g sıcaklığında 30 dakika boyunca 4°C'de santrifüj edin. Daha yüksek zar saflığı elde etmek için, 15.000 × g santrifüjden elde edilen süpernatantı ultrasantrifüj tüplerine aktarın ve 100.000 × g sıcaklıkta 1 saat boyunca 4°C'de ultrasantrifüj ile santrifüj yapın.
   DIKKAT: Ultrasantrifüj tüplerinin doğru dengede olduğundan ve rotor dengesizliğini veya arızasını önlemek için yüksek hızlı santrifüj için derecelendirildiğinden emin olun.
   NOT: Ultrasantrifüjasyon, hücre içi organel kontaminasyonunu azaltan saflaştırılmış plazma zarları sağlar.
8. MMM parçalarını içeren peleti toplayıp yaklaşık 1–2 mg/mL protein konsantrasyonu elde etmek için 300 μL 1× PBS veya liz tamponunda yeniden süzülür.
9. Membran protein konsantrasyonunu BCA protein nicelendirme testi seti kullanarak belirleyin.
   NOT: İzole edilmiş zarlar daha sonra kullanılmak üzere −80°C sıcaklığında depolanabilir.

3. Kolşisin yüklü PLGA NP'lerinin (COL NP) hazırlanması

1. 10 mg PLGA (50:50, MW 90.000) ve 1 mg kolşisin 1 mL dimetil sülfoksitte (DMSO) çözün.
   DIKKAT: DMSO cildi nüfuz edebilir ve diğer maddelerin emilimini artırabilir. El tutarken uygun kişisel koruyucu ekipman (nitril eldivenler, laboratuvar önlüğü ve güvenlik gözlüğü) takın. DMSO içeren çözeltileri organik çözücü atık olarak toplayın ve lisanslı tehlikeli atık bertaraf hizmetleri aracılığıyla bertaraf edin. Kolşisin toksiktir ve potansiyel olarak teratojeniktir. Kolşisin ile kirlenmiş tüm maddeleri (çözeltiler, eldivenler ve tüpler) tehlikeli ilaç atığı olarak toplayın ve kurumsal ve yerel düzenlemelere uygun olarak lisanslı tehlikeli atık bertaraf hizmetleri aracılığıyla bertaraf edin.
2. Çözeltiyi 500 rpm'de 10 mm Teflon kaplamalı karıştırıcı ile 25°C'de karıştırın.
3. 4 mL ultrasaf suyu yaklaşık 1 mL/dakika hızla damla olarak ekleyin; 5 mL şırınga ve 26G iğne ile 25°C'de takılmış bir şırınga pompası kullanılmıştır.
4. NP oluşumu için karışımı 3 saat karıştırmaya devam edin.
5. NP süspansiyonunu diyaliz poşetine (MWCO 3.500 Da) aktarın.
6. 200 rpm'de nazikçe karıştırarak 4°C'de 2 L damıtılmış suya karşı diyaaliz yapın.
7. Diyalizi 24 saat sürdürün ve diyaliz tamponunu tamamen 6, 12 ve 24 saatte değiştirerek serbest kolşisin ve DMSO'yu çıkarın.
   DIKKAT: Diyalizden gelenler dahil tüm organik çözücü ve reaktifleri organik kimyasal atık olarak toplayın. Onu gidere atmayın. Kurumsal tehlikeli atık bertaraf protokollerini takip edin.
8. Diyalizlenmiş COL NP askısını topla ve 4°C'de sakla.
   NOT: COL NP'ler kısa süreli kullanım için 4°C'de (3 güne kadar) saklanabilir. Floresan etiketleme için, Step 3.1 sırasında PLGA çözeltisine %0,1 (w/w) 1,1′-dioktadesil-3,3,3′,3′-tetrametilindokarbosiyanin perklorat (DiI) boyası ekleyin.
9. DMSO ve serbest kolşisinin kaldırıldığını doğrulayın
   1. Son diyalizat (24 saatte son değişimden sonraki tampon) toplan ve ultraviyole görünür (UV–vis) spektromotometri ile analiz ediliyor.
   2. Diyalizyonu 200 ila 400 nm arasında tarayın ve kontrol örneğiyle (taze diyaliz tamponu) karşılaştırın.
   3. Yaklaşık 210 nm (DMSO'nun karakteristikası) veya 345 nm (kolşisine karakteristik) yükseklikte hiçbir absorbans zirvesi olmadığını doğrulayın; bu da kalıntı çözücü ve serbest ilacın başarılı bir şekilde çıkarıldığını gösterir.
   4. Alternatif olarak, üreticinin talimatlarına göre bir DMSO test kiti kullanarak kalan DMSO konsantrasyonunu belirleyin. Sonraki analizlerde sitotoksisiteyi önlemek için kalan DMSO'nun %0,1'in (v/v) altında olduğundan emin olun.

4. Membran kaplı NP'lerin (MMM/COL NP'ler) üretimi

1. İzole MMM süspansiyonunu (2.7. adımdan itibaren) 20 dakika boyunca 40 kHz ve 110 W frekansında su banyosu sonikatörü ile sonikle. Numune hacmini 1,5 mL'lik bir tüpte 1 mL ve sıcaklığı 25°C'nin altında tutmak için buz banyosu ile kullanın.
2. Soniklenmiş membran süspansiyonu, mini ekstruder kullanarak 400 nm gözenek boyutuna sahip polikarbonat membran filtresinden ekstradüde ederek membran vezikülleri oluşturulur.
3. COL NP'leri (3.5. adımdan itibaren) MMM vezikülleriyle membran protein-PLGA kütle oranı 1:1 ile karıştırın.
   1. Protein nicelendirme testiyle belirlenen 10 mg PLGA için 10 mg protein içeren bir membran süspansiyonu kullanın.
   2. COL NP'leri MMM vezikülleriyle 1 mL pipet kullanarak 15 kez yukarı ve aşağı nazikçe pipet yapın.
4. Karışımı, 200 nm gözenek boyutuna sahip polikarbonat membran filtresinden birlikte ekstrüzyon yapar ve ekstrüzyon 15 geçiş boyunca tekrarlanır.
5. Ortaya çıkan süspansiyonu MMM/COL NP'leri içeren ve hemen kullanılmak üzere 4°C sıcaklığında depolayın.

5. NP'lerin Karakterizasyonu

1. Hidrodinamik çap, polidispersite indeksi (PDI) ve zeta potansiyelini dinamik ışık saçılması (DLS) kullanarak aşağıdaki koşullarda ölçin: sıcaklık, 25°C; geri saçılma açısı 173°; denge süresi, 2 dakika; ve her örnek için üç tekrarlayıcı ölçüm.
2. Örnekleri deyonize suda 20 kat seyreldin (nihai konsantrasyon yaklaşık 0,1 mg/mL).
   NOT: Sulandırma, birden fazla saçılma etkisini en aza indirir.
3. MMM/COL NP'lerin çekirdek–kabuk yapısını geçirim elektron mikroskopisi (TEM) kullanarak görselleştirin.
   1. 5 μL NP süspansiyonu (yaklaşık 0.1 mg/mL) parlayan tahşal, karbon kaplı bakır ızgara (300 ağ) üzerine yerleştirin.
   2. Numunenin 25°C'de 2 dakika adsorbasyon yapmasına izin verin.
   3. Fazla sıvıyı filtre kağıdıyla ızgaranın kenarına hafifçe dokunarak çıkarın.
   4. 5 μL %1 uranil asetat çözeltisi ızgaraya uygulayın ve 25°C'de 1 dakika kuluçka yapın.
   5. Fazla lekeyi filtre kağıdıyla temizleyin.
   6. Görüntülemeden önce ızgaranın tamamen hava kurumasına en az 10 dakika izin verin.
      DIKKAT: Uranyl asetat toksik ve radyoaktiftir. Uygun kişisel koruyucu ekipmanlarla (eldiven, laboratuvar önlüğü ve göz koruma) kullanın ve atıkları kurumsal tehlikeli madde yönergelerine göre bertaraf edin.
4. Membranı 2. adımda 3,3′-dioktadesiloksakarbosiyanin perklorat (DiO) boyası ile veya membran izolasyonu öncesinde sağlam hücreleri etiketleyerek etiketleyin ve PLGA çekirdeğini DiI ile etiketleyin.
5. DiO (yeşil) ve DiI (kırmızı) sinyallerinin birlikte lokalizasyonunu konfokal lazer tarama mikroskobu (CLSM) kullanarak analiz edin.
   1. Uyarılma/emisyon parametrelerini şu şekilde ayarlayın: DiO (yeşil), uyarılma 488 nm, emisyon 550 nm; DiI (kırmızı), uyarılma 561 nm, emisyon 620 nm.
   2. 60× oranında yağ daldırma objektif lens (sayısal diyafram 1.4) kullanın.
   3. İğne deliğini 1 Airy ünitesine ayarlayın.
   4. Piksel doygunluğunu önlemek için dedektör kazancını ayarlayın.
   5. 1024 × 1024 piksel çözünürlükte ve 2× çizgi ortalamasıyla görüntüler alın.
   6. Foto ağartmayı en aza indirmek için lazer gücünü %5'in altında tutun.
6. Western blot analiziyle MMM/COL NP yüzeyinde CD47, integrin α4 ve integrin β1 varlığını analiz edin.
7. İlaç yükleme ve serbest bırakmayı belirleyin
   1. DMSO'da 100 μL NP hacmini lizize edin ve ilaç yükü ile kapsülleme verimliliğini belirlemek için 345 nm'de kolşisin emilimini ölçebilirsiniz.
   2. 1 mL MMM/COL NP süspansiyonunu (yaklaşık 100 μg kolşisin içeren) bir diyaliz torbasına (MWCO, 3.500 Da) yerleştirin.
   3. Poşeti kapatın ve 100 mL'lik cam bir beakerde %20 FBS içeren 50 mL PBS (pH 7.4) içine daldırın.
   4. Serbest bırakma ortamını, 20 mm Teflon kaplamalı bir karıştırıcı ile 100 rpm'de sürekli karıştırma altında 37°C'de tutun.
   5. Deney boyunca batma koşullarını koruyun.
      NOT: %20 FBS ile PBS'de kolşisin çözünürlüğü >1 mg/mL'dir; Salınım ortamındaki maksimum kolşisin konsantrasyonu doygunluğun %10'u <'dir.
   6. Önceden belirlenmiş zaman noktalarında (0, 1, 2, 4, 8, 12, 24, 36, 48 ve 62 saat) 500 μL salınım ortamı çekilir.
   7. Çekilen hacmi, %20 FBS içeren eşit hacmde taze önceden ısıtılmış PBS (37°C) ile değiştirin.
   8. Çekilen örneklerdeki kolşisin konsantrasyonunu UV–Vis spektrofotometrisi ile 345 nm'de ölçün.
   9. Tüm ölçümleri üçlü olarak yapın.

6. In vitro fonksiyonel testler

1. Tohum insan göbek ven endotel hücreleri (HUVEC). VCAM-1'i yukarı düzenlemek için 24 saat boyunca 10 ng/mL tümör nekroz faktörü alfa (TNF-α) ile hücreleri uyarın.
2. MMM/DiI NP'lerin HUVEC'lerle hücresel ilişkisi
   1. Hücreleri, PLGA çekirdek kütlesine göre 50 μg/mL konsantrasyonda (PLGA çekirdek kütlesine göre) 4 saat boyunca 37°C sıcaklıkta, %5 CO₂ atmosferinde DiI-etiketli MMM/COL NP'lerle (MMM/DiI NP'ler) kümübe edin.
   2. Hücreleri önceden soğutulmuş PBS ile üç kez yıkayın. Her yıkamadan sonra hücreleri 300 × g sıcaklığında 4 °C'de 5 dakika boyunca santrifüj yapın.
   3. Yıkanmış hücreleri %0,5 sığır serum albümini (BSA) içeren PBS içindeki yeniden süzüldürün. Son hücre konsantrasyonunu 1 × 10⁶ hücre/mL'ye ayarlayın.
   4. Akış sitometrisi veya CLSM için cihaz parametrelerini ayarlayın. 549 nm'de uyarılma ve 565 nm (PE kanalı) emisyonu kullanarak DiI floresansı tespit edin.
   5. Örneklerden veri edinin. Akış sitometrisi veya CLSM için örnek başına en az 10.000 olay elde edin veya temsilci alanları yakalatın.
   6. Kenarlar hariç olarak, 60× yağ batdırma lensi kullanarak farklı bölgelerden beş temsil alan seçin. Hücrelerin sağlam ve üst üste bükmediğinden emin olun.
   7. Görüntü alınmadan önce örnekleri kör edin. Belirli alanları manuel olarak seçmek yerine sahneyi rastgele hareket ettirerek alanları seçin.
   8. Kör koşullarda tüm örneklere aynı eşik ve analiz parametreleri uygulanır.
   9. FSC-A/SSC-A kapı ile hücre kalıntılarını dışlayın. FSC-A/FSC-H gatingi kullanarak singlet hücrelerini seçin.
   10. Canlı hücreleri canlı boyama boyaması ile seçin. 7-aminoaktinomisin D (7-AAD) 1 μg/mL ile ekleyin, karanlıkta 4°C'de 5 dakika kuluçka yapın ve canlı hücre kapı kapatma için kullanın.
   11. Hücresel ilişkiyi nicelendirmek için floresans yoğunluğunu analiz edin. Ortalama floresans yoğunluğu nicelik ölçüsü olarak kullanın. FlowJo (v10.8.1) akış sitometrisi analiz yazılımını kullanarak veri analizi yapın.
3. RAW 264.7 makrofaj tarafından MMM/DiI NP'lerin hücresel alımı
   1. DiI-etiketli MMM/COL NP'leri (MMM/DiI NP'leri) değiştirilmemiş RAW 264.7 makrofajlarla 50 μg/mL konsantrasyonda (PLGA çekirdek kütlesine göre) 4 saat boyunca 37°C'de, %5 CO₂ atmosferinde kuluçka yapın.
   2. Hücreleri 6.2.2–6.2.3. Adımlarda açıklandığı gibi analiz için hazırlayın.
   3. 549 nm'de uyarılma ve 565 nm (PE kanalı) emisyonu kullanarak DiI algılama için enstrüman parametrelerini ayarlayın.
   4. Örneklerden veri edinin. Her örneklem başına en az 10.000 olay edinin.
   5. FSC-A/SSC-A kapı ile hücre kalıntılarını dışlayın. FSC-A/FSC-H gatingi kullanarak singlet hücrelerini seçin.
   6. Canlı hücreleri canlı boyama boyaması ile seçin. 7-AAD ile 1 μg/mL ekleyin, karanlıkta 4 °C'de 5 dakika kuluçka yapın ve canlı hücre kapı ayarlaması için kullanın.
   7. Hücresel alımı nicelik olarak belirlemek için floresans yoğunluğunu analiz edin. Ortalama floresans yoğunluğu nicelik ölçüsü olarak kullanın. Akış sitometrisi analiz yazılımı kullanarak veri analizi yapın.
4. Köpük hücre testi
   1. RAW 264.7 hücrelerini, oksitlenmiş düşük yoğunluklu lipoprotein (oxLDL) ile 50 μg/mL ile 48 saat boyunca inkübe ederek köpük hücrelerine ayırın. Hücre içi lipid birikimi ile belirtilen Yağ Kırmızı O boyama ile köpük hücresi oluşumunu doğrulayın.
   2. Köpük hücreleri, eşdeğer kolşisin konsantrasyonu olan 1 μM'de serbest kolşisin, COL NP'ler veya MMM/COL NP'lerle tedavi edin. Hücreleri %5 CO₂ içeren nemli atmosferde 37°C'de 24 saat kuluçka yapın.
      NOT: Bu konsantrasyonu, hücre yaşamlılığını ve anti-inflamatuar etkinliğini değerlendiren ön doz-yanıt deneylerine dayanarak seçin.
   3. Enzimle bağlantılı immünosorbent testi (ELISA) kullanarak inflamatuar sitokin seviyelerini ölçün.
      1. Tedaviden hemen sonra (tedavi sonrası 24 saat sonra) hücre kültürü süpernatantları toplayın.
      2. Plakaları 300 × g sıcaklığında 5 dakika boyunca 4°C'de santrifüjle yaparak hücre kalıntılarını temizleyin.
      3. Aydınlaştırılmış süpernatantları temiz tüplere aktarın ve analiz yapılana kadar −80°C'de saklanın.
      4. ELISA kitleriyle üreticinin talimatlarına göre TNF-α ve interleukin-6 seviyelerini ölçün.
      5. Tüm ölçümleri üçlü kuyularda yapın ve deneyi bağımsız üç kez tekrarlayın.
      6. Sitokin konsantrasyonlarını mutlak değerler (pg/mL) olarak bildirin, ek normalizasyon olmadan, çünkü hücre tohumlama yoğunluğu ve tedavi koşulları tüm gruplarda tutarlıdır.

7. Ateroskleroz modelinde in vivo terapötik uygulama

NOT: Tüm hayvan prosedürleri ilgili Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanmalıdır.

1. Hayvan modeli oluşturun
   1. 8 haftalık erkek apolipoprotein E nakat (ApoE⁻/⁻) farelerde (C57BL/6 arka planı) hassas aterosklerotik plak modeli oluşturuldu.
   2. Ameliyattan önce 1 hafta boyunca farelere %15 yağ ve %0,25 kolesterol içeren yüksek yağlı diyet verin ve ameliyattan sonra 4 hafta boyunca devam edin.
   3. Karotis arter daralma ameliyatı sırasında fareleri izofluran ile anestezi edin (%2–%3 indüksiyon için %1–%2) ve buprenorfin (0,1 mg/kg, deri altı olarak) verin.
   4. Sol ortak karotis arteri, arterin yanına yerleştirilen 0,3 mm çapında bir iğne ile daraltın. Hem arter hem de iğneyin etrafına 6-0 ipek bir bağ bağlayın ve ardından iğneyi çıkararak kısmi daralma oluşturun.
   5. Ameliyattan 4 hafta sonra haistolojik değerlendirmeyle hassas plak oluşumu doğrulan.
   6. Hematoxylin ve Eosin (H&E), Yağ Kırmızı O ve Masson'un trikrom boyama işlemlerini uygulayarak plak morfolojisi, lipid birikimi ve kolajen içeriğini değerlendirin.
   7. Hassas plakları damar kesitinin %40'ı > plak alanı, 120 μm < lifli kap kalınlığı, toplam plak alanının %40'ı > lipid çekirdek alanı ve önemli CD68-pozitif makrofaj infiltrasyonu ile tanımlanır.
2. DiI-etiketli MMM/COL NP'leri kuyruk damarı üzerinden damar yoluyla 2 mg/kg dozda (PLGA çekirdek kütlesine göre) damar yoluyla 100 μL enjekte edin.
   1. Enjeksiyondan 1 gün sonra, tüm vücut biyodağılımı değerlendirmek için in vivo görüntüleme sistemi kullanılarak fareleri görüntülemek.
      1. Fareleri izofluran ile anestezi edin (indüksiyon için %3 ve bakım için %1,5–%2, oksijen akışı sırasıyla 1 ve 0,5 L/dakika). Anestezi derinliğini solunum hızı ve ayak parmak sıkma refleksi ile izleyin.
      2. Görüntüleme sırasında vücut sıcaklığını korumak için fareleri 37°C ısıtmalı aşamada sırtüstü konumlandırın.
      3. DiI ayarlarıyla (uyarılma 549 nm ve emisyon 565 nm) CY3 veya TRITC filtre setiyle floresans görüntüleri alın. Otomatik pozlama modu (genellikle 50–200 ms) ve epifloresans alımı kullanın.
      4. Anatomik referans için aynı anda 1024 × 1024 piksel çözünürlükte karşılık gelen parlak alan görüntülerini yakalayın.
   2. Ex vivo floresan görüntüleme için ana organları ve karotis arterleri alın.
      1. Fareleri izofluran ile anestezi edin (%3 indüksiyon ve %2,5–%3 bakım için).
      2. Fareleri, sol ventriküler ponklama ile 5 mL/dakika akış hızında 20 mL buz gibi soğuk PBS (pH 7.4) ile perfüze ederek kalıntı kan ve bağlanmamış NP'leri çıkarır.
      3. Perfüzyonun hemen ardından 24 saat sonra organları (kalp, aorta, karaciğer, dalak, böbrek ve akciğer) alın.
      4. Toplanan organları buz gibi soğuk PBS ile durulayarak yüzeydeki kanı alın.
      5. Aortu uzunlamasına açın ve paslanmaz çelik pinlerle siyah silikon bir plakaya düz (endotel yüzü yukarı) sabitleyin.
      6. Dokuları buz gibi PBS'de tutun ve hassattan sonra 30 dakika içinde ex vivo floresan görüntüleme yapın. Görüntülemeden hemen önce doku yüzeyinden fazla PBS çıkarın.
3. Dozajlama ve tedavi yapın
   1. Kolşisin dozunu ön doz-yanıt çalışmasından belirleyin (0,01–0,45 mg/kg, n = 7/grup). Terapötik doz olarak 0,05 mg/kg kolşisin seçin.
   2. Kuyruk damarı enjeksiyonuyla 100 μL uygulanır; bu, 2 mg/kg (PLGA çekirdek kütlesi) NP dozu ve 0,05 mg/kg kolşisin dozuna karşılık gelir. Günde bir kez 14 gün ardışık enjekte edin.
   3. Fareleri rastgele sayı üreteci kullanarak tedavi gruplarına (PBS, serbest kolşisin ve MMM/COL NP'leri) göre rastgele hale getirin. Tüm nicelikleri tedavi gruplarına kör olan iki gözlemci tarafından gerçekleştirin.
   4. %20 vücut kilosu kaybı, hareket kabiliyetinin bozulması veya rahatsızlık belirtileri gibi insancıl >yöntemler uygulayın.
4. Uç nokta analizi yapın
   1. Son enjeksiyondan 24 saat sonra fareleri ötenazi yapın. Karotis arterleri ve aortaları toplayın. Aortaların en face Oil Red O boyası ile plak yükünü değerlendirin.
   2. Plak alanını nicelikle ölçer
      1. Plaka alanını, kesitlerde toplam aort lümeninin yüzde yüzdesi olarak (fare başına beş kesit) görüntü analiz yazılımı olarak nicelikleştirin.
      2. ImageJ görüntü analiz yazılımında görüntüyü açın.
      3. Resme tıklayın → 8-bit → yazı ile görüntüyü gri tonlamaya dönüştürebilirsiniz.
      4. Resme tıklayın → → eşiğini ayarlayın. Otsu yöntemini seçin ve eşik noktasını uygulayarak Yağ Kırmızı O-pozitif bölgeleri belirleyin.
      5. Tüm örnek görüntülere aynı eşik parametrelerini uygulayın ve doğrulama için eşik ayarlarını kaydedin.
      6. Analiz → Ölçümleri Ayarlay seçeneğine tıklayın ve Alan'ı seçin.
      7. Seçilen bölgeleri nicelikten ölçmek için Analyze → Measure seçeneğine tıklayın.
      8. Nicel edilmiş verileri dışa aktarın.
   3. Plak stabilitesini değerlendirin
      1. H&E, Yağ Kırmızı O ve Masson trikrom boyama kullanarak karotis kesitlerinin histolojik boyamalarıyla plak stabilitesini değerlendirin. Kollageni, Masson'ın trikrom-pozitif mavi alan plak alanı yüzdesi olarak nicelikle ölçün.
      2. 5 μm kalınlıkta parafinli gömülü kesitler ve 8 μm kalınlıkta optimal kesme sıcaklığıyla gömülü donmuş kesitler hazırlanır.
      3. Bölümleri deparafinize edip yeniden nemlendirerek H&E boyama işlemi yapılır, ardından oda sıcaklığında (RT; 23°C ± 2°C) 5 dakika hematoksilin boyama ve 2 dakika eozin boyama yapılır.
      4. Donmuş bölümlerde Yağ Kırmızı O çalışma çözeltisiyle 15 dakika RT'de inkübe uygulayın. %60 izopropanolde bölümleri 2 saniye boyunca ayırt edin ve damıtılmış suyla durulayın.
      5. Masson'ın trikrom boyamasını kit talimatlarına uygun olarak Weigert'in demir hematoksiliniyle 10 dakika kuluçka, 5 dakika Ponceau-asit fuşsin, 5 dakika fosfomolibdik asit ve 5 dakika anilin mavisiyle RT'de inkubasyon yapın.
      6. Görsel analiz yazılımında açık histolojik görüntüler.
      7. Kolajen pozitif bölgeleri belirlemek için renk eşik noktası uygulayın. Otomatik eşik belirleme yapın ve aynı parametreleri tüm örnek görüntülere uygulayın.
      8. Doğrulama için eşik ayarlarını kaydedin.
      9. Toplam plak alanını, damar intimasındaki tüm plak alanlarının toplamı olarak tanımlayın.
      10. Plak alanını ölçün, plak sınırlarını manuel olarak çizerek veya tüm plak bölgelerini belirlemek için otomatik eşik segmentasyonu kullanarak.
      11. Kolajen pozitif alanı ölçün.
      12. Kolajen içeriğini, toplam plak alanına bölünmüş olarak hesaplayın× %100.
   4. Makrofaj içeriğini değerlendirin
      1. Makrofaj içeriğini değerlendirmek için CD68 immünoflüoresans boyama işlemi yapıldı. Makrofaj içeriğini plak alanının CD68-pozitif alan yüzdesi olarak nicelikle ölçün.
      2. Parafinli kesitler için 5 μm kalınlıkta doku kesitleri hazırlanır. Sitrat tamponu (pH 6.0) ile yüksek basınç altında 2 dakika boyunca antijen toplama işlemi yapılmalıdır.
      3. RT'de 30 dakika boyunca %5 BSA ile bölümleri blokla.
      4. Tavşan anti-fare CD68 monoklonal primer antikoru (klon D4B9C, seyrelme %1 BSA) ile gece boyunca 4°C'de inkübe bölümleri yapılabilir.
      5. Alexa Fluor 488 ile konjuge edilmiş keçi anti-tavşan IgG ikincil antikoru (seyreltme 1:500) ile RT'de 1 saat kuluçka bölümleri alın.
      6. 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) ile çekirdekleri 5 dakika boyunca karşı boyama yapın.
      7. Görüntü analiz yazılımında açık floresans görüntüleri.
      8. CD68-pozitif bölgeleri eşik belirleme yöntemiyle belirleyin. Otomatik eşik belirleme yapın ve aynı parametreleri tüm örnek görüntülere uygulayın.
      9. Doğrulama için eşik ayarlarını kaydedin.
      10. CD68-pozitif alan ölçün.
      11. Makrofaj içeriğini CD68-pozitif alanın toplam plak alanına bölünmesi olarak %100 olarak hesaplayın×

Results

DLS ölçümleri, 25°C'de 173° geri saçılma açısıyla Zetasizer Nano ZS sistemi kullanılarak gerçekleştirildi. Örnekler deiyonize suda 20 kat seyreltildi (nihai konsantrasyon yaklaşık 0,1 mg/mL) ve ölçümden önce 2 dakika dengelendi. Her örnek üçlü olarak ölçülmüş ve sonuçlar ortalama SD ± olarak sunulmuştur. DLS ve TEM, membran kaplamasından sonra NP boyutunda bir artış gösterir ve çekirdek-kabuk yapısının oluşmasını doğrular (Şekil 1). COL NP'lerin hidrodinamik...

Discussion

Bu protokol, hedefli ateroskleroz tedavisi için CD47- ve integrin α4/β1–komodifiye makrofaj membranı kaplı NP'lerin oluşturulması ve uygulanması için kapsamlı bir yöntem sunar. Bu sistemin temel avantajları, integrin α4/β1–VCAM-1 etkileşimi yoluyla aktif hedefleme ve CD47 aracılı sinyal ile ilişkili makrofaj alımının azalmasıdır; bu, in vitro alım testleri (Şekil 3) ve in vivo biyodağılım sonuçları (Şekil 4) tarafından ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
7-aminoaktinomisin D (7-AAD)	Thermo Fisher Scientific (ABD)	A1310	Akış sitometrisi canlı/ölü ayırımı için uygulanabilirlik boyası
Alexa Fluor 488-konjuge keçi anti-tavşan IgG	Thermo Fisher Scientific (ABD)	A-11008	CD68 immünoflüoresans boyama için ikincil antikor
Fare karşıtı CD47 antikoru	Abcam (ABD)	ab214453	CD47 ifadesini doğrulamak için Western blot analizinde kullanılır
Anti-fare integrin α 4 antikor (B-2)	Santa Cruz Biyoteknolojisi (ABD)	SC-376334	Western blot analizinde integrin ve alfa doğrulamak için kullanılır; 4 ifadesi
Anti-fare integrin & beta; 1 antikor (A-4)	Santa Cruz Biyoteknolojisi (ABD)	SC-374429	Western blot analizinde integrin ve beta doğrulamak için kullanılır; 1 ifadesi
ApoE-/- fareler	Jackson Laboratuvarı (ABD)	Yok	in vivo ateroskleroz modeli için kullanılıyor
BCA test kiti	Thermo Fisher Scientific (ABD)	23225	Protein konsantrasyonunu belirlemek için kullanılır
Siyah silikon plaka	Yok	Yok	Ex vivo görüntüleme için aort monte etmek için kullanıldı
CD47 plazmid (pcDNA3.1(+))	Generay Biotech (Çin)	G0177361-1	Aşırı ifade için fare Cd47 geni içerir
Kolşisin	Sigma-Aldrich (ABD)	C9754	Nanopartiküllerde terapötik yük
Konfokal lazer tarama mikroskobu	Leica Microsystems	TCS SP8	Floresans görüntüleme ve ortak lokalizasyon analizi için kullanılır
Sitrat tamponu (pH 6.0)	Thermo Fisher Scientific (ABD)	Yok	İmmünoflüoresans boyamada antijen alımında kullanılır
Diyaliz tüpü (MWCO 3.500 Da)	Sigma-Aldrich (ABD)	PURD35030	Nanopartikül arıtma için kullanılır
Dimetil sülfoksit (DMSO)	Sigma-Aldrich (ABD)	D2447	Nanopartikül hazırlamak için çözücü
DiI (1,1′-dioktadesil-3,3,3′,3′-tetrametilindokarbosiyanin perklorat)	Beyotime (Çin)	C1036	Nanopartikül çekirdeğinin floresan etiketlenmesi
DiO (3,3′-dioktadesisiksakarbosiyanin perklorat)	Beyotime (Çin)	C1038	Makrofaj zarının floresan etiketlenmesi
DiR	Beyotime (Çin)	Y239280	in vivo floresans görüntüleme için kullanılır
DAPI	Thermo Fisher Scientific (ABD)	D3571	Floresans görüntüleme için nükleer karşı boyama
Dulbecco' s Modifiye Kartal Ortamı (DMEM)	Thermo Fisher Scientific (ABD)	11965092	Hücre kültürü ortamı
Dinamik ışık saçma analizörü (Zetasizer Nano ZS)	Malvern Panalytical (Birleşik Krallık)	Yok	Nanopartikül boyutu, PDI ve zeta potansiyelinin dinamik ışık saçılması (DLS) ölçümleri için kullanılır
ELISA kiti	R& D Systems (ABD)	Hedef sitokine bağlıdır	İltihap sitokinleri nicelendirmek için kullanılır
Endothelin-1 (ET-1)	Sigma-Aldrich (ABD)	E7764	Integrin ve alfa uyarıcısı için kullanılır; 4/β 1 ifadesi
Fetal sığır serumu (FBS)	Gibco (Thermo Fisher Scientific, ABD)	10091148	Hücre kültürü ortamı için takviye
Akış sitometresi	BD Biosciences (ABD)	FACSCalibur	Floresans sinyal alımı için kullanılır
Akış sitometrisi analiz yazılımı (FlowJo v10.8.1)	BD Biosciences (ABD)	Yok	Akış sitometrisi veri analizi için kullanılır
İnsan göbek veni endotel hücreleri (HUVEC)	FuHeng Biyoteknolojileri (Çin)	FH1122	In vitro hedefleme testleri için kullanılır
Görüntü analiz yazılımı (ImageJ)	Ulusal Sağlık Enstitüleri (ABD)	Yok	Nicel görüntü analizi için kullanılır
In vivo görüntüleme sistemi	PerkinElmer (ABD)	IVIS Lumina III	Tüm vücut floresans görüntüleme için kullanılır
İzopropanol (%60)	Sigma-Aldrich (ABD)	34863	Yağlı Kırmızı O boyama sırasında farklılaştırma için kullanılır
Lipofektamin 3000	Thermo Fisher Scientific (ABD)	L3000001	Transfeksiyon reaktifi
Manyetik karıştırıcı ve karıştırma çubuğu	Yok	Yok	Nanopartikül hazırlamada kullanılır
Masson' s Trikrom leke kiti	Abcam (ABD)	AB150686	Kolajen boyama için kullanılır
Mini ekstruder	Avanti Polar Lipids (ABD)	610000	Membran ekstrüzyonu için kullanılır
Murine RAW 264.7 hücre hattı	FuHeng Biyoteknolojileri (Çin)	FH0328	Makrofajların kaynağı
Mouse düz kas hücre hattı	FuHeng Biyoteknolojileri (Çin)	FH-Y063	Güvenlik değerlendirmesi için kullanılıyor
Yağlı Kırmızı O	Sigma-Aldrich (ABD)	O0625	Lipid boyama için kullanılır
Opti-MEM	Thermo Fisher Scientific (ABD)	31985062	Transfeksiyon için indirgenmiş serum ortamı
Oksitlenmiş düşük yoğunluklu lipoprotein (Ox-LDL)	Yiyuan Biyoteknolojileri (Çin)	YB-002	Köpük hücre oluşumunu indüklemek için kullanılır
Penisilin ve dash; Streptomisin	Thermo Fisher Scientific (ABD)	15140122	Hücre kültürü için antibiyotik takviyesi
Fenilmetilsülfonil florür (PMSF)	Sigma-Aldrich (ABD)	78830	Proteaz inhibitörü
Fosfatla tamponlanmış tuzlu (PBS)	Thermo Fisher Scientific (ABD)	10010023	Yıkama ve seyreltme tamponu
Poli(laktik-ko-glikolik asit) (PLGA, 50:50; MW 90.000)	Dalian Meilun Biyoteknolojisi (Çin)	MB5649-1	Nanoparçacık üretimi için polimer
Polikarbonat membran filtreleri (200 nm, 400 nm)	Whatman (Birleşik Krallık)	800282	Ekstrüzyon için Kullanım
Potasyum klorür (KCl)	Sigma-Aldrich (ABD)	P9333	Liz tamponunun bileşeni
P3000 reaktifi	Thermo Fisher Scientific (ABD)	L3000001	Transfeksiyon artırıcı
Döner mikrotom	Leica Biosystems (Almanya)	RM2235	Parafin kesitleri için kullanılır
Şırınga pompası	Harvard Cihazı (ABD)	70-3007	Kontrollü nanoparçacık oluşumu için kullanılır
Geçirim elektron mikroskobu (TEM)	Thermo Fisher Scientific (ABD)	Talos F200S	Nanopartikül görüntüleme için kullanılıyor
Tris-HÇL	Sigma-Aldrich (ABD)	T2663	Tampon bileşeni
Tümör nekroz faktörü alfa (TNF-α)	R& D Systems (ABD)	410-MT	Endotel hücrelerini aktive etmek için kullanılır
Ultrasaf su	Milli-Q (Merck, ABD)	ZMQSV0T01	Nanopartikül hazırlama ve diyaliz için kullanılır