Yöntem makalesi

HEK293 Hücrelerinde Bölünmüş Lüminesans Etiketleme ile Canlı Hücre mRNA Translasyon Dinamiklerinin Ölçümü

DOI:

10.3791/70840

⸱

14 Ağustos 2026

 ,  ,  , 
1Gurdon Institute, University of Cambridge, 2Department of Pharmacology, University of Cambridge

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, bölünmüş lüminesans etiketleme kullanarak HEK293 hücrelerinde in cellulo canlı mRNA translasyon dinamiklerini ölçmek için esnek ve yüksek verimle uyumlu bir yöntem sunuyoruz. Bu çok yönlü analiz, yapısal etkileri ayırt eder, in vitro transkripsiyon optimizasyonunu destekler ve mRNA terapötik geliştirme süreçlerini kolaylaştırır.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

COVID-19 ile mücadele için aşıların hızla geliştirilmesi, haberci RNA (mRNA) terapilerinin ilaç geliştirmeyi dönüştürme potansiyelini ortaya koymuştur. Olgun mRNA gibi, in vitro transkript edilen mRNA; 5' kepi, translasyona uğramayan bölgeler (UTR'ler), kodlama dizisi ve bir poli(A) kuyruğu dahil olmak üzere aynı elementlere sahiptir. Bu bileşenlerin mRNA translasyonu üzerindeki etkilerini inceleyen önceki çalışmalar, temel olarak yüksek verimlilikte translasyon ve protein stabilitesi sergileyen, ileri düzeyde mühendislik ürünü reporter proteinler kullanmıştır. Her bir mRNA'nın yapısal elementlerinin translasyonu farklı şekilde etkilemesi nedeniyle, ilgilenilen terapötik protein (POI) için uygun olan optimal tasarımın belirlenmesi zorunludur. POI translasyon karakterizasyonunu sağlamak amacıyla, bir bölünmüş lüsiferaz komplemantasyon sistemi kullanılmıştır. POI'nin herhangi bir ucuna füzyonlanabilen kısa bir peptit etiketi (HiBiT), hücre geçirgen bir substrat varlığında enzimatik aktiviteyi yeniden oluşturmak için tamamlayıcı heterodimeri (LgBiT) ile birleşir. Bugüne kadar, bölünmüş lüminesan etiketleme temel olarak yüksek kapasiteli protein döngüsü çalışmalarında kullanılmıştır. Daha önce, bölünmüş lüminesan etiketlemenin mRNA translasyonunun zamansal olarak yüksek kapasiteli kantifikasyonunu sağlamak için nasıl kullanılabileceğini göstermiştık. hücre içinde komplementer heterodimeri konstitütif olarak eksprese eden HEK293 hücrelerinde. Burada, analizin çok yönlülüğünü daha detaylı bir şekilde gösteriyoruz ve bu analizin optimizasyon için nasıl kullanılabileceğini ayrıntılandırıyoruz in vitro maliyetleri azaltmak için transkripsiyon. Analiz sistemi, mühendislik uygulanmamış genler kullanarak kodlama dizisi optimizasyonunun etkilerini vurgularken, yapısal bileşenlerdeki değişiklikleri benzersiz bir şekilde ayırt edebilmektedir. Ek olarak, 5' kap konsantrasyonundaki 4 katlık bir azalmanın... in vitro transkripsiyon, eşdeğer çeviri ile sonuçlanır hücre içindeBu bulgular, bölünmüş lüminesans etiketlemenin mRNA terapötik iş akışına nasıl kolayca entegre edilebileceğini göstermekter ve gerçek zamanlı mRNA güdümlü protein ekspresyon dinamiklerinin izlenmesine olanak sağlamaktadır. hücre içinde böylece mRNA tabanlı terapötiklerin geliştirilmesi için çok yönlü bir yöntem sunmaktadır.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Messenger RNA (mRNA) terapötikleri ve araştırma uygulamaları, mRNA aşılarının başarısı1,2 ve RNA'nın programlanabilir bir biyomolekül olarak çok yönlülüğünün giderek daha fazla kabul görmesiyle son yıllarda hızla genişlemiştir. Bu alandaki temel zorluk, mRNA translasyon verimliliğini farklı bağlamlarda kantitatif ve dinamik olarak değerlendirebilme yeteneğidir. Burada açıklanan yöntem – split lüminesans etiketleme sisteminden yararlanarak – canlı mRNA translasyonunu in cellulo incelemek için esnek ve ölçeklenebilir bir platform sunmaktadır3. Bu yöntemin genel amacı, araştırmacıların dizi özelliklerinin, kimyasal modifikasyonların ve yapısal elementlerin translasyon kinetiğini ve ardından gelen protein döngüsünü nasıl etkilediğini ölçmelerine olanak tanımak ve böylece terapötik ve temel bilim uygulamaları için mRNA konstrüktlarını optimize etmek adına güçlü bir araç sağlamaktır.

In vitro transkribe edilmiş mRNA, 5′ kep yapısı, translasyon dışı bölgeler (UTR'ler), bir kodlama dizisi ve bir poly(A) kuyruğu içeren olgun transkriptlerin temel mimarisini yansıtırken, immünojeniteyi azaltmak için genellikle modifiye edilmiş nükleotidler içerir4,5. Kapsamlı çalışmalar, bu elementlerin her birinin –tek başına veya kombinasyon halinde– translasyon verimliliğini ve protein verimini güçlü bir şekilde etkileyecek şekilde tasarlanabileceğini göstermiştir6,7. Ancak önceki çalışmaların çoğu, yüksek verimlilikle translasyon yapmak ve oldukça stabil proteinler üretmek üzere tasarlanmış olan Yeşil Floresan Protein (GFP)7, NanoLuc8 veya SARS-CoV-2 spike proteini8,9 gibi yüksek düzeyde optimize edilmiş raporlayıcı proteinlere dayanmıştır ve bu nedenle terapötik bağlamlarda karşılaşılan zorlukları yansıtmazlar. Terapötik mRNA'lar, her biri kendine özgü yapısal kısıtlamalara ve hücre tipine özgü düzenlemelere tabi olan çeşitli ilgi alanı proteinlerini (POIs) kodladığından, daha önce rapor edildiği üzere, bir konstrükt için translasyonu maksimize eden tasarım ilkeleri bir başkası için genel geçer olmayabilir3. Bu nedenle, belirli bir terapötik POI için optimal konfigürasyonun belirlenmesi esastır ve transkriptin bireysel özelliklerinin protein çıktısına nasıl katkıda bulunduğunu hassas ve sistematik bir şekilde değerlendirebilen yöntemler gerektirir.

Polizom profilleme gibi ribozom odaklı yöntemler, gradyan santrifüjasyon aracılığıyla translasyon fraksiyonlarını birbirinden ayırırken10, ribozom profilleme (Ribo-seq) ribozom doluluğu, başlama bölgeleri ve duraklamaların nükleotid düzeyinde çözünürlüğünü sağlar11. Ribo-seq gibi, Çapraz Bağlama İmmünopresipitasyon ile İzole Edilen RNA'nın Yüksek Verimli Dizilemesi (HITS-CLIP) ve Transle Eden Ribozom Affinite Saflaştırması (TRAP) gibi diğer dizileme tabanlı yaklaşımlar, RNA bağlayan proteine ilişkili veya ribozoma ilişkili RNA'ların translasyonunu daha detaylı karakterize eder12. Güçlü olmalarına rağmen, bu teknikler karmaşık hazırlık, özel ekipman ve hesaplamalı uzmanlık gerektirdiğinden, yüksek verimli terapötik mRNA geliştirme süreçleri için uygun değildirler. Yeni sentezlenen zincir immünopresipitasyonu13, ribozomlardan immünopresipite edilen ve Kantitatif Ters Transkripsiyon Polimeraz Zincir Reaksiyonu (qRT-PCR) ile miktarı belirlenen FLAG etiketli proteinleri kullanarak translasyon verimliliğini ölçer. Terapötik mRNA'lara uyarlanabilir olsa da, bu analiz iş gücü yoğunludur, zamansal çözünürlükten yoksundur ve yüksek verimli uygulamalar için uygun değildir. SunTag sistemi14, tekil mRNA moleküllerinden protein sentez çıktısının ve translasyonel regülasyonun canlı hücre ölçümlerini sunar ve GFP'ye füzyonlanmış tek zincirli değişken bir fragmanın (scFv) ile peptit epitopunun tandem tekrarlarının etkileşimi yoluyla çalışır. Bu sistem, tekil mRNA çözünürlüğünde translasyon ve lokalizasyonun dinamik ölçümlerini sağlar ve bu nedenle çok sayıda yeni sentezlenen zincir takip sistemi geliştirmek için kullanılmıştır15,16. Ancak, bu yaklaşım düşük verimlidir ve yüksek güçlü mikroskopların kullanımını gerektirir.

Yeni sentezlenen proteinin etiketlenmesi kaçınılmaz olsa da, canlı hücrelerde mRNA translasyonunu raporlamak için NanoLuc lusiferazdan türetilmiş küçük bir peptit etiketin potansiyel kullanımı belirlenmiştir. NanoLuciferase, hızla dimerize olabilen ve substrat varlığında fonksiyonel bir lusiferazı yeniden oluşturabilen küçük, 11 amino asitlik (HiBiT) ve daha büyük, 158 amino asitlik (LgBiT) bir alt birime ayrılacak şekilde tasarlanmıştır17,18. mRNA dinamikleri çalışmalarında, bölünmüş lüminesans etiketleme sisteminin birkaç temel avantajı vardır. İlk olarak, POI'ye eklenen küçük alt birimin minimal boyutu, kodlanan konstrüktün ilgilenilen doğal proteine mümkün olduğunca yakın kalmasını sağlar. Kodlama dizisi uzunluğu translasyon oranlarını doğrudan etkileyebildiğinden19, etiket uzunluğunun minimize edilmesi, sentetik mRNA'ların translasyon dinamikleriyle ilgili öngörülerimizi iyileştirir. Kritik olarak, bu minimal etiketleme stratejisi, eş anlamlı kodlama dizisi varyasyonları tarafından yönlendirilen translasyondaki farklılıkların tespit edilmesini sağlayarak, translasyonel verimliliğin protein dizisinden veya stabilitesinden bağımsız olarak sorgulanmasına olanak tanır3. Bu nedenle, floresan proteinler veya tam uzunluktaki lusiferazlar gibi daha büyük etiketlerin kullanımı suboptimaldir. İkinci olarak, burada kullanılan bölünmüş lüminesans etiketleme sistemi anlık sinyal üretimine olanak tanır. Sisteminin hızlı ve verimli in cellulo komplementasyon reaksiyonunun yüksek afiniteye (KD = 700 pM) sahip olduğu bildirilmiş olup, protein döngüsü modülasyonunu ölçmek için 30 s gibi kısa aralıklarla yapılan okumalarla kullanılmıştır18. Orijinal bölünmüş lüminesans etiketleme sistemi öncelikle diğer bölünmüş lusiferaz sistemleriyle kıyaslanmış olsa da17,18, bu bağlamdaki temel avantaj sinyal üretiminin protein maturasyonu ile sınırlı olmamasıdır. Buna karşılık, floresan proteinler, dakikalar ile saatler ölçeğinde gerçekleşebilen kromofor maturasyonu gerektirir20, bu da zamansal çözünürlüğü sınırlar. Son olarak, burada kullanılan yerleşik bölünmüş lüminesans etiketleme sistemi, genellikle komplementasyon sonrası kromofor oluşumu gerektiren21 bölünmüş floresan protein sistemlerinin sınırlamalarını aşarak, ek bir gecikmeyi ortadan kaldırır ve hızlı, dinamik süreçlerin yakalanması için uygunluklarını artırır. Önceki çalışmalar, bölünmüş lüminesans etiketlemenin protein döngüsü analizleri ve degradasyon çalışmalarındaki faydasını göstermiştir22,23,24. Bu yerleşik teknolojinin translasyon kinetiğine genişletilmesi önemli bir metodolojik gelişmeyi temsil eder. Örneğin, ribozom profilleme transkriptler boyunca ribozom yoğunluğunu ortaya çıkarabilse de, farklı koşullar altında translasyon başlama veya uzama hızlarındaki dinamik değişiklikleri kolayca yakalayamaz. Daha önce gösterildiği gibi3, bu bölünmüş lüminesans etiketleme sistemi; kap yapısı, 5′ translasyona uğramayan bölge (UTR) kompozisyonu, kodon optimizasyonu, nükleotid modifikasyonları ve poli(A) kuyruk uzunluğu gibi translasyon verimliliğinin kritik belirleyicileri olan unsurlar değiştirildiğinde ortaya çıkan farkları tespit edebilir. Uygulanabilirlik kapsamının genişliği, bu yöntemi bireysel mRNA özelliklerinin toplam protein çıktısına katkılarını çözümlemek için benzersiz şekilde güçlü kılar. Kullanılan cihaza bağlı olarak, bu teknolojiyle hem tek hücre hem de tüm kuyucuk verilerinin yakalanabileceği belirtilmelidir. Lüminesans tabanlı görüntüler elde edebilen görüntüleme platformları, bu teknolojinin tek hücre translasyon dinamiklerini incelemek için kullanılmasına olanak tanıyabilir. Burada, orta-yüksek verimli doğası ve veri analizi için gereken minimum gereksinimler nedeniyle plaka okuyucu tabanlı, kuyucuk bazlı bir uygulamaya odaklanıyoruz.

Bu yöntemi değerlendiren araştırmacıların, yöntemin uygunluğunu kendi özel deneysel hedefleri ışığında analiz etmeleri gerekir. Bu analiz, mRNA tabanlı terapötik tasarım süreçlerinde olduğu gibi, sentetik mRNA konstrüktlerinin yüksek kapasiteli taramasının gerektiği durumlarda özellikle değerlidir. Çevirimsiz bölgeler, kodon kullanımı veya nükleotid modifikasyonları dahil olmak üzere sentetik mRNA dizi özelliklerinin karşılaştırmalı analizleri için oldukça uygundur; bu sayede translasyon verimliliğindeki küçük farklar tespit edilebilir3. Sistemin hücre dışı translasyon platformları, canlı hücre analizleri ve zaman noktasına özgü litik analizlerle uyumlu olması, deneysel tasarımlarını mekanistik çalışmalara veya uygulamalı araştırmalara göre uyarlamak isteyen araştırmacılara esneklik sağlar. Aynı zamanda, tekniğin sınırlarını kabul etmek önemlidir. Kritik olarak, split lüminesans etiketleme analizi, ribozom ayak izi yaklaşımlarına özgü bir yetenek olan ribozom doluluk oranını çözümleme imkanı sunmaz; ayrıca RNA stabilitesini veya degredasyonunu doğrudan ölçmez, bu parametrelerin tamamlayıcı yöntemler kullanılarak değerlendirilmesi gerekebilir. Ancak, mevcut ribozom odaklı tekniklerin sınırlamaları nedeniyle araştırmacılar, translasyonel dinamiklerin bir göstergesi olarak zaman çözünürlüklü mRNA kaynaklı protein ekspresyonunu incelemek için split lüminesans sistemi gibi etiket tabanlı analizlere güvenmektedir. Dolayısıyla, bu sistem sentetik mRNA kaynaklı protein ekspresyonunu izlemek için güçlü bir araç olsa da, uygunluğu, araştırma sorusunun ayrıntılı ribozom konumlandırması veya RNA bozunmasından ziyade dinamik protein çıktısına odaklanıp odaklanmadığına bağlıdır.

Özetle, bölünmüş lüminesan etiketleme sistemi, mRNA translasyonunu incelemek için güçlü ve çok yönlü bir yöntem sunmaktadır. Temel amacı, araştırmacılara esnek, sistem ölçeklenebilir, yüksek kapasiteli ve farklı yapısal ve sekans elementlerine sahip sentetik mRNA'lardan kaynaklanan protein çıktısındaki farklılıkları tespit edebilen bir araç sağlamaktır3. Bu yöntemin geliştirilme gerekçesi, mevcut tekniklerin sınırlamalarının üstesinden gelerek hassasiyet, ölçeklenebilirlik ve zamansal çözünürlük konularında avantajlar sunmaktır. RNA biyolojisi ve terapötikleri üzerine olan geniş literatür içerisinde konumlandırılan bu yöntem, hem temel bilimsel içgörülere hem de translasyonel ilerlemelere olanak tanıyarak deneysel repertuvara değerli bir katkı sağlar. Araştırmacılar, analiz yönteminin güçlü yönlerini ve sınırlamalarını dikkatle değerlendirerek, kendi özel uygulamaları için uygunluğunu belirleyebilir ve böylece hızla gelişen RNA bilimi alanındaki etkisini maksimize edebilirler.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tüm protokolün grafiksel gösterimi Şekil 1'de sunulmuştur.

1. in vitro transkripsiyon (IVT) için kalıp hazırlama

NOT: IVT için DNA kalıbını hazırlarken, plazmid DNA'nın bir RNA polimeraz promotörü (genellikle T7 veya SP6), 5’ ve 3’ UTR'leri ve POI'nin açık okuma çerçevesini içerdiğinden emin olun (Şekil 1).

  1. 3’ UTR sonrası konumlanmış tek bir kesim bölgesine sahip bir restriksiyon enzimi kullanarak plazmit DNA'sını lineerleştirin ve reaksiyonu üreticinin talimatlarına göre hazırlayın. İnkübasyon sonrası, restriksiyon sindirim reaksiyonunu spin kolon tabanlı bir DNA saflaştırma kiti kullanarak temizleyin. DNA miktarını bir spektrofotometre ile belirleyin.
  2. Lineerleşmeyi doğrulamak için, 0,1 µg/mL konsantrasyonda Etidyum Bromür DNA boyası içeren %1'lik bir agaroz TAE jeli hazırlayın. Sindirilmiş 150 ng DNA'yı su ve yükleme boyası ile karıştırın. Agaroz jeline örneği, kesilmemiş plazmidi ve bir DNA merdivenini yükleyin ve agaroz jelini 1× Tris-asetik asit-EDTA (TAE) tamponunda 100 V'da 40 dk boyunca çalıştırın. Bir jel görüntüleme sistemi ile görselleştirin.
    UYARI: Etidyum bromür çözeltisi güçlü bir mutajendir ve uygun kişisel koruyucu donanım (KKD) kullanılarak dikkatle işlenmesi gerekir.
  3. Plazmit DNA'sının 3’ UTR'den hemen sonra bir poly(A) kuyruğuna sahip değilse, bunu bir PCR ile ekleyin. PCR'ı, uygun şekilde tasarlanmış primerler ve yüksek sadakatli (high-fidelity) bir polimeraz kullanarak üreticinin talimatlarına göre tamamlayın. Amplikonun T7 promotörünü, açık okuma çerçevesini ve bir poly(A) kuyruğunu içerdiğinden emin olun.
    NOT: Capping teknolojileri T7 promotöründe spesifik sekans gereksinimlerine sahip olabilir; bu nedenle, bu gereksinimler uygun ileri primer tasarımı ile karşılanabilir. Geri primer 3’ UTR'nin sonuna bağlanır ve bir poly(A) kuyruğu ekler (en az 80 T uzunluğu önerilir). Yüksek GC içeriğine sahip konstrüktlar için step-up PCR ve/veya %3 DMSO önerilir.
  4. PCR'ın başarılı olduğunu doğrulamak için Etidyum Bromür içeren bir agaroz TAE jeli hazırlayın (adım 1.2'ye bakın). Konstrükt uzunluğu ≥1 kb veya <1 kb ise, sırasıyla %1'lik veya %2'lik bir jel hazırlayın. 5 µL PCR reaksiyonunu su ve yükleme boyası ile karıştırın. Agaroz jeline hem örneği hem de DNA merdivenini yükleyin ve TAE tamponunda 100 V'da 40 dk boyunca çalıştırın. Bir jel görüntüleme sistemi ile görselleştirin.
  5. PCR boyut doğrulaması sonrası, PCR reaksiyonunu spin kolon tabanlı bir DNA saflaştırma kiti kullanarak temizleyin. IVT'de kullanılmak üzere DNA şablonunu konsantre etmek için 15–20 µL elüsyon tamponunda (genellikle DNA saflaştırma kitiyle birlikte sağlanır) veya nükleaz içermeyen suda elüye edin. DNA miktarını bir spektrofotometre ile belirleyin.

2. In vitro transkripsiyon

  1. Başlamadan önce tezgahı, eldivenleri ve pipetleri bir RNaz dekontaminasyon solüsyonu ile püskürtün ve silin. Verimi ve kaliteyi artırmak için bu prosedürü steril bir laminar akışlı kabin ortamında gerçekleştirin.
  2. T7 tabanlı bir in vitro transkripsiyon (IVT) kitinin bileşenlerini üretici talimatlarına göre çözün ve hazırlayın.
    NOT: Bazı üreticiler, reaksiyon oksidasyonunu sınırlamak ve verimliliği artırmak için ditiyotreitol (DTT, 0.1 M) kullanımını önermektedir. Bu adım, kit ile uyumlu olduğu sürece önerilir. Modifiye dNTP'ler kullanılıyorsa, ilgili modifiye edilmemiş nükleotidi aynı miktarda modifiye nükleotid ile değiştirin. Tam bir reaksiyonda verimde önemli bir artış gözlemlenmediğinden, verimi yarım bir reaksiyon üzerinden değerlendirin. Birden fazla mRNA sentezlenirken, pipetleme hatalarını ve değişkenliği azaltmak için bir master mix oluşturulması önerilir.
  3. Pipetle alın ve kısa süreliğine iyice karıştırın, ardından yoğuşmayı önlemek için ısıtmalı kapakla 37 °C'de 5 sa boyunca inkübe edin. mRNA verimi veya bütünlüğü üzerinde minimum etkisi olduğundan, gerekirse inkübasyonu gece boyuna uzatın.
  4. 1 µL DNaz I ekleyin ve pipetle iyice karıştırın. 37 °C'de 30 dk inkübe edin.
  5. in vitro transkribe edilmiş (IVT) RNA'nın saflaştırılması
    1. IVT reaksiyonunu, üretici talimatlarına uygun olarak kolon tabanlı bir RNA Temizleme kiti kullanarak temizleyin (farklı kitler farklı geri kazanım seviyelerine ve değişken bağlanma kapasitelerine yol açabilir). Elüsyon için 60 µL nükleazdan arındırılmış su ekleyin ve santrifüjlemeden önce oda sıcaklığında 5 dk inkübe edin.
    2. Alternatif olarak, daha ucuz ve esnek bir yaklaşım olan lityum klorür çöktürmesini kullanın.
      1. Reaksiyona eşit hacimde 7.5 M lityum klorür ekleyin, karıştırın ve -20 °C'de gece boyunca inkübe edin.
      2. 4 °C'de 18,300 × g'de 20 dk santrifüjleyin, ardından RNA peletini bozmadan süpernatantı dikkatlice uzaklaştırın.
      3. 950 µL %70 etanol ile yıkayın ve 4 °C'de 18,300 × g'de 5 dk santrifüjleyin. Süpernatantı uzaklaştırın, peletin oda sıcaklığında yaklaşık 5 dk kurumasını bekleyin ve nükleazdan arındırılmış suda yeniden süspande edin (60 µL standarttır; konsantrasyonu artırmak için hacmi pelet boyutuna göre azaltın).
        DİKKAT: Uygun KKD kullanılmadığında Lityum Klorür cilt veya göz irritasyonuna neden olabilir. İşlem sırasında eldiven ve göz koruması kullanın. Ayrıca etanol, yüksek derecede yanıcı bir sıvıdır ve göz irritasyonuna neden olabilir. Açık alevlerden uzak tutun ve göz koruması dahil uygun KKD kullanın.
  6. mRNA miktarını bir spektrofotometre kullanarak belirleyin. mRNA için A260/A280 oranının ~2.0 olduğundan emin olun ve A260/A230 oranının 1.8 ile 2.2 arasında olduğunu doğrulayın.
  7. Başarılı bir IVT'yi doğrulamak için, Etidyum Bromür içeren %1'lik agaroz TAE (denatüre edilmemiş) jel hazırlayın. 500 ng mRNA'yı su ve yükleme boyası ile karıştırın; RNA merdiveni hazırlama ve denatürasyon talimatları için üretici talimatlarını izleyin. Agaroz jeli yükleyin ve TAE tamponunda 80 V'ta 40 dk çalıştırın. Bir jel görüntüleme sistemi ile görselleştirin.
  8. Doğru mRNA boyutunun daha ileri düzeyde doğrulanması için örnekleri bir Bioanalyser'da çalıştırın.
  9. Dondurma-çözme döngülerinden kaçınmak için mRNA'yı deney için gereken hacimlerde alikotlayın. Örneğin, 96 kuyucuklu bir plakanın her kuyucuğunda 1.2 pmol mRNA kullanın. Bu nedenle, 1.2 pmol × n replika için uygun hacmi alikotlayın ve ardından -80 °C'de saklayın.

3. HEK293 ters transfeksiyonu

NOT: Zamansal ölçümler gerçekleştirmek için, tamamlayıcı lusiferaz fragmanını konstitütif olarak eksprese eden bir hücre hattı gereklidir. Bu, gerekli lusiferaz fragmanını eksprese eden bir plazmidin transfeksiyonu ve ardından klonal seleksiyon yoluyla stabil bir hücre hattı oluşturularak sağlanabilir. Bu yöntem, kullanıcının seçtiği herhangi bir hücresel arka planda zamansal olarak çözünürleştirilmiş mRNA translasyonel dinamiklerini ölçmesine olanak tanır. Alternatif olarak, gerekli lusiferaz fragmanını eksprese eden hücre hatları satın alınabilir. Bu deneyler, tamamlayıcı heterodimeri konstitütif olarak eksprese eden HEK293 hücreleri kullanılarak gerçekleştirilmiştir.

  1. Başlamadan önce, degradasyonu önlemek için mRNA'yı buz üzerinde çözün.
  2. Transfeksiyon komplekslerini hazırlayın. 96 kuyucuklu bir plaka için kuyucuk başına 1,2 pmol mRNA gereklidir. Düplikasyonlu çalışılıyorsa, pipetleme hatasını karşılamak için 2,5 düplikasyona yetecek kadar hazırlayın. Bu nedenle, 3 pmol mRNA'yı 50 µL son hacme (20 µL/kuyucuk) ulaşacak şekilde Opti-MEM Reduced Serum Medium ile birleştirin.
  3. 0,5 µL katyonik lipid bazlı transfeksiyon reaktifi (0,2 µL/kuyucuk) ekleyin, pipetle yukarı-aşağı çekerek karıştırın ve oda sıcaklığında inkübe edin. 5 dakika inkübasyondan sonra tekrar pipetle yukarı-aşağı çekerek karıştırın, ardından 96 kuyucuklu beyaz düz tabanlı mikroplakanın her kuyucuğuna 20 µL ekleyin. Transfeksiyon kuyucuklarının, kenar kuyucukları boş bırakacak şekilde plakanın merkezine yerleştirilmesi önerilir.
  4. Besiyerini uzaklaştırıp Ca2+ ve Mg2+ içermeyen 2 mL fosfat tamponlu salyen (PBS) ile yıkayarak HEK293 hücrelerini hazırlayın. Yıkama solüsyonunu uzaklaştırın ve 500 µL Trypsin-EDTA ekleyip 37 °C'de 3 dakika inkübe edin.
  5. Hücre disosiasyonu sırasında, hücre kültürü boyunca besiyeri buharlaşmasını azaltmak için 96 kuyucuklu plakanın kenar kuyucuklarını PBS ile doldurun. Tüm kuyucukların kullanılması gerekiyorsa, kuyucuklar arasını PBS ile doldurabilirsiniz.
  6. Hücreleri toplamak için 1× L-glutamin ve %10 fetal bovin serum (FBS) ile desteklenmiş 4,5 mL Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) ekleyin. Bir hemositometre veya otomatik hücre sayıcı kullanarak hücre sayımı gerçekleştirin.
  7. Gerekli miktardaki hücreyi (kuyucuk başına 1 x 105 hücre ekimine yetecek kadar) artı 3 ekstra kuyucukluk payı (pipetleme hatası için) yeni bir tüpe aktarın ve 500 × g'de 2 dakika santrifüj edin.
  8. Süpernatantı uzaklaştırın ve hücreleri, 1 × 106 hücre/mL son konsantrasyonunu sağlamak için %10 FBS ve Endurazine Live Cell Substrate (1:200) ile desteklenmiş gerekli hacimdeki Leibovitz’s L-15 besiyerinde (fenol içermeyen) yeniden süspande edin. Endurazine'in tamamen karıştığından emin olmak için serolojik pipet ile karıştırın. Yeniden süspande edilen hücrelerden her kuyucuğa 100 µL (1 × 105 hücre) pipetleyin.
    NOT: 72 saat sürecek zaman serisi deneyleri yapılıyorsa, buharlaşmayı önlemek için hacmi 200 µL'ye çıkarın.
  9. Transfeksiyondan hemen sonra, hücreleri 37 °C'ye ayarlanmış bir plaka okuyucuya (luminometre) yerleştirin. 1 saniye entegrasyon süresiyle düzenli aralıklarla kayıtlar alın. Sistemin verimli komplemantasyonu nedeniyle sinyal dakikalar içinde tespit edilebilir. Bu nedenle, doğru bir bazal okuma elde etmek için bu adım derhal uygulanmalıdır. Bu aralıklar deneye ve cihaza bağlıdır; ancak bu deneylerde, 18 saatlik zaman serisi deneyleri için her 12 dakikada bir, 72 saatlik deneyler için ise sadece her 48 dakikada bir ölçüm yapmanın optimal olduğu görülmüştür. Lüminesans ölçümü için filtre gerekmemektedir; ancak 530–540 nm'lik bir filtre kullanıldığında daha iyi bir sinyal-gürültü oranı gözlemlenmiştir.
    NOT: Bölünmüş lüsiferaz etiketli eGFP'den bir Biyolüminesans Rezonans Enerji Transferi (BRET) sinyali üretilir, bu nedenle 530–540 nm'lik bir filtre hem lüminesan hem de floresan sinyali yakalayacaktır. BRET yakalanmasını önlemek için 460–480 nm'lik bir filtre kullanın veya alternatif olarak referans olarak MYL3 gibi floresan olmayan bir protein kullanın.

4. Veri analizi

  1. Deneyin başlangıcındaki sinyal arka plan seviyesi olduğundan, her koşulun sinyalini ilk zaman noktasına (teknik tekrarların ortalamasına normalize edilmiş t0) normalize ederek bağıl lüminesans birimleri (RLU) cinsinden kat değişimlerini hesaplayın.
  2. Kontrol koşuluna normalizasyon yaparak biyolojik tekrarlar arasındaki değişkenliği azaltın.
  3. Sorulan soruya bağlı olarak, deney için tek bir zaman noktası veya eğri altındaki alan (AUC) şeklinde bir istatistiksel analiz seçin.
    1. Tek bir zaman noktası için, pik ekspresyonun gerçekleştiği zaman noktalarını (bu POI'ye bağlıdır) ve bitiş zamanını kullanın. 4.1 adımında hesaplanan RLU değerini belirli bir zaman noktası için (örneğin 240 dk) grafiğe dökün ve uygun bir istatistiksel test kullanarak analiz edin.
    2. Belirli bir zaman aralığı (yani t0 ile 240 dk arası) veya deney süresi (yani t0 ile bitiş arası) için AUC değerini hesaplayarak protein translasyonu ve degradasyon dinamiklerini ölçün. Her biyolojik tekrar için AUC değerini referans mRNA'nın ortalamasına normalize edin; böylece uygun istatistiksel testlerle analiz edilebilecek bir AUC kat değişim ölçümü elde edin.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokolün maliyet etkinliği çeşitli yollarla optimize edilebilir. Örneğin, IVT reaksiyonu üretici tarafından önerilen hacmin yarısına indirgenmiş ve elde edilen verimin in cellulo deneyleri için gereken miktarı karşıladığı görülmüştür. Sekans uzunluğunun ve karmaşıklığının IVT verimini etkilediği unutulmamalıdır; bu nedenle başarılı bir protokol optimizasyonu, IVT reaksiyonu başına en az 50 µg mRNA sağlamalıdır. IVT reaksiyon kitleri gibi, capping reaktifleri de genellikle oldukça maliyetlidir. mRNA molekülü başına yalnızca bir cap gerektiği göz önüne alındığında, IVT reaksiyonunun, ortaya çıkan mRNA moleküllerinin sayısına kıyasla fazla miktarda cap molekülü içerdiğini varsayıyoruz. Bu nedenle, IVT reaksiyonuna eklenen capping reaktifi miktarının titrasyonu ile protokolün daha fazla optimize edilip edilemeyeceği araştırılmış ve sonuçları Şekil 2'de gösterilmiştir. 10 µL'lik IVT reaksiyonlarına capping reaktifinin %100'ü (final 10 mM cap), %50'si, %25'i veya %0'ı (capped edilmemiş) eklenmiş ve elde edilen eGFP mRNA, tamamlayıcı heterodimeri konstitütif olarak eksprese eden HEK293 hücrelerine transfekte edilmiştir. Normalizasyon kontrolü olarak MYL3 (%100 capped) de transfekte edilmiştir; çünkü kas bakımından zengin bir yapısal proteini kodlayan bu endojen gen, eGFP ile benzer translasyon dinamikleri sergilemekle birlikte, diğer endojen genlerininkine daha yakın bir sinyal vermektedir3. Önceki verilerle3 tutarlı olarak, capped edilmemiş eGFP mRNA, mock kontrolle benzer şekilde translasyon eksikliği ile sonuçlanmıştır (Şekil 2A). Önerilen capping reaktifinin %25'i veya %50'si ile sentezlenen eGFP mRNA, %100 ile karşılaştırılabilir ekspresyon seviyeleri göstermiş (Şekil 2A) ve 18 saatlik zaman seyri boyunca eğri altındaki alan (AUC) değerlerinde herhangi bir fark oluşmamıştır (Şekil 2B). Bu sonuçlar, bu koşullar altında capping reaktifinin fazla miktarda bulunduğunu ve konsantrasyonunun düşürülmesinin, yeterli cap inklüzyonu ile tutarlı olarak translasyonel çıktıyı bozmadığını göstermektedir. Şekil 2'de sunulan bulgular kullanılan capping reaktifi markasına özgüdür ve farklı reaktifler için optimize edilmelidir.

Kep teknolojisindeki ilerlemeler ve modifiye nükleotidlerin kullanımı mRNA ekspresyonunu artırmış olsa da, mRNA tasarım algoritmalarının geliştirilmesi ekspresyonu daha da iyileştirmiştir. Bu algoritmalar, sırasıyla minimum serbest enerjiyi (MFE) ve kodon adaptasyon indeksini (CAI) iyileştirerek mRNA stabilitesini ve kodon kullanımını optimize etmeye odaklanır. Optimizasyonun mRNA ekspresyonu üzerindeki etkisini test etmek için LinearDesign9 kullanılmıştır. Bu algoritma, optimizasyon formüllerinde kullanılan ve bir algoritmanın MFE veya CAI'yi ne kadar güçlü bir şekilde tercih ettiğini belirleyen bir ölçeklendirme parametresi olan lambda değerinin girişine dayanır. Aynı optimizasyon ayarları (yani aynı lambda değeri), dört transkripsiyon faktörüne – HAND2, GATA4, MEF2C ve TBX5 – uygulanmıştır. Şekil 3, optimizasyonun translasyon hızları üzerindeki etkilerini incelemektedir. Optimizasyon, tüm transkripsiyon faktörleri için hem MFE hem de CAI değerlerini iyileştirmiş olup, her iki parametrede de en büyük değişimler MEF2C'de görülmüştür (Şekil 3A). Her bir konstrüktün C-terminusuna, önünde bir GS linker bulunacak şekilde bölünmüş bir lüminesans etiketi bağlanmış ve dört transkripsiyon faktörünün hem optimize edilmemiş hem de optimize edilmiş formları için mRNA sentezlenmiştir. Her bir mRNA'nın transle edilebildiğinden ve beklenen moleküler ağırlıktaki proteini ürettiğinden emin olmak için tavşan retikülosit lizatı hücre dışı translasyon sistemi3 kullanılmıştır. Ortaya çıkan proteinler, bölünmüş lüsiferaz proteininin enzimatik alt birimi ve uygun substrat kullanılarak bölünmüş lüminesans etiketini tespit etmek amacıyla western blot ile çözümlenmiştir. Western blot analizi, optimizasyonun hâlâ beklenen moleküler ağırlığa uygun proteinler ürettiğini göstermiştir (Şekil 3B). HEK293 hücreleri, her bir transkripsiyon faktörünün optimize edilmemiş veya optimize edilmiş formları ile transfekte edilmiş ve 18 saat boyunca canlı hücre kayıtları alınmıştır. Tüm 18 saatlik deneyler için üç biyolojik tekrardan ölçümler alınmış ve her tekrarlanan deneyde örnek başına üç teknik tekrar kullanılmıştır. HAND2 (Şekil 3C) ve GATA4'ün (Şekil 3D) optimizasyonu, optimize edilmemiş karşılıklarıyla karşılaştırıldığında sırasıyla 1,07 kat artış ve 1,25 kat azalma ile ekspresyon üzerinde herhangi bir etki yaratmamıştır (eşleşmemiş iki örneklemli t-testi ile belirlenmiştir). Bu sırada, MEF2C (Şekil 3E) ve TBX5'in (Şekil 3F) optimizasyonu, sırasıyla AUC'de 2,25 (P = 0,0486, n = 3, eşleşmemiş iki örneklemli t-testi) ve 1,72 katlık (P = 0,0379, n = 3, eşleşmemiş iki örneklemli t-testi) bir artışla ekspresyonda istatistiksel olarak anlamlı bir artışa yol açmıştır. Bununla tutarlı olarak, farklılıklar sadece uç nokta ekspresyonunda değil, aynı zamanda ekspresyon eğrilerinin şeklinde ve hızında da gözlemlenmiş olup, bu durum analiz yönteminin zaman içindeki translasyonel dinamiklerdeki değişimleri çözebildiğini göstermektedir. Bu ekspresyon artışının daha uzun bir süre boyunca korunup korunmadığını belirlemek için HEK293 hücreleri MEF2C mRNA'sı ile transfekte edilmiş ve 72 saat boyunca kayıtlar alınmıştır (Şekil 3G). 18 saatlik deneylerde olduğu gibi, üç biyolojik tekrardan ölçümler alınmış ve her tekrarlanan deneyde örnek başına üç teknik tekrar kullanılmıştır. 18 saat sonra gözlemlenenlere benzer şekilde, optimize edilmiş MEF2C, optimize edilmemiş versiyona kıyasla AUC'de 2,5 katlık (P = 0,0061, n = 3, eşleşmemiş iki örneklemli t-testi) bir iyileşme ile ekspresyonu önemli ölçüde artırmıştır. Optimizasyonla ekspresyonda ciddi bir artış olsa da, bu sonuçlar optimizasyonun bu durumda 72 saat boyunca yıkımı önlemediğini kanıtlamakta olup, her iki MEF2C formu 24. saatten itibaren benzer eğimler sergilemiştir. Bu yıkım muhtemelen lineer mRNA degradasyonu ve/veya hücre bölünmesinden kaynaklanmaktadır. Birlikte ele alındığında bu sonuçlar, mRNA tasarım algoritmalarının mRNA ekspresyonunu iyileştirme potansiyelini kanıtlamaktadır; ancak optimizasyonun POI'ye bağımlı bir şekilde gerçekleştirilmesi gerektiğini vurgulamaktadır.

figure-results-1
Şekil 1: HEK293 hücrelerinde mRNA sentezi ve bölünmüş lüminesans etiketi deneyi için iş akışı. Bölünmüş lüminesans etiketi deneyi için IVT gerçekleştirmek için; plazmidin bir RNA polimeraz promotörü (T7 veya SP6), 5’ ve 3’ UTR'ler ve kısa bir lusiferaz alt birimi HB (HiBiT) ile birleştirilmiş ilgi duyulan proteinin kodlayan dizilerini içerdiğinden emin olun. Plazmid, tek bir bölgeyi kesen bir restriksiyon enzimi ile lineerize edilerek Poly T PCR için kalıp sağlar ve bu PCR ürünü daha sonra IVT için kalıp olarak kullanılır. mRNA sentezlenir, lipozomlarla kompleks oluşturulur ve büyük lusiferaz alt birimini (LB) konstitütif olarak eksprese eden HEK293 hücrelerine ters transfekte edilir; bu hücreler canlı kayıtların ölçüldüğü bir plaka okuyucuya hemen yerleştirilebilir. Deney tamamlandıktan sonra, normalizasyon ve ardından gelen istatistiksel analiz için veri analizi gerçekleştirilir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-2
Şekil 2: Capping reaktifi konsantrasyonundaki dört katlık azalma, tam konsantrasyonla karşılaştırılabilir eGFP ekspresyonu üretir.(A) Farklı konsantrasyonlarda capping reaktifi, MYL3 veya Mock ile eGFP mRNA transfekte edilmiş HEK293 hücrelerinde canlı hücresel kinetik analiz, veriler t0 değerine normalize edilmiştir; noktalar her zaman noktası için en az üç biyolojik tekerrürün ortalamasını temsil etmektedir. (B) En az üç biyolojik tekerrürün 18 saatlik zaman seyri eğrilerinin AUC değerindeki kat değişimi, referans örnek MYL3'e normalize edilerek elde edilmiş ve Tukey çoklu karşılaştırma testi ile tek yönlü ANOVA kullanılarak karşılaştırılmıştır. Veriler, her bir nokta bir biyolojik tekerrürün ortalamasını temsil edecek şekilde ortalama ± standart hata (SEM) olarak gösterilmiştir. ***P < 0.001. (eGFP – geliştirilmiş yeşil floresan protein; AUC – eğri altındaki alan; RLU – bağıl lüminekans birimleri) Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-3
Şekil 3: Sekans optimizasyonu, POI'ye bağlı olarak mRNA translasyonunu iyileştirir. (A) mRNA sekansının LinearDesign optimizasyonu, her bir transkripsiyon faktörü için minimum serbest enerji (MFE) değerlerinde azalma ve kodon adaptasyon indeksi (CAI) değerlerinde artışla sonuçlanmıştır. (B) Optimize edilmemiş ve optimize edilmiş HAND2, GATA4, MEF2C, TBX5 kodlayan mRNA'lar veya RNA içermeyen örnekler için RRL reaksiyonları 120 dk boyunca gerçekleştirilmiştir. Elde edilen proteinler western blotting için işlenmiş ve membranın split luciferase sistemindeki enzimatik alt birim ve uygun substrat ile inkübasyonu yoluyla kemilüminesans ile tespit edilmiştir. Optimize edilmemiş veya optimize edilmiş HAND2 (C), GATA4 (D), MEF2C (E) veya TBX5 (F) ile birlikte MYL3 ve Mock transfekte edilmiş HEK293 hücrelerinde canlı hücresel kinetik analizi. Veriler t0 değerine göre normalize edilmiş olup noktalar, her zaman noktası başına üç biyolojik tekrarın ortalamasını temsil etmektedir. Üç biyolojik tekrarın 18 saatlik zaman seyri için eğrilerin AUC değerindeki kat değişimi, referans örnek MYL3'e normalize edilerek elde edilmiş ve Welch düzeltmeli eşleşmemiş t-testi ile karşılaştırılmıştır. Veriler mean ± SEM olarak gösterilmiş olup her nokta bir biyolojik tekrarın ortalamasını temsil etmektedir. *P < 0.05. (G) Optimize edilmemiş veya optimize edilmiş MEF2C, MYL3 ve Mock transfekte edilmiş HEK293 hücrelerinde canlı hücresel kinetik analizi; veriler t0 değerine göre normalize edilmiş olup noktalar, her zaman noktası başına üç biyolojik tekrarın ortalamasını temsil etmektedir. Üç biyolojik tekrarın 72 saatlik zaman seyri için eğrilerin AUC değerindeki kat değişimi, referans örnek MYL3'e normalize edilerek elde edilmiş ve Welch düzeltmeli eşleşmemiş t-testi ile karşılaştırılmıştır. Veriler mean ± SEM  olarak gösterilmiş olup her nokta bir biyolojik tekrarın ortalamasını temsil etmektedir. **P < 0.01. (MFE – minimum serbest enerji; CAI – kodon adaptasyon indeksi; RRL – tavşan retikülosit lizatı; AUC – eğri altındaki alan, RLU – göreceli lüminesans birimleri) Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

mRNA terapötikleri alanı son yıllarda hızla genişlemiş, bu da sekans tasarımının ve optimizasyonunun geliştirme sürecindeki kritik bir aşama olarak önemini vurgulamıştır. Özellikle sekans optimizasyonuna odaklanılarak, en etkili RNA yapılarını ve kompozisyonlarını öngörmek için hesaplamalı araçların oluşturulmasına yönelik önemli çalışmalar yapılmıştır8,9. Bu araçlar güçlü olsa da, söz konusu tasarımların deneysel doğrulaması hala sürecin temel bir parçasıdır. Ancak, bu doğrulama işlemi büyük ölçüde GFP7, NanoLuc8 ve SARS-CoV-2 spike proteini9  gibi zaten son derece stabil ve yüksek düzeyde transle edilebilir olan rapor proteinlerine dayanmıştır. Bu kısıtlamayı aşmak için, HEK293 hücrelerinde in vitro transkribe edilmiş mRNA'nın translasyon dinamiklerini incelemek ve zamansal çözünürlük sağlamak amacıyla bir bölünmüş lüsiferaz sistemi bir iş akışına entegre edilmiş3 ve mRNA mühendisliği sonrası translasyondaki değişiklikleri tespit etmede rapor proteinleri kullanmanın kısıtlamaları ortaya konmuştur. Bu yöntemin makalesi, bu analizin gerçekleştirilmesi için gereken adımları göstermekte; IVT reaksiyonunun minyatürize edilebileceğini ve 5’ kap konsantrasyonunun translasyonel sonuçlar doğurmadan azaltılabileceğini, böylece maliyetlerin düşürülebileceğini kanıtlamaktadır. Önceki gözlemlerimizden yola çıkarak, artırılmış ekspresyon elde etmek için mRNA sekans optimizasyonunda POI'ye bağımlı bir yaklaşımın gerekli olduğunu vurguluyoruz.

Burada açıklandığı üzere, bölünmüş lüminesans etiket deneyi, kullanıcıların ilgilendikleri proteinin (POI) zamansal ekspresyonunu gerçek zamanlı olarak incelemelerine olanak tanıyan, mRNA translasyonunun orta ölçekli ölçümünü sağlayan nispeten basit bir işlem hattıdır. Ancak, güvenilir sonuçlar elde etmek için gereken birçok kritik adım ve husus bulunmaktadır. İlk olarak, tüm alt sonuçlar, IVT ve bunun için kullanılan ekipmanın dekontaminasyonu ile başlayan mRNA kalitesine bağlıdır. Sentez sonrası mRNA'nın saklanması kilit önem taşır; mRNA elüsyon sonrası buz üzerinde tutulur ve mRNA boyutunun onaylanmasının ardından, dondurma-çözme döngülerini önlemek için çalışma hacimlerinde alikotlara ayrılarak -80°C'de saklanmaya devam eder. İkinci olarak, kullanılan 96 kuyucuklu plaka son derece önemlidir ve deneyler arasında tutarlı olmalıdır. Bu protokol için tamamen beyaz bir 96 kuyucuklu plaka kullanıldığından emin olun. Hücre morfolojisinin izlenmesi gerekiyorsa, altı şeffaf, duvarları beyaz plakalar kullanılabilir; bunlar çok daha düşük bir sinyalle sonuçlanır, bu nedenle iki plaka tipi birbirinin yerine kullanılamaz. Aynı mRNA'ların translasyonu altı şeffaf, duvarları beyaz bir plaka ile ölçüldüğünde, ortaya çıkan lüminesans sinyalinin, paralel bir tamamen beyaz duvarlı plakadan 5 kat daha düşük olduğu gözlemlenmiştir. Bu teknik not, verimsiz translasyonel dinamiklere sahip genler değerlendirilirken etkili olabilir. Sinyaldeki azalma, verilerde tutarsızlığa yol açmanın yanı sıra, mRNA dizisi veya yapısal pertürbasyonların neden olduğu ince farkların tespit edilmesini engelleyebilir. Üçüncü olarak, L-15 besiyerinin kullanımı bu deney için kilit rol oynar; çünkü CO2 takviyesi olmayan bir ortamda hücre canlılığını sağlar25, bu da kullanılan lüminometre konusunda esneklik sunar. Ek olarak, fenol içermeyen L-15 kullanımı, lüminesans ölçümü sırasında arka plan sinyalini azaltır. Son olarak, kültürleme ve lüminesans ölçümünün 37°C'de (veya ilgilenilen hücre tipinin kültür koşullarında) yapılması gerekir. Bu deneyi oda sıcaklığında gerçekleştirmek, translasyon elongasyon hızının azalması26 nedeniyle sonuçları büyük ölçüde değiştirecek ve normal kinetiğin gözlemlenmemesine yol açacaktır.

in vitro transkribe edilen mRNA tasarımının çok yönlülüğü, çok sayıda modifikasyona izin veren sentez sürecine aktarılabilir. Gözlemlendiği üzere, 5' kep konsantrasyonu 4 kat azaltılabildiği halde hala benzer ekspresyon sağlanabilmekte ve bu da araştırmacıların maliyetleri düşürmesine olanak tanımaktadır. IVT sonrası kepleme verimliliği doğrudan ölçülmemiş olsa da, IVT havuzundaki keplemesiz mRNA oranının artması, keplemesiz mRNA tarafından gösterildiği gibi sinyalde azalmaya yol açardı; ancak bu gözlemlenmemiştir. Ek olarak, eGFP'nin sadece 27 kDa'lık nispeten küçük bir protein olduğu düşünüldüğünde, kep konsantrasyonundaki bu modülasyon, IVT sonrası keplenecek daha az transkript olacağı için daha büyük genlere kolayca uygulanabilir. İmmünojeniteyi3 ve protein ekspresyonunu27 etkileyen, farklı metilasyon modifikasyonlarına sahip birden fazla kep analoğu mevcuttur. Ayrıca, kepleme işlemi ko-transkripsiyonel olarak (burada gösterildiği gibi) veya Vaccinia virüsü kullanılarak post-transkripsiyonel olarak gerçekleştirilebilir; bu yöntem %100 kepleme verimliliğiyle28 sonuçlanır ancak ekstra saflaştırma adımları gerektirir. mRNA'nın laboratuvar ölçekli üretimi için saflaştırma kolonları hızlı ve verimli oldukları için yaygın olarak kullanılırlar, ancak maliyetlidirler. Daha ucuz ve daha çok yönlü bir yaklaşım olan lityum klorür çöktürmesi, daha fazla zaman alsa da, kullanıcının mRNA'yı konsantre etmesine olanak tanır ve verimi kolon bağlanma kapasitesiyle kısıtlamaz; bu nedenle ölçek büyütme için uygundur. Saflaştırma kolonları gibi, bu yaklaşım da immünojeniteye29 neden olan çift zincirli RNA'ları ve kesilmiş RNA fragmanlarını tamamen temizlemez. 5' keplemesine benzer şekilde, poly(A) kuyruğunun eklenmesi, burada açıklanandan farklı alternatif yöntemlerle gerçekleştirilebilir. Kuyruğun PCR ile eklenmesine benzer olarak, plazmid DNA'sı bir poly(A) kuyruğu içerecek şekilde tasarlanabilir; ancak bu uzun diziler rekombinasyona uğrayarak heterojen ve kısalmış poly(A) sekanslarıyla sonuçlanabilir. Bununla birlikte, poly(A) segmentasyonu – heteronükleotid ara dizilerin eklenmesi – bu etkileri minimize etmiştir30,31. Alternatif olarak, poly(A) kuyruğu, daha uzun poly(A) kuyruklarının üretilmesine olanak tanıyan kalıptan bağımsız bir poly(A) polimeraz kullanılarak oluşturulabilir32, ancak bu durum düzenleyici gereklilikleri etkileyebilecek heterojenite riskini beraberinde getirir33.

Tanımlanan bölünmüş lüminesans etiket analizi, eksojen olarak iletilen mRNA'nın protein ekspresyonunu ölçmede son derece etkili olsa da, araştırma sorusuna bağlı olarak dikkate alınması gereken bazı sınırlamalar vardır. İlk olarak, bölünmüş lusiferazın bir yarısını konstitütif olarak eksprese eden bir hücre hattı oluşturma ihtiyacı vardır. Bu hazır olarak satın alınabilse de, şu an için yalnızca HEK293 hücreleri ile sınırlıdır. İlgilenilen hücre tipinde stabil bir hattın oluşturulması zorlayıcıysa, HEK293'ler, insan embriyonik kök hücreleri ve diferansiye kardiyomiyositler arasında aynı sonucu gösterdiğini saptadığımız litik bir analiz mevcuttur3. Ancak, daha önce yayınlanmış bu çalışmadaki3 litik analiz için seçilen zaman noktası, canlı hücre HEK293 verileriyle yönlendirilmiştir. İkinci olarak, analiz canlı hücre temporal çözünürlüğü sağlamaktadır ancak bazı araştırmacıların ilgisini çekebilecek olan canlı hücre spatial çözünürlüğünü sunamamaktadır. Bununla birlikte, bu deneylerde kullanılan kısa lusiferaz peptid etikete karşı floresan immünositokimya için iyi çalışan bir primer antikor mevcuttur ve bu da transle edilen POI'nin spatial sorgulamasını mümkün kılmaktadır. Ek olarak, lüminesans görüntüleme yapabilen bir mikroskop, tek hücre çözünürlüğünde veri sağlayabilir. Spatiotemporal bilgi sunan bir yaklaşım, GFP etiketli scFv'nin peptid epitoplarına bağlanması arasındaki etkileşimler aracılığıyla canlı hücre görüntüleme kullanarak aktif translasyonu ve lokalizasyonu ölçen SunTag'dir14,34. Ancak, bu epitopların 24 tandem tekrarı gerekmektedir, bu da potansiyel olarak translasyonu bozabilirken iş akışı nispeten düşük verimlidir. Üçüncü olarak, bölünmüş lüminesans etiket mRNA bolluğunun ölçülmesine olanak tanır ancak bunu canlı hücrelerde yapamaz. Önceki çalışmamızda3, eksojen olarak iletilen transkripte özgü primerler kullanılarak ekstrakte edilen RNA üzerinde qRT-PCR gerçekleştirilmiş; bu da konstrüktler arasındaki transfeksiyon verimliliği ve zaman noktaları arasındaki azalma için mRNA seviyelerini doğrulamıştır. Bir başka yaklaşımda, mRNA stabilitesini ölçmek için Northern blotting kullanımı görülmüştür35. Ancak, her iki yaklaşım da zahmetlidir ve sürekli ölçümler sağlayamaz. Şu anda, canlı hücrelerde mRNA translasyonu ve bolluğunun eş zamanlı ölçümlerine olanak tanıyan bir yöntem mevcut değildir ve bu durum, bu alanda analiz geliştirmek için potansiyel bir yol sunmaktadır.

Bölünmüş lüsiferaz sistemi başlangıçta protein dinamiğini incelemek için uygulanmıştır, ancak bu assay'in diğer araştırma alanlarında da önemli etkileri olduğu burada açıkça görülmektedir. Yeni gen tedavisi yaklaşımlarında mRNA terapötiklerinin ön planda olmasıyla birlikte, bu assay, araştırmacıların potansiyel terapötiklerinin ekspresyonunu karakterize etmelerine ve bunu artırılmış ekspresyon için optimize etmelerine olanak sağlamak adına mükemmel bir şekilde uygundur. Daha önce belirtildiği gibi, kodon optimizasyonu, birden fazla aracın geliştirilmesiyle mRNA tasarımında güçlü ve yeni bir araç haline gelmiştir8,9,36. Tek tip bir sekans optimizasyon yaklaşımı dört transkripsiyon faktörüne uygulandığında, tüm genler için hem MFE hem de CAI iyileştirilmiş, ancak sadece MEF2C ve TBX5 artmış ekspresyon göstermiştir. Özellikle, yalnızca eş anlamlı kodlama sekansı varyasyonlarından kaynaklanan ekspresyon farklılıklarının tespitine olanak tanıyarak bu yaklaşım, canlı hücrelerdeki translasyon verimliliğini yüksek zamansal çözünürlükle sorgulamak için benzersiz bir platform sunmaktadır. Bu bulgular, artırılmış ekspresyon elde etmek için sekans optimizasyonunun; başlangıç GC içeriğini, kodon kullanımını ve RNA sekonder yapısını POI'ye bağımlı bir şekilde dikkate alması gerektiğini ortaya koymaktadır. Daha fazla konstrüktun test edilmesi gerekse de, bölünmüş lüminesans etiket assay'i, POI için optimal adayı belirlemek üzere yüksek kapasiteli analiz potansiyeline sahiptir. Ayrıca, daha önce gösterildiği gibi3, bu assay, mRNA'nın herhangi bir sekans veya yapısal bileşeninin bozulmasının etkilerini ölçebilir ve böylece uygulamalarını daha da genişletir. mRNA'daki değişikliklerin araştırılmasının yanı sıra, bölünmüş lüminesans etiket assay'i iletim ve formülasyon araştırmalarında da kullanılabilir. 5' kaplarındaki iyileştirmelere ve modifiye nükleotidlerin kullanımına rağmen, ekzojen olarak iletilen mRNA, degradasyonu önlemek ve hücresel alımı sağlamak için bir paketleme sistemine ihtiyaç duyar37. Lipid nanopartiküller38, hücre dışı veziküller39 ve biyomimetikler40 mRNA iletiminin ön saflarında yer alsa da, hala daha fazla geliştirme gereklidir. Bölünmüş lüminesans etiketli mRNA'nın bu taşıyıcılardan herhangi birine enkapsülasyonu, bunların iletim verimliliğinin karakterizasyonuna olanak tanır ve araştırmacıların modifiye edilmiş taşıyıcıları orta ila yüksek kapasiteli bir şekilde test etmelerini sağlar. Translasyon odaklı araştırmaların dışında, bölünmüş lüminesans etiket assay'i temel biyoloji için de kolayca kullanılabilir. İster sekans ve yapısal element pertürbasyonlarının mRNA translasyonu üzerindeki etkilerinin değerlendirilmesi, ister translasyon mekanizması fonksiyonuna müdahale edilmesi veya proteazomun incelenmesi olsun, bölünmüş lüminesans etiketleme sistemi çekici bir seçenek sunmaktadır.

Genel olarak, burada açıklanan bölünmüş lüminesans etiket sistemi, translasyonel dinamiklerin bir çıktısı olarak sentetik mRNA güdümlü protein ekspresyonunu zamansal olarak izlemek için esnek ve sağlam bir analiz sunmaktadır. Canlı hücre analizinin uygulanması, mRNA translasyonu alanındaki önceki birçok kısıtlamanın üstesinden gelmekte; protein sentezi ve POI degradasyonu dinamikleri hakkında kritik bilgiler ortaya çıkarmaktadır. Transkriptler farklı düzenleyici ve ekspresyon profillerine sahip olduğundan, terapötik POI'nin karakterize edilmesi, mRNA terapötiklerinin gelişmeye devam etmesi ve kliniğe aktarılması için zorunludur.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar beyan edilecek herhangi bir çıkar çatışmasına sahip değildir.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, HEK293 LgBiT hücre hattı için Laura Itzhaki'ye teşekkür ederler. Bu çalışma, British Heart Foundation proje hibe ve translasyonel ödülü (CHW'ye verilen G114642 ve G919651) ile bir GenScript Life Science Araştırma Hibesi (CAPB) tarafından desteklenmiştir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Asetik AsitSigma-AldrichA6283TAE tamponu bileşeni
AgarozSigma-AldrichA9539Jel elektroforezi
Agilent 2100 BioanalyzerAgilentG2939BmRNA kalite kontrolü için kullanılan biyanalizör
CLARIOstar Plus LuminometreBMG Labtech430-501S-FLüminesans ölçümü için kullanılan plak okuyucu/luminometre
CleanCap AGTrilink BiotechnologiesN-7113IVT için kullanılan 5' kep (cap)
DMEM, yüksek glukoz, piruvatThermo Fisher Scientific41966029HEK293-LgBiT hücrelerinin kültürü için kullanılan besiyeri
DNase INew England BiolabsM0303IVT reaksiyonu sonrası DNA kalıbını degrade eder
Dulbecco Fosfat Tamponlu Salin (PBS)Sigma-AldrichD8537Hücre yıkama ve buharlaşmayı önlemek için plağa ekleme amaçlı
EDTA, pH 8.0, RNase-freeThermo Fisher ScientificAM9260TAE tamponu bileşeni
Etidyum BromürSigma-AldrichE1510Jel elektroforezi için boya
Fetal Bovin Serum (FBS)Sigma-AldrichF7524DMEM'e eklenen takviye
HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis KitNew England BiolabsE2040In vitro transkripsiyon (IVT) kiti
Leibovitz L-15 Besiyeri, fenol kırmızısızThermo Fisher Scientific21083027Lüminesans ölçümleri sırasında HEK293-LgBiT kültürü için kullanılan besiyeri
L-glutaminThermo Fisher Scientific25030-024DMEM'e eklenen takviye
Lipofectamine RNAiMAXThermo Fisher Scientific13778150Lipid tabanlı transfeksiyon reaktifi
Lityum Klorür Presipitasyon SolüsyonuThermo Fisher ScientificAM9480IVT sonrası mRNA saflaştırması için alternatif yaklaşım
Monarch Spin PCR & DNA Cleanup KitNew England BiolabsT1130Plazmit lineerizasyonu sonrası saflaştırma kiti
NanoDrop One Mikrohacim UV-Vis SpektrofotometreThermo Fisher ScientificND-ONE-WDNA ve mRNA konsantrasyonunu belirlemek için kullanılan spektrofotometre
Nano-Glo Endurazine Live Cell SubstratePromegaN2570L-15 besiyerine eklenen, lüminesans için gerekli substrat 
NucleoSpin RNA Cleanup KitMacherey-Nagel12708612IVT reaksiyonu sonrası mRNA'yı saflaştırır
Nunc MicroWell 96-Well, Nunclon Delta-Treated, Düz Tabanlı MikroplakaThermo Fisher Scientific136101HEK293-LgBiT ekimi ve sonraki ölçümler için kullanılan plaka
Opti-MEM İndirgenmiş Serum BesiyeriThermo Fisher Scientific31985062Transfeksiyon reaksiyonu için kullanılan besiyeri
Phusion High-Fidelity PCR KitNew England BiolabsE0553PCR kiti
RiboRuler High Range RNA LadderThermo Fisher Scientific11883993Jel elektroforezi için RNA merdiveni
RNaseZapThermo Fisher ScientificR2020RNase dekontaminasyon spreyi
TRIZMA BaseSigma-AldrichT6066TAE tamponu bileşeni
Tripsin-EDTA SolüsyonuSigma-AldrichT4174Hücre disosiasyon reaktifi
UltraPure DNase/RNase free Distile SuThermo Fisher Scientific10977035Kalıp hazırlama ve IVT için kullanılır

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Polack FP et al. Safety and efficacy of the BNT162b2 mRNA COVID-19 vaccine. N Engl J Med. 2020;383(27):2603-2615.
  2. Baden LR et al. Efficacy and safety of the mRNA-1273 SARS-CoV-2 vaccine. N Engl J Med. 2021;384(5):403-416.
  3. Ascanelli C, Lawrence E, Batho CAP, Wilson CH. A flexible, high-throughput system for studying live mRNA translation with HiBiT technology. Nucleic Acids Res. 2025;53(11).
  4. Qin S et al. mRNA-based therapeutics: Powerful and versatile tools to combat diseases. Signal Transduct Target Ther. 2022;7(1):166.
  5. Kariko K, Buckstein M, Ni H, Weissman D. Suppression of RNA recognition by Toll-like receptors: The impact of nucleoside modification and the evolutionary origin of RNA. Immunity. 2005;23(2):165-175.
  6. Sample PJ et al. Human 5' UTR design and variant effect prediction from a massively parallel translation assay. Nat Biotechnol. 2019;37(7):803-809.
  7. Leppek K et al. Combinatorial optimization of mRNA structure, stability, and translation for RNA-based therapeutics. Nat Commun. 2022;13(1):1536.
  8. Vostrosablin N et al. mRNAid, an open-source platform for therapeutic mRNA design and optimization strategies. NAR Genom Bioinform. 2024;6(1):lqae028.
  9. Zhang H et al. Algorithm for optimized mRNA design improves stability and immunogenicity. Nature. 2023;621(7978):396-403.
  10. Chasse H, Boulben S, Costache V, Cormier P, Morales J. Analysis of translation using polysome profiling. Nucleic Acids Res. 2017;45(3):e15.
  11. Ingolia NT, Ghaemmaghami S, Newman JR, Weissman JS. Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling. Science. 2009;324(5924):218-223.
  12. Choe HK, Cho J. Comprehensive genome-wide approaches to activity-dependent translational control in neurons. Int J Mol Sci. 2020;21(5):1592.
  13. Cacioppo R, Lindon C. Immunoprecipitation of reporter nascent chains from active ribosomes to study translation efficiency. Bio Protoc. 2023;13(18):e4821.
  14. Tanenbaum ME, Gilbert LA, Qi LS, Weissman JS, Vale RD. A protein-tagging system for signal amplification in gene expression and fluorescence imaging. Cell. 2014;159(3):635-646.
  15. Pichon X et al. Visualization of single endogenous polysomes reveals the dynamics of translation in live human cells. J Cell Biol. 2016;214(6):769-781.
  16. Wu B, Eliscovich C, Yoon YJ, Singer RH. Translation dynamics of single mRNAs in live cells and neurons. Science. 2016;352(6292):1430-1435.
  17. Dixon AS et al. Nanoluc complementation reporter optimized for accurate measurement of protein interactions in cells. ACS Chem Biol. 2016;11(2):400-408.
  18. Schwinn MK et al. CRISPR-mediated tagging of endogenous proteins with a luminescent peptide. ACS Chem Biol. 2018;13(2):467-474.
  19. Wang T et al. Translating mRNAs strongly correlate to proteins in a multivariate manner and their translation ratios are phenotype specific. Nucleic Acids Res. 2013;41(9):4743-4754.
  20. Balleza E, Kim JM, Cluzel P. Systematic characterization of maturation time of fluorescent proteins in living cells. Nat Methods. 2018;15(1):47-51.
  21. Koker T, Fernandez A, Pinaud F. Characterization of split fluorescent protein variants and quantitative analyses of their self-assembly process. Sci Rep. 2018;8(1):5344.
  22. Hoare BL, Kocan M, Bruell S, Scott DJ, Bathgate RAD. Using the novel HiBiT tag to label cell surface relaxin receptors for BRET proximity analysis. Pharmacol Res Perspect. 2019;7(4):e00513.
  23. Boursier ME et al. The luminescent HiBiT peptide enables selective quantitation of G protein-coupled receptor ligand engagement and internalization in living cells. J Biol Chem. 2020;295(15):5124-5135.
  24. Winter GE et al. Drug development: Phthalimide conjugation as a strategy for in vivo target protein degradation. Science. 2015;348(6241):1376-1381.
  25. Leibovitz A. The growth and maintenance of tissue-cell cultures in free gas exchange with the atmosphere. Am J Hyg. 1963;78:173-180.
  26. Farewell A, Neidhardt FC. Effect of temperature on in vivo protein synthetic capacity in Escherichia coli. J Bacteriol. 1998;180(17):4704-4710.
  27. Mandell ZF et al. CleanCap M6 inhibits decapping of exogenously delivered IVT mRNA. Mol Ther Nucleic Acids. 2025;36(1):102456.
  28. Ensinger MJ, Martin SA, Paoletti E, Moss B. Modification of the 5'-terminus of mRNA by soluble guanylyl and methyl transferases from vaccinia virus. Proc Natl Acad Sci U S A. 1975;72(7):2525-2529.
  29. Gholamalipour Y, Karunanayake Mudiyanselage A, Martin CT. 3' end additions by T7 RNA polymerase are RNA self-templated, distributive, and diverse in character RNA-seq analyses. Nucleic Acids Res. 2018;46(18):9253-9263.
  30. Trepotec Z, Geiger J, Plank C, Aneja MK, Rudolph C. Segmented poly(A) tails significantly reduce recombination of plasmid DNA without affecting mRNA translation efficiency or half-life. RNA. 2019;25(4):507-518.
  31. Spiewla T et al. Poly(A) tail segmentation improves the stability of the template DNA and increases the translatability of &lt;em&gt;in vitro.&lt;/em&gt; transcribed mRNA. bioRxiv. 2025:2025.10.21.683660.
  32. Martin G, Keller W. Tailing and 3'-end labeling of RNA with yeast poly(A) polymerase and various nucleotides. RNA. 1998;4(2):226-230.
  33. Weissman D. mRNA transcript therapy. Expert Rev Vaccines. 2015;14(2):265-281.
  34. Mateju D et al. Single-molecule imaging reveals translation of mRNAs localized to stress granules. Cell. 2020;183(7):1801-1812.e1813.
  35. Schwaller N, Karousis ED. Protocol for monitoring mRNA translation and degradation in human cell-free lysates. STAR Protoc. 2025;6(3):104073.
  36. Li Y et al. Deep generative optimization of mRNA codon sequences for enhanced mRNA translation and therapeutic efficacy. Nat Commun. 2025;16(1):9957.
  37. Pardi N et al. Expression kinetics of nucleoside-modified mRNA delivered in lipid nanoparticles to mice by various routes. J Control Release. 2015;217:345-351.
  38. Hou X, Zaks T, Langer R, Dong Y. Lipid nanoparticles for mRNA delivery. Nat Rev Mater. 2021;6(12):1078-1094.
  39. Kalluri R, LeBleu VS. The biology, function, and biomedical applications of exosomes. Science. 2020;367(6478).
  40. Yin M et al. Delivery of mRNA using biomimetic vectors: Progress and challenges. Small. 2024;20(43):e2402715.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

mRNA TranslasyonuCanl H cre G r nt lemen Vitro TranskripsiyonProtein Ekspresyon DinamikleriL siferaz KomplemantasyonuKodlayan Dizi Optimizasyonu5 Kep ModifikasyonumRNA Terap tikleri

İlgili makaleler