Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Araştırma makalesi

Kronik Apikal Periodontitte P. gingivalis/F. nucleatum, TLR4/MyD88/NF-κB Yolu üzerinden gebelik kısalmasıyla ilişkilidir

161 görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/70793

⸱

15 Mayıs 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cariology and Endodontics, The First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, The Affiliated Stomatology Hospital of Xinjiang Medical University, 2Development and Related Diseases of Women and Children Key Laboratory of Sichuan Province, 3Stomatology Disease Institute of Xinjiang Uyghur Autonomous Region, Xinjiang Medical University, 4Department of Endodontics, Urumqi Stomatological Hospital, 5Department of Obstetrics and Gynecology, The First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University

Bu makalede

Özet

Kronik apikal periodontitle ilişkili ağız patojenleri (P. gingivalis, F. nucleatum) fare CAP modelleri ve insan trofoblast enfeksiyonu testleri kullanılarak değerlendirilir. Gebeliksel kısalma, plasenta inflamatuar aktivasyonla birlikte gözlemlenir ve bu da TLR4/MyD88/NF-κB sinyalleriyle uyumludur. Bakteriyel DNA, plasenta/damar dokularında tespit edilebilir olup, hematojenik bir bağlantı ve potansiyel müdahale hedeflerini destekler.

Özet

Kendiliğinden erken doğum (sPTB; 37. haftadan önce doğum) yenidoğan ölümünün başlıca nedenlerinden biri olmaya devam etmekte olup, vakaların önemli bir kısmında intrauterin enfeksiyon da rol oynamaktadır. Ortaya çıkan kanıtlar, Porphyromonas gingivalis ve Fusobacterium nucleatum gibi ağızdan patojenleri olumsuz gebelik sonuçlarıyla ilişkilendirir; ancak kronik apikal periodontiti (CAP) gebelik riski ile bağlayan mekanik yollar henüz tam olarak tanımlanmamıştır. Hamile C57BL/6J farelerinde, CAP kök kanal aşısıyla belirlenmiş ve bakteriyel süspansiyonlar (1 × 108 CFU/mL) kullanılarak kuyruk damarı meydan okuma modeliyle tamamlanmıştır. Gebelik süresi, plasenta histopatoloji, inflamatuar belirteçler ve bakteriyel DNA sinyalleri qPCR ile değerlendirildi. Paralel olarak, insan trofoblastları TLR4/MyD88/NF-κB ekseninin aktivasyonuyla uyumlu inflamatuar sinyalleri incelemek için P. gingivalis veya F. nucleatum (MOI = 50, 24 saat) ile maruz kaldılar. Kontrol gruplarına göre, CAP ile ilişkili gruplarda gebelik kısalması (medyan 19,5 vs 20,5 gün), plasentada inflamatuar değerlerin artması (yüksek IL-1β ve TNF-α dahil) ve inflamatuar hasarla uyumlu histopatolojik özellikler gösterildi. qPCR, plasenta ve damar dokularında bakteriyel DNA sinyallerinin varlığını da gösterdi. Trofoblast testlerinde, F. nucleatum P . gingivalis'e göre daha güçlü proinflamatuar yanıtlar üretmiş ve bu da artan NF-κB fosforilasyonu ile ilişkilidir. Bu bulgular toplamda, CAP ile ilişkili ağız patojenlerinin TLR4/MyD88/NF-κB sinyalizasyonu yoluyla plasenta iltihabını yönlendirerek gebeliksel kısalmaya katkıda bulunabileceğini ve enfeksiyonla ilişkili gebelik riskini azaltmak için potansiyel hedef olarak ağız–plasentalı mikrobiyal eksenin desteklenebileceğini göstermektedir.

Giriş

Kendiliğinden erken doğum (sPTB), gebeliğin 20–37. haftaları arasında tıbbi müdahale olmadan gerçekleşen doğum olaraktanımlanır 1. Kritik bir küresel halk sağlığı endişesi olarak, sPTB görülürlüğü gelişmiş ülkelerde yaklaşık %5–%9'dan, kaynakları sınırlı bölgelerde %12–%18'ekadar değişmektedir 2,3. Erken doğum ve komplikasyonları, 5 yaş altı çocuklarda ölüm oranlarının başlıca nedenlerinden biri olmaya devam etmekte olup, yılda yaklaşık bir milyon yeni doğumlu ölümeneden olur 4. Hayatta kalanlar genellikle hem solunum sıkıntısı sendromu gibi ani komplikasyonları hem de serebral palsi ve gelişimsel gecikmeler dahil uzun vadeli sonuçlaryaşar 5,6 ve böylece aileler ve toplum üzerinde önemli ekonomikyükler oluşturur 7,8.

sPTB'nin etiyolojisi çok faktörlüdür ve rahim kontraktil disfonksiyonu, servikal yetmezlik, endokrin bozukluklar, plasenta bozuklukları ve intrauterin enfeksiyon gibi anne, fetal ve çevresel faktörler arasındaki etkileşimleriyansıtır9. Rahim içi enfeksiyon önemli bir katkı kaynağı olarak kabul edilir ve erken doğum vakalarının yaklaşık %30–%40'ını oluşturduğutahmin edilmektedir (10,11). Patojenler, amniyotik boşluğa yükselen (örneğin, servikovajinal) veya hematojen yollarla ulaşabilir, bu da konak bağışıklık yanıtlarını aktive eder ve proinflamatuar sitokinlerin (örneğin, IL-6, TNF-α) ve proinflamatuar sitokinlerin salınımını teşvik eder; bu da doğum12'yi hızlandırabilir. Trofoblastlar, anne-fetal arayüzünün temel hücresel bileşenleri olarak bağışıklık toleransına ve antimikrobiyal savunmaya katkıdabulunur 13.

Porphyromonas gingivalis ve Fusobacterium nucleatum gibi ağız mikroorganizmaları, sPTB ile ilişkili iltihap süreçlerinde, muhtemelen bakterisemi ve/veya inflamatuar aracıların yayılması yoluyla ilişkilendirilmiştir14. Bu türler yerleşik periodontal patojenler olup, periodontit ile sPTB arasındaki ilişkiler epidemiyolojik ve klinik çalışmalardabildirilmiştir 15,16,17. Özellikle, P. gingivalis ve F. nucleatum da kronik apikal periodontitte (CAP)18,19 sıkça tespit edilmektedir, ancak CAP ile olumsuz gebelik sonuçları arasındaki ilişki nispeten az incelenmiş ve ilgili biyolojik yollar tam olaraktanımlanmamıştır 20. Harjunmaa ve ark. apikal periodontit ile gebelik süresinin azalması ile düşük doğum ağırlığı arasında bir ilişkiyi ilk kez 2015 yılında bildirdi21. Aynı kohortun takip çalışması, plasentaya doğrudan bakteriyel transferi desteklememiştir; bu da sistemik iltihapın apikal periodontit ile gebelik sonuçları arasında makul bir bağlantı olabileceğiniöne sürmektedir 22. Bu yorumla tutarlı olarak, radyografik olarak doğrulanmış apikal periodontit, erken düşük kilolu doğum riski ileilişkilendirilmiştir 23. Kalıcı bir gizli enfeksiyon olarak, CAP, kronik düşük dereceli sistemik iltihap ve/veya mikrobiyal bileşenlere hematojen maruziyet yoluyla gebelik riskinekatkıda bulunabilir 24,25. Bu nedenle, ağız–plasenta inflamatuar yollarının anlaşılmasını geliştirmek ve enfeksiyona bağlı gebelik riskini önleme stratejilerini bilgilendirmek için CAP–gebelik ilişkisinin daha fazla netleştirilmesine ihtiyaç vardır.

Son çalışmalar, iltihapla ilişkili erken doğumda TLR4/MyD88/NF-κB sinyal ekseninin önemini ortaya koymuştur. Robertson ve ark. TLR4'ü iltihap kaynaklı erken doğumda potansiyel bir terapötik hedef olarak tanımladı ve hayvan modellerinde önleyici etkiler bildirdi26. Peng ve ark. ayrıca miR-199a-3p'nin servikal epitel iltihabını HMGB1/TLR4/NF-κB yolu27'nin baskılanması yoluyla azalttığını göstermiştir. Ayrıca, Shen ve arkadaşları diyabetik hamile farelerde şırtinginin antioksidatif ve anti-inflamatuar etkilerini tanımladı; TLR4/MyD88/NF-κB yolunun modülasyonu gözlemleneniyileşmelerde rol oynadı 28. Bu bulgular birlikte, TLR4/MyD88/NF-κB ile bağlantılı inflamatuar sinyalin doğum sürecini etkileyen enfeksiyonla ilişkili yollara katkıda bulunduğu, aynı zamanda birden fazla doğuştan gelen bağışıklık reseptörünün patojenin bağlamına bağlı olarak paralel etki gösterebileceğini kabul eden mekanik bir çerçeveyi desteklemektedir.

Mevcut çalışma, CAP ile ilişkili gebelik etkilerini, tamamlayıcı in vitro trofoblast testleri ve in vivo fare modelleri kullanarak değerlendirmektedir. Trofoblast modeli, patojenlere bağlı inflamatuar sinyallerin kontrollü sorgulanmasını sağlarken, hamile farenin CAP modeli hücresel yanıtları fizyolojik gebelik koşullarında organizma düzeyindeki gebelik fenotiplerine bağlar. Kuyruk damarı meydan okuma modeli, tamamlayıcı bir hematojen maruziyet yolu sağlamak ve ağız enfeksiyonu ortamında gözlemlenen inflamatuar aktivasyon kalıplarının, bakteriyel bileşenler anne dolaşımına eriştiğinde tekrarlanıp tekrarlanmadığını değerlendirmek için dahil edilmiştir. Özellikle, P. gingivalis ve F. nucleatum'a trofoblast maruziyeti, sitokin yanıtlarının profillenmesi ve TLR4/MyD88/NF-κB ekseninin aktivasyonunu profillemek için kullanılırken, hayvan deneyleri gebelik süresi, plasenta iltihabı ve karotis bifurkasyonu ile plasenta dokularında bakteriyel DNA sinyallerinin qPCR tabanlı tespitini değerlendirir. qPCR, canlılık veya hücresel lokalizasyon yerine bakteriyel DNA'nın varlığını gösterdiğinden, anne-fetal arayüzdeki mikrobiyal varlıkla ilgili yorumlar temkinli kalır. Ayrıca, tür farklılıkları ve kontrollü deneysel maruziyet, doğrudan klinik çeviriyi sınırlayabilir ve bu da insan ile ilgili ortamlarda sonraki doğrulama ihtiyacını vurgulamaktadır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Tüm hayvan deneyleri, Xinjiang Tıp Üniversitesi Birinci Bağlı Hastanesi Hayvan Araştırmaları Etik Komitesi tarafından belirlenen etik kurallara (Onay No.: IACUC-20231121-13) ve Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) laboratuvar hayvanlarının bakımı ve kullanımı rehberine (2011 baskısı) uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Ayrıca, bu çalışma ARRIVE yönergelerine uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Tüm malzemeler (reaktifler, tüketim malzemeleri, ekipman ve yazılım) ile ilgili üretici bilgileri ve katalog numaraları, tekrarlanabilirliği kolaylaştırmak için Malzeme Tablosu'nda sağlanmıştır.

1. Bakteriyel kültür

Porphyromonas gingivalis ve Fusobacterium nucleatum referans suşları (Materyal Tablosu'nda verilen suş tanımlayıcıları) anaerobik koşullarda işlendi. Birincil kültürler, önceden indirgenmiş Columbia kan agar plakalarında kurulmuş ve anaerobik olarak (%85 N₂, %10 H₂ ve %5 CO₂) 37 °C'de 48 saat boyunca kuluçka uygulanmıştır. Deneysel preparatlar için, iyi izole edilmiş tek bir koloni 40 mL beyin kalp infüzyon suyuna aşılanmış ve aynı anaerobik koşullarda orta günlük faza büyümesine (OD660 = 0.6–0.8) kadar kuluçka edilmiştir. Oksijen maruziyetini en aza indirmek için, aşılama ve transfer adımları önceden indirgenmiş ortam ve aletlerle anaerobik bir iş istasyonunda gerçekleştirildi. Bakteriyel konsantrasyonlar, aynı kültür koşullarında üretilen suş-spesifik OD–CFU standart eğrisi ile OD660 tabanlı niceliklendirme kullanılarak hayvan maruziyeti için 1 ×10 8 CFU/mL olarak standartlaştırıldı; Kalibrasyon eğrisi, en az üç bağımsız kalibrasyona sahip anaerobik agar plakalarında seri seyreltme ve koloni sayımı ile belirlenmiştir. Trofoblast enfeksiyonu çalışmaları için, bakteriyel süspansiyonlar doğrulanmış bir sayılama yöntemiyle nicelendirildi ve antibiyotiksiz tam kültür ortamında seyreltilerek belirtilen enfeksiyon çokluğu (MOI) hemen önce elde edildi.

2. Hayvan barınması ve gruplanması

6–7 haftalık spesifik patojensiz C57BL/6J fareleri (n = 90; 60 dişi, 30 erkek) kontrollü koşullarda (22 °C ± 2 °C, %60 ± %10 nem, 12 saat ışık döngüsü) ve yiyecek ve suya imkansız erişim sağlandı. 1 haftalık aklimatizasyondan sonra, fareler rastgele olarak altı deneysel gruba (n = 15/grup) ayrıldı: Normal kontrol (NC), P. gingivalis ile CAP (AP), F. nucleatum (AF) ile CAP, normal tuzlu kuyruk ven enjeksiyonu (VN), P. gingivalis kuyruk ven enjeksiyonu (VP) ve F. nucleatum kuyruk ven enjeksiyonu (VF). Randomizasyon ve kafes tahsisi, tahsis yanlılığını ve potansiyel kafes etkilerini en aza indirmek için kaydedildi.

3. CAP modelinin kurulması

Tüm cerrahi işlemler aseptik koşullar altında gerçekleştirildi. Anestezi, pentobarbital sodyum (1,62 mg/30 g vücut ağırlığı) ile atropin sülfat (12,5 μg/30 g vücut ağırlığı) intraperitoneal uygulanmasıyla indüklenmiş ve pedal çekilme refleksinin olmaması yeterli anestezik derinliği doğrulanmıştır. Fareler, vücut sıcaklığını korumak için ısınma pedinde sırtüstü konumlandırıldı ve ağız nazikçe açılarak iki taraflı maksiller birinci azı dişleri stabil görselleştirmeyi sağlandı. Büyütme altında, iki taraflı maksiller birinci azı dişlerinin pulp odaları steril yuvarlak burulu kullanılarak açıldı ve ardından koronal pulp dokusu steril mikro-aletlerle çıkarıldı. Kök kanal delikleri küçük bir endodontik dosya (06–10 boyut) kullanılarak tanımlandı ve kanallar, aşırı kuvvetten kaçınarak delme riskini en aza indirmek için açıklığı sağlamak için nazikçe şekillendirildi. Oda, aşılamadan önce steril tuzlu su (veya steril PBS) ile durulanır ve steril kağıt noktalarıyla kurutulurdu.

Bakteriyel aşılama, 1 × 108 CFU/mL olarak standart süspansiyon kullanılarak gerçekleştirildi. Dozajı tekrarlanabilir kılmak için, teslim edilen hacim operasyonel olarak diş başına 2 μL olarak sabitlendi (yaklaşık 2 ×10,5 CFU diş başına), odanın girişinde yerleştirilmiş kalibre edilmiş mikropipet ucu kullanılarak verildi. Aynı süspansiyonla önceden ıslatılmış steril emici kağıt ucu daha sonra hamur odasına yerleştirilerek lokal maruziyeti sürdürülürdü. Başarılı doğum, kağıt noktasının görünür şekilde ıslanması ve ağız boşluğuna sızıntı olmaması ile doğrulandı. Aşılamadan sonra, oda görünür sıvı kalmayınca hava ile kurutuldu, ardından hafifçe kürlenmiş bir diş yapıştırıcısı (20 s) ile mühürlendi ve ardından ışıkla kürlenmiş akan reçine kompozit (20 s) kullanılarak restorasyon yapıldı. Mühür bütünlüğü görsel inceleme ve nazik probing ile doğrulandı; boşluklar veya erken kayıplar gösteren restorasyonlar hemen yeniden kapatılmıştır. Prosedür sonrası analjezi ve izleme ise kurumsal hayvan bakım rehberliğine göre sağlandı.

İki hafta sonra, CAP'nin kurulmasını doğrulamak için periapikal radyografiler alındı. Başarılı oluşum, kronik periapikal iltihap ve kemik yıkımıyla uyumlu çevredeki kemik değişiklikleriyle belirgin periapikal radyolucensiyle tanımlandı. Çiftleşme, enfeksiyon/model oluşumundan iki hafta sonra başladı.

4. Kuyruk damarı enjeksiyon modelinin oluşturulması

Bakteriyel süspansiyonlar, steril salin içinde 1 × 108 CFU/mL konsantrasyonda hazırlandı. Fareler kısıtlanmış, kuyruklar 1–2 dakika ısıtılmış, yan kuyruk damarları genişletilmiştir. Enjeksiyonlar, lateral kuyruk damarına sığ bir açıyla (yaklaşık 10–15°) ince ölçülü bir iğne (genellikle 29–30 G) yerleştirilerek yapıldı. Doğru intravenöz yerleştirme, hub'da bir kan dalgası ve düşük dirençle düzgün infüzyonla doğrulandı; Başarılı olmayan yerleştirme, direnç artışı ve/veya deri altı bleb oluşumu ile gösterildi; bu durumda infüzyon durdurulup kısa bir yeniden ısınmadan sonra daha yakın bir bölgede tekrarlandı. Farelere üst üste üç gün boyunca günlük enjeksiyon yapıldı (her seferinde fare başına 100 μl). Üç gün sonra, dişiler erkeklerle birlikte yerleştirildi ve ertesi sabah vajinal tıkaçlar kontrol edildi. Vajinal tıkaçların (GD 0.5) doğrulanmasının ardından, 15. gebelik gününe kadar her üç günde bir (fare başına 100 μL) enjeksiyonlar uygulandı.

5. Hamile fare modelinin kurulması

Dişi ve erkek fareler, her gün saat 20:00'den itibaren gece boyunca 2:1 oranında (dişi:erkek) birlikte katılırdı. Ertesi sabah saat 08:00'de vajinal tıkaç veya sperm pozitif vajinal smear bulunması, gestasyon günü (GD) 0.5 olarak belirlendi. Her fare için başlangıç vücut ağırlığı, doğum öncesi kilo, doğum sonrası kilo, gebelik süresi, yenidoğan doğum ağırlığı, yavru büyüklüğü ve ölü doğum sayısı kaydedildi. Öncekiçalışmalara göre 29,30, GD 18.5'ten önce gerçekleşen doğum farelerde operasyonel olarak erken doğum olarak tanımlanmıştır. Gebelik kısaltması dönem aralığı içinde gerçekleşebileceği için, gebelik sonuçları gerçek erken doğum ile gebelik kısaltma fenotipleri arasındaki ayrım göz önünde bulundurularak yorumlandı.

6. Örnek toplama ve işleme

15. gebelik gününde, her grup başına üç hamile fare plasenta ve damar örneklemesi için rastgele seçildi (NC/AP/AF ve VN/VP/VF). Pentobarbital sodyum (30 g vücut ağırlığı başına 1,62 mg) ve atropin sülfat (30 g vücut ağırlığı başına 12,5 μg) intraperitoneal enjeksiyonuyla yapılan aestezinin ardından, retro-orbital kanama yoluyla kan örnekleri alındı. Fareler, solunum, kalp atışı ve kornea refleksinin olmaması nedeniyle ölüm doğrulanana kadar karbondioksit odasında ötenaziler yapıldı; Karbondioksit teslimatı, kurumsal hayvan refahı rehberliğine uygun kademeli doldurma yaklaşımını takip etti. Karotis arter bifurkasyonu ve plasenta dokuları, çapraz numune kontaminasyonunu azaltmak için steril aletlerle derhal toplandı. Plasenta dokusu iki porsiyona ayrıldı: bir kısmı −80 °C'de depolandı, diğer kısmı ise %10 nötr tamponlu formalinde 24 saat sabitlendi, ardından dereceli etanol dehidrasyonu ve parafin gömülmesi yapıldı. Kalan fareler günlük vücut ağırlığı, gebelik süresi, yavru büyüklüğü ve yenidoğan doğum ağırlığı açısından izlendi.

7. Hücre kültürü ve tedavi

İnsan trofoblast hücre hattı HTR-8/SVneo, %10 ısıyla inaktive edilmiş fetal sığır serumu ile takviye edilmiş RPMI 1640 ortamında 37 °C ve %5 CO₂ ile takviye edildi. Enfeksiyon deneyleri için, logaritmik büyüme fazındaki HTR-8/SVneo hücreleri (1 × 106 hücre) 6 kuyu plakalarına tohumlanarak gece boyunca yapışmasına izin verildi. Bakteriyel mücadeleden önce, ortam, ortak kültür sırasında antibakteriyel kalıcı etkileri önlemek için antibiyotiksiz tam ortamla değiştirildi. P. gingivalis veya F. nucleatum'un bakteriyel süspansiyonları MOI = 50 seviyesinde eklendi ve her kuyu tam kültür ortamı kullanılarak 2,5 mL nihai hacme ayarlandı. Plakalar 24 saat kuluçka içindedir. Süpernatantlar 24 saat içinde toplandı ve sitokin ölçümü öncesinde kalıntıları uzaklaştırmak için kısa santrifüjle temizlendi. Yapışkan hücreler, yapışmayan bakterileri çıkarmak için steril PBS ile iki kez yıkanmış ve aşağıda açıklanan iş akışlarına göre hemen RNA veya protein ekstraksiyonu için işlenmiştir.

8. Fare plasentasının histolojik analizi

Plasenta dokular, 24 saat boyunca %10 nötr tamponlu formalinde parafinle gömülü ve 4,5 μm kalınlıkta kesitlenerek sabitlendi. Plasenta morfolojisini incelemek için rutin hematoksilin ve eozin (H&E) boyama işlemi yapıldı. İmmünohistokimyasal boyama için, antijen lokalizasyonu kromojenik peroksidaz substratı kullanılarak pozitif bölgelerde kahverengi birikintiler üretir, ardından hematoksilin ile karşı boyama yapıldı. Negatif kontroller, birincil antikorların bağışıklık dışı serumla değiştirilmesiyle gerçekleştirildi.

Tekrarlanabilirliği ve şeffaflığı artırmak için immünohistokimyasal değerlendirme önceden belirlenmiş yarı nicel puanlama yöntemi kullanmıştır. Boyama yoğunluğu 0 (hiç yok), 1 (zayıf), 2 (orta) veya 3 (güçlü) olarak derecelendirildi ve pozitif hücrelerin oranı 0 (<5%), 1 (%5–25), 2 (%26–50), 3 (%51–75) veya 4 (>75%) olarak puanlandı. Bir immünoreaktivite puanı, her alan için yoğunluk ve yüzde puanlarının çarpılmasıyla hesaplandı. Her plasenta için, karşılaştırılabilir anatomik bölgelerden en az beş örtüşmeyen yüksek güçlü alan puanlandı. Puanlama, grup dağılışına kör olan iki gözlemci tarafından bağımsız olarak yürütüldü ve anlaşmazlıklar ortak incelemeyle çözüldü.

9. Fare karotis ikişlenmesi ve plasentada bakteriyel DNA sinyallerinin nicel gerçek zamanlı PCR tespiti

Doku DNA'sı, silika sütunu tabanlı doku DNA ekstraksiyon iş akışı kullanılarak çıkarıldı. Doku lizatları, 20–25 °C'de 5 dakika boyunca 12.000 × g seviyesinde santrifüjle temizlendi ve silika sütunlarına süpernatantlar uygulanarak DNA bağlanması için 12.000 × g sıcaklığında 20–25 °C'de 1 dakika boyunca santrifüj yapıldı. Yıkama adımları iş akışına göre gerçekleştirildi; her yıkama ardından 12.000 × g sıcaklıkta 20–25 °C sıcaklıkta 1 dakika boyunca santrifüj yapıldı. Son kuru spin, 12.000 × g ile 20–25 °C sıcaklıkta 2 dakika boyunca kalıntı etanol almak için gerçekleştirildi. DNA, 20–25 °C sıcaklıkta 2 dakikalık kuluçkadan sonra 50 μL elusyon tamponunda elüasyon yapıldı ve 12.000 × g sıcaklıkta, 20–25 °C'de 1 dakika boyunca santrifüjle toplandı. Bakteriyel genomik DNA, iş akışı gerektirmedikçe aynı bağlama/yıkama/kuru spin/elusiyon santrifüjleme parametreleri kullanılarak silika sütun tabanlı bakteriyel DNA çıkarma iş akışı kullanılarak çıkarılmıştır.

DNA konsantrasyonu ve saflığı mikrohacimli nükleik asit niceleyici kullanılarak ölçüldü ve bütünlük agaroz jel elektroforezi ile değerlendirildi. Nitelikli DNA örnekleri sonraki analizler için –20 °C'de saklandı. Hedef bakteriyel genler, Ek Tablo 1'de listelenen primerlerle amplifiye edilip klonlandı; PCR koşulları Ek Tablo 2 ve Ek Tablo 3'te detaylandırıldı. Amplifikasyonlu hedef bantlar arıtıldı, Ek Tablo 4 spesifikasyonlarına göre klonlandı ve yetkin Escherichia coli DH5α hücrelerine dönüştürüldü. Rekombinant plazmid içeren suşlar, doğru insert dizilerini sağlamak için doğrulandı ve plazmid DNA'sı standart hazırlık için çıkarıldı. Hedef bakteriyel gen parçalarını içeren seri seyreltilmiş plazmid standartlarında qPCR uygulanarak standart eğriler oluşturuldu. P . gingivalis 16S ve F. nucleatum 16S bakteriyel DNA sinyalleri, karotis bifurkasyonu ve plasenta örneklerinde gerçek zamanlı PCR ile nicel olarak tespit edildi; standart eğri kullanılarak KT değerlerinden DNA kopya sayıları hesaplandı. Reaksiyon sistemleri ve programları sırasıyla Ek Tablo 5 ve Ek Tablo 6'da ayrıntılı olarak yer almaktadır. qPCR, canlılık veya hücresel lokalizasyon yerine bakteriyel DNA sinyallerini gösterdiği için, anne-fetal arayüzdeki mikrobiyal varlıkla ilgili yorumlar temkinli kalır.

10. Fare serum örneklerinde ve hücre kültürü süpernatantlarında inflamatuar faktörlerin ELISA tespiti

Tüm reaktifler ve örnekler test öncesi oda sıcaklığında dengelendi. TNF-α ve IL-1β serum seviyeleri fare ELISA iş akışları kullanılarak ölçüldü ve hücre kültürü süpernatantlarındaki TNF-α ve IL-1β seviyeleri, kit prosedürlerine uygun olarak insan ELISA iş akışları kullanılarak belirlendi. Standartlar ve örnekler çift kuyularda ölçüldü ve her plaka için standart eğriler oluşturuldu. Teknik kopyalar, biyolojik kopya başına bir değer elde etmek için ortalamaya alındı.

11. Diğer moleküler biyoloji analizleri

qRT-PCR için, fenol-kloroform bazlı RNA ekstraksiyon iş akışı kullanılarak kültürlenmiş hücrelerden toplam RNA çıkarıldı. Faz ayrılmasından sonra, sulu faz 12.000 × g sıcaklıkta 4 °C'de 10 dakika boyunca santrifüjle aydınlaştırıldı ve RNA iş akışına göre çökeltildi, yıkanıp yeniden süspansiyon yapıldı. RNA konsantrasyonu bir nüklein asit analizörü kullanılarak ölçüldü ve RNA bütünlüğü agaroz jel elektroforezi ile değerlendirildi. Ters transkripsiyon cDNA oluşturmak için yapıldı ve TNF-α ile IL-1β mRNA seviyelerini nicelendirmek için nicel gerçek zamanlı PCR kullanıldı. Primer dizileri Ek Tablo 7'de, reaksiyon karışımları Ek Tablo 8'de, reaksiyon programları ise Ek Tablo 9'da listelenmiştir.

Western blotting için, fare plasenta dokularından veya trofoblast hücrelerinden elde edilen protein lizatları, 12.000 × g sıcaklıkta 4 °C'de 15 dakika boyunca santrifüjle arandırıldı, nicel olarak ölçüldü ve SDS-PAGE'ye maruz kaldı, ardından floresan görüntüleme iş akışı kullanılarak membran transferi ve antikor tabanlı tespit yapıldı. Eşit protein yükü şerit başına 30 μg olarak ayarlandı. Orijinal, kırpılmamış membran görüntüleri, moleküler ağırlık belirteçleri dahil olmak üzere, şekillerde sunulan tüm lekeler için korunmuş ve DOI: 10.57760/sciencedb.28254 olarak mevcuttur. Aksi belirtilmedikçe, "n" biyolojik çoğaltmaları (bireysel hayvanlar veya bağımsız hücre kültürleri) ifade ederken, teknik tekrarlar kalite kontrolü için kullanılır ve biyolojik çoğaltmanın yerini almaz.

12. İstatistiksel analiz

İstatistiksel analizler istatistiksel analiz yazılımı kullanılarak yapıldı ve şekiller grafik yazılımı kullanılarak oluşturuldu ( Materyaller Tablosu'nda listelenmiştir). Normal dağılımlı sürekli veriler ortalama ± standart sapma olarak sunuldu ve uygun post hoc testlerle tek yönlü ANOVA tarafından analiz edildi; normalde dağılım olmayan veriler ise medyan (çeyreklerarası aralık) olarak ifade edildi ve uygun çift karşılaştırmalarla Kruskal–Wallis testi kullanılarak analiz edildi. İstatistiksel anlamlılık eşikleri P < 0.05, P < 0.01 ve P < 0.001 olarak belirlendi. Aksi belirtilmedikçe, "n" biyolojik çoğaltmaları gösterir ve teknik kopyalar (örneğin, çoğaltılmış ELISA kuyuları) her biyolojik çoğaltma başına tek bir değer elde etmek için ortalamaya alınmıştır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

P. gingivalis veya F. nucleatum enfeksiyonu, farelerde gebelik sırasında kısalma ve serum proinflamatuar sitokinlerinin yükselmesiyle ilişkilidir
Anne kilo değişiklikleri, yenidoğan sonuçları ve gebelik süresi için temel istatistikler Tablo 1 ve Şekil 1'de özetlenmiştir. Anne kilo yönleri ve yenidoğan hastalıkları gruplar arasında anlamlı olarak fark etmedi (tek yönlü ANOVA, P > 0.05;

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Son yıllarda, biriken kanıtlar ağız sağlığı ile gebelik sonuçları arasında yakın bağlantılar olduğunu göstermiştir; bu da kronik apikal periodontit (CAP) ile erken doğumla ilişkili fenotipler dahil olmak üzere olumsuz gebelik sonuçları arasındaki olası ilişkilere daha fazla dikkat çekmektedir. Sistematik bir inceleme, mevcut klinik kanıt tabanının sınırlı ve heterojen olduğunu göstermekte, ancak genel olarak anne apikal periodontitiyle olumsuz gebelik sonuçları ar...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların beyan edecek rakip çıkarları yoktur.

Teşekkürler

Bu çalışma, Sichuan Eyaleti Kadın ve Çocukların Gelişim ve İlgili Hastalıkları Vakfı Key Laboratory tarafından desteklenmiştir (Hibe No. FYYFEJB2025002).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Chromogenic Peroxidase SubstrateAgilent DakoK3468IHC için kromojenik peroksidaz substratı
Defibrinated sheep blood, sterileThermo Fisher (Remel)R54012Kan agar (5%) için katkı maddesi
Dental X-ray unit / radiography systemPlanmecaIntra (model)CAP onayı için periapik radyografiler
DNeasy Blood & Tissue KitQIAGEN69504Dokulardan/bakterilerden silika kolonu DNA ekstraksiyonu
E. coli DH5α Competent CellsTaKaRa9057Plazmid standardı yapımı için transformasyon
Eosin Y solution, alcoholicSigma-Aldrich (Merck)HT110132H&E boyası
Fetal Bovine Serum (FBS), qualified, AustraliaGibco (Thermo Fisher Scientific)10099-141Tamamlayıcı ortam için tamamlayıcı
Flowable resin composite3MFiltek Supreme Flowable 6010Mühürlemeden sonra restorasyon; ışık kürleme
Fusobacterium nucleatum subsp. nucleatum reference strainATCC25586Anaerob kültür; CAP ve kuyruk ven maruziyeti
GraphPad PrismGraphPad SoftwarePrism 9 (version)İstatistiksel analiz ve şekil oluşturma
Hematoxylin solutionSigma-Aldrich (Merck)HHS32H&E karşı boya
HTR-8/SVneo human trophoblast cell lineATCCCRL-3271In vitro enfeksiyon analizleri
Human IL-1β/IL-1F2 Quantikine ELISA KitR&D Systems (Bio-Techne)DLB50Hücre süpernatanı IL-1β ölçümü
Human TNF-α Quantikine ELISA KitR&D Systems (Bio-Techne)DTA00DHücre süpernatanı TNF-α ölçümü
Immobilon-FL PVDF membrane, 0.45 µmMillipore (Merck)IPFL00010Floresan Western blot transferi
IRDye 680RD Goat anti-Rabbit IgG (H+L)LI-COR925-68071Floresan ikincil antikor
IRDye 800CW Goat anti-Rabbit IgG (H+L)LI-COR926-32211Floresan ikincil antikor
IκBα (44D4) Rabbit mAbCell Signaling Technology4812Birincil antikor (WB)
K-File (endodontic file)Dentsply Sirona (Maillefer)A012D015Kana aracı (örnek boyut 15)
LED dental curing light3MElipar DeepCure-S (model)20 sn kürleme (protokol başına)
Mouse IL-1β/IL-1F2 Quantikine ELISA KitR&D Systems (Bio-Techne)MLB00CSerum IL-1β ölçümü
Mouse TNF-α Quantikine ELISA KitR&D Systems (Bio-Techne)MTA00BSerum TNF-α ölçümü
MyD88 (D80F5) Rabbit mAbCell Signaling Technology4283Birincil antikor (WB)
NanoDrop One Microvolume UV-Vis SpectrophotometerThermo Fisher ScientificND-ONE-WDNA/RNA kantitasyonu
Near-infrared imaging systemLI-COROdyssey CLx (model)Floresan Western blot görüntüleme
NF-κB p65 (D14E12) Rabbit mAbCell Signaling Technology8242Birincil antikor (WB)
PBS, pH 7.4, without Ca2+/Mg2+Gibco (Thermo Fisher Scientific)10010-023Hücre yıkama ve reaktif hazırlanması
Penicillin-Streptomycin Gibco (Thermo Fisher Scientific)15140-122Antibiyotikler 
Pentobarbital sodium saltSigma-Aldrich (Merck)P3761Anestezi indüksiyonu (protokol dozajı)
Peroxidase blocking solutionAgilent DakoS2023IHC için endojen peroksidazı blokajı
Phospho-NF-κB p65 (Ser536) (93H1) Rabbit mAbCell Signaling Technology3033Birincil antikor (WB)
Porphyromonas gingivalis reference strainATCC33277Anaerob kültür; CAP ve kuyruk ven maruziyeti
PrimeScript RT Reagent Kit (Perfect Real Time)TaKaRaRR037AcDNA sentezi
Real-time PCR systemApplied BiosystemsQuantStudio 5 (model)16S hedeflerin qPCR kantitasyonu
Round bur (sterile)Dentsply SironaH1-010Maksiller birinci molar pulpa odacığı için erişim açıklığı
RPMI 1640 MediumGibco (Thermo Fisher Scientific)11875-093HTR-8/SVneo kültür ortamı tabanı
SYBR-safe DNA gel stainInvitrogenS33102DNA görselleştirme
TaKaRa MiniBEST Plasmid Purification Kit Ver.4.0TaKaRa9760Standartlar için plazmid miniprep
TB Green Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus)TaKaRaRR820AqPCR master karışımı (boya bazlı)
TLR4 (D8L5W) Rabbit mAbCell Signaling Technology14358Birincil antikor (WB)
TRIzol ReagentInvitrogen15596-026Fenol–kloroform RNA ekstraksiyonu
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol redGibco (Thermo Fisher Scientific)25200-056Hücre koparılması
T-Vector pMD19 (Simple)TaKaRa3271Standart eğriler için PCR ürün klonlaması
Universal dental adhesive3MScotchbond Universal Adhesive 26200İnokülasyondan sonra pulpa odasını mühürle

Kaynaklar

  1. American College of Obstetricians and Gynecologists’ Committee on Practice Bulletins—Obstetrics. Practice bulletin no. 171: Management of preterm labor. Obstet Gynecol. 128, e155-e164 (2016).
  2. Vogel, J. P., Chawanpaiboon, S., Moller, A. B., Watananirun, K., Bonet, M., et al. The global epidemiology of preterm birth. Best Pract Res Clin Obstet Gynaecol. 52, 3-12 (2018).
  3. Svenvik, M., et al. Early prediction of spontaneous preterm birth before 34 gestational weeks based on a combination of inflammation-associated plasma proteins. Front Immunol. 15, 1415016-1415028 (2024).
  4. Liu, L., et al. Global, regional, and national causes of under-5 mortality in 2000–15: An updated systematic analysis with implications for the sustainable development goals. Lancet. 388, 3027-3035 (2016).
  5. Saigal, S., Doyle, L. W. An overview of mortality and sequelae of preterm birth from infancy to adulthood. Lancet. 371, 261-269 (2008).
  6. Liang, S., et al. Development of a spontaneous preterm birth predictive model using a panel of serum protein biomarkers for early pregnant women: A nested case-control study. Int J Gynaecol Obstet. 168, 701-708 (2025).
  7. Bradley, E., et al. Born too soon: Global epidemiology of preterm birth and drivers for change. Reprod Health. 22, 105-119 (2025).
  8. Hodek, J. M., von der Schulenburg, J. M., Mittendorf, T. Measuring economic consequences of preterm birth: Methodological recommendations for the evaluation of personal burden on children and their caregivers. Health Econ Rev. 1 (1), 6 (2011).
  9. Romero, R., Dey, S. K., Fisher, S. J. Preterm labor: One syndrome, many causes. Science. 345, 760-765 (2014).
  10. Goldenberg, R. L., et al. Epidemiology and causes of preterm birth. Lancet. 371, 75-84 (2008).
  11. Combs, C. A., et al. Amniotic fluid infection, inflammation, and colonization in preterm labor with intact membranes. Am J Obstet Gynecol. 210, 125.e1-125.e15 (2014).
  12. Mendz, G. L., Kaakoush, N. O., Quinlivan, J. A. Bacterial aetiological agents of intra-amniotic infections and preterm birth in pregnant women. Front Cell Infect Microbiol. 3, 58-64 (2013).
  13. Semmes, E. C., Coyne, C. B. Innate immune defenses at the maternal-fetal interface. Curr Opin Immunol. 74, 60-67 (2022).
  14. Han, Y. W., Wang, X. Mobile microbiome: Oral bacteria in extra-oral infections and inflammation. J Dent Res. 92, 485-491 (2013).
  15. Ide, M., Papapanou, P. N. Epidemiology of association between maternal periodontal disease and adverse pregnancy outcomes—systematic review. J Periodontol. 84, S181-S194 (2013).
  16. Offenbacher, S., et al. Periodontal infection as a possible risk factor for preterm low birth weight. J Periodontol. 67, 1103-1113 (1996).
  17. Jeffcoat, M. K., et al. Periodontal infection and preterm birth: Results of a prospective study. J Am Dent Assoc. 132, 875-880 (2001).
  18. Siqueira, J. F., Rôcas, I. N. Microbiology and treatment of acute apical abscesses. Clin Microbiol Rev. 26, 255-273 (2013).
  19. Marchesan, J., et al. TLR4, NOD1 and NOD2 mediate immune recognition of putative newly identified periodontal pathogens. Mol Oral Microbiol. 31, 243-258 (2016).
  20. Georgiou, A. C., Crielaard, W., Armenis, I., de Vries, R., van der Waal, S. V. Apical periodontitis is associated with elevated concentrations of inflammatory mediators in peripheral blood: A systematic review and meta-analysis. J Endod. 45 (11), 1279-1295.e3 (2019).
  21. Harjunmaa, U., et al. Association between maternal dental periapical infections and pregnancy outcomes: Results from a cross-sectional study in Malawi. Trop Med Int Health. 20, 1549-1558 (2015).
  22. Harjunmaa, U., et al. Periapical infection may affect birth outcomes via systemic inflammation. Oral Dis. 24, 847-855 (2018).
  23. Leal, A. S., et al. Association between chronic apical periodontitis and low-birth-weight preterm births. J Endod. 41, 353-357 (2015).
  24. León, R., et al. Detection of Porphyromonas gingivalis in the amniotic fluid in pregnant women with a diagnosis of threatened premature labor. J Periodontol. 78, 1249-1255 (2007).
  25. Sanz, M., et al. Periodontitis and cardiovascular diseases: Consensus report. J Clin Periodontol. 47, 268-288 (2020).
  26. Robertson, S. A., et al. Targeting Toll-like receptor-4 to tackle preterm birth and fetal inflammatory injury. Clin Transl Immunol. 9, e1121-e1139 (2020).
  27. Peng, J., et al. miR-199a-3p suppresses cervical epithelial cell inflammation by inhibiting the HMGB1/TLR4/NF-κB pathway in preterm birth. Mol Med Rep. 22, 926-938 (2020).
  28. Shen, Z., et al. Protective effects of syringin against oxidative stress and inflammation in diabetic pregnant rats via TLR4/MyD88/NF-κB signaling pathway. Biomed Pharmacother. 131, 110681-110690 (2020).
  29. McCarthy, R., et al. Mouse models of preterm birth: Suggested assessment and reporting guidelines. Biol Reprod. 99, 922-937 (2018).
  30. Ao, M., et al. Dental infection of Porphyromonas gingivalis induces preterm birth in mice. PLoS One. 10 (8), e0137249-e0137265 (2015).
  31. Jakovljevic, A., et al. The association between apical periodontitis and adverse pregnancy outcomes: A systematic review. Int Endod J. 54 (9), 1527-1537 (2021).
  32. Khalighinejad, N., Aminoshariae, A., Kulild, J. C., Mickel, A. Apical periodontitis, a predictor variable for preeclampsia: A case-control study. J Endod. 43 (10), 1611-1614 (2017).
  33. Venugopal, B., Narasimman, H., Mahalingam, A., Naren Kishore, R., Jayavel, K., et al. Systemic health associations of apical periodontitis: A systematic review of observational studies. Cureus. 17 (10), e95273 (2025).
  34. Liang, S., et al. Periodontal infection with Porphyromonas gingivalis induces preterm birth and lower birth weight in rats. Mol Oral Microbiol. 33 (4), 312-321 (2018).
  35. Lin, D., et al. Porphyromonas gingivalis infection in pregnant mice is associated with placental dissemination, an increase in the placental Th1/Th2 cytokine ratio, and fetal growth restriction. Infect Immun. 71 (9), 5163-5168 (2003).
  36. Han, Y. W., et al. Fusobacterium nucleatum induces premature and term stillbirths in pregnant mice: Implication of oral bacteria in preterm birth. Infect Immun. 72 (4), 2272-2279 (2004).
  37. Liu, H., et al. Fusobacterium nucleatum induces fetal death in mice via stimulation of TLR4-mediated placental inflammatory response. J Immunol. 179 (4), 2501-2508 (2007).
  38. Chan, E., et al. Identification of Fusobacterium nucleatum in formalin-fixed, paraffin-embedded placental tissues by 16S rRNA sequencing in a case of extremely preterm birth secondary to amniotic fluid infection. Pathology. 51 (3), 320-322 (2019).
  39. Habelrih, T., Augustin, T. L., Mauffette-Whyte, F., Ferri, B., Sawaya, K., et al. Inflammatory mechanisms of preterm labor and emerging anti-inflammatory interventions. Cytokine Growth Factor Rev. 78, 50-63 (2024).
  40. Gomez-Lopez, N., Romero, R., Plazyo, O., Panaitescu, B., Furcron, A. E., et al. Intra-amniotic administration of HMGB1 induces spontaneous preterm labor and birth. Am J Reprod Immunol. 75 (1), 3-7 (2016).
  41. Wang, S., Ma, L., Ji, J., Huo, R., Dong, S., et al. Protective effect of soy isolate protein against streptozotocin induced gestational diabetes mellitus via TLR4/MyD88/NF-κB signaling pathway. Biomed Pharmacother. 168, 115688 (2023).
  42. Reyes, L., et al. Porphyromonas gingivalis and adverse pregnancy outcome. J Oral Microbiol. 10 (1), 1374153 (2017).
  43. Aagaard, K., et al. The placenta harbors a unique microbiome. Sci Transl Med. 6 (237), 237ra65 (2014).
  44. Kuperman, A. A., et al. Deep microbial analysis of multiple placentas shows no evidence for a placental microbiome. BJOG. 127 (2), 159-169 (2020).
  45. Einenkel, R., et al. Less is more! Low amount of Fusobacterium nucleatum supports macrophage-mediated trophoblast functions in vitro. Front Immunol. 15, 1447190 (2024).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Porphyromonas GingivalisFusobacterium NucleatumTLR4 YoluMyD88 SinyalizasyonuNF KappaB AktivasyonuPlasental nflamasyonPreterm Do umOral Patojenler
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.