Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Drosophila lizatlarında hücresiz In vitro mRNA çevirisi

377 görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/70844

⸱

12 Haziran 2026

 ,  ,  ,  , 
1mRNA and Cancer Laboratory, Subdirección de Investigación Básica, Instituto Nacional de Cancerología (INCan; National Institute of Cancer), 2Escuela de Medicina y Ciencias de la Salud, Tecnologico de Monterrey, 3Escuela de Ingeniería y Ciencias, Tecnologico de Monterrey

Bu makalede

Özet

Burada, lizatların nasıl hazırlanacağı ve Drosophila embriyoları kullanılarak in vitro çeviri yapılacağına dair detaylar sunuyoruz.

Özet

Hücresiz mRNA in vitro çeviri, ökaryotlar arasında gen ekspresyonu sırasında protein sentezi sürecinin anlaşılmasında kritik rol oynamıştır. In vitro çeviri için farklı sistemlerden lizatların geliştirilmesi, çeviri makinesinin çoğu bileşeninin rolünün incelenmesinde ve protein sentezi sürecinin birçok adımının incelenmesinde önemli olmuştur. Drosophila melanogaster lizatları kullanılarak çeviri ve translasyonel kontrolün farklı yönleri incelenmiştir. Bu makale, sentetik mRNA şablonlarının hazırlanması, büyük ölçekli canlı sinek kültürlerinin yetiştirilmesi, Drosophila embriyolarından translasyon yetkili lizatların hazırlanması ve hücresiz in vitro translasyon reaksiyonlarının gerçekleştirilmesi için ayrıntılı protokoller sunmaktadır. Bu protokol, Drosophila cinsine ait herhangi bir tür—melanogaster, virilis, pseudoscura, grimshawi, hydei vb. türleri için uygundur. Bu protokolü diğer çeviri sistemleriyle karşılaştırıyor ve sınırlamaları, kritik adımları ve sorun giderme konularını tartışıyoruz. Protokol performansını ve tekrarlanabilirliğini değerlendirmeye yardımcı olmak için temsilci sonuçlar dahil edilmiştir. Son olarak, biyoteknoloji ve araştırmadaki potansiyel uygulamaları tartışıyoruz.

Giriş

Bir yüzyıldan fazla süredir Drosophila, translasyon kontrolü ve çeviri makinesi 1,2,3,4 dahil olmak üzere birçok biyolojik olgu ve molekülü incelemek için güçlü, genetik olarak yönetilebilir bir model organizma olduğunu kanıtlamıştır. Drosophila hücresiz in vitro çeviri, in vivo gözlemlenen birçok olayı tekrarlayabildiği için protein sentezini incelemek için güçlü bir araç haline gelmiştir. Bu nedenle, Drosophila, çeviri ve translasyonel kontrol yapan yeni fonksiyonlar ve moleküller keşfetmek için ideal bir sistemdir. Erken çalışmalar, sinek ilişkili artropodlu Artemia salina5'te ve daha sonra Drosophila hydei6'da in vitro, translasyonal olarak yetkin bir sistem sağlamıştır.

Daha sonra, Drosophila melanogaster'da dıştan mRNA'lara yanıt veren lizatlar geliştirildi. Drosophila in vitro çevirisi üzerine yapılan çoğu çalışma, farklı yaşlardan embriyolarda yapılmıştır, ancak farklı araştırma grupları tarafından bazı translasyon reaksiyon tamponu varyasyonları kullanılmıştır. Karşılaştırma için, incelenen farklı olaylar ve translasyon reaksiyon koşulları Tablo 1'de listelenmiştir. Embriyoların yanı sıra, Drosophila oositleri 10,22,23,24,25,26 ve kültürlenmiş Schneider veya Kc hücresi lizatları kullanılarak hücresiz in vitro çeviri protokolleri de geliştirilmiştir 17,27,28,29,30,31,32. In vitro translasyon için gerekli bileşenlerin tanımı ve farklı türlerden lizatlar arasında karşılaştırma 33,34 referanslarında açıklanmıştır.

mRNA çevirisi süreci ökaryotlar arasında korunmuş olsa da, taksonlar arasında önemli farklılıklar çoğunlukla translasyonun başlatma aşamasında, çeşitli moleküllerin gelişim boyunca takson veya türe özgü bir şekilde translasyonu bastırdığı veya teşvik ettiği aşamadagörülür (35,36). Bu protokol, filogenetik olarak uzak Metazoan'dan lizatlar, buğday veya tavşandan alınan ticari lizatlar dahil olmak üzere, böceklerde mRNA çevirisinin gelişim boyunca incelenmesi için çok uygundur. Gerçekten de, bu protokol embriyogenezde gerçekleşen translasyon olaylarını özetleyebilir; bu, oositlizatları 23 kullanıldığında mümkün olmayan bir durumdur. Bugüne kadar embriyo, oosit ve kültürlenmiş hücreli Drosophila sistemleri arasında herhangi bir karşılaştırma yapılmamıştır. In vitro sentezlenen proteinlere posttranslasyonel modifikasyonlar eklemek, bu protokolün mevcut halindeki bir sınırlamasıdır. Ayrıca, bu yöntem bakterilerde rekombinant protein üretme yöntemlerine kıyasla hazırlık miktarlarında protein vermez.

Burada, Drosophila sineklerinin büyük ölçekli kafeslerini rutin olarak büyütmek, sentetik mRNA şablonları hazırlamak, embriyolardan translasyon yetkinliğine sahip lizatlar hazırlamak ve hücresiz in vitro çeviri testleri yapmak için ayrıntılı protokolleri açıklıyoruz. Materyal Tablosu , protokol boyunca gerekli reaktifleri gösterir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

1) In vitro transkripsiyon için şablon plazmid yapısı

  1. T7, T3 veya SP6 RNA polimeraz promotorunun aşağısında 5' tercüme edilmemiş bölge (UTR), bir reporter sistron, bir 3' UTR ve bir poli(A) kuyruğu içeren plazmidleri seçin. Her yapının poli(A) kuyruğunun hemen aşağısında, transkripsiyondan önce plazmid linearizasyonu için benzersiz bir kısıtlama noktası içerdiğinden emin olun (Şekil 1).
    NOT: Kullanılan kısıtlama enzim bölgesi, tanıma bölgesi transkribe edilen dizinin dışında veya doğrusal DNA'nın A ile sona ermesine izin veren bir yer olarak dikkatlice seçilmelidir. Ayrıca, kısıtlama enzimi şablonun 3' ucunda bir küt veya 5' çıkıntı bırakmalıdır. 3' çıkıntılar anormal transkripsiyon ürünlerine yol açabilir. Eğer 3' çıkıntılı bir enzim kullanılırsa, parça kullanımdan önce köreltilmelidir.
  2. Tüm yapıları in vitro transkripsiyon için şablon olarak kullanmadan önce dizeleme ile doğrulayın.
    NOT: Bu iş akışı için poli(A)71 kuyruğuna sahip Firefly luciferaz (FLuc) raporlayıcı yapıları kullanılmıştır. FLuc yapıları pLUC-kaset12'den türetilmiştir. Vektör ve kit bilgileri Materyaller Tablosu'nda listelenmiştir.

2) Kaplı ve poliadenillenmiş mRNA'ların in vitro transkripsiyonu

  1. Her plazmid yapısını poli(A) kuyruğunun aşağısındaki benzersiz kısıtlama bölgesi kullanarak doğrusal hale getirin (burada KpnI).
  2. Doğrusal DNA'yı 100 V'da 1 saat boyunca çalıştırılan %1 agaroz jel elektroforezi ile çözer.
  3. DNA'yı jel olarak çıkarıp bütünlüğünü ve doğru linearizasyonunu aynı agaroz jel elektroforezi ile kontrol edin.
    NOT: Doğrusal DNA'yı jel olarak arındırmak zorunlu değildir—eğer DNA tamamen kesilmişse, kolon arıtması veya fenol ekstraksiyonu/ETOH çökeltmesi yeterlidir.
  4. Üreticinin talimatlarına göre in vitro transkripsiyon kiti kullanarak saflaştırılmış lineerize DNA'yı transkribe edin. Transkripsiyon reaksiyonuna 5' kapsul bir analog ekleyerek RNA'yı stabilize edin ve çeviriyi uyarın.
    NOT: m7G(5′)ppp(5′)G RNA gibi fonksiyonel bir kap analogu, transkript stabilizasyonu ve translasyon uyarlamasını destekler. G(5′)ppp(5′)A gibi işlevsel olmayan bir cap analogu, transkripsiyon stabilizasyonunu destekler ancak çeviri uyarısını desteklemez. Bu çeviri inhibitörü, bisistronik transkriptler çevrildiğinde ikincisistron 7'nin translasyonunu yönlendiren iç ribozom giriş noktalarının (IRES) varlığını test etmek için kullanılır. Bir poli(A) kuyruğunun bağımlılığını test etmek için, bu durum transkripsiyon yapılmadan önce şablon plazmidde silinebilir.
  5. Tüm transkripsiyon reaksiyonlarını üreticinin talimatlarına göre transkripsiyondan sonra DNA şablonunu çıkarmak için RNazsız DNaz ile tedavi edin. Tüm in vitro transkripsiyon kitleri RNaz-serbest DNazı sağlar.
  6. Üreticinin talimatlarına göre transkripti lityum klorür çökeltmesi veya kolon tabanlı RNA temizleme ile arındırın.
    NOT: Tüm in vitro transkripsiyon kitleri lityum klorür reaktiflerini sağlar.
  7. Spektroskopiyle arındırılmış transkripti nicelikleştirin ve mRNA bütünlüğünü 100 V'da 100 V'da 1 saat boyunca çalıştırarak mRNA bütünlüğünü değerlendirin.
  8. MRNA'yı alayın ve kullanana kadar -70 °C'de depolayın.

3) Büyük ölçekli bir Drosophila kültürünün rutin bakımı

  1. Referans Drosophila melanogaster vahşi tip Oregon-R suşunu kullanın.
  2. Sinek yemeğini yerleşik bir referans merkezi tarifine göre hazırlayın.
    NOT: Yazarlar, gıda hazırlama referansı olarak Bloomington Drosophila Stok Merkezitarifi 37'yi kullanmıştır. Bu tarifin detayları Tablo 237'de verilmiştir. Şekil 2, embriyo toplamadan lusiferaz aktivitesinin nicelenmesine kadar olan genel iş akışını göstermektedir.
  3. Yaklaşık 1 m uzunluğunda ve 50 cm çapında kübik veya silindirik akrilik kafes yerleştirin.
  4. Kafesin üst kısmında yaklaşık 30 cm çapında bir delik açın ve bunu ağla kapatın (Şekil 3).
  5. Sinekler için su sağlamak amacıyla ıslak kağıdı ağın üzerine yerleştirin ve ıslak kağıdı her gün değiştirin (Şekil 3).
  6. Kafesin ön kısmını açık ve kumaşla kaplı tutun ki kafesin içine erişim sağlansın. Plastik sinek kafesinin arka tarafına akrilik koyun, tamamen mühürlü olarak.
  7. Embriyo toplamadan önce sinek stokunu güçlendirin ve ~1.000 genç sineği kafese yerleştirin. Sinek kafesini sürekli 22–25 °C sıcaklıkta tutun.
    NOT: Aynı boyutlarda ve sinek yoğunluğunda birkaç sinek kafesi aynı anda korunabilir. Sinekler yaklaşık 15 gün boyunca yumurta bırakır ve yaklaşık 20. gün civarında ölmeye başlar.
  8. Sinekleri her gün, üzerine 200 μL asetik asit veya sirke içeren bir kaşık yenilenmiş fırıncı mayası koyan agar-meyve suyu tabaklarıyla besleyin.
  9. Bir sonraki sinek neslini belirlemek için, 0–12 saat yaşındaki embriyolardan birkaç plaka toplayın. Embriyoları, sinek maması içeren 22 cm × 17 cm × 10 cm plastik kutulara 3 cm derinliğe yerleştirin. Kutuların ağ ile kapatılan bir deliği olduğundan emin olun, böylece hava dolaşımı sağlanır ve larvaların kaçmasını engeller (Şekil 4). Yiyeceğin üzerine kuru aktif maya ekleyin ve embriyoların 25 °C'de büyümesini sağlayın.
  10. 3 gün sonra, üçüncü yaş larvaların tırmanıp pupa olabileceği için 5 cm yüksekliğinde katlanmış kağıdı kutulara yerleştirin.
  11. 10 gün sonra, yeni çıkmış yetişkin sineklerin bulunduğu kutuları kafese yerleştirin. Sineklerin kutulardan çıkmasına izin verin ve kafeste 2 gün çiftleşin.
  12. Belirli yaşta embriyoları lizat hazırlamak için, kafesi dikkatlice açın ve gerekli yumurta bırakma süresi için kafesin içine agar-suyu tabakları yerleştirin.
  13. Tabakları çıkarın ve yumurtaları bir yığın elek kullanarak toplayın.
    NOT: 0–12 yaş arası embriyo lizatları için, sabah 8:00'de kafese iki agar-meyve suyu tabağı yerleştirin ve 20:00'de embriyo toplamak için çıkarın.
    1. Yetişkin sinekler yumurtadan çıktıktan sonra 3-10. günler arasında lizat hazırlığı için embriyoları toplayın.
    2. Paralel olarak, 2–4. günlerde embriyolar toplanır ve yukarıda açıklandığı gibi yiyecek içeren kutularda yeni nesil sinek oluşturulur.

4) 0–12 yaş Drosophila embriyolarından translasyon lizatlarının hazırlanması

NOT: Bu protokol mikrokokkal nükleaz tedavisini içermez. Bu adım, nükleaz inaktivasyonu eksikse dış ötürücü mRNA'nın olası bozulmasını önlemek için atıldı. Her deneyde arka plan çevirisi mRNA olmadan kontrol kullanılarak izlenmelidir.
NOT: Bu yöntem, daha önce tanımlanan 7,12,14,15,16,17,22 protokollerinden türetilmiştir.

  1. Embriyo lizis tamponu Tablo 2'de açıklandığı gibi hazırlanın ve -20 °C'de 1 mL aliquotlarda saklanın.
    NOT: Her aliquotu hemen kullanmak üzere 2 katına kadar çözebilirsiniz.
  2. Embriyoları elek kullanarak toplayın.
    NOT: Standart protokol 0–12 yaş yaşındaki embriyolar kullanır, ancak diğer embriyo yaşları da lizat hazırlamak için uygun olabilir.
  3. Embriyoları musluk suyu ile iyice yıkayın ve ardından %0,9 NaCl + %0,03 Triton X-100 içeren embriyo tamponu ile yıkayın.
    NOT: Embriyolar, işlemeden önce 4 °C'de 24 saate kadar saklanabilir.
  4. Embriyoları 5 dakika boyunca %50 embriyo tamponu ve %50 ev çamaşır suyu (%4–6 sodyum hipoklorit [NaOCl] ve %0,02–0,1) sodyum hidroksit [NaOH] %0,02–0,1) içinde dekoriyonat yapın.
    DIKKAT: Çamaşır suyu kullanırken eldiven ve şeffaf plastik gözlük kullanın.
  5. Musluk suyla iyice yıkayın. Embriyoları kağıtla kurutup tartın.
  6. Paketlenmiş embriyoları buz üzerinde cam doku öğütücüsü homojenizatoruna aktarın. Her 1 g embriyoya 1 mL embriyo lizis tamponu ekleyin. Embriyoları buz üzerinde 20 darbeyle homojenleştirin.
  7. Homogenatı 1.5 mL mikrosantrifüj tüplerine aktarın. Santrifüj 15.900 × g'de 4 °C'de 20 dakika sürdü.
  8. Buz üzerinde 50 μL aliquot içinde interfaz geri kazanılır. Aliquotları sıvı azotta dondurun ve -80 °C'de saklayın.
    NOT: Ara faz, üst ve alt fazlar arasında bulanık bir sıvı çözeltidir. Üst faz, yüksek viskoz, opak beyaz lipidlerden oluşan bir katmandır. Alt faz katı bir pelettir.
    DIKKAT: Ara fazlı çözeltiyi bitişik fazlardan kirletmekten kaçının.
    DIKKAT: Sıvı azot kullanırken eldiven ve şeffaf plastik gözlük kullanın.

5) In vitro translasyon reaksiyonu

  1. Çeviri reaksiyonlarını 96 kuyruklu bir plakada veya PCR termosiklinde bireysel 0.2 mL PCR tüplerinde kurun. Her dönüşüm reaksiyonunu 17 μL'lik nihai hacimde hazırlayın; bu hacmde 5 μL embriyo lizat ve Tablo 2'de açıklanan kalan reaksiyon bileşenleri dahil.
    NOT: Embriyo lizat, toplam reaksiyon hacminin %30 hacim/hacimini temsil eder.
  2. Eğer rekombinant proteinler translasyon reaksiyonuna eklenirse, proteini 20 mM HEPES-KOH pH 7.4 karşı diyaalize edilir. Diyaliz kaset hacmini ve moleküler ağırlık kesim sınırını örnek hacmi ve protein boyutuna göre seçin.
    NOT: Rekombinant proteinlerin eklenmesi, translasyonel baskılayıcılar veya başlatma faktörlerine bağlı doza bağlı testlerin incelenmesinde önemlidir. Çeviri reaksiyonunda kullanılan rekombinant proteinlere PBS eklemeden kaçının. Protein örneğinde veya translasyon reaksiyonunda gliserolu %5 veya altında tutun. Mümkünse, reaksiyona gliserol eklemekten kaçının.
  3. mRNA'yı 65 °C'ye kadar 2 dakika ısıtarak ve in vitro translasyon reaksiyonundan önce 2 dakika buzda hızlı soğutarak denatüre edin.
  4. Her mRNA'nın üçlü çevrilmesini gerçekleştirin. Reaksiyonu şu şekilde ayarlayın: 2,7 μL reaksiyon kokteyli (Tablo 2) + 5 μL embriyo lizat + mRNA (30 ng) + H2O ile 17 μL nihai hacm. Baz master karışımı olarak, Tablo 2'deki bir reaksiyon için Reaksiyon kokteylini takip edin ve yapılacak reaksiyon sayısına göre ölçekleyin. Reaksiyonu 25 °C'de 60 dakika kuluçka yapın.
    NOT: ATP ve GTP burada tanımlanan standart reaksiyona ayrı eklenmemiştir. Bizim elimizde, reaksiyonu ek ATP/GTP ile takviye etmek, test edilen koşullarda FLuc çıkışını artırmadı ve translasyonu azaltmadı. Bu nedenle, reaksiyon Tablo 2'de tanımlanan enerji yenileyici sistemle ek nükleotid takviyesi olmadan gerçekleştirilir.
  5. Termosikleti 4 °C'de 5 dakikalık ilk adımla, ardından 25 °C'de 60 dakika ve 4 °C'de 10 dakika son aşama ile programlayın.
  6. Reaksiyonu durdurmak için 20 μL soğuk 1× pasif liz tamponu ekleyin. Reaksiyonu buzun üzerinde ek 10 dakika koyun.
  7. Örnekleri -20 °C'de saklayabilir veya lusiferaz nicelenmesine geçin.
    NOT: Protokol burada duraklatılabilir.

6) Sentezlenmiş lusiferazın nicelenmesi

  1. FLuc aktivitesini nicelikten önce reaksiyonları 20 dakika oda sıcaklığına getirin.
  2. Her dönüşüm reaksiyonundan 10 μL ve kullanmadan önce en az 2 saat boyunca 50 μL lusiferaz substratını oda sıcaklığına getirin.
  3. Lusiferaz substratını çeviri reaksiyonuna ekleyin. Göreceli ışık birimlerini otomatik veya manuel bir luminometre kullanarak kaydedin. Luminometreyi 1 saniye aralıklı olarak 10 ölçüm alacak şekilde programlayın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

0–12 saat yaşındaki embriyoları kullanarak altı bağımsız lizat preparatı (yani biyolojik tekrarlar) arasındaki verimlilik değişkenliğini analiz etmek için çeviri reaksiyonları gerçekleştirdik. Her çubuk teknik üçlü bir parçayı temsil eder (Şekil 5). Benzer bir translasyon verimliliği gözlemlenmiş, ancak bazı değişkenlikler vardı. Ayrıca farklı yaş embriyoları arasında translasyon verimliliğini karşılaştırdık. Bu nedenle, 0–2 yaş, 0–12 yaş ve 0–18 yaş yaşında...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Drosophila lizatları hücresiz in vitro translasyon için tekrarlanabilir sonuçlar verebilir. Farklı yaşlarda ve tampon bileşimindeki farklılıklardaki embriyolar, protein sentezi ve mekanizmalarındaki çok çeşitli temel olguları incelemek için kullanılmıştır (Tablo 1). Burada, her yaştaki embriyolar için hassas ve nicel bir şekilde çalışmalar yapmak için uygun standart bir yöntemi tanımladık (Tablo 1). Bu protokol, mutant sinekler...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların beyan edecek çıkar çatışmaları yoktur.

Teşekkürler

N.B-Á ve G.H., Meksika'daki Ulusal Kanser Enstitüsü'nün (Instituto Nacional de Cancerología, INCan) intramural fon programı tarafından desteklendi; D.E.V., 2022 yılında Meksika Araştırmaları ve Araştırmaları Araştırmaları Sağlayan Bilim Akademisi (SECIHTI) Programı'nın doktora araştırmasıdır. Fannis Missirlis ve Bety Osorio (CINVESTAV, Meksika) için sinekler için teşekkür ederiz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Aluminum foil sheetReynoldsN/AStandart ev tipi alüminyum folyo; herhangi bir eşdeğer ticari marka kabul edilebilir.
Amino acids mixturePromegaL4461N/A
Apple cider vinegarHeinzN/ATicari elma sirkesi (%5 asitlik); herhangi bir eşdeğer marka kabul edilebilir.
Apple or grape fruit juiceJumexN/ATicari üzüm suyu; veya herhangi bir eşdeğer ticari marka.
Bacteriological agar Merck/Sigma-Aldrich9002-18-0N/A
Boric acid (H3BO3)Merck/Sigma-AldrichB6768BioReagent, Moleküler Biyoloji sınıfı, ≥99.5%, toz; TBE tamponunun hazırlanmasında kullanılır.
Cap: Anti reverse cap (ARCA): 3´-O-Me-m7G(5´)ppp(5´)G RNA cap structureBioLabsS1411SN/A
Cap: m7G(5')ppp(5')G RNA cap structure analogNew England BiolabsS1404SN/A
Cap: Non-functional cap analogue G(5´)ppp(5´)ANew England BiolabsS1406N/A
Centrifuge Tube (15 mL)Corning 430053N/A
Complete, EDTA-free protease inhibitor cocktailRoche11836170001N/A
Creatine phosphokinase from rabbit muscleMerck/Sigma-AldrichC-3755N/A
Creatine phosphoric acid, disodium saltMerck1120A47950N/A
Dehydrated baker´s yeastFleischmann'sN/ATicari aktif kuru maya; herhangi bir eşdeğer marka kabul edilebilir.
Diethyl pyrocarbonate Merck/Sigma-AldrichD575897%(NNR)
DNA Clean & Concentrator-5Zymo ResearchD4004N/A
Drosophila melanogaster wild-type strain Oregon-RBloomington Drosophila Stock Center, Indiana, USAhttps://bdsc.indiana.edu/index.html ; Drosophila melanogaster mutant suşları, ayrıca diğer Drosophila türlerinin (virilis, pseudoscura, grinshawi, hydei, vb.) vahşi tip referans suşları da bu Stok Merkezi tarafından sağlanmaktadır.
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)Merck/Sigma-AldrichE9884ACS reaktifi, 99.4-100.6%, toz; TBE tamponunun hazırlanmasında kullanılır.
HEPESSigmaSLBH4583V99.5%(titre)
Hydrogen peroxide (H2O2)EquateN/ATicari (~%2,5-3,5 hidrojen peroksit çözeltisi; herhangi bir eşdeğer marka kabul edilebilir.
In vitro transcription mMessage mMachine T7, T3, or SP6 KitThermo Fisher ScientificAM1344 and AM1348N/A
KOAc, also termed KCH3COOMerck/Sigma-AldrichSeveralN/A
Lb broth (lennox)Merck/Sigma-AldrichL30221kg 
Luciferase assay systemPromega E1501N/A
MAXIscript T7, T3, or SP6 in vitro transcription KitInvitrogenAM1316 and AM1312N/A
Mg(OAc)2, also termed Mg(CH3COO)2Merck/Sigma-AldrichSeveralN/A
NaCl (sodium chloride)J.T Baker B17W53ACS Reaktifi
OligonucleotidesAny companyN/ASıraya özgü.
Pasive lysis 5X bufferPromegaE1941N/A
Pipet TipsAxygenT-200-Y200 mikrolitre sarı uçlar.
Pipet TipsAxygenT-1000-B1ml mavi uçlar.
Pipet Tips AxygenT-3000,5-10 mikrolitre şeffaf uçlar.
Propionic AcidMerck/Sigma-Aldrich79-09-04ACS reaktifi sınıfı, ≥99.5%, sıvı.
PYREX® 5 mL Glass Pestle Tissue Grinder  PYREX®  7724-5N/A
QIAprep spin plasmid miniprep kitQiagen27106N/A
QIAquick gel extraction kitQiagen28704N/A
Rabbit reticulocyte lysate (RRL)Promega L4960N/A
Renilla luciferase (RLuc) assay systemPromega E2820N/A
RNasin ribonuclease inhibitorPromegaN2111AN/A
RNeasy minielute RNA clean up kitQiagen74204N/A
Slide-A-Lyzer Dialysis CassettesThermo Scientific87735 (Ancak, moleküler boyut kesme noktasına bağlıdır).N/A
Sodium hypochlorite (bleach)CloroxN/ATicari ağartıcı (%5-6 NaOCl); benzer konsantrasyona sahip herhangi bir eşdeğer ticari marka kabul edilebilir.
SpermidineMerck85558N/A
Stainless steel sieveN/AN/AHerhangi bir ticari tedarikçi.
Taq plus precision DNA polymeraseStratagene600211-51N/A
Transfer ribonucleic acid (tRNA) from bovine liver type XIMerck/Sigma-Aldrich9014-25-9 or R4752N/A
Tris (Tris base)

Kaynaklar

  1. Marygold SJ, Attrill H, Lasko P. The translation factors of Drosophila melanogaster. Fly (Austin). 2017;11(1):65-74.
  2. Hernández G, Vazquez-Pianzola P. eIF4E as a molecular wildcard in metazoans RNA metabolism. Biol Rev Camb Philos Soc. 2023;98(6):2284-306.
  3. Kong J, Lasko P. Translational control in cellular and developmental processes. Nat Rev Genet. 2012;13(6):383-94.
  4. Bayer LV, Milano SN, Bratu DP. The mRNA dynamics underpinning translational control mechanisms of Drosophila melanogaster oogenesis. Biochem Soc Trans. 2024;52(5):2087-99.
  5. Filipowicz W, et al. A protein binding the methylated 5′-terminal sequence, m7GpppN, of eukaryotic messenger RNA. Proc Natl Acad Sci U S A. 1976;73(5):1559-63.
  6. Sondermeijer PJA, Lubsen NH. Heat-shock peptides in Drosophila hydei and their synthesis in vitro. Eur J Biochem. 1978;88(2):331-9.
  7. Hernández G, Vazquez-Pianzola P, Sierra JM, Rivera-Pomar R. Internal ribosome entry site drives cap-independent translation of reaper and heat shock protein 70 mRNAs in Drosophila embryos. RNA. 2004;10(11):1783-97.
  8. Zapata JM, Martínez MA, Sierra JM. Purification and characterization of eukaryotic polypeptide chain initiation factor 4F from Drosophila melanogaster embryos. J Biol Chem. 1994;269(27):18047-52.
  9. Maroto FG, Sierra JM. Purification and characterization of mRNA cap-binding protein from Drosophila melanogaster embryos. Mol Cell Biol. 1989;9(5):2181-90.
  10. Andrews S, Snowflack DR, Clark IE, Gavis ER. Multiple mechanisms collaborate to repress nanos translation in the Drosophila ovary and embryo. RNA. 2011;17(5):967-77.
  11. Smibert CA, et al. Smaug, a novel and conserved protein, contributes to repression of nanos mRNA translation in vitro. RNA. 1999;5(12):1535-47.
  12. Gebauer F, et al. Translational control of dosage compensation in Drosophila by Sex-lethal: cooperative silencing via the 5′ and 3′ UTRs of msl-2 mRNA is independent of the poly(A) tail. EMBO J. 1999;18(21):6146-54.
  13. Pamudurti NR, et al. Translation of circRNAs. Mol Cell. 2017;66(1):9-21.e7.
  14. Vázquez-Pianzola P, Hernández G, Suter B, Rivera-Pomar R. Different modes of translation for hid, grim and sickle mRNAs in Drosophila. Cell Death Differ. 2007;14(2):286-95.
  15. Hernández G, et al. Two functionally redundant isoforms of Drosophila eIF4B are involved in cap-dependent translation, cell survival and proliferation. Eur J Biochem. 2004;271(14):2923-36.
  16. Hernández G, et al. Functional analysis of the AUG initiator codon context reveals novel conserved sequences that disfavor mRNA translation in eukaryotes. Nucleic Acids Res. 2024;52(3):1064-79.
  17. Tuschl T, et al. Targeted mRNA degradation by double-stranded RNA in vitro. Genes Dev. 1999;13(24):3191-7.
  18. Scott MP, Storti RV, Pardue ML, Rich A. Cell-free protein synthesis in lysates of Drosophila melanogaster cells. Biochemistry. 1979;18(8):1588-94.
  19. Clark IE, Wyckoff D, Gavis ER. Synthesis of the posterior determinant Nanos is spatially restricted by a novel cotranslational regulatory mechanism. Curr Biol. 2000;10(20):1311-4.
  20. Jeske M, et al. Rapid ATP-dependent deadenylation of nanos mRNA in a cell-free system from Drosophila embryos. J Biol Chem. 2006;281(35):25124-33.
  21. Jeske M, Moritz B, Anders A, Wahle E. Smaug assembles an ATP-dependent stable complex repressing nanos mRNA translation at multiple levels. EMBO J. 2011;30(1):90-103.
  22. Castagnetti S, Hentze MW, Ephrussi A, Gebauer F. Control of oskar mRNA translation by Bruno in a novel cell-free system from Drosophila ovaries. Development. 2000;127(5):1063-8.
  23. Gebauer F, Hentze MW. Studying translational control in Drosophila cell-free systems. Methods Enzymol. 2007;429:23-33.
  24. Hernández G, et al. Mextli is a novel eukaryotic translation initiation factor 4E-binding protein that promotes translation in Drosophila melanogaster. Mol Cell Biol. 2013;33(15):2854-64.
  25. Lie YS, Macdonald PM. In vitro translation extracts prepared from Drosophila ovaries and embryos. Biochem Biophys Res Commun. 2000;270(2):473-81.
  26. Peng Y, Gavis ER. The Drosophila hnRNP F/H homolog Glorund recruits dFMRP to inhibit nanos translation elongation. Nucleic Acids Res. 2022;50(12):7067-83.
  27. Sanders MM, Triemer DF, Olsen AS. Regulation of protein synthesis in heat-shocked Drosophila cells: soluble factors control translation in vitro. J Biol Chem. 1986;261(5):2189-96.
  28. Storti RV, Scott MP, Rich A, Pardue ML. Translational control of protein synthesis in response to heat shock in Drosophila melanogaster cells. Cell. 1980;22(3):825-34.
  29. Krüger C, Benecke BJ. In vitro translation of Drosophila heat-shock and non-heat-shock mRNAs in heterologous and homologous cell-free systems. Cell. 1981;23(2):595-603.
  30. Zhao F, Yu CH, Liu Y. Codon usage regulates protein structure and function by affecting translation elongation speed in Drosophila cells. Nucleic Acids Res. 2017;45(14):8484-92.
  31. Roy G, et al. The Drosophila poly(A) binding protein-interacting protein, dPaip2, is a novel effector of cell growth. Mol Cell Biol. 2004;24(3):1143-54.
  32. Wakiyama M, Yokoyama S. Posttranscriptional control of protein synthesis in Drosophila S2 cell-free system. Methods Mol Biol. 2014;1118:257-66.
  33. Spirin AS, Swartz JR. Cell-free protein synthesis systems: historical landmarks, classification, and general methods. In: Spirin AS, Swartz JR, editors. Cell-free protein synthesis. Weinheim: Wiley-VCH; 2008. p. 1-34.
  34. Gregorio NE, Levine MZ, Oza JP. A user’s guide to cell-free protein synthesis. Methods Protoc. 2019;2(1):24.
  35. Hernández G, Altmann M, Lasko P. Origins and evolution of the mechanisms regulating translation initiation in eukaryotes. Trends Biochem Sci. 2010;35(2):63-73.
  36. Hernández G, Proud C, Preiss T, Parsyan A. On the diversification of the translational apparatus across eukaryotes. Comp Funct Genomics. 2012;2012:256848.
  37. Lakovaara S. Malt as a culture medium for Drosophila species. Drosoph Inf Serv. 1969;44:128.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Daha fazla makale keşfet

Hücreden Bağımsız TranslasyonIn Vitro TranslasyonProtein SenteziTranslasyon MekanizmasıSentetik mRNA ŞablonlarıTranslasyonel KontrolDrosophila EmbriyolarıTranslasyon Protokolü
Drosophila lizatlarında hücresiz In vitro mRNA çevirisi
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.