Çevresel Çalışmalar İçin Etkili Kök Hücre Türemli Fare Blastosist Modelleri İnşap Etmek

Sergi Junyent; Manasvi Pinnaka; Magdalena Zernicka-Goetz

doi:10.3791/70796

Method Article

Çevresel Çalışmalar İçin Etkili Kök Hücre Türemli Fare Blastosist Modelleri İnşap Etmek

DOI:

10.3791/70796

⸱

July 14th, 2026

Sergi Junyent^*¹ , Manasvi Pinnaka¹ , Magdalena Zernicka-Goetz^*¹

¹Division of Biology and Biological Engineering, California Institute of Technology

^* These authors contributed equally

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, fare blastosistinin temel özelliklerini, örneğin soy organizasyonu ve kavitasyonu dahil olmak üzere, ölçeklenebilir kök hücre tabanlı bir model olan iGATA4-blastoidlerin üretimini ve analizini açıklar; böylece erken embriyonik gelişimi etkileyen çevresel ve moleküler bozulmaların tekrarlanabilir, yüksek verimli değerlendirilmesini sağlar.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kök hücre tabanlı embriyo modelleri, erken memeli gelişimini ve çevresel bozulmalara karşı hassasiyetini araştırmak için güçlü bir platform sunar. Burada, embriyonik kök hücreler (ESC'ler), trofoblast kök hücreleri (TSC) ve indüklenebilir GATA4 ekspresyonu için tasarlanmış embriyonik kök hücreler (iGATA4-ESC) kullanılarak yüksek isabetli fare blastoidleri üretmek için sağlam ve erişilebilir bir protokol sunulmaktadır. Bu sistem, doğal E4.5 blastosist morfolojisini, soy oranlarını ve transkripsiyonel imzalarını doğru şekilde yeniden düzenleyen iGATA4-blastoidler üretir ve böylece primitif endoderm (PE), epiblast (EPI) ve trofektoderm (TE) bölmelerinin güvenilir in vitro modelini sağlar. Bu protokol, blastoid oluşumu için gerekli üç kök hücre popülasyonunun nasıl korunacağını ve hazırlanacağını ilk olarak gösterir. İGATA4-blastoidlerin pre-implantasyon kültür koşullarında adım adım montajı daha sonra belirtilir ve kritik deneysel parametreler vurgulanır. Titiz karakterizasyonu mümkün kılmak için, blastoid fiksasyonu, boyama ve görüntüleme için test edilmiş bir iş akışı sağlanır. Son olarak, iGATA4-blastoidlerin yüksek verimli testler için nasıl kullanılabileceğini gösteren bir örnek sunulmaktadır. Büyük blastoid gruplarını tanımlanmış çevresel faktörlere maruz bırakarak, morfoloji, soy dağılımı ve gelişimsel ilerlemedeki değişiklikler hızlı ve tekrarlanabilir şekilde nicele edilebilir. Bu protokol birlikte, implantasyon öncesi gelişimi modelleme, erken soy kararlarını incelemek ve blastosist oluşumu üzerindeki çevresel veya moleküler etkileri değerlendirmek için çok parametrik taramalar yapmak için ölçeklenebilir bir platform oluşturur.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Erken memeli embriyolarının nasıl kendiliğinden oluştuğunu ve yaygın çevresel faktörlerin oluşumlarını nasıl olumsuz etkileyebileceğini anlamak, tekrarlanabilir, deneysel olarak erişilebilir ve ölçeklenebilir model sistemleri gerektirir. Embriyonik ve embriyon dışı kök hücrelerin birleştirilmesiyle oluşturulan entegre embriyo benzeri modeller böyle bir platform^sağlar ^1,2. Bu protokol, embriyonik kök hücreler (ESC'ler), trofoblast kök hücreleri (TSC'ler) ve indüklenebilir GATA4 ekspresyonu için tasarlanmış ESC'lerin (iGATA4-ESC'ler) pre-implantasyon koşullarında nasıl bir araya getirilerek sağlam ve doğru orantılı ilkel endoderm (PE), epiblast (EPI) ve trofektoderm (TE) hatlarına sahip blastoidler üretilebileceğini açıklar. Son çalışmalar, iGATA4-blastoidler³ olarak adlandırılan bu yapıların, soyun oranları, transkripsiyonel imzaları ve fonksiyonel belirtici ifadesi açısından E4.5 blastosistine benzediğini göstermiştir. In vitro kültürlendiğinde, bu yapıların %12,5'i implantasyon sonrası morfolojiye geçiş yapar. Önemli olarak, toksikoloji ve çevresel testlere açık olmaları.

Bu tekniğin geliştirilmesi, önceden var olan blastoid^{sistemlerdeki sınırlamalar nedeniyle motive olmuştur} ^2,4,5. Birçok protokol 6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21 erken blastosistlere benzeyen kavitasyonlu yapılar üretir, çoğu bunu nispeten düşük verimlilikle yapar veya eksik PE oluşumu, tanımlanmamış hücre kimlikleri veya yanlış soy oranları içeren yapılar üretir. Bu tutarsızlıklar, mekanik çalışmalar ve yüksek verimli pertürbasyon ekranları için uygunluklarını azaltır. PE spesifikasyonu in vivo GATA6, SOX17, GATA4 ve SOX7^22'nin aktivasyonunu takip ettiği ve PE veya onun türevi olan visseral endodermdeki (VE) kusurlar, peri-implantasyon^gelişimini 23,24,25,26,27 bozduğundan ve bu transkripsiyon programını in vitro uygular Blastoid isabetliliğini artırır. Koşullu GATA4 transgeni taşıyan ESC'ler, güçlü bir şekilde VE'ye dönüştürülür ve implantasyon sonrası koşullarda ESC ve TSC'lerle birleştirildiğinde, organogenezi başlatan ve gastrulasyon yapan entegre embriyo^{modelleri oluşturur 28,29,30,31}. Burada, bu prensip implantasyon öncesi koşullara uyarlanır ve iGATA4-ESC'lerin güvenilir şekilde PE ürettiğini ve doğal blastosistlere çok benzeyen^{blastoidler verdiğini gösterir 3}.

Bu yöntem, kök hücreler kullanılarak blastosist modellemedeki önceki sınırlamaları aşar ve yüksek blastoid oluşum etkinliği (oluşan yapıların %80'i blastoiddir, bunların %75'i uygun soy örgütlüyü ve oranlarını gösterir) ve yüksek embriyoya benzerlik sunar. Ayrıca, her blastosist hattının bağımsız kültürlenmiş bir kök hücre popülasyonundan türetildiği iGATA4-blastoidlerin modüler montajı, her embriyo bölmesine doğrudan deneysel erişim sağlar. Bu özellikler, sistemi çok parametrik tarama uygulamaları için özellikle uygun kılar. Doğru orantılı TE, EPI ve PE soylarına sahip morfolojik olarak tutarlı yapıların büyük kohortlarını elde ettiği için, doğal embriyolarla ulaşılamayacak istatistiksel güçle soyun spesifik yanıtların paralel bozulmalarını ve nicelendirilmesini sağlar.

İlke kanıtı olarak, fizyolojik^aralıklar 32,33,34,35,36,37,38 gibi yaygın çevresel faktörlerin blastoid gelişimi üzerindeki etkileri ölçülmüştür. Kafein, nikotin, etanol ve amino asit modifikasyonlarının kavitasyon oranı, morfolojisi, uygunluk ve soy oranları üzerindeki etkisi, çeşitli konsantrasyon ve geçici tedavi aralıkları arasında değerlendirildi. Çoğu durum (kafein, etanol, nikotin ve düşük proteinli diyetleri taklit edenler) sapkın blastoid oluşumu ve yapısal kalitenin bozulmasına yol açtı. Buna karşılık, dallanmış zincirli amino asitlerin konsantrasyonunun artırılması (yüksek proteinli diyetlere benzer) blastoid oluşum verimliliğini ve kalitesini artırdı. Bu sonuçlar, in vitro-kültürlü doğal fare^{blastosistleri 3'te} gözlemlenen etkileri yansıtarak, bu sistemin ince, doza bağlı fenotipleri yakaladığını ve doğal embriyolarda mümkün olmayan ölçeklenebilir, çok boyutlu tarama boru hatlarını desteklediğini göstermiştir.

Embriyo modellemesinin daha geniş bağlamında, bu teknik, entegre implantasyon sonrası gelişimi modellemek için kullanılan aynı hücrelerin implantasyon öncesi modeller olarak da kullanılabileceğini göstermektedir. Bu yöntem, özellikle doğru PE oluşumu ve sağlam soy entegrasyonu ile blastosist benzeri yapıların ölçeklenebilir modellemesi gerektiren uygulamalar için uygundur. Ancak, fare blastosistinin diğer kök hücre tabanlı modellerinde olduğu gibi, iGATA4-blastoidler konak faresine aktarıldıktan sonra yerleşmez ve daha da gelişir ve bu nedenle embriyo-anne etkileşimleri için uygun değildir. Genel olarak, bu protokol memeli embriyosunda erken hücre tipi kararlarını modelleyen yüksek isabetli blastoidler üretmek için güvenilir ve erişilebilir bir yaklaşım sunar.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokolde tanımlanan tüm prosedürler yerleşik hücre hatlarını içerir ve Kaliforniya Teknoloji Enstitüsü'nün kurumsal biyogüvenlik yönergelerine uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Canlı hayvan veya insan konu çalışmaları yapılmadı.

Birden fazla ESC ve TSC hattı test edilmiş ve iGATA4-blastoid oluşumunu desteklediği bulunmuştur. Önceki çalışmalardan ESC, iGATA4-ESC ve TSC²⁸ , bu protokolde tanımlanan tüm adımların tamamlanması için başarıyla kullanılmıştır. Aynı yazarlar, daha önce kurulmuş bir CD1 (ICR) fare ESC hattından iGATA4-ESC üretimini anlatmaktadır.

TSC'ler, ticari olarak bulunan fare embriyonik fibroblastları (MEF) üzerine kültürlenir. Bu protokolde kullanılan tüm kimyasallar, reaktifler, kitler, ekipmanlar ve yazılımlar Malzeme Tablosu'nda listelenmiştir.

1. Blastoid oluşumu için fare kök hücrelerinin kültürü

MEF besleyici plakalarının hazırlanması
1. 6 deyonly hücre kültür plakasını 1,5 mL %0,2 (w/v) jelatinle deionize (DI) suya kaplayın. Normoksiya içinde 37 °C'de en az 45 dakika kuluçka yapın.
2. Kuluçka sırasında, 4 mL FC ortamı (Tablo 1) ile önceden ısıtılmış 15 mL santrifüj tüpü hazırlanır.
3. MEF şişesini, sekiz şekilli hareketle su banyosunda eritilen, geriye sadece küçük bir buz topu kalana kadar. İçindekileri hazırlanmış tüpe aktarın, sonra pipetle yukarı aşağı iyice karıştırın. Santrifüj 500 × g'de 4 dakika koyun.
4. Süpernatantı aspire edin ve pelleti 1 mL FC ortamında yeniden süspansiyona yerleştirin. Kuyu başına 1,5 mL kutu başına ~160.000 hücre plaka için yeterli hacme ayarlayın.
5. Jelatini aspire edin ve her kuyu başına 1,5 ml MEF levha yapın. Normoksiya içinde gece boyunca rahatsız edilmeden kuluçka yapın.
6. Ertesi gün ortamı 1.5 mL başına yeni FC ortamı ile değiştirin. Her 48 saatte bir ortamı değiştirin. MEF'leri kaplamadan 2–7 gün sonra kullanın. MEF'ler daha uzun süre sağlıklı kalabilir, ancak TSC büyümesini destekleme yetenekleri zayıflayabilir.

DIKKAT: BSL-2 tekniği kullanılarak biyogüvenlik seviyesi (BSL) 1 laminar akış dolaplarında tüm fare hücre kültürünü gerçekleştirin.

Fare embriyonik kök hücrelerinin erimesi ve geçişi (WT ESC'ler ve iGATA4-ESC'ler)
1. WT ESC'leri veya iGATA4-ESC'leri 1.1.1–1.1.3 adımlarını takip ederek çözmek. Santrifüjlemeden sonra, hücreler 1 mL N2B27/2i/LIF ortamında (Tablo 1) yeniden süzülür ve ~50.000 hücre kuyu başına ~1,5 mL ile jelatin kaplı 6 kuyu tabakasına tohumlanın. Normoksiya içinde 37 °C'de kuluçka yapın ve her 48 saatte bir ortam değiştirin.
2. Kolonilerin sıkı ve yuvarlak olduğuna, minimum çıkıntı ile geçmeden önce emin olun. Her 2–3 günde bir geçiş.
  NOT: WT ESC'ler ve iGATA4-ESC'ler, doksisiklin (DOX) ile indüksiyona kadar morfolojik olarak ayırt edilemezler.
3. 6 kuyu başına 1,5 mL %0,2 jelatin DI suyu ile kaplayın. 37 °C'de en az 45 dakika kuluçka yapın.
4. Her kuyuya 500 μL hücre ayrıştırma reaktifi ekleyin ve 3 dakika kuluçka yapın. Kenarları nazikçe pipetle yaparken 2 mL FC orta madde ekleyin. Mikroskop altında >%90 kopmanı doğrulayın. Hücreler bağlı kalırsa, yeniden süspansiyona yardımcı olmak için nazikçe pipet yapın.
5. Hücre süspansiyonunu 15 mL'lik santrifüj tüpüne aktarın ve 500 × g ile 4 dakika boyunca santrifüj yapın.
6. Süpernatantı aspire edin ve pelleti 1 mL N2B27/2i/LIF ortamında yeniden süzülün. Hücre konsantrasyonu 10 μL kullanılarak hemositometre ile belirlenir. Hacmi tohum için ~50.000 hücre başına ayarlayın.
7. Jelatini aspire edin ve hücreleri tohumlayın. Normoksiyada kuluçka yapın. Ertesi gün ve sonrasında her 48 saatte bir malzeme değiştirin.
Fare trofoblast kök hücrelerinin (TSC) erimesi ve geçişi
1. 1.1.1–1.1.3 adımlarını takip eden TSC eritmeleri. Santrifüjleme sonrası, hücreleri 1 mL TSF4H ortamında (Tablo 1) yeniden süzülün ve her kuyu başına ~20.000 hücre MEF kaplı 6 kuyu plakasına tohumlayın. 37 °C, %5 CO₂, %5 O₂ (hipoksi) sıcaklıkta kuluçka yapın ve her 24 saatte bir ortam değiştirin.
2. Kolonilerin büyük olduğundan (>75 μm çapında) ve geçmeden önce düzleştirildiğinden emin olun. Her kuyu başına 500 μL hücre dissosiyasyon reaktifi ekleyin ve 5 dakika kuluçka yapın. Nazikçe pipetle yaparken 2 mL FC ortam ekleyin. >%90 kopukluğu onaylayın.
3. Hücreleri bir santrifüj tüpüne aktarın ve 500 × g ile 4 dakika boyunca döndürün.
4. 1 mL TSF4H ortamda yeniden süzülür. Konsantrasyonu belirleyin ve her kuyu başına ~20.000 hücreye ayarlayın.
5. MEF'lere levha takın ve hipokside kuluçka yapın. Koloni birleşmeden önce her 24 saatte bir ortayı değiştirin ve her 2–3 günde bir geçiş yapın.

2. iGATA4-blastoidlerin oluşumu

Hücre toplama için Microwell toplama plakasının hazırlanması
1. Bir Microwell toplama plakasının her kuyusuna 500 μL anti-yapışma durulama çözeltisi ekleyin. 2.000 × g sıcaklığında 5 dakika boyunca santrifüj yapın, mikro kuyulardan hapsolmuş havayı çıkarmak için doğru dengeleme yapıldı. Normoksiya içinde 37 °C'de en az 1 saat veya gece boyunca kuluçka yapın.
Blastoid hazırlığı, 0. gün — WT ve iGATA4-ESC'lerin hazırlanması ve kaplaması
1. N2B27/2i/LIF, FC ve FCYL ortamlarını (FC + 10 ng/mL fare rekombinant LIF (mLIF) + 2 μM ROCK inhibitörü Y27632) 37 °C'ye kadar ısıt. %0,2 jelatin DI suyunda hazırlayın ve hücre dissosiyasyon reaktifini hazır edin.
2. Kuyu dibine dokunmadan anti-yapışma çözeltisi aspire edin. 1 mL PBS ile iki kez, bir kez 1 mL FCYL orta ile yıkayın. Mikro kuyruklara zarar vermemek için duvar boyunca pipet koyun.
3. Geçiş hücreleri için jelatin kaplı 6 kuyu plakası (≥45 dakika kuluçka) hazırlayın.
4. WT ve iGATA4-ESC'leri aspirasyon ortamı ile ve her kuyu başına 500 μL hücre dissosiyasyon reaktifi ekleyerek hasat edin. 37 °C'de 3 dakika kuluçka yapın. 2 mL FC orta ve nazikçe pipet ekleyin. Mikroskop altında tam ayrılmayı doğrulayın. 15 mL'lik bir tüpe aktarın ve 500 × g'de 4 dakika boyunca santrifüj yapın.
5. 1 mL FCYL ortamında yeniden süzülür. Hücre konsantrasyonu 10 μL kullanılarak hemositometre ile belirlenir. 500.000–700.000 hücre/mL arasında ayarlayın. Mikro kuyu başına 5 WT ESC ve 5 iGATA4-ESC için gereken hacmi hesaplayın (kuyu başına 6.000 hücre).
  NOT: Gerekirse diğer ESC hatları için optimize edin. Başlangıç aralığı, mikro kuyuda 4–7 ESC ile 1:1 oranında ESC'ler iGATA4-ESC'ler arasında değişir.
6. Her kuyu başına 500 μL hücre süspansiyonu hazırlayın. 1000 μL pipet kullanarak Microwell toplama plakasına damla olarak ekleyin. 100 × g'de 3 dakika boyunca santrifüj yapın ve eşit dağılımı doğrulayın. 6 saat kuluçka yapın, agregalar oluşana kadar.
7. Bölüm 1.2'de açıklandığı gibi kalan ESC'lerin geçişi.
Blastoid hazırlığı, 0. gün — TX ortamının hazırlanması
1. DMEM/F12 kullanarak ~20 mL TX bazal ortam hazırlayın (Tablo 2). Her deney için taze hazırlanın.
  1. 200 μL 200 mM L-alanil-L-glutamin takviyesi ekle (son 2 mM). Stokları 4 °C'de sakla.
  2. 200 μL 10.000 U/mL penisilin / streptomisin ekleyin (son 100 U/mL her biri). −20 °C'de depolayın.
  3. 40 μL 32 mg/mL L-askorbin asit (son 64 μg/mL) ekleyin. DI suyla hazırlayın, filtreleyin, sterilize edin ve −20 °C'de saklayın.
  4. 20 μL sodyum selenit ekleyin (son 14 ng/mL). Hazırlık yapın ve −20 °C'de saklayın.
  5. 240 μL NaHCO₃ ekle (son 543 μg/mL). Çözüldükten sonra iyice karıştırın.
  6. 20 μL holo-transferrin ekleyin (son 10,7 μg/mL). Çözüldükten sonra karıştırın.
  7. ~37,5 μL insülin ekleyin (son 19,4 μg/mL; partiye bağlı). 4 °C'de depolayın.
2. Kullanımdan hemen önce, Y27632'yi 20 μM'ye, CHIR99021'yi 3 μM'ye, IL-11'i 30 ng/mL'ye, FGF4'ü 25 ng/mL'ye, heparini 1 μg/mL'ye, mLIF 10 ng/mL'ye, TGFβ'yu 15 ng/mL'ye ve 8Br-cAMP'yi 25 μM'ye ekleyin.
Blastoid hazırlığı, 0. gün — TSC'lerin hazırlanması ve kaplaması
1. Önceden ısınmış TSF4H, FC (Tablo 1) ve TX ortamı (Bölüm 2.3). MEF tükenmesi için jelatin kaplı plakalar (≥45 dakika) hazırlayın.
2. TSC'leri kuyuya 500 μL hücre dissosiyasyon reaktifi ekleyerek ve hipokside 5 dakika kuluçka geçirerek hasat edin. 2 mL FC orta ve nazikçe pipet ekleyin. Ayrılmayı onaylayın. Bir tüpe aktarın ve 500 × g 4 dakika boyunca santrifüj yapın.
  NOT: >4 gün kültürlenen TSC'ler, 10 dakikaya kadar hücre ayrışma reaktif tedavisi gerektirebilir.
3. 1 mL TSF4H ortamda tekrar süsleyin ve kaplama için uygun hacme göre 1:2 bölünmede ayarlayın.
4. MEF tükenmesi için jelatin kaplı kuyulara plaka ekleyin. Hipokside ~45 dakika kuluçka yapın. MEF'lerin bağlandığından emin olun, TSC'ler ise çoğunlukla bağlı kalmamaktadır.
5. Mikrokuyu toplama plaka kuyularından alınan 900 μL ortamı 500 μL TX ortamı ile değiştirin. Hipoksiye geri dön.
6. TSC içeren süpernatantı bağlı MEF'leri rahatsız etmeden bir tüpe aktarın. Konsantrasyonu belirleyin (hedef: 500.000–700.000 hücre/mL).
7. Mikro kuyu başına 12 TSC (kuyu başına 14.400 hücre) hacmi hesaplayın. Daha fazla konsantrasyon gerekirse santrifüj yapın.
  NOT: Diğer TSC hatları için optimize edin (mikro kuyu başına 10–15 hücre önerilir).
8. Her kuyu için 500 μL hücre süspansiyonu drop-down ile ekleyin. Santrifüj 100 × g'de 3 dakika boyunca pişirin. Dağılımı onaylayın ve 24 saat boyunca hipokside kuluçka yapın.
9. Kalan TSC'lerin gerektiğinde geçişi (Bölüm 1.3).
Blastoid hazırlığı, 1. gün — İndüksiyon
1. TSC eklendikten yaklaşık 24 saat sonra, her kuyu başına 20 μL 5 mM 8Br-cAMP ve 1 μL 1 μg/mL DOX ekleyin. Hipokside 48–72 saat kuluçka yapın.
Blastoid hazırlığı, 3. gün — Fiksasyon
1. Agregaları kesilmiş 1000 μL pipet ucu kullanarak yeniden askıya alın. 2 mL'lik tüplere aktarın ve 5 dakika boyunca tortulmaya izin verin.
2. Süpernatantı çıkarın ve %4 paraformaldehit (PFA) 250 μL ekleyin. Nazikçe geri çek.
  DIKKAT: PFA'yı uygun PPE'lerle bir duman davlumbasında kullanın.
3. 15 dakika kuluçka yapın, her 5 dakikada bir çevirin.
4. PFA çıkarın ve 300 μL PBST (PBS + %0,1 Tween-20) ekleyin. Nazikçe karıştır. Boyamadan önce 4 °C'de <1 hafta boyunca saklayın.
Blastoidlerin immünoflüoresansı
1. Her örnek için 150 μL 96 kuyuyla U-bottom plakasına aktarın.
2. 100 μL permeabilizasyon tamponu ekleyin ve 20 dakika kuluçka yapın. Birincil antikor çözeltisi ile değiştirin ve gece boyunca 4 °C'de inkübe edin.
3. 3× PBST ile yıkayın (her biri 5 dakika). İkincil antikorlar ekleyin.
4. Oda sıcaklığında karanlıkta 2 saat kuluçka yapın.
5. 3× yıkayın ve görüntüleme kabına aktarın.
6. Konfokal mikroskopi kullanılarak görüntü (≥25× objektif, NA ≥0.8).

3. iGATA4-blastoid modeli kullanılarak yüksek geçirimli ekranlar

iGATA4-blastoid hazırlanma ve çevresel faktörlerin test edilmesi
1. Bölüm 2.1'de açıklandığı gibi Mikrokuyu toplama plakasını hazırlayın ve 2.2–2.4 Bölümlerine göre iGATA4-blastoidler üretin. Yeterli kuyu hazırla, uygun kontroller dahil. Standart protokolle hazırlanmış boş kontrol (blastoidler), taşıyıcı kontrolü ve bir veya daha fazla deneysel koşul ekleyin.
2. Blastoidleri gece boyunca hipokside kuluçka edin. TSC tohumlamasından yaklaşık 24 saat sonra, 8Br-cAMP, doksisiklin (DOX) ve ilgilenilen bileşik (veya taşıyıcı kontrol) ile takviye edilmiş TX ortamı hazırlanır. Aşağıdaki koşullar test edilmiştir:
  1. Kafein: 3.5 mg/L, ultra saf su stoklarından seyreltilmiş.
  2. Nikotin: 330 ng/L, %100 etanol (EtOH) stoklarından seyreltilmiş.
  3. Etanol: 17 mM, mutlak EtOH'dan seyreltilmiş.
  4. Yüksek dallanmış zincirli amino asitler (BCAA): +%5, +25%, +%50, temel konsantrasyonlara (0,45 mM L-lösin, 0,45 mM L-valin, 0,42 mM L-izoleusin), ultra saf suda yoğun stoklardan hazırlanmıştır.
  5. Düşük metyonin ve lösin: −5%, −25%, −%50, −%100, temel konsantrasyonlara göre %100 (0,12 mM L-metionin, 0,45 mM L-lösin), Met/Leu-free DMEM/F12 kullanılarak hazırlanmıştır. Met/Leu-içermeyen DMEM (LM-DMEM) kullanımdan önce 1x Ham's F-12 Besin Karışımı ile takviye edilir.
    DIKKAT: Konsantre kafein ve nikotin stoklarını uygun kişisel koruyucu ekipmanlarla (PPE; eldiven, laboratuvar önlüğü, göz koruması) bir buhar davlumbazında hazırlayın ve işleyin. Etanol yanıcıdır ve ısı kaynaklarından uzak tutulmalıdır.
3. Her kuyidan ortamı aspire edin ve 1 mL bileşik içeren TX ortamı ekleyin. Kurumayı önlemek için birer tek bir işleyin. Plakayı hipoksi kuluçka makinesine geri götürün ve 3. güne kadar kültürleyin.
4. 3. gün iletim ışık mikroskobu kullanarak temsilci parlak alan görüntüleri yakalayın. Yapıları sabitleyin ve 2.6 ve 2.7. bölümlerde açıklandığı gibi immünoflüoresansı gerçekleştirin.
  NOT: Deneme hedefine göre tedavi pencerelerini ayarlayın. Tedaviler erken agregasyon (1. gün) veya sonraki aşamalarda (örneğin çürük genişleme) uygulanabilir. Örnek pencereler arasında 1–3. gün, 1–2. gün (ardından medya değişimi) ve 2–3. gün bulunur.
Çok parametrik iGATA4-blastoid analizi
1. Parlak alan görüntülerini kullanarak kavitasyonlu yapıların (yani net tanımlanmış merkezi boşluğa sahip yapılar) kuyunun yüzdesini nicelikle ölçün ve blastoid çapını ölçün.
  1. Görsel analiz yazılımında görüntüleri açın.
  2. Her yapının üzerinden bir çizgi çizmek için düz çizgi aracını kullanın.
  3. Çapı Analyze > Measure ile ölçün.
2. Temsil eden immünboyalı örnekler (biyolojik replikasyon başına 20–40 yapı, her koşul başına en az üç biyolojik replika) ve Bölüm 2.7'de açıklandığı şekilde görüntü seçin.
3. İmmünofluoresans belirteçleri kullanılarak toplam hücre sayısı ve soy bileşimi nicelendirilin: TE (CDX2-pozitif), EPI (SOX2-pozitif ve SOX17-negatif) ve PE (SOX17-pozitif).
4. PE hücrelerinin iç hücre kütlesi (ICM) içinde EPI hücrelerinden mekânsal olarak ayrılıp ayrılmadığını belirleyerek yapısal organizasyon ve morfolojiyi değerlendirin (ikili sınıflandırma: evet/hayır).
5. Morfolojiyi iyi (belirgin bir boşluğa sahip ve düzgün organize edilmiş TE, EPI ve PE bölmeleri olan net blastosist benzeri yapı), vasat (düzensiz şekil veya kısmen oluşmuş çürük gibi küçük anormallikler) veya kötü (çürüğün olmaması veya düzensiz/sıralanmamış soylar gibi büyük anormallikler) olarak sınıflandırın.
6. Gerekirse boşluk boyutu veya hacmi dahil olmak üzere ek parametreleri nicelikle ölçemek. Biyobilişim araçları veya grafik ve istatistiksel analiz için diğer araçları ve hücre sayımı ve/veya görüntüleme için görüntü hazırlamak için 3D görüntü analiz yazılımı kullanın.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ESC'lerin ve iGATA4-ESC'lerin (normoksi) ve TSC'lerin (hipoksi) uygun kültür koşullarında korunması, başarılı blastoid üretimi için gereklidir. Tanımlandığı gibi kültürlendiğinde, ESC'ler ve iGATA4-ESC'ler büyük ölçüde ayırt edilemez olmalı, 3 gün sonra orta büyüklükte, yuvarlak ve iyi tanımlanmış koloniler oluşturmalıdır. Yasılmış kolonilerin veya çıkıntılı kenarların ortaya çıkışı, yeni bir farklılaşmanın işaretidir ve bu tür kültürler blastoid oluşumu için kullanılmamalıdır. TSC'ler, hafifçe yükseltilmiş kenarlara ve daha düz merkezlere sahip düz epitel kolonileri oluşturmalıdır. Aşırı büyümüş veya birleşen TSC kolonileri (genellikle kültürde >3 gün sonra) genellikle kötü blastoid sonuçlarına yol açar (Şekil 1).

iGATA4-blastoid montajı sırasında, protokolün başarısını gösteren birkaç erken özellik vardır (Şekil 2A, B). ESC ve iGATA4-ESC toplamasından yaklaşık 6 saat sonra, mikro kuyrukların alt kısmında sıkı hücre agregaları görünür olmalıdır. Gevşek agregalar, hücre-hücre yapışmasını azaltan aşırı hücre dissosiyasyon reaktüsü maruziyetini gösterir. Bir sonraki adıma ilerleme (TSC ekleme; Bölüm 2.4) ancak sıkı toplamlar gözlemlendiğinde gerçekleşmelidir (Şekil 2B, D0.5 zaman noktası). Bu aşamada immünboyama işlemlerinde homojen SOX2⁺ ve GATA4⁻ agregaları gösterilmelidir (Şekil 2B, D0.5 zaman noktası).

TSC eklemesi ve gece kuluçkasından sonra, CDX2⁺ hücreleriyle çevrili tek bir koheziv agregat belirgin olmalıdır (Şekil 2B). Agregaların yüzeyinde büyük, toplanmamış hücrelerin varlığı genellikle kalıntı MEF'leri gösterir. MEF kirlenmesi, blastoid oluşum etkinliğini azaltabilir; bu nedenle, ağırlıklı olarak TSC popülasyonu elde etmek için yeterli MEF azalması, toplanmadan önce kritik öneme sahiptir. 40 μm'lik bir hücre süzgeçi, kalıntı MEF'leri çıkarmak için kullanılabilir, ancak bu TSC verimini azaltabilir. Eksik veya aşırı CDX2⁺ kapsaması, mikro kuyu başına eklenen TSC sayısının ayarlanmasıyla düzeltilebilir (önerilen aralık: 10–15).

DOX ve 8Br-cAMP eklendikten sonra, çürükler genellikle 2. güne kadar gözlemlenir ve 3. güne kadar devam edebilir. Parlak alan mikroskopisinde, boşluklar blastoidler içinde berrak, boş alanlar olarak görülür (Şekil 2B, C; beyaz kesik çizgi). GATA4⁺ hücreleri, DOX indüksiyonundan kısa süre sonra ortaya çıkar ve ICM benzeri bölmenin yüzeyine kademeli olarak sıralanır (Şekil 2B). Başarılı blastoid oluşumu, yüksek kavitasyon verimliliğiyle karakterizedir (genellikle Microwell toplama plakası başına yapıların ~%80'i; Şekil 2D), tek katmanlı CDX2⁺ TE-benzeri dış epitel, blastocoel benzeri bir boşluk ve GATA4⁺ PE benzeri hücrelerin üzerine SOX2⁺ EPI benzeri hücrelerin yer aldığı yuvarlak ICM benzeri bir bölme (Şekil 2C–E).

Yaygın optimal olmayan sonuçlar arasında kavitasyonsuz yapılar, düzensiz şekilli blastoidler, çoklu boşluklar veya ICM benzeri bölmeler ve az sayıda yapı veya hücresel kalıntı içeren kuyular bulunur. Yaklaşık %20 anormal yapı bekleniyor (Şekil 2C), yüksek oranlar yanlış TX ortam preparatı, düşük başlangıç hücre kalitesi, 1. günde DOX veya 8Br-cAMP eklenmemesi veya ortam değişiklikleri sırasında yapıların yer değiştirmesi gibi sorunlara işaret edebilir.

Yüksek verimli tarama uygulamaları için, işlememiş ve araç kontrol kuyuları pozitif kontrol koşullarına benzer blastoidler vermelidir (Şekil 3A,B). Deneysel tedaviler, blastoid boyutu (Şekil 3C), kavitasyon verimliliği, toplam ve soy-soyun spesifik hücre sayıları (Şekil 3D), PE sıralaması ve genel morfoloji (Şekil 3E) dahil olmak üzere birden fazla kalite ölçütünü etkileyebilir. Örneğin, blastoid oluşumu sırasında kafein, nikotin veya etanol ile yapılan işlem, daha küçük yapılar, azalan kavitasyon etkinliği, daha düşük toplam veya ICM hücre sayısı, PE ayırtmasının bozulması ve daha kötü morfolojiye yol açtı. Buna karşılık, dallanmış zincirli amino asitlerin artan konsantrasyonları, hücre sayısını artmış ve morfolojisi geliştirmiş daha büyük, daha yüksek kavitasyonlu blastoidler üretmiştir (Şekil 3C–E). Deneyler arasında biyolojik değişkenlik beklenmektedir; bu da her deneyde hem boş hem de taşıyıcı kontrollerin dahil edilmesinin önemini vurgular.

figure-results-1
Şekil 1: İyi ve düşük kaliteli WT ESC'leri, iGATA4-ESC'ler ve TSC örnekleri. WT ESC, iGATA4-ESC ve TSC'lerin parlak alan mikrografları, N2B27/2i/LIF (ESCler) veya TSF4H ortamında (TSCler) 2–3 günlük kültür sonrası beklenen koloni morfolojilerini göstermektedir. "WT ESC'ler – kötü kalite" başlıklı panel, kenarları çıkıntılı yassı koloniler (kırmızı ok uçları) dahil olmak üzere optimal olmayan morfolojiye sahip hücreleri gösteriyor. "TSC aşırı büyümüş" paneli, 4 günlük kültür sonrası birleşmiş ve büyümüş TSC kolonilerini gösteriyor. Ölçek çubuğu: Tüm paneller için 100 μm. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-2
Şekil 2: iGATA4-blastoidlerin şematik ve beklenen morfolojisi. Developmental Cell, Cilt 61, Jorgensen V, Bao M, Junyent S ve diğerleri, Çevresel çalışmalar için verimli kök hücre kaynaklı fare embriyo modelleri, s. 193–207.e6, Telif Hakkı (2025)³, Elsevier'in izniyle. (A) WT ESC, iGATA4-ESC ve TSC'ler kullanılarak doğal fare blastosist gelişiminin şematik temsili (üstte) ve kök hücre tabanlı blastosist modellemesi.
(B) Protokolün farklı aşamalarında beklenen morfoloji ve işaretleyici ifadesini gösteren mikrograflar. Maksimum yoğunluk projeksiyonu (MIP); kesik çizgiler boşluğu belirler. Ölçek çubuğu: 20 μm. (C) 3. günde iGATA4-blastoidlerin parlak alan görüntüsü. Ölçek çubuğu: 100 μm.
(D) Normoksi veya hipokside önceden kültürlenmiş TSC'ler kullanılarak üretilen iGATA4-blastoidlerin kavitasyon oranları; agregalar hipoksik koşullarda kültürlendi. n ≥ 4; hata çubukları, ortalamanın standart hatasını temsil eder. (E) E4.5 blastosistlerinin ve 3. gün iGATA4-blastoidlerinin soy belirteçleri (CDX2, sian; OCT4, kırmızı; GATA4, yeşil). Maksimum yoğunluk projeksiyonu (MIP); gösterilen yerde tek bir Z-düzlemi gösterilmiştir. Ölçek çubuğu: 25 μm. Bu figürün daha büyük versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-3
Şekil 3. Çevresel faktörlerin blastoid oluşumu ve kalitesi üzerindeki etkileri. (A) Çevresel faktörlerle (kafein, nikotin, etanol ve yüksek ve düşük proteinli diyetleri taklit eden durumlar) işlenmiş iGATA4-blastoidlerin temsil immünoflüoresans 3D görüntüleri (üstte) ve IMARIS yüzey rekonstrüksiyonları (altta). Ölçek çubukları: Tüm görüntüler için 25 μm. (B) Deneysel iş akışının şeması. (C) Farklı tedavi koşullarında blastoid çapı. Bu aralık 10.–90. perdelik aralığı temsil eder; kutular çeyreklerarası aralığı gösterir; çizgi medianı gösterir. İstatistiksel analiz, tek yönlü ANOVA kullanılarak ve çoklu karşılaştırmalar yapıldı. (D) Kontrol ve tedavi edilen blastoidlerde toplam (gri), trofektoderm (siyani), epiblast (kırmızı) ve ilkel endoderm (yeşil) hücre sayılarının nicelendirilmesi. Çubuklar ortalamayı temsil eder; hata çubukları standart sapmayı temsil eder. İstatistiksel analiz, tek yönlü ANOVA kullanılarak ve çoklu karşılaştırmalar yapıldı. (E) Kontrol ve tedavi koşullarında "iyi" (minimum morfolojik anormallikle doğru soy sıralaması), "vasat" (büyük ölçüde doğru morfoloji, eksik EPI–PE sıralaması dahil, küçük anormallikler içeren) veya "kötü" (ciddi anormal morfoloji, soy organizasyonu bozulmuş bir şekilde bozuk morfoloji) olarak sınıflandırılan oranın nicelendirilmesi. İstatistiksel analiz, kontrol koşullarına göre iki yönlü ANOVA kullanılarak gerçekleştirildi. Tüm paneller için n ≥ 3. İstatistiksel önemlilik *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001 olarak gösterilir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Medya	Reaktif	Son yoğunlaşma
FC
	DMEM	N.A.
	Isı inaktive edilmiş FBS (iFBS)	15%
	GlutaMax	2 mM
	2-Merkaptoetanol (2-ME)	0.1 mM
	Temel olmayan amino asitler (NEAA)	1x
	Na Pyruvate	1x
	Penisillin–Streptomisin	1x
N2B27/2i/LIF
	DMEM/F12	50%
	Nörobazal A	50%
	B27 takviyesi	1x
	N2 takviyesi	0.5x
	2-ME	100 μM
	Penisillin–Streptomisin	1%
	GlutaMax	2 mM
	PD0325901	1 μM
	CHIR99021	3 μM
	Fare rekombinant LIF	10 ng/mL
TSF4H
	Megacell RPMI-1640 Medium	N.A.
	iFBS	20%
	GlutaMax	2 mM
	Na Pyruvate	1x
	Penisillin–Streptomisin	1x
	FGF4	25 ng/mL
	Heparin	1 μg/mL

Tablo 1: FC, N2B27/2i/LIF ve TSF4H için medya tarifleri. FC ortamı, N2B27/2i/LIF ortamı ve TSF4H ortamı hazırlamak için tarifler, nihai konsantrasyonlarla.

Bileşen	Son yoğunlaşma	Stok yoğunluğu	Çözücü ve depolama	Hacim ~20 mL'ye kadar
8Br-cAMP	25 μM	5 mM	PBS, -20 °C'de depolayın	100 μL
CHIR99021	3 μM	10 mM	DMSO, -20 °C'de depolayın	6 μL
DMEM/F12	Yok	Yok	4 °C'de depolayın	20 mL
FGF4	25 ng/mL	100 μg/mL	PBS'de %0,1 BSA, -20 °C'de saklan	5 μL
L-alanil-L-glutamin Takviyesi	2 mM	200 mM	4 °C'de depolayın	200 μL
Heparin	1 μg/mL	1 mg/mL	PBS, -20 °C'de depolayın	20 μL
Holo-transferrin	10.7 μg/mL	10,7 mg/mL	DI suyu, -20 °C'de depolayın	20 μL
İnsan TGF-β1	15 ng/mL	20 μg/mL	4 mM HCl + %0,1 BSA, -20 °C'de depolayın	15 μL
IL-11	30 ng/mL	25 μg/mL	PBS'de %0,1 BSA, -20 °C'de saklan	24 μL
İnsülin	19.4 μg/mL	9.5 - 11.5 mg/mL	Konsantrasyon partiye bağlıdır, 4 °C'de saklanır	33.7–40.8 μL, stok konsantrasyonuna göre hacmi ayarlayın.
L-askorbin asit-2-fosfat magnezyum	64 μg/mL	32 mg/mL	DI suyu, -20 °C'de depolayın	40 μL
Fare rekombinant LIF	10 ng/mL	10 μg/mL	PBS + %0,1 BSA, -20 °C'de sakla	20 μL
NaHCO₃	543 μg/mL	45,25 mg/mL	DI suyu, -20 °C'de depolayın	240 μL
Penisilin/Streptomisin	1x	100x	-20 °C'de depo yapın	200 μL
Sodyum selenit	14 ng/mL	14 μg/mL	DI suyu, -20 °C'de depolayın	20 μL
Y27632	20 μM	20 mM	DMSO, -20 °C'de depolayın	20 μL

Tablo 2: TX için medya tarifi. TX ortamı hazırlamak için tarif, küçük moleküllerin ve diğer reaktiflerin nasıl hazırlanacağı ve saklanacağı ile nihai konsantrasyonlarla birlikte.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

iGATA4-blastoidler, fare blastosistinin son derece verimli, embriyo benzeri, kök hücre tabanlı bir modelini sağlar; üç in vitro kültürlü hücre tipini kendiliğinden organize ederek: ESC'ler, indüklenebilir GATA4-ESC'ler (iGATA4-ESC) ve hipoksi kültürlü TSC'ler. Bu yapılar, uygun soy oranları ve transkripsiyonel kimlik dahil olmak üzere E4.5 blastosistinin temel özelliklerini özetler ve çok parametrik çevresel tarama için kullanılabilir; blastosist evresi gelişimsel kusurlarını güvenilir şekilde^{yansıtır 3}. Yakın zamanda yapılan bir çalışma, bazal blastoid ortamında ESC'ler, iGATA4-ESC ve TSC'lerin toplanmasının yüksek verimli blastoid oluşumu da sağladığını göstermekte; bu da bu yaklaşımın laboratuvarlar ve kültür koşulları arasında dayanıklılığını ve uyum sağlamlığını^{vurgulamaktadır 39}. iGATA4-ESC'lerin, implantasyon sonrası kök hücre bazlı embriyo modellerinde VE hücrelerinin işlevlerini^{özetlediği daha önce gösterilmiştir} 28,29,30,31. Bu sonuçlar birlikte, iGATA4-ESC'lerin kök hücre tabanlı embriyo modellemesinde gelişim aşamalarında PE/VE hücreleri için esnek ve güvenilir yedek olarak nasıl hizmet edebileceğini göstermektedir.

Protokoldeki birkaç adım, yüksek kaliteli blastoidler elde etmek için kritiktir. Bunlar arasında başlangıç hücre popülasyonlarının, özellikle hipoksi kültürlü TSC'lerin kalitesi (Şekil 1); TX ortamının hazırlanması, ki bu gün 0. günde taze hazırlanmalıdır (Tablo 2; Bölüm 2.3); ve toplama sonrası plakaların dikkatli şekilde ele alınması. Protokol başarısının temel okumaları arasında kavitasyon verimliliği (genellikle ~80%), uygun morfoloji (~100 μm çapında, blastocoel benzeri boşluğa sahip yapılar, CDX2⁺ TE-benzeri dış katman ve yaklaşık 3 TE:1 EPI:1 PE oranına sahip sıralanmış SOX2⁺ ve GATA4⁺ iç hücre kütlesi) ve doğru şekilde sıralanmış GATA4⁺ PE benzeri tabakanın varlığı yer alır. Bunlar, 1,2,4,5 alanlarında yaygın olarak kullanılan metriklerdir. Kavitasyonlu blastoidler arasında, yapıların yaklaşık %75'i bu özelliklerin tamamını gösterir. Bu metrikler, sorun giderme için ilk göstergeler olarak kullanılabilir. Optimal olmayan hücre kalitesi genellikle anormal koloni morfolojisinde yansır ve kötü agregasyona veya kavitasyona uğramamış yapılara yol açar. Yanlış ortam hazırlanması, eksik toplama veya soy hattlarına yol açabilirken, kaba işleme mikro kuyu veya boş kuyular başına birden fazla agrega çıkabilir.

Daha fazla optimizasyon, tohumlanmış hücre sayısının ayarlanmasını (önerilen başlangıç aralıkları: 4–7 ESC ve iGATA4-ESC, mikro kuyu başına 10–15 TSC), MEF tüketme yöntemlerinin iyileştirilmesini (örneğin, 40 μm hücre süzgeciyle filtreleme) ve TX ortam bileşiminin değiştirilmesini içerebilir. Örneğin, FGF4 ve heparinin çıkarılması, verimli blastoid oluşumunu desteklerken daha duvar TE'si benzeri bir kimlik teşvik edebilir. iGATA4-blastoidler kültürde 6 güne kadar saklanabilir; ancak 4–6. günlerdeki yapılar genellikle büyürken soyun blastosist benzeri oranlarını korur. Protokol, biyolojik kopyalar arasında tutarlı sonuçlar verir, ancak her deneyde uygun kontroller dahil edilmelidir.

Başlangıç hücre popülasyonları ve kültür koşulları açısından değişen diğer fare blastoid^{sistemleriyle karşılaştırıldığında,} 6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20 , iGATA4-blastoidler hem yüksek oluşum verimliliği hem de doğru soy temsili sağlar. Mevcut birçok protokol kavitasyonlu yapılar üretir ve belirli biyolojik uygulamalar için değerli olsa da, genellikle eksik PE oluşumu, heterojen veya tanımlanmamış hücre kimlikleri veya yanlış soy oranları gösterirler. Üç soy yönümlü kök hücre popülasyonunu adım adım birleştirerek, iGATA4-blastoidler bu sınırlamaları aşar ve tekrarlanabilir, modüler ve deneysel olarak erişilebilir bir sistem sağlar.

Bu avantajlara rağmen, birkaç sınırlama hâlâ mevcuttur. TX ortamında 4–6 günden fazla uzatılmış in vitro kültür, hatta soy oranları blastosist benzeri kalında bile aşırı büyümeye yol açar. iGATA4-blastoidlerin yaklaşık %12,5'i, pro-amniyotik boşluğu çevreleyen fincan şeklinde, psödotabakalı epiblast, proksimal epiblasta bitişik genişlemiş embriyonik ektoderm benzeri bir bölme ve dış visseral endoderm benzeri tabaka ile karakterize edilen peri-implantasyon benzeri morfolojilere in vitro geçiş yapar. Ancak, iGATA4-blastoidler yerleşemez ve konak faresine aktarıldıktan sonra daha da gelişir. Bu nedenle, iGATA4-blastoidler ve daha geniş anlamda blastoidler, implantasyon veya embriyo-anne etkileşimlerini incelemek için uygun değildir.

Blastoidlerin implantasyon başarısızlığının moleküler temeli belirsizdir, ancak mevcut kanıtlar eksik trofektoderm modellemesinin katkıda bulunabileceğini göstermektedir. iGATA4-blastoidlerdeki TE-benzeri hücreler aşırı polar moleküler bir kimlik sergiler. Duvar TE hücrelerine daha çok benzeyen TSC'ler tasarlama veya implantasyon yetkinliğine uygun TE'yi daha iyi tekrarlayan alternatif hücre hatları tanıtma girişimleri, bu sınırlamaların aşılması için umut verici yönleri temsil ediyor. iGATA4-blastoidlerin modüler doğası, TE-spesifik modifikasyonların EPI ve PE oluşumundan bağımsız olarak uygulanabilmesi, bu sistemi bu tür gelişmeler için özellikle uygun kılar.

Bir arada ele alındığında, iGATA4-blastoid protokolü, memeli embriyosunda soy spesifikasyonları ve erken gelişim süreçlerini incelemek için sağlam ve ölçeklenebilir bir platform sağlar. Tekrarlanabilirliği ve uyum sağlama yeteneği, yüksek verimli çevresel analiz, farmakolojik ve genetik tarama uygulamaları için oldukça uygun hale getirir. Bu nedenle, iGATA4-blastoidler, erken gelişim mekanizmalarını araştırmak ve çeşitli bozulmaların implantasyon öncesi gelişimi nasıl etkilediğini değerlendirmek için güçlü bir sistemdir.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar rekabet eden çıkarlar belirtmemektedir.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, iGATA4-blastoidlerin geliştirilmesi ve geliştirilmesindeki yardımları için Christoph Häfelfinger, Victoria Jorgensen, Min Bao, Lenja Fluetsch ve Zernicka-Goetz laboratuvarı üyelerine teşekkür ediyor. Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüsü Direktörünün Öncü Ödülü (5DP1HD104575-04 to M.Z.-G.), Açık Hayırseverlik Ödülü (M.Z.-G.), Human Frontiers Science Program (LT-0022/2022 to S.J.), NSFC (82301873 M.B.), Çin Bilim ve Teknoloji Bakanlığı (2024YFA1107002'den M.B.'ye), İsviçre Çalışma Vakfı (C.M.H.), tarafından desteklendi. Werenfels Fonu, Serbest Akademik Derneği'nin (Freie Akademische Gesellschaft), Basel (C.M.H.) ve Claudine ve Hans-Heiner Zaeslin-Bustany Vakfı (C.M.H.).

Materials

List of materials used in this article
Name	Company	Catalog Number	Comments
2-Mercaptoethanol	Thermo Fisher Scientific	31350010	Genel ortam hazırlamada kullanılır
8-Bromo-cAMP	STEMCELL Technologies	73602	TX ortamı hazırlamada ve blastoid kavitasyonunda kullanılır
AggreWell400	STEMCELL Technologies	34415	Mikro kuyuluk agregasyon plakası; Blastoid hazırlamada kullanılır
Anti-Adherence Rinsing Solution	STEMCELL Technologies	7010	Blastoid hazırlamada kullanılır
ART Wide Bore Filtered Pipette Tips	Thermo Fisher Scientific	2079GPK	Blastoid hareketi sırasında immün boyama için geniş gövdeli pipetler.
B27 Supplement	Thermo Fisher Scientific	17504044	Ortam hazırlamada kullanılır
Kafein	Sigma	58-08-2	iGATA4-blastoidlerde test için çevresel faktör olarak kullanılır
CDX2 antikoru, fare	Biogenex	MU392A5UC	İmmünfloresan için, 1:200 oranında kullanılır
CellXpert (normoksik inkübatör)	Eppendorf	6731010015	Diğer markalar/modeller de çalışabilir.
CHIR99021	STEMCELL Technologies	72054	Ortam hazırlamada kullanılır
Countess Hücre Sayımı Odası slaytları	Invitrogen	C10228	Genel doku kültürü amaçları için kullanılır
DAPI	Thermo Fisher Scientific	D1306	İmmünfloresan için, 1:500-1:1,000 oranında kullanılır
DMEM	Gibco	11995040	FC ortamı hazırlamada kullanılır
DMEM/F12	Thermo Fisher Scientific	21331-020	N2B27 ve TX ortamı hazırlamada kullanılır
DMEM-LM	Thermo Fisher Scientific	30030	DMEM-LM'yi Ham's F-12 Besin Karışımı tozu ile 1x'lik son konsantrasyona kadar takviye edin, Met- ve Leu-süz DMEM/F12 elde etmek için
Donkey anti-Keçi IgG (H+L) Çapraz Adsorbe Oluşturulan İkincil Antikoru, Alexa Fluor 488	Invitrogen	A-11055	İmmünfloresan için, 1:500-1:1,000 oranında kullanılır
Donkey anti-Fare IgG (H+L) Yüksek Derecede Çapraz Adsorbe Oluşturulan İkincil Antikoru, Alexa Fluor™ 647	Invitrogen	A-31571	İmmünfloresan için, 1:500-1:1,000 oranında kullanılır
Donkey anti-Tavşan IgG (H+L) Yüksek Derecede Çapraz Adsorbe Oluşturulan İkincil Antikoru, Alexa Fluor™ 568	Invitrogen	A10042	İmmünfloresan için, 1:500-1:1,000 oranında kullanılır
Donkey anti-Sıçan IgG (H+L) Yüksek Derecede Çapraz Adsorbe Oluşturulan İkincil Antikoru, Alexa Fluor 647	Invitrogen	A78947	İmmünfloresan için, 1:500-1:1,000 oranında kullanılır
Donkey Serum	Jackson ImmunoResearch	017-000-121	İmmünfloresan için. 4°C'de çözülür ve -20°C'de alikot halinde saklanır.
Doksiksiklin	Sigma	D9891-5G	Blastoid hazırlaması sırasında iGATA4 indüksiyonu için
Eppendorf Santrifüj 5702	Eppendorf	5702	Laboratuvarımızda kullanılır, diğerleri de çalışabilir. Tüp ve plaka adaptörleri gerekir.
Falcon 96 kuyuluk Şeffaf Yuvarlak Tabanlı İşlemsiz Mikroplaka, Kapaklı, Tek Tek Sarmalı	Corning	351177	İmmünfloresan için kullanılır
FGF4	R&D Systems	5846-F4	Ortam hazırlamada kullanılır
Fiji	Schindelin ve diğ., 2012	https://imagej.net/Fiji	Görüntü analizi için kullanılır
GATA4 antikoru, tavşan	Cell Signalling	36966S	İmmünfloresan için, 1:500 oranında kullanılır
Jelatin çözeltisi, %2	Sigma	G1393	Genel doku kültürü amaçları için kullanılır
Cam Tabanlı Tabaka 35 mm	Ibidi	81218-200	İmmünfloresan ve görüntüleme için
GlutaMAX	Thermo Fisher Scientific	35050-061	L-alanil-L-glutamin takviyesi; Ortam hazırlamada kullanılır
Ham's F-12 Besin Karışımı tozu	Thermo Fisher Scientific	21700075	DMEM-LM için takviye olarak, düşük protein diyeti koşullarında kullanılır.
Heparin	Sigma	H3149	Ortam hazırlamada kullanılır
Heracell VIOS 160i (hipoksi inkübatörü)	Thermo Fisher Scientific	51030400	Diğer markalar/modeller de çalışabilir.
Holo-transferrin	Sigma	T4132	TX ortamı hazırlamada kullanılır.
İnsan rekombinant TGF-ß1	PeproTech	100-21	TX ortamı hazırlamada kullanılır.
IL-11	PeproTech	200-11	TX ortamı hazırlamada kullanılır.
Imaris	Oxford Instruments	https://imaris.oxinst.com/	Görüntü analizi ve görüntü hazırlaması için kullanılır.
İnaktif Fetal Boğa Serumu	Corning	35-010-CV	Ortam hazırlamada kullanılır
İndüklenebilir GATA4 ESC'ler (tetO-GATA4-ESC'ler)	Amadei ve diğ., 2021	NA	Zernicka-Goetz laboratuvarından istek üzerine

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Çevresel Çalışmalar İçin Etkili Kök Hücre Türemli Fare Blastosist Modelleri İnşap Etmek

In This Article

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgements

Materials

Reprints and Permissions

Tags

Related Articles