DSS Kaynaklı Ülseratif Kolit Farelerinde Entegre Ağ Farmakolojisi, Metabolomik ve Liangxue Dihuang Karışımının in vivo Doğrulaması

Özet

Bu protokol, ağ farmakolojisi, hedefsiz metabolomik ve in vivo doğrulamayı entegre eden tekrarlanabilir bir iş akışını tanımlar; böylece ülseratif kolitin dekstran sülfat sodyumla indüklenen fare modelinde Liangxue Dihuang Decoction'un çok bileşenli mekanizmalarını açıklar.

Özet

Ülseratif kolit (UC), kalıcı bağırsak iltihabı ve metabolik düzensizlikle karakterize edilen kronik bir inflamatuar bağırsak hastalığıdır. Geleneksel Çin tıbbı (TCM) formülleri, inflamatuar bozukluklar için klinik uygulamada yaygın olarak kullanılır; Ancak, çok bileşenli ve çok hedefli mekanizmalarını aydınlatmak için sistematik deneysel yaklaşımlar sınırlı kalır. Bu makale, ağ farmakolojisi, hedefsiz metabolomik ve in vivo doğrulamayı entegre eden tekrarlanabilir deneysel bir protokol sunar; böylece Liangxue Dihuang Demlendirmesi (LXDHD) dekstran sülfat sodyum (DSS) ile indüklenen fare modelinde anti-enflamatuar etkilerini araştırır. İş akışı, bitkisel karışımın hazırlanması, DSS kaynaklı kolit modellemesi, hastalık aktivite değerlendirmesi, histopatolojik ve hematolojik değerlendirme, serum sitokin ölçümü, LC–MS tabanlı metabolom profilleme ve hesaplamalı ağ analizini içerir. Bu entegre yaklaşımla, DSS kaynaklı kolit başarıyla tespit edildi ve LXDHD tedavisi hastalık aktivite indeksi, kolon uzunluğu, histopatolojik hasar, inflamatuar sitokin seviyeleri ve metabolik profillerde ölçülebilir iyileşmeler sağladı. Ağ farmakolojisi ve metabolomik analizleri, bu protokolün terapötik müdahaleyle ilişkili ana hedeflerin, yolların ve metabolitlerin tanımlanmasını sağladığını ayrıca göstermiştir. Bu görselleştirilmiş ve standartlaştırılmış iş akışı, çok bileşenli TCM formüllerinin inflamatuar bağırsak hastalıklarında farmakolojik mekanizmalarını incelemek için pratik bir metodolojik çerçeve sunar ve diğer bitkisel reçeteler ile hastalık modellerine uyarlanabilir.

Giriş

Ülseratif kolit (UC), kolon 1'de sürekli mukozal iltihaplanma ile karakterize edilen kronik bir inflamatuar bağırsak^{hastalığıdır ve} karın ağrısı, ishal, rektal kanama ve kilo kaybı gibi^{belirtilere yol açar.} Üniversite (KK) vakası dünya çapında artmakta, sağlık sistemlerine önemli bir yük oluşturmakta ve hastaların yaşam kalitesini önemli ölçüde^{düşürmektedir 3}. UC'nin etiyolojisi tam olarak anlaşılmamış olsa da, biriken kanıtlar bağışıklık yanıtlarının düzensiz olduğunu, aşırı inflamatuar sitokinler üretimi, oksidatif stres ve metabolik bozuklukların hastalık patogenezinde merkezi rol oynadığını^{göstermektedir 4,5}.

UC için mevcut terapötik stratejiler esas olarak aminosalisilatlar, kortikosteroidler, immünosupresyefre ajanlar ve inflamatuar sitokinleri hedef alan biyolojik ilaçlardan^{oluşmaktadır 6}. Bu tedaviler semptomları hafifletebilir ve remisyona yol açabilir, ancak uzun vadeli kullanımı genellikle olumsuz etkiler, yüksek maliyetler ve değişken terapötik yanıtlarla^{ilişkilidir 7,8,9}. Ayrıca, hastaların önemli bir kısmı sürdürülebilir remisyona ulaşamıyor; bu da daha iyi güvenlik ve çoklu hedef etkinliğine sahip alternatif veya tamamlayıcı tedavi yaklaşımlarına olan ihtiyacı ortaya koymaktadır.

Geleneksel Çin tıbbı (TCM), yüzyıllardır gastrointestinal bozuklukların tedavisinde yaygın olarak kullanılmakta olup, UC¹⁰ gibi karmaşık inflamatuar hastalıklarda potansiyel faydalarıyla giderek daha fazla tanınmaktadır. Tek hedefli tedavilerin aksine, TCM formülleri genellikle çoklu hedef ve yollar üzerinde etkili olan çoklu bileşenler aracılığıyla terapötik etkiler gösterir; bu da UC^11'in çok faktörlü doğasını daha iyi ele alabilir. Klinik ve deneysel çalışmalar, bazı TCM reçetelerinin bağışıklık yanıtlarını modüle edebildiğini, iltihabı bastırabileceğini, bağırsak bariyerinin bütünlüğünü koruyabileceğini ve metabolik homeostazı^{düzenleyebileceğini göstermiştir} 12,13,14,15.

Liangxue Dihuang Demlendirmesi (LXDHD), geleneksel olarak "kanı soğutmak ve ısıtmayı derinleştirmek" için kullanılan klasik bir TCM formülüdür ve klinik olarak iltihap ve hemorajik hastalıklar için^{uygulanmıştır 16}. Reçete, Scutellaria baicalensis, Phellodendron chinense, Rehmannia glutinosa, Paeonia suffruticosa, Paeonia lactiflora, Sanguisorba officinalis, Platycladus orientalis, Saposhnikovia divaricata, Citrus aurantium, Angelica sinensis ve Glycyrrhiza uralensis gibi birçok bitkiden oluşmaktadır. Modern farmakolojik çalışmalar, birkaç bileşen bitki ve aktif bileşiklerin anti-inflamatuar, antioksidan ve immünomodülatör özelliklere sahip olduğunu^{göstermiştir} 17,18,19. Ancak, LXDHD'nin UC'de genel terapötik etkileri ve altta yatan mekanizmaları henüz sistematik olarak açıklanmamıştır.

Ağ farmakolojisi, çok bileşenli bitkisel formüller ile hastalıkla ilgili moleküler hedefler arasındaki karmaşık etkileşimleri incelemek için etkili bir yaklaşım olarak ortaya^{çıkmıştır 20}. Birden fazla veri tabanından gelen bilgileri entegre ederek, ağ farmakolojisi potansiyel aktif bileşikleri, terapötik hedefleri ve sinyal yollarını tahmin edebilir ve TCM mekanizmalarının sistem düzeyinde anlaşılmasını^{sağlar 21}. Buna rağmen, ağ farmakolojisi öncelikle veritabanı tahminlerine dayanır ve in vivo metabolik değişiklikleri doğrudan yansıtmaz.

Metabolomik, küresel metabolik değişiklikleri profillemek için güçlü bir araç olarak, hastalık patofizyolojisi ve terapötik yanıtlar hakkında tamamlayıcı içgörüler^{sunar 22}. UC'de metabolomik analizler, lipid ve amino asit metabolizmasında önemli bozulmalar ile oksidatif stresle ilişkili^yollar 23,24,25 ortaya koymuştur. Metabolomiklerin ağ farmakolojisiyle entegre edilmesi, tahmin edilen moleküler hedefler ile gerçek metabolik fenotipler arasındaki boşluğu kapatmaya yardımcı olabilir ve böylece mekanik yorumların güvenilirliğini artırabilir.

Mevcut çalışmada, ağ farmakolojisi, hedefsiz metabolomik ve deneysel doğrulamayı birleştiren entegre bir strateji, LXDHD'nin dekstran sülfat sodyum (DSS) indüklenmiş UC fare modelinde anti-enflamatuar etkileri ve potansiyel mekanizmalarını incelemek için kullanılmıştır (Şekil 1A). Bu genel metodolojik tasarım, in silico tahminleri in vivo metabolom ve fenotipik doğrulama ile entegre etmek, yerleşik titiz araştırma^{çerçeveleriyle uyumludur 26}. Ağ farmakoloji analizi, LXDHD tedavisiyle zenginleştirilen aktif bileşikleri, potansiyel terapötik hedefleri ve sinyal yollarını belirlemek için kullanılmıştır. Hedefsiz metabolomikler, UC tarafından indüklenen metabolik değişiklikleri ve bunların LXDHD tarafından modülasyonunu karakterize etmek için gerçekleştirildi. Ayrıca, temel bulgular in vivo deneylerle doğrulandı; bunlar arasında hastalık aktivitesi, histopatolojik değişiklikler, hematolojik parametreler ve inflamatuar sitokin seviyeleri değerlendirilmiştir.

Hesaplamalı tahminler, metabolik profilleme ve biyolojik doğrulamayı entegre ederek, bu çalışma LXDHD'nin UC'deki terapötik etkilerinin altında yatan çok bileşenli, çok hedefli ve çok yollu mekanizmaları kapsamlı bir şekilde anlamayı amaçlamaktadır. Bu çalışma, LXDHD'nin UC için potansiyel bir tamamlayıcı tedavi olarak kullanımını destekleyen deneysel kanıtlar sunmakla kalmıyor, aynı zamanda diğer karmaşık TCM formüllerinin mekanizmalarını incelemek için metodolojik bir çerçeve de sunmaktadır.

Protokol

Tüm hayvan deneysel prosedürleri, Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzları'na uygun olarak gerçekleştirildi ve Nanjing Çin Tıbbı Üniversitesi Bağlı Hastanesi Hayvan Etik Komitesi tarafından onaylandı (Onay No. #2025DW-034-01; Onay Tarihi: 24 Mart 2025). Liangxue Dihuang Demlendirmesinin hazırlanması, Çin Farmakopesi^27'de tanımlanan prosedürlere uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Protokolde kullanılan reaktifler, kimyasallar ve yazılımlar Malzeme Tablosu'nda listelenmiştir.

1. Liangxue Dihuang Demlendirmesinin (LXDHD) Hazırlanması

1. Kurutulmuş bitkisel malzemeleri LXDHD'nin standart formülasyonuna göre hazırlayın. On bir bileşen bitkinin kesin bitkisel bileşimi, botanik isimleri ve kesin belirlenen dozları Tablo 1'de belirtilmiştir.
   NOT: Kullanımdan önce tüm bitkisel materyalleri nitelikli bir farmakognosist tarafından doğrulamak, böylece botanik kimlik ve kalite tutarlılığı sağlanır. Tekrarlanabilirlik için kimlik doğrulama kayıtlarını sakla.
2. Toz hazırlama
   1. Tüm bitkisel malzemeleri oda sıcaklığında, temiz ve iyi havalandırılan bir ortamda hava ile kurutun.
   2. Her bitkiyi mekanik bir öğütücüyle tek tek öğütücü ile ezerek ince bir toz elde edilene kadar.
   3. Tozları belirlenen oranlara göre birleştirin.
   4. Karışık toz, partikül boyutunun eşit olması için 80 ağlık bir elek (iç çapı 180 μm ± 7,6 μm) geçirin.
   5. Eleğin tozunu iyice homojenize edin.
      NOT: Düzenli ekstraksiyon verimliliği için eşit parçacık boyutu gereklidir. Eksik öğütme veya düzensiz karıştırma kimyasal bileşimde değişkenliğe yol açabilir.
3. LXDHD sulu ekstraktının hazırlanması
   1. Karışık bitkisel tozu doğru şekilde tartın ve 1:10 (w/v) oranında damıtılmış su ekleyin.
   2. Karışımı kaynayana kadar ısıtın ve 20 dakika dekokt yapın.
   3. Ekstraktı filtreleyin ve filtratı toplayın.
   4. Kalıntıya taze damıtılmış su ekleyin ve 20 dakika daha tekrar tekrar etmelisiniz.
   5. İki filtratı birleştirerek nihai LXDHD sulu ekstraktını elde edin.
      NOT: Çift decoksiyon, hem suda çözünürken hem de orta derecede çözünür bileşenlerin verimli ekstraksiyonunu sağlamak için gereklidir.
4. Konsantrasyon ve depolama
   1. Kombine demeksiyonu düşük basınç veya hafif ısıtma altında konsantre edin, istenen konsantrasyon sağlanana kadar.
   2. Ekstraktın oda sıcaklığına soğumasına izin verin.
   3. Hazırlanan LXDHD ekstraktını 4 °C'de sakla ve 48 saat içinde kullan.
      NOT: Tekrar eden donma–erime döngülerinden kaçının, çünkü biyoaktif bileşikleri bozabilir ve deneysel tekrarlanabilirliği azaltabilirler.
5. Yönetim
   1. Ekstraktı uygulamadan önce oda sıcaklığına getirin.
   2. Deneysel gruplamaya göre belirlenen dozlarda farelere oral garajla LXDHD'nin yoğun sulu deksiyonunu verin.

2. Hayvan deneyi tasarımı

1. Hayvanlar ve barınma koşulları
   1. 6–8 haftalık, 20–25 g ağırlığında erkek C57BL/6 farelerini sertifikalı laboratuvar hayvanı tedarikçisinden alın.
   2. Standart laboratuvar koşullarında, 12 saat ışık/karanlık döngü, kontrollü sıcaklık (22–25 °C) ve göreli nem (%50–%60) ile ev fareleri.
   3. Deney boyunca farelere standart yemek ve suya ücretsiz erişim sağlanın.
   4. Deneyden önce farelerin en az 7 gün boyunca uyum sağlamasına izin verin.
      NOT: Sonraki deneylerde sadece normal aktiviteye ve vücut ağırlığına sahip sağlıklı fareleri dahil edin.
2. Gruplandırma ve doz hesaplaması
   1. Pharmacological Experiments Metodolojisinde tanımlanan insan-hayvan doz dönüşüm prensibine göre, standart yetişkin vücut ağırlığı 70 kg ve günlük klinik doz 8.4 g²⁸ temelinde fare LXDHD dozunu hesaplayın.
   2. Fareleri rastgele aşağıdaki gruplara ayırın (n = 6 grup başı): Normal kontrol grubu, DSS kaynaklı KK model grubu, düşük dozlu LXDHD grubu (1,09 g/kg), yüksek dozlu LXDHD grubu (2,18 g/kg) ve 5ASA pozitif kontrol grubu (100 mg/kg)²⁹.
      NOT: Seçim yanlılığını en aza indirmek için rastgele sayı tablosu kullanarak rastgele işlem yapın.
   3. UC'nin indüksiyonu ve ilaç uygulaması
      1. İçme suyunda %2,5 (w/v) DSS çözeltisi hazırlayın.
      2. Model, LXDHD ile tedavi edilmiş ve 5ASA gruplarındaki farelere DSS çözümünü ardışık 7 gün^{boyunca 30} gün boyunca imtiyaz olarak uygular.
      3. Normal kontrol grubundaki farelere arındırılmış içme suyu sağlanır.
      4. Deney dönemi boyunca tedavi gruplarına günde bir kez LXDHD ve 5ASA'yı ilgili dozlarda ağızdan uygulanır.
      5. Normal kontrol ve DSS model gruplarına eşit hacimde araç çözümü uygulanır.
         NOT: DSS çözümünü taze hazırlayın ve her 2 günde bir değiştirin. DSS partileri kolit indükleyen güç açısından farklılık gösterebilir; Yeni bir parti kullanırken pilot testler yap. DSS kaynaklı UC modelinin başarılı şekilde kurulması, ilerleyici vücut kilo kaybı, kanlı ishal, yüksek DAI puanları ve belirgin kolon kısaltması ile karakterizedir. Bu kriterler ve fare deneylerinin metodolojik tasarımı, yerleşik referans^{standartları 31} ile tutarlıdır.
3. Dışsal metabolomik için boş ve ilaç içeren serumun hazırlanması
   1. Sağlıklı erkek C57BL/6 farelerden ayrı bir grup kullanın.
   2. Fareleri rastgele iki gruba ayırın: boş grup ve LXDHD grubu.
   3. LXDHD grubuna 7 gün ardışık olarak günde bir kez 2.18 g/kg dozunda oral garaj ile LXDHD uygulanır.
   4. Boş gruba eşit miktarda damıtılmış su verin.
   5. Son uygulamadan 1 saat sonra kan örnekleri alın.
   6. Kan örneklerini işleyerek serum elde edin, Bölüm 3.5'te açıklandığı gibi.

3. Hastalık aktivitesinin değerlendirilmesi

1. Deney sırasında vücut ağırlığını, dışkı kıvamını ve dışkı kanamasını günlük olarak takip edin.
2. Vücut kilosu kaybı, dışkı kısamı, dışkı kanaması temelinde Hastalık Aktivite Indeksi (DAI) hesaplayın. Belirli puanlama çerçevesi Tablo 3'te detaylandırılmıştır. Hesaplayın
   nihai DAI puanı bu üç parametrin ortalaması (veya toplamı^{) olarak 32}.
3. 8. günün sonunda, her gruptaki fareleri %1 sodyum pentobarbital (30 mg/kg) ile anestezi yapın. Her farenin retro-orbital venöz pleksusundan yaklaşık 400 μL kan toplayın. Daha sonra, Amerikan Veteriner Tıp Birliği (AVMA) Hayvanların Ötenazi Yönergeleri'ne (Şekil 1B) tam olarak uygun olarak, hayvanları rahim ağzı çıkıntısı yoluyla ötenazi ile ötenazi yapın.
   NOT: Arka patilerin parmaklarını ve plantar yüzeyini nazikçe sıkıştırarak yeterli anestezi doğrulan; Yoksunluk yanıtının olmaması anestezi derinliğinin yeterli olduğunu gösterir.
4. Kolon dokularını toplayın ve hastalık şiddetinin bir göstergesi olarak kolon uzunluğunu ölçün.
   NOT: Kısa kolon uzunluğu, DSS kaynaklı kolit^{şiddeti 33'ün} bir özelliği olarak kabul edilir.
5. Kan serumu elde etmek
   1. Toplanan kan örneklerinin bir kısmının oda sıcaklığında 1 saat pıhtı oluşmasına izin verin.
   2. Santrifüj örnekleri 1.000 × g sıcaklığında 4 °C'de 15 dakika boyunca serum elde etmek için yapılır.
   3. Serum seviyelerini interlökin (IL)-1β, IL-6, IL-17, tümör nekroz faktörü-alfa (TNF-α) ve IL-10 seviyelerinde nicelikle ölçemek.
   4. Histopatolojik analiz için kolon dokusu örnekleri toplayın.
   5. Kalan kan örneklerini periferik kan analizi için kullanın.
   6. Metabolomik analizi için ek serum örnekleri ayırın.

4. Hematoksilin–Eosin (H&E) boyama

1. Kolon dokularını %4 paraformaldehit ile en az 24 saat düzeltin.
2. Dereceli etanol serisi ile dokuları kurutun.
3. Ksilenli temiz dokular ve parafin içine gömül.
4. Mikrotom kullanılarak 3–5 μm kalınlığında doku kesimleri kesilin.
5. Kesitleri ksilenle deparaffize edin.
6. Bölümleri kaliteli etanol ile yeniden nemlendirin.
7. Nükleer görselleştirme için hematoksilin ile boyama kesitleri.
8. Sitoplazmik boyama için eosin ile karşı boyama bölümleri.
9. Histopatolojik değişiklikleri ışık mikroskobu altında gözlemleyin ve ilgili görüntüleme yazılımıyla temsil görüntüler alın.
10. İltihapın şiddeti, yaralanma derinliği ve kriptasyon hasarına göre histolojik skorları (HCS) değerlendirin.
11. Detaylı histolojik puanlama kriterleri için Tablo 4'e bakınız.
    NOT: Protokol görselleştirmesini geliştirmek için doku gömülmesi, kesitlenmesi ve boyama konularının temsilci görüntülerini yakalayın.

5. Çevresel kan analizi

1. Periferik kan örneklerini EDTA-K2 antikoagülan tüplerine (1,5 mg EDTA/mL kan) toplayın.
2. Doğru karıştırma sağlamak için tüpleri 8–10 kez nazikçe ters çevirin.
3. Üç bölümlü veteriner hematoloji analizörü (Mindray BC-2600vet) ile kan hücresi sayılarını analiz edin ve türe özgü kalibrasyon.
4. Numuneleri 4 °C'de taşıyın.
5. Numuneleri topladıktan sonra 4 saat içinde analiz edin.
   NOT: Hemoliz veya pıhtılaşma gösteren örnekleri analizden hariç tutun.

6. Enzimle bağlantılı immünosorbent test (ELISA)

NOT: IL-6, IL-17, IL-1β ve TNF-α önemli pro-inflamatuar sitokinlerken, IL-10 önemli bir anti-inflamatuar sitokindir. Bu sitokinler, inflamatuar yanıtların varlığını ve şiddetini^{yansıtır 34}.
Bu sitokinlerin ölçümü, iltihap süreçlerini anlamak ve anti-inflamatuar tedavilerin etkinliğini değerlendirmek için çok önemlidir.

1. Retro-orbital venöz pleksustan kan örnekleri alın.
2. Örneklerin oda sıcaklığında 1 saat pıhtı oluşmasına izin verin.
3. Santrifüj örnekleri 1.000 × g sıcaklığında 4 °C'de 15 dakika boyunca serum elde etmek için alınır.
4. Ticari ELISA kitleri kullanarak IL-1β, IL-6, IL-17, TNF-α ve IL-10 serum seviyelerini ölçün.
5. Standart veri toplama yazılımıyla donatılmış bir mikroplaka okuyucu kullanarak absorbansı ölçün.
6. Standart eğrilere göre sitokin konsantrasyonlarını hesaplayın.
   NOT: Tüm örnekleri ve standartları ikili olarak analiz ederek teknik değişkenliği azaltın.

7. Liangxue Dihuang Karışımının LC–MS analizi

1. Numune hazırlama
   1. LXDHD karışımı ham bitkisel tozun 10 gramını doğru şekilde tartın.
   2. Tozu 30 mL sıcak suda çöz.
   3. 30 dakika ultrasonik ekstraksiyon yapın.
   4. 100 μL ekstraktı 400 μL metanol ile karıştırın.
   5. 10 dakika girdabında kaldı.
   6. Santrifüj 14.000 × g'de 10 dakika boyunca koyun.
   7. Üst katmanı test çözümü olarak toplayın.
2. LC–MS koşulları
   1. Q kütle spektrometresi ile birlikte LC sistemi kullanılarak kromatografik ayrım yapılabilir.
   2. C18 kolonu kullanın (150 × 2.1 mm, 1.8 μm).
   3. Hareketli fazı şu şekilde ayarlayın: çözücü A, suda %0,1 formik asit; çözücü B, metanol.
   4. Akış hızını 0.30 mL/dakika olarak ayarlayın.
   5. Kolon sıcaklığını 35 °C'ye ayarlayın.
   6. Enjeksiyon hacmini 5 μL olarak ayarlayın.
   7. Aşağıdaki gradyan-elusyon programını uygulayın:
      0–2 dk, %5 B;
      2–15 dk, %5–95 B;
      15–18 dk, %95 B;
      18–18,1 dk, %95–5 B;
      18.1–22 dk.
   8. Kütle spektrometrisi parametrelerini şu şekilde ayarlayın: kılıf gazı akış hızı, 35 arb; yardımcı gaz akış hızı, 10 arb; püskürtme voltajı, 3,5 kV (pozitif) ve 2,8 kV (negatif); kapiler sıcaklığı, 320 °C; Yardımcı gazlı ısıtıcı sıcaklığı, 350 °C.
   9. MS verilerini hem pozitif hem negatif iyon modlarında elde edin ve tam MS tarama aralığı m/z 100–1500 (çözünürlük: 70.000) arasında.
   10. Veriye bağlı MS2 (dd-MS2) taramalarını 17.500 çözünürlükte gerçekleştirin.
   11. Ham verileri işleyin ve bileşikleri mzCloud veritabanı kullanarak belirleyin.

8. Serum hedefsiz metabolomik analizi

1. Serum numune hazırlama ve kalite kontrolü (QC)
   1. Serum örneklerini buz üzerinde eritin.
   2. 50 μL serumu 1.5 mL santrifüj tüpüne aktarın.
   3. 200 μL soğuk metanol/asetonitril (1:1, v/v) ekleyin.
   4. Proteinleri çökeltmek için 1 dakika girdabında kalın.
   5. 15 dakika buzda kuluçka yapın.
   6. 14.000 × g sıcaklıkta 4 °C'de 15 dakika boyunca santrifüj yapın.
   7. Süpernatantı yeni bir tüpe aktarın.
   8. Ekstraktı vakum konsantratör ile kurutun.
   9. 100 μL asetonitril/su (1:1, v/v) içinde yeniden oluşturulur.
   10. Vortex'i iyice kontrol edin.
   11. Tekrar 14.000 × g ile 15 dakika boyunca 4 °C'de santrifüj yapın.
   12. LC-MS analizi için süpernatantı toplayın.
   13. Her örnekten 10 μL aliquot toplayarak kalite kontrol örnekleri hazırlayın.
   14. Her 8–10 deneysel örnek için bir kalite kontrol örneği enjekte ederek enstrüman kararlılığını ve tekrarlanabilirliğini izleyin.
2. LC-MS satın alma ayarları
   1. LC sistemi kullanılarak C18 kolonu (150 × 2.1 mm, 1.8 μm) kromatografik ayrım yapılabilir.
   2. Kolon sıcaklığını 35 °C'ye ayarlayın.
   3. Akış hızını 0.30 mL/dakika olarak ayarlayın.
   4. Enjeksiyon hacmini 2 μL (pozitif mod) veya 5 μL (negatif mod) olarak ayarlayın.
   5. Çözücü A (suda %0,1 formik asit) ve çözücü B (asetonitril ile %0,1 formik asit) kullanın.
   6. Doğrusal gradyan elütasyon programı uygulayın.
   7. Kütle spektrometresini pozitif ve negatif HESI modlarında çalıştırın.
   8. Kütle tarama aralığını m/z 100–1500 olarak ayarlayın.
   9. Püskürtme voltajını 3.5 kV (pozitif) ve 2.8 kV (negatif) olarak ayarlayın.
   10. Kapiller sıcaklığını 320 °C'ye ayarlayın.
3. Veri işleme ve diferansiyel metabolit tanımlama
   1. Ham LC-MS verilerini (.raw dosyalarını) yazılıma aktarın.
   2. Zirve hizalama, zirve seçme ve temel düzeltme gerçekleştirin.
   3. Çıkarılmış zirve alan özelliklerini toplam iyon yoğunluğuna normalize edin.
   4. Doğru kütle (kütle toleransı < 5 ppm) ve MS/MS parçalanma desenlerini mzCloud ve ChemSpider veritabanlarıyla eşleştirerek metabolitleri tanımlayın.
   5. Çok değişkenli istatistiksel analiz (PCA ve OPLS-DA/PLS-DA) gerçekleştirin.
   6. Aşağıdaki eşiklere göre diferansiyel metabolitleri tanımlayın: VIP > 1.0 ve p < 0.05 (Öğrencinin t-testi).

9. Ağ farmakolojisi analizi

NOT: UC ^35,36'da LXDHD'nin aktif bileşenleri ve ana hedeflerini tahmin etmek için ağ farmakolojisi kullanılmıştır. Metodoloji, veritabanı madenciliği, kimyasal bilgi işleme, biyoaktivite veri edinimi, protein hedef buluşması, gen ifade profili, etkileşim ağı inşası ve yol zenginleştirme^{analizini içerir 37,38}.

1. Aktif bileşik taraması
   1. Geleneksel Çin Tıp Sistemleri Farmakoloji Veritabanı ve Analizi (TCMSP) veritabanından (10 Aralık 2025'te erişildi) OB ≥% 30 ve DL ≥ 0.18 kullanılarak aktif bileşikler alın.
   2. PubMed ve Web of Science (10–15 Aralık 2025) gibi literatür aramalarıyla bileşikleri takviye edin.
   3. UniProt veritabanı kullanılarak hedefleri standartlaştırın (erişim tarihi: 15 Aralık 2025).
2. Hastalık hedef tanımlaması
   1. GeneCards, OMIM, TTD ve DrugBank veritabanlarından UC ile ilgili hedefleri topla (erişim tarihi: 15 Aralık 2025).
3. Ağ inşası ve analizi
   1. R yazılımındaki VennDiagram paketiyle kesişen hedefleri belirleyin.
   2. Cytoscape yazılımı kullanarak ağı kurun.
   3. Topolojiyi NetworkAnalyzer eklentisi ve CytoNCA eklentisi kullanarak analiz edin.
4. PPI ağı ve çekirdek hedef tanımlama
   1. Kesişen hedefleri STRING veritabanına aktarın.
   2. Türleri Homo sapiens ile sınırlayın.
   3. İzole düğümleri kaldırın.
   4. PPI puan eşiği > 0.9 uygula.
   5. Verileri dışa aktarın ve yazılımda analiz edin.
   6. DC, BC, EC, CC, NC ve LAC hesaplayın.
   7. Alt ağlar oluşturmak ve çekirdek hedefleri belirlemek için medyan tabanlı^{filtreleme gerçekleştirmek ve 39}.
5. GO ve KEGG Zenginleştirme Analizi
   1. R ve Bioconductor paketleriyle GO ve KEGG zenginleştirme gerçekleştirin.
   2. Org dahil R paketlerini kullanın. Hs.eg.db, clusterProfiler, DOSE, enrichplot, stringi ve ggplot2.
   3. Anlamlılık eşiklerini p = 0.05 ve q = 0.05 olarak ayarlayın.
   4. MF, BP ve CC kategorileri için GO analizi yapın.
   5. KEGG yol zenginleştirmesi ve^{sınıflandırma 40} gerçekleştirin.
6. Moleküler kenetleme
   1. TCMSP'den bileşik yapıları SDF formatında indirin.
   2. AlphaFold'dan protein yapılarını PDB formatında indirin.
   3. CB-DOCK2 web sunucusu (CADD Lab, Sichuan Üniversitesi, Chengdu, Çin) kullanılarak kenetlenmeyi gerçekleştirin.
   4. Reseptör ve ligand dosyalarını buna göre tanımlayın.
   5. Optimal bağlanma pozisyonunu ve bağlanma enerjisini kaydedin.
      NOT: Kenetlenme işlemi genetik^{algoritma 41} kullanılarak gerçekleştirildi. Sonuçlar bağlanma enerjisine göre sıralandı.

10. İstatistiksel analiz

1. GraphPad Prism yazılımı kullanarak istatistiksel analiz yapın.
2. Nicel verileri ortalama ± standart sapma (SD) olarak ifade edin.
3. Shapiro–Wilk testiyle normalliği test edin.
4. Brown–Forsythe testi kullanılarak varyansın homojenliğini test edin.
5. Normal dağıtılmış veriler için Tukey'nin post hoc testi ile tek yönlü ANOVA yapın.
6. Parametrik olmayan veriler için Dunn testiyle Kruskal–Wallis testi yapılacak.
7. P < 0.05'i istatistiksel olarak anlamlı olarak kabul edin.
   NOT: Daha küçük bir p-değeri, gruplar arasında daha büyük istatistiksel farkı gösterir.

Sonuçlar

UC'de LXDHD'nin ağ farmakoloji analizi

Ağ farmakolojisi, UC'de LXDHD'nin potansiyel terapötik hedefleri ve moleküler mekanizmalarını tahmin etmek için uygulanmıştır. TCMSP veritabanından toplam 211 farmakokinetik özelliklere sahip bileşik eleme yapıldı; bunlar arasında 36'sı Scutellaria baicalensis'ten, 37'si Phellodendron chinense'den, 10'u Rehmannia glutinosa'sı, 11'i Paeonia suffruticosa'sı, 29'u Paeo...

Tartışma

Bu yöntem, ağ farmakolojisi, hedefsiz metabolomik ve in vivo doğrulamayı entegre eden görselleştirilmiş, tekrarlanabilir deneysel bir iş akışı sunar; böylece DSS ile indüklenen bir fare UC modelinde TCM formüllerinin anti-inflamatuar etkilerini araştırır. Geleneksel farmakolojik çalışmaların aksine, özellikle izole mekanik sonuçlara odaklanan bu protokol, metodolojik çerçevenin sağlamlığını vurgularken kritik biyolojik içgörülerin ortaya çıkarılmasını sağlar. Bu entegre iş akışı...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
5-aminosalisilik asit (5-ASA)	Sigma-Aldrich	A3537	Ülseratif kolit için pozitif kontrol ilacı; 100 mg/kg oranında oral garaj ile uygulanır.
Asetonitril (LC-MS derecesi)	Merck	100030	Metabolomik örnek hazırlama ve LC-MS mobil fazı için kullanılır.
AlphaFold Protein Yapısı Veritabanı	EMBL– Avrupa Biyobilişim Enstitüsü	https://alphafold.ebi.ac.uk/	Hedef proteinlerin tahmin edilen üç boyutlu yapılarını elde etmek için kullanılan veritabanı.
Angelica sinensis (Dang Gui)	Jiangsu Eyaleti Çin Tıbbı Hastanesi	Parti: 2409001	LXDHD'nin bileşen otu (Doz: 1,6 g).
CB-Dock2	CADD Laboratuvarı	https://cadd.labshare.cn/cb-dock2/	Ligand&ndash'ın moleküler kenetlenmesi ve tahmini için kullanılan web tabanlı platform; protein bağlanma modları.
Narenciye aurantyumu (Zhi Ke)	Jiangsu Eyaleti Çin Tıbbı Hastanesi	Parti: 2409001	LXDHD'nin bileşen otu (Doz: 0,5 g).
Bileşik Keşif Yazılımı	Thermo Fisher Scientific	Sürüm 3.3	LC–MS veri işleme ve bileşik tanımlama için kullanılır.
CTAn Yazılımı	Bruker	Sürüm 1.17	Micro-CT 3D görüntü rekonstrüksiyonu ve kemik erozyon analizi için kullanılır.
Sitoscape	Sitoscape Konsorsiyumu	Sürüm 3.8.0	Ağ oluşturma ve görselleştirme için kullanılan yazılımlar.
Dekstran Sülfat Sodyum (DSS)	MP Biyomedikal	160110	Moleküler ağırlık 36.000– 50.000 Da; farelerde ülseratif kolit indüklemek için kullanılır.
EDTA-K2 Antikoagülan Tüpler	Sinopharm Kimyasal Reaktif Şirketi, Ltd.	Yok	Çevresel kan toplama için kullanılır.
Eozin Boyama Çözeltisi	Biosharp	Yok	Used for cytoplasmic counterstaining in H& E lekelenmesi.
Etanol	Chengdu Köln Kimyasalları Şirketi, Ltd	64-17-5	Doku susuzluğu için kullanılır.
Formik asit (LC-MS sınıfı)	Merck	5.33002	LC-MS mobil faz hazırlığı için kullanıldı.
Glycyrrhiza uralensis (Gan Cao)	Jiangsu Eyaleti Çin Tıbbı Hastanesi	Parti: 2409001	LXDHD'nin bileşen otu (Doz: 0,5 g).
GraphPad Prizması	GraphPad Yazılımı	Sürüm 9.0	İstatistiksel analiz ve grafiksel sunum için kullanılır.
Hematoloji Analizörü	Mindray	BC-2600vet	Kan rutini analizi için üç bölümlü veteriner hematoloji analizörü.
Hematoksilin Boyanma Çözeltisi	Biosharp	BL700B	H& için Kullanılıyor Kolon dokusu kesitlerinde E boyama.
Yüksek hızlı santrifüj	Hitachi	CT15E/CT15RE	Serum ve örnek hazırlamak için kullanılır.
IL-10 ELISA Kiti (Fare)	MEIMIAN	MM-0176M2	Serum IL-10 seviyelerini değerlendirmek için kullanılır.
IL-17 ELISA Kiti (Fare)	Abklonal	RK00039	Serum IL-17 seviyelerini ölçmek için kullanılır.
IL-1β ELISA Kiti (Fare)	Abklonal	RK00006	Serum IL-1 ve beta tespiti için kullanılır; seviyeleri.
IL-6 ELISA Kiti (Fare)	Abklonal	RK00008	Serum IL-6 seviyelerini nicelendirmek için kullanılır.
ImageJ (Fiji) Yazılımı	Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH)	Sürüm 1.53c	Görüntü işleme ve nicelik için kullanılan açık kaynak yazılım.
Leica Uygulama Paketi X (LAS X)	Leica Microsystems	Sürüm 3.7	Histopatolojik slaytları yakalamak için kullanılan görüntüleme yazılımı.
Metanol (LC-MS derecesi)	Merck	106035	Metabolomik örnek hazırlama ve LC-MS mobil fazı için kullanılır.
Fareler (Erkek C57BL/6)	Anokang Biyoteknoloji Şirketi, Ltd.	Yok	Deneysel hayvanlar (6 yaşında; 8 hafta, 20 ve dash; 25 g) DSS kaynaklı UC modeli için kullanılmıştır.
mzCloud Veritabanı	Thermo Fisher Scientific	https://www.mzcloud.org/	MS/MS spektral eşleştirme için kullanılan veritabanı.
Optik Mikroskop	Leica	DM500	Histopatolojik gözlem için kullanılır.
Paeonia lactiflora (Chi Shao)	Jiangsu Eyaleti Çin Tıbbı Hastanesi	Parti: 2409001	LXDHD'nin bileşen otu (Doz: 0.6 g).
Paeonia suffruticosa korteksi (Mu Dan Pi)	Jiangsu Eyaleti Çin Tıbbı Hastanesi	Parti: 2409001	LXDHD'nin bileşen otu (Doz: 0,5 g).
Paraformaldehit (%4)	Sinopharm Kimyasal Reaktif Şirketi, Ltd.	Yok	Kolon dokularının fiksasyonu için kullanılır.
Patolojik Mikrotom	Leica	RM2016	Parafin dokusu kesitlerinin hazırlanmasında kullanılır.
Phellodendron chinense (Huang Bo)	Jiangsu Eyaleti Çin Tıbbı Hastanesi	Parti: 2409001	LXDHD'nin bileşen otu (Doz: 0,5 g).
Platycladus orientalis (Ce Bai Ye Tan)	Jiangsu Eyaleti Çin Tıbbı Hastanesi	Parti: 2409001	LXDHD'nin bileşen otu (Doz: 0,7 g).
Q Exactive Yüksek Çözünürlüklü Kütle Spektrometresi	Thermo Fisher Scientific	Q Exactive	LC–MS analizi için Orbitrap tabanlı kütle spektrometresi.
R Yazılımı	R İstatistiksel Hesaplama Vakfı	Sürüm 4.2.1 (https://www.r-project.org/)	GO ve KEGG zenginleştirme analizleri için kullanılan yazılım.
Rehmannia glutinosa (Sheng Di Huang)	Jiangsu Eyaleti Çin Tıbbı Hastanesi	Parti: 2409001	LXDHD'nin bileşen otu (Doz: 2.1 g).
Sanguisorba officinalis (Di Yu Tan)	Jiangsu Eyaleti Çin Tıbbı Hastanesi	Parti: 2409001	LXDHD'nin bileşen otu (Doz: 0.6 g).
Saposhnikovia divaricata (Fang Feng)	Jiangsu Eyaleti Çin Tıbbı Hastanesi	Parti: 2409001	LXDHD'nin bileşen otu (Doz: 0.3 g).
Scutellaria baicalensis (Huang Qin)	Jiangsu Eyaleti Çin Tıbbı Hastanesi	Parti: 2409001	LXDHD'nin bileşen otu (Doz: 0,5 g).
Sodyum pentobarbital (%1)	Sigma-Aldrich	P3761	Numune toplamadan önce hayvan anestezisi için kullanılır.
SoftMax Pro Yazılımı	Moleküler Cihazlar	Sürüm 7.1	ELISA için mikroplaka okuyucu ile kullanılan veri toplama ve analiz yazılımı.
STRING Veritabanı	STRING Konsorsiyumu	https://string-db.org/	Protein&ndash için kullanılan veritabanı; Protein etkileşim analizi.
TCMSP Veritabanı	TCMSP Platformu	https://tcmsp-e.com/	Aktif bileşikleri taramak ve ilaç hedeflerini tahmin etmek için kullanılan veritabanı.
TNF-α ELISA Kiti (Fare)	Abklonal	RK00027	Serum TNF-&alpha belirlemek için kullanılır; yoğunlaşmalar.
Ultimate 3000 RS LC Sistemi	Thermo Fisher Scientific	Ultimate 3000 RS	UHPLC sistemi ve kütle spektrometrisi ile birleşir.
Ultrasonik Temizleyici	Kunshan Ultrasonik Aletler Şirketi, Ltd	KQ3200E	LXDHD'nin ultrasonik ekstraksiyonu için kullanılır.
UniProt Veritabanı	UniProt Konsorsiyumu	https://www.uniprot.org/	Gen ve protein isimlerinin standartlaştırılması için kullanılan veritabanı.
Vortex Mikser	Pekin PowerStar Technology Co., Ltd	LC-Vortex-P1	Örnek miksajı için kullanıldı.
Welch AQ-C18 Kolonu (150 & Times; 2.1 mm, 1.8 μ m)	Welch Malzemeleri	AQ-18-15021	Metabolitler ve bitkisel bileşenlerin ayrılması için kullanılan sütun.
Ksilen	Chengdu Köln Kimyasalları Şirketi, Ltd	1330-20-7	Histolojik işlem sırasında doku temizleme için kullanılır.