Serbest Hareket Eden Farelerde Kendiliğinden Yürüyüş ve Hareket Analizi için İşleyicisiz DeepLabCut Tabanlı Düşük Maliyetli İş Akışı

Özet

DeepLabCut kullanarak serbest hareket eden farelerde spontan yürüyüş ve hareket etme nicelini ölçmek için düşük maliyetli, işaretsiz bir iş akışı sunuyoruz. Bu protokol, tek kameralı video alımını, anatomik işaretlerin işaretsiz takibi ve uzaylı-zamansal lokomotor parametrelerinin çıkarılmasını entegre ederek, özel ekipman olmadan motor davranış analizi için invaziv olmayan ve erişilebilir bir çerçeve sağlar.

Özet

Yürüyüş, çeşitli hastalıklar ve durumlar arasında motor değişiklikleri tespit etmek için yaygın olarak kullanılan fonksiyonel bir biyobelirteçtir; çünkü koordinasyon, güç, denge ve sensorimotor entegrasyondaki değişiklikleri yansıtır. Ancak, hayvan modellerinde yürüyüşü analiz etmek için geleneksel yöntemler genellikle pahalı ekipman, karmaşık kurulumlar veya doğal davranışı değiştirebilecek istilacı prosedürler gerektirir. Burada, serbest hareket eden farelerde yürüyüş ve kendiliğinden hareket etme işlemlerinin nicel analizi için açık kaynaklı poz tahmin yazılımı DeepLabCut tabanlı düşük maliyetli, işaretsiz bir iş akışı sunuyoruz. Yöntem, fiziksel işaretleyici veya özel donanım gerektirmeden tek kameralı video alımı, anatomik işaretlerin işaretsiz izlenmesi ve mekansal zaman lokomotor parametrelerinin çıkarılmasını gerektirir. Protokolün uygulanabilirliğini göstermek için, Alzheimer hastalığının üçlü transgenik fare modelinde (3xTg-AD) uygulanan bir uygulama örneği olarak uygulanmıştır. Bu yaklaşım, serbest hareketi korur ve müdahaleyle ilgili stresi en aza indirerek motor davranışın invaziv olmayan değerlendirilmesini sağlar. Protokol, standart davranışsal test ortamlarıyla uyumludur. Genel olarak, bu yöntem preklinik araştırmalarda yürüyüş ve hareketin nicel analizi için erişilebilir ve invaziv olmayan bir çerçeve sağlar.

Giriş

Yürüyüş, motor, duyusal ve bilişsel sistemlerin gerçek zamanlı etkileşiminden ortaya çıkan karmaşık bir motor süreçtir ve dengeli, uyarlanabilir hareket oluşturmak için duyusal geri bildirim, duruş kontrolü, motor planlama ve kas aktivasyonunun koordineli şekilde işlenmesini gerektirir^. Bu bütünleşme yapısı nedeniyle, yürüyüş değişiklikleri hem klinik uygulamada hem de deneysel araştırmalarda nörolojik işlevsel işlev bozukluğunun fonksiyonel göstergeleri olarak giderek daha fazla kabul edilmektedir. İnsan ve hayvan modellerinde yürüyüş analizi, hareket kabiliyeti, düşme riski, kırılganlık ve fonksiyonel kapasitedeki değişikliklerin tespitini sağlar ve hastalık ilerlemesi ve müdahale etkinliği için birden fazla durumda biyobelirteç olarak ^{önerilmiştir 2,3,4}.

Temel araştırmalarda, özellikle fare modellerinde, spontan yürüyüş ve lokomotor aktivitenin değerlendirilmesi, motor fenotipleri karakterize etmek ve fizyolojik bozulmaların ve terapötik müdahalelerin etkisini değerlendirmek için yaygın kullanılan bir stratejidir. Lokomotor parametrelerin nesnel nicel olarak tanımlanması, yalnızca görsel incelemeyle güvenilir şekilde yakalanamayan ince motor değişikliklerin tespit edilmesini sağlar; bu sınırlama özellikle erken veya hafif fenotipleri hedefleyen preklinik çalışmalarda^{geçerlidir 5}. Bu bağlamda, yürüyüş analizi, motor davranışlardaki değişiklikleri araştırmak ve nörolojik ve nörodejeneratif hastalıklar gibi farklı deneysel durumlarla ilişkili fonksiyonel değişiklikleri belirlemek için değerli bir araç olarak ortaya^{çıkmıştır 6}.

Fare modellerinde motor davranış ve yürüyüş analizi geleneksel olarak mekansal ve zamansal kinematik değişkenleri nicelendirmek için tasarlanmış özel teknolojik platformlara dayanmıştır. Aydınlatılmış yürüyüş yolları, enstrümantlı platformlar ve ticari hareket takip yazılımları gibi sistemler yaygın olarak kullanılır; Ancak, pahalı donanım ve özel altyapıya olan bağımlılıkları, birçok laboratuvarın erişimini önemli ölçüde^sınırlar 7,8,9,10. Ekonomik nedenlerin ötesinde, bu yaklaşımlar ek deneysel kısıtlamalar getirir. Bazı sistemler hayvanların dar koridorlardan veya yüksek aydınlatılmış koridorlardan geçmesini gerektirir; bu da zorla hareket desenleri uygular, bu da kendiliğinden davranışı azaltır; diğerleri ise fiziksel işaretlere, boya noktalarına veya uzuvlara bağlı yapışkan etiketlere dayanır. Bu tür müdahaleler strese yol açabilir, yürüyüş mekaniğini değiştirebilir ve motor sonuçların fizyolojik yorumunu^{karıştırabilir} 11,12,13,14. Bu sınırlamalar birlikte, invaziv prosedürlere veya pahalı altyapıya bağımlı olmadan doğal, serbest hareket koşullarında yürüyüşü yakalayabilen metodolojilere olan ihtiyacı vurgulamaktadır.

Kısıtlamamış hareket sırasında yürüyüşün değerlendirilmesi, hız, yörünge veya duruşu yapay olarak düzenleyen dış kısıtlamalardan kaçınarak daha doğal motor kalıplarının gözlemlenmesini sağlar. Bu yaklaşım, minimum kısıtlı koşullarda lokomotor davranışın karakterizasyonunu kolaylaştırır. DeepLabCut, fiziksel belirteçlere ihtiyaç duymadan kullanıcı tanımlı anatomik işaretleri takip etmek için konvolüsyon sinir ağları kullanan, açık kaynaklı, derin öğrenme tabanlı bir poz tahmin çerçevesidir. Standart video kayıtlarından anatomik nokta takibi mümkün kılarak, DeepLabCut kinematik parametrelerin çıkarılmasını sağlarken maliyeti ve deneysel karmaşıklığı önemli ölçüde^azaltır 15,16,17,18. Önemli olarak, işaretsiz takip deneysel paraziti en aza indirir ve bu da spontan davranış çalışmaları için uygun hale getirir. Bu tek kameralı işaretleyicisiz yaklaşım, serbest hareket eden koşullarda spontan lokomotor aktivite ve iki boyutlu yürüyüşle ilgili özelliklerin erişilebilir, invaziv olmayan niceliklendirilmesini gerektiren çalışmalar için en uygundur. Ancak, doğrudan biyomekanik değişkenler, örneğin yer reaksiyon kuvvetleri, plantar basıncı, eklem açıları veya tam üç boyutlu uzuv kinematiği gerektiğinde enstrümantlı yürüyüş platformları veya üç boyutlu hareket yakalama sistemleri gereklidir.

Bu makalenin amacı, serbest hareket eden farelerde yürüyüş ve kendiliğinden hareket etmenin invaziv olmayan niceliklerini sağlamak için DeepLabCut tabanlı düşük maliyetli, işaretsiz bir iş akışı sunmaktır; tek kameralı video alımı, anatomik dönüm noktası takibi ve mekansal-zamansal lokomotor parametrelerinin çıkarılmasını özel donanım veya müdahaleci manipülasyon gerektirmeyen erişilebilir bir iş akışı içinde entegre eder. Bu protokol, iş akışının metodolojik uygulamasına ve temsil eden çıktılarına odaklanır.

Protokol

Tüm hayvan prosedürleri, NIH Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Rehberi'ne uygun olarak gerçekleştirildi ve Meksika Ulusal Özerk Üniversitesi Nörobiyoloji Enstitüsü Biyoetik Komitesi tarafından protokol numarası 117 kapsamında onaylandı.

1. Çalışma bağlamı

1. Çalışmanın gerektirdiği deneysel koşullarda fareleri kullanın. Bu protokol makalesinde, APPSwe ve tauP301L transgenlerini PS1M146V bir boşluk arka planında barındıran ve kontrol olarak transjenik olmayan farelerle birlikte üçlü transjenik fare modelini (3xTg-AD) kullanarak iş akışı uygulamasının temsilci bir örneği olarak kullanıyoruz.
2. Çalışma başlamadan önce tüm hayvanları genotiple tutuyor.
3. Fareleri, veteriner gözetimi altında 12:12 saat ışık-karanlık döngü, 22 °C ± 2 °C sıcaklık ve %60 ± %5 bilgili nem gibi kontrollü koşullarda yiyecek ve su ile tamamen beslince beslemek.
4. 60 dakikalık alışkanlık döneminden sonra ışık aşamasında, her hayvan için tek bir açık alan oturumu kullanarak spontan keşif davranışını korumak ve arenaya tekrar maruz kalmanın getirdiği azalmış aktiviteyi önlemek için kayıtlar yapın.
   NOT: Bu protokol makalesinde, biyolojik karşılaştırmaları desteklemek yerine, yalnızca iş akışını ve yöntemle üretilen lokomotor ve yürüyüş çıkışlarının türünü göstermek için temsil eden kayıtlar sunuyoruz.

2. Malzemeler

1. Spontan hareket ve yürüyüşün kaydı ve analizi için Malzeme ve Ekipman Tablosu'nda listelenen malzeme ve ekipmanlarıkullanıyoruz. Deneysel kurulumun genel montajı için Şekil 1'e bakınız.

3. Kendiliğinden hareket etmeye alışma ve kaydetme

1. Hayvan hazırlığı ve alışkanlık
   1. Çevreye alışmak için fareyi deneyden en az 60 dakika önce konu odasından davranış test odasına dikkatlice aktarın.
   2. Davranışsal test odasını kontrollü çevresel koşullar altında tutmak; bunlar arasında 20 °C–22 °C arasında sabit sıcaklık, standart ışık yoğunluğu (arena seviyesinde ölçülür 120–150 luks) ve dış işitsel uyarıcıları en aza indirmek için sürekli beyaz gürültü dahildir.
   3. Alışma döneminde, hayvanı ev kafesinde tutarak ek uyarıcı veya zenginleştirme yapmadan bulunuyor. Stres kaynaklı davranışsal değişkenliği en aza indirmek için hayvanları kurumsal hayvan refahı yönergelerine uygun şekilde ele alın.
   4. Hayvanı temiz eldivenlerle ve yavaş, bilinçli hareketlerle ele alın. Hayvanı kuyruğunun tabanından nazikçe kaldırın ve karşı elinizle vücudunu destekleyin, ardından açık alana yerleştirin.
      Not: KRİTİK ADIM: Tutarsız müdahale veya yetersiz alışma süresi, kaygıya bağlı davranışları artırabilir ve lokomotor parametrelerde değişkenlik yaratabilir. Tüm hayvanlar ve seanslar için aynı alışkanlık prosedürlerini sağlayın.
2. Açık alan arenası ve kamera hazırlığı
   1. Her kayıt oturumundan önce, kalan kokuları ve önceki koku ipuçlarını gidermek için akrilik açık alan alanını %70 (v/v) etanol ile iyice temizleyin. Kullanmadan önce yüzeyin tamamen kurumasına izin verin.
   2. %70 etanolü iyi havalandırılan bir alanda işleyin, ısı veya ateşleme kaynaklarından uzak tutun ve kullanmadan önce arenanın tamamen kurumasına izin verin.
   3. Açık alan arenasını ahşap platforma güvenli bir şekilde yerleştirerek yapının stabil ve titreşimden arınmış olmasını sağlayın.
   4. Şeffaf akrilik duvarları ve mat zemin yüzeyini toz, nem veya video takimini engelleyebilecek yansıtıcı kalıntılardan arınmış olup olmadıklarından emin olmak için kontrol edin.
   5. Arenanın her iki tarafındaki dış yan beyaz ışık lambalarını, kayıt alanında eşit aydınlatma sağlamak ve gölgeleri, yansımaları veya aşırı parlaklığı en aza indirmek için arenanın her iki tarafına yaklaşık 30–45° açı olarak yerleştirin. Her oturumdan önce lamba yerleşimini ayarlayın ve arena seviyesinde aydınlatmanın hedef 120-150 lux aralığında kaldığından emin olun.
   6. Kamerayı, arenanın altında, arena düzleminden yaklaşık 80 cm sabit bir mesafede, alt görünüm konfigürasyonunda konumlandırarak kayıt alanının tam görüşünü garanti edin. Bu optimal mesafenin, tam alanı korumak için kameranın lens diyaframı ve görüş alanına (FOV) bağlı olarak ayarlanması gerekebileceğini unutmayın.
   7. Kamerayı bilgisayar sistemine bağlayın ve hayvanı tanıtmadan önce video alım yazılımını başlatın.
   8. Tüm arena yüzeyinin görünür ve keskin bir şekilde çözülmesini sağlamak için kamera odak ve görüş alanını ayarlayın.
   9. Arena düzleminde bilinen boyutlara sahip dama tahtası ızgarasını veya kalibrasyon desenini yerleştirerek mekânsal kalibrasyon için referans görüntü elde edin.
      NOT: KRİTİK ADIM: Doğru kamera hizası, sabit kamera mesafesi ve tutarlı aydınlatma, güvenilir işaretsiz poz tahmini için gereklidir. Geometri veya aydınlatma koşullarındaki sapmalar, takip doğruluğunu azaltabilir ve oturumlar arasında veri karşılaştırılabilirliğini tehlikeye atabilir.
      NOT: Dış destek yapısı için paslanmaz çelik gibi alternatif malzemeler kullanılabilir; ancak kurulum stabil kalırsa ve kayıt hizalanması korunursa.
      NOT: Özellikle dış görsel girişin ek kontrolü istendiğinde, kayıt sistemi stabil kalırsa ve dış görsel parazit en aza indirilirse, opak bir arena veya alternatif duvar malzemeleri de kullanılabilir.
      NOT: Bu protokolde kullanılan arena boyutları, serbest hareket eden farelerin kaydı için kullanılan konfigürasyona karşılık gelir. Bu boyutlar, tam hayvan görünürlüğü, mekansal kalibrasyon ve tutarlı yakalama koşulları korunduğu koşulu, kullanılan kemirgene ve benimsenen açık alan protokolüne göre ayarlanabilir.
3. Kendiliğinden hareket davranışının kaydı
   1. Faresi arenaya yerleştirmeden önce, kayıt ile ilgili deneysel oturum arasında doğrudan görsel bağlantı sağlamak için hayvan tanımlayıcısını video çerçevesinde kısa bir süre gösterin.
   2. Fareyi açık alan arenasının ortasına yerleştirmeden önce video kaydını başlatın; böylece oturumun başındaki ilk keşif davranışının yakalanması sağlanır.
   3. Faresi nazikçe açık alan arenasının ortasına yerleştirin.
   4. Görmesel, işitsel veya dokunsal rahatsızlıklar yaratmadan 3 dakika boyunca kesintisiz olarak spontan hareketleri kaydedin. Mevcut protokolde, fare başına yalnızca bir kayıt oturumu yapılıyordu.
   5. Bilgisayar ekranındaki canlı video yayınını takip ederek kesintisiz kaydı ve hayvanın hareketlerinin doğru şekilde kaydedildiğini doğrulayın.
   6. Oturumlar arasında kamera hizalanması ve aydınlatma düzenliliğini periyodik olarak doğrulayarak hayvanlar arasında tutarlı kayıt koşulları sağlanır.
   7. Kayıt süresinin sonunda, video kaydını durdurun ve yukarıda belirtilen aynı işlem yöntemiyle hayvanı dikkatlice arenadan çıkarın.
   8. Hayvanı ev kafesine geri götürün ve daha fazla işlem yapılmadan önce dinlenmesine izin verin.
      NOT: Kayıt sırasında hayvanı yeniden konumlandırmaktan kaçının, çünkü dış müdahale spontan yürüyüş kalıplarını değiştirebilir ve sonraki analizleri etkileyebilir.
4. Temizlik, veri depolama ve oturum tamamlama
   1. Her seanstan sonra açık alanı %70 (v/v) etanol ile tekrar temizleyin ve bir sonraki hayvanı tanıtmadan önce tamamen kurumasına izin verin.
   2. Bir sonraki hayvanı tanıtmadan önce arena yüzeyinde kalıntı etanol veya koku kalmadığından emin olun.
   3. Her kayıttan hemen sonra hayvan tanımlayıcısı, oturum tarihi ve saati, deneysel durum ve operatör adını belgeleyin.
   4. Ek hayvanlar test edilirse, aynı çevresel ve deneysel koşullarda 3.1.1 adımından itibaren prosedür tekrarlanacaktır.
   5. Her video dosyasını standart bir adlandırma düzeni (örneğin, AnimalID_SessionDate_Trial1.mp4) kullanarak özel bir klasöre kaydedin.
   6. Deneysel günün sonunda, oturumlar arasında aydınlatma ayarlarında kaymayı önlemek için kamera sistemini ve aydınlatma ekipmanını kapatın.
      NOT: Bu protokolde %70 etanol kullanılmış olsa da, bu tür işlemlerde yaygın olarak kullanılan dezenfektan olduğu için, akrilik uyumlu dezenfektanlar da yüzeyin ilerleyici bozulmasını önlemek için kullanılabilir; tabii ki arena bir sonraki kayıttan önce tamamen kuru ve kalıntı kokudan arınmış durumda.
      NOT: Mümkün olduğunda, seanslar arasında anında geçiş yapılmasına ve deneyin hayvanlar arasında sürekli ilerlemesini kolaylaştırmak için birden fazla arena hazırlanabilir.
      Deneysel kurulumun malzemeleri ve montajı için Şekil 1'e bakınız; bunlar arasında ahşap platform (Şekil 1A), akrilik arena (Şekil 1B), yanal aydınlatma sistemi (Şekil 1C), alt görünüm kamera konumlandırması (Şekil 1D) ve tam deneysel kurulum (Şekil 1E) yer alır.

Şekil 1: Açık alan arenasında hareket hareketinin video kaydı için deneysel kurulum. (A) arena için destek yapısı; (B) platforma yerleştirilmiş akrilik açık alan arenası; (C) eşit aydınlatmayı sağlamak için yanlı aydınlatma; (D) aşağıdan hareketi kaydetmek için kamera konumlandırması; (E) Tam kurulum. Beyaz ok uçları, Şekil 1C'de ışık kaynağının, Şekil 1D'de ise kameranın yönünü gösterir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

4. Video İşleme ve Kinematik Analiz

1. Video hazırlığı ve kalite kontrolü
   1. Ham videoları . MOV formatı ile DeepLabCut ile uyumluluk için sabit kare hızı ve çözünürlük parametrelerini koruyarak .avi formatına dönüştürür.
   2. B,tüm ham video dosyalarını satın alındıktan hemen sonra analiz bilgisayarında özel bir klasöre aktarır ve standart bir adlandırma geleneği uygular (örneğin AnimalID_Session_Date).
   3. Her videoyu tamamını inceleyerek kaydın tamamlanmış ve kesinti, kareler veya bozulma olmadan olup olmadığını doğrulayın. Satın alma hataları içeren videolar analizden çıkarılmalıdır.
   4. Orijinal format DeepLabCut ile uyumlu değilse videoları MP4 (H.264) veya sıkıştırılmamış AVI formatına dönüştürün.
   5. Isteğe bağlı olarak, oturumun başında ve sonunda (örneğin, hayvanın deneysel alana girişi veya çıkarılması sırasında) deneysel olmayan aralıkları ortadan kaldırmak için video görüntülerinin zamansal kesimi yapılabilir.
   6. Çözünürlüğün ve kare hızının kayıt sırasında kullanılan alım parametreleriyle uyumlu olup tüm oturumlarda tutarlı kaldığını doğrulayın.
   7. Video çerçevesinde tüm arena yüzeyinin görünür olduğundan ve hareket sırasında vücut parçalarının sürekli tıkanmadığından emin olun.
   8. Tüm doğrulanmış ve işlenmiş videoları DeepLabCut analizi için belirlenmiş bir proje dizinine yerleştirin.
      NOT: KRİTİK ADIM: Tutarsız kare hızları, kısmi arena görünürlüğü veya hareket bulanıklığı takip doğruluğunu doğrudan düşürür. Kalite kriterlerini karşılamayan videolar model eğitimi veya çıkarımına dahil edilmemelidir.
2. Proje oluşturma ve yapılandırma
   1. Proje için, analiz için tasarlanan aynı videoları veya ağ eğitimi için temsil eden bir alt kümeyi kullanarak bir video kütüphanesi belirleyin.
   2. Python ortamını başlatın ve DeepLabCut paketini içe aktarın.
   3. Şu komutu kullanarak yeni bir DeepLabCut projesi oluşturun:
   4. deeplabcut.create_new_project('ProjectName','Author','VideoPath').
   5. İlgilendiğiniz anatomik işaretleri (vücut parçaları) config.yaml dosyasında belirleyin, böylece net ve anatomik olarak tutarlı tanımlar sağlanır.
   6. Vücut parçalarının tanımları deneysel soru için optimize edilmeli ve tüm hayvanlar ile seanslar arasında aynı kalmalıdır.
3. Çerçeve çıkarımı ve vücut parçalarının etiketlenmesi
   1. Video uzunluğu ve mekansal düzene göre config.yaml dosyasında start, stop, numframes2extract ve cropping_parameters belirtin.
   2. Temsilci çerçeveleri şu şekilde çıkarın: deeplabcut.extract_frames(config_path, 'otomatik', 'kmeans'/'uniform').
   3. Kayıt boyunca vücut duruşu, yönelim, uzuv pozisyonu ve yürüyüş fazındaki varyasyonların yer aldığını doğrulamak için çıkarılan çerçeveleri inceleyin. Belirli duruşlar, uzuv konfigürasyonları veya lokomotor fazlalar yeterince temsil edilmemişse, bu koşulları daha iyi temsil etmek için ek çerçeveler çıkarın.
   4. Belirli yürüyüş döngüsü aşamaları gerektiğinde, çerçeveleri manuel olarak şu şekilde çıkarabilirsiniz: deeplabcut.extract_frames(config_path, 'manuel').
   5. Grafiksel etiketleme arayüzünü şu şekilde başlatın: deeplabcut.label_frames(config_path).
   6. Şekil 2'de gösterilen tüm önceden tanımlanmış anatomik simgeleri, alınım sırasında temsil eden video çerçevesi (Şekil 2A), orijinal çerçevenin üzerine yerleştirilmiş otomatik vücut noktası algılama (Şekil 2B) ve analiz için kullanılan tanımlanmış vücut işaretleri ile arena referans noktalarının şematik temsili (Şekil 2C) dahil olmak üzere etiketleyin. Anatomik kriterleri tutarlı takip edin (örneğin, burun: burnun ön ucu; kuyruk tabanı: omurga ile kuyruk arasındaki birleşim)
   7. Her dört uzuvu tutarlı şekilde etiketleyin; her bir işareti patinin ortasında, yere temas ettiği plantar yastıkların üzerine yerleştirin.
   8. Etiketleri şu deeplabcut.check_labels(config_path) kullanarak kaydedin ve inceleyin, gerekirse yanlış açıklamaları düzeltin.
   9. Mümkün olduğunda, ikinci eğitimli bir değerlendiriciden bir çerçeve alt kümesini etiketlemesini isteyin; böylece değerlendiriciler arası tutarlılığı değerlendirebilirsiniz.
      NOT: KRİTİK ADIM: Tutarsız veya anatomik olarak kesin olmayan etiketleme, aşağı akış takip hatalarının başlıca kaynağıdır. Tüm çerçevelerde simge tanımlarına sıkı şekilde uyulduğundan emin olun.
4. Sinir ağı eğitimi
   1. Poz tahmin modelini 200 epoch için eğitin ve 3,27 piksel nihai ortalama eğitim hatası (RMSE) ve 3,59 piksel ortalama test hatası elde edinin; bu, tanımlanan alım koşullarında kararlı takip performansına karşılık gelir.
   2. Eğitim ve değerlendirme veri setlerini şu şekilde oluşturun: deeplabcut.create_training_dataset(config_path).
   3. config.yaml içindeki Eğitim Kesimi parametresini ayarlayarak eğitim için kullanılan görüntülerin oranını belirleyin.
   4. GPU kullanılabilirliğini şu şekilde doğrulayın: nvidia-smi.
   5. Ağ eğitimine şu şekilde başlayın: deeplabcut.train_network(config_path, save_epochs=5, epochs=200).
   6. Antrenman kaybını takip edin ve kayıp değerleri stabilleşip başka bir iyileşme gözlemlenmediğinde antrenmanı durdurun.
   7. Eğitim kesintiye girerse, son kaydedilen kontrol noktasından devam edin.
   8. Eğitilen modeli şu şekilde değerlendirin: deeplabcut.evaluate_network(config_path) ve ortalama piksel hatasını kaydedin.
   9. Hata deneysel kurulum için kabul edilebilir eşiği aşarsa, ek etiketlenmiş çerçeveler ekleyin veya açıklamaları iyileştirin ve eğitimi tekrarlayın.
      NOT: Kabul edilebilir piksel hata eşikleri kamera çözünürlüğü ve arena büyüklüğüne bağlı olarak değişebilir, ancak deneyler arasında tutarlı kalmalıdır.
5. Video analizi ve yürüyüş miktarı
   1. Olasılık değeri 0.3'ün altında olan noktaları eksik olarak düşünün.
   2. Eksik noktaları yalnızca aralıklar ≤3 ardışık çerçeve olduğunda doğrusal olarak enterpolasyon yapar; analizden daha uzun boşlukları hariç tutun.
   3. Vücut merkezi hız eşiği 10 cm/s kullanarak lokomotor hareketleri tanımlayın.
   4. Bu eşik altındaki hareketleri ve 3 kareden kısa geçici olayları hariç tutun.
   5. Deneysel videolarda şu şekilde çıkarım yapın: deeplabcut.analyze_videos(config_path, [video_path], save_as_csv=Doğru).
   6. İzleme kalitesini görsel olarak doğrulamak için deeplabcut.create_labeled_video(config_path, [video_path]) ile etiketlenmiş videolar oluşturun (Şekil 2).
   7. Takip görselleştirme ve değerlendirme sırasında bir güven eşiği uygulamak için config.yaml içindeki pcutoff parametresini 0.6 olarak ayarlayın.
   8. Çıktı CSV dosyalarını, Materyaller Tablosu'nda listelenen istatistiksel hesaplama ortamına aktarın; ilgili analiz paketi ve davranışsal nicelik için Ek Materyal 1'de sağlanan özel betiklerle birlikte alın.
   9. Orijinal video örnekleme hızını kullanarak kare indekslerini zamana dönüştürün.
   10. Bilinen arena boyutları ve izlenen arena köşe işaretleri kullanılarak piksel koordinatlarını fiziksel birimlere dönüştürerek mekansal boyutları kalibre edin.
   11. Metrik çıkıştan önce izlenen koordinatlar üzerinde kalite kontrolü gerçekleştirin.
   12. 0.3'ün altında olasılık değeri olan noktaları eksik olarak kabul edin ve uygun olduğunda bunları doğrusal enterpolasyon ile değiştirin.
   13. Görsel inceleme sırasında istisna yörüngeleri belirleyin ve gerektiğinde düzeltin veya hariç tutun.
   14. Vücut merkez yer değiştirmesi ve arka uzuv hareketine dayalı senkronize kinematik kriterler kullanarak yürüyüş segmentlerini tanımlayın.
   15. Hareketsiz davranışlar (kalkma, dönme) ve bakım gibi hareketsiz davranışlar hariç tutulur.
   16. Deneysel koşullara ve hayvan modeline göre tanım eşiklerini manuel olarak kalibre edip iyileştirin; böylece analiz için yalnızca sağlam, sürekli hareket hareketleri tutulur.
   17. İzlenen işaretler arasındaki geometrik ve zamansal ilişkilerden türetilen yürüyüş metriklerini filtrelenmiş sürekli lokomotor segmentler kullanarak hesaplayın (Tablo 1). Bunlar arasında adım uzunluğu, adım uzunluğu, adım genişliği, kadans, adım süresi, adım süresi, duruş süresi, sallanma süresi, ipsilateral genlik ve uzuvlara özgü yer değiştirme ölçümleri yer almaktadır.
   18. Aynı takip verileriyle tam kayıttan açık alan metriklerini çıkarın (Tablo 1). Bunlar arasında toplam kat edilen mesafe, ortalama hız, hareket süresi, hareket yüzdesi, yürüyüş süresi sayısı ve süresi ile merkez, çevre ve köşe bölgelerinde toplam mesafe yer alıyordu.
   19. Tüm çıktıları aşağı yönlü istatistiksel analiz için yapılandırılmış bir ana dosyaya derleyin.
   20. Materyaller Tablosu'nda listelenen hesaplama ortamları ve yukarıda açıklanan çizim betiklerini kullanarak görsel temsiller (örneğin, yörüngeler, ısı haritaları, zaman tabanlı yer değiştirme, yürüyüş desenleri ve uzuvlar arası koordinasyon grafikleri) üretin.
   21. Nokta güveni, yürüyüş bout algısı, keşif bölgesi sınıflandırması ve uzuvlar arası koordinasyonun temsil eden senkronize görselleştirmeleri, analitik iş akışının yorumlanmasını kolaylaştırmak için Ek Video 1 ve Ek Video 2'de sunulmaktadır.
6. Kalite kontrolü ve veri yedeklemesi
   1. Rastgele etiketlenmiş videoların bir alt kümesini görsel olarak inceleyerek kareler ve oturumlar arasında anatomik tutarlılığı doğrulayın.
   2. Tahmin edilen simge noktalarını açıklamalı etiketlerle karşılaştırarak model kararlılığını ve genellemesini doğrulayın.
   3. Projenin tam bir kopyasını, config.yaml, orijinal etiketler, eğitilmiş ağ ağırlıkları ve çıktı dosyaları dahil olmak üzere kaydedin.
   4. İş akışında kullanılan yazılım sürümlerini, DeepLabCut, Python, PyTorch, CUDA ve istatistiksel hesaplama ortamını, GPU özellikleri ve analiz tarihiyle birlikte belgeleyin.
   5. evaluation-results.csv'den ortalama hatalar ve işlem sürelerine dair özet bir rapor oluşturun.
   6. Tüm projeyi yerel bir arşive ve kurumsal bir sunucuya ya da güvenli bulut depolamaya yedekleyin.
7. Hesaplamalı ortam ve tekrarlanabilirlik kaynakları
   1. Orijinal video kayıtlarını . 1080 × 1920 piksel çözünürlükte ve yaklaşık 60 FPS çözünürlükte MOV formatı sunuyor.
   2. Videoları önceden işleyip .avi formata dönüştürün.
   3. Bu dönüşüm adımında, ilgi duyulan bölgeyi kırpın, 720 × 720 piksel kare çözünürlükte yeniden boyutlandırın ve sonraki kinematik analizlerde doğru zamansal nicelik sağlamak için kare hızını sabit 60 FPS olarak standartlaştırın.
   4. Python 3.12.12, PyTorch 2.5.1 ve CUDA 11.8 ile yapılandırılmış bir Python ortamında DeepLabCut sürüm 3.0.0rc13 kullanarak işaretsiz takip iş akışını uygulayın.
   5. Poz tahmin modelini 200 epoch için eğitin ve nihai ortalama eğitim hatası (RMSE) 3,27 piksel ve ortalama test hatası 3,59 piksel elde edinin.
   6. Yürüyüş ve açık alan niceliklendirme için istatistiksel hesaplama ortamı ve Ek Materyal 1'de sağlanan özel betikleri kullanarak takip sonrası analiz gerçekleştirin.
   7. Yürüme nöbetlerini belirlemek için vücut merkezi hız eşiği 10 cm/s kullanın. Lokomotor dönemler arasında 3'e kadar aralıkları doldurun ve analiz için sürekli yürüyüş segmentlerini korumak amacıyla 3 kareden kısa geçici hareketleri hariç tutun.
   8. İlgili config.yaml ayarlarını, temsil edici analiz betiklerini, örnek video ve takip dosyalarını ve Ek Materyal 1'de model ağırlıklarını sağla.
   9. Ek uygulama detayları, model değerlendirme metrikleri, donanım spesifikasyonları ve duruma özgü analiz parametreleri Ek Materyal 1'de sağlanır.
      NOT: Bu parametreleri, her deneyde kullanılan satın alma koşullarına göre ayarlayın.

Şekil 2: Video kayıtlarından işaretçisiz vücut noktası takibi ve yürüyüş analizi için temsil iş akışı. (A) Satın alma sırasında açık alan alanında serbestçe hareket eden bir farenin temsil eden video çerçevesi. (B) Poz tahmininden sonra orijinal video kareye bindirilmiş otomatik vücut noktası algılama örneği, analiz için kullanılan anatomik işaretleri göstermektedir. (C) Yürüyüş rekonstrüksiyonu, mekânsal kalibrasyon ve nicel lokomotor analiz için kullanılan tanımlanmış gövde işaretlerinin ve arena referans noktalarının şematik temsili. Önemli noktalar ve arena referans noktaları: burun, boğaz, vücut ortası, vücut ortası sol (bcl), vücut merkez sağ (bcr), sol kalça (hipl), sağ kalça (hipr), kuyruk tabanı, kuyruk merkezi, kuyruk ucu, sol ön ayak, sol arka ayak, sol arka ayak, sağ ön ayak, sağ arka (rhp), sol üst (tl), sağ üst sağ (TR), alt sol (bl) ve sağ alt (br). Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Sonuçlar

Takip ve analiz iş akışının uygulanmasının ardından, otomatik işleme, tanımlanmış gövde merkezi işareti kullanılarak kendiliğinden açık alan hareketini yeniden inşa etti ve aşağı akış analizine uygun nicel çıktılar üretti. Temsilci yörünge grafikleri, protokolün arena boyunca mekânsal yer değiştirmesini, zaman doluluğunu ve serbest keşif sırasında hız dinamiklerini nasıl yakaladığını gösterir. Bu bölümde gösterilen açık alan değişkenleri tam kayıttan hesaplanmış ve protokol tarafından üretilen iş akışını ve yürüyüş çıkış...

Tartışma

Bu çalışma, standart video alımı ve DeepLabCut tabanlı poz tahmini kullanarak serbest hareket eden farelerde spontan hareket ve yürüyüş analizi için düşük maliyetli, işaretsiz bir yaklaşım sunmaktadır. Bu iş akışı, video kayıtlarından lokomotor ve yürüyüşle ilgili değişkenlerin çıkarılmasını sağlarken, doğal hareket davranışını koruyor ve deneysel paraziti azaltır. Bu anlamda, protokol motor davranışın preklinik çalışmaları için pratik ve erişilebilir bir alternatif sunar.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
70% etanol	Genel	Yok	Arena temizliği oturumlar arasında
Ayarlanabilir beyaz ışık lambaları	Genel	Yok	Sabit aydınlatma (100–150 lx)
Siyah perdeler/parlama kontrolü	Genel	Yok	Harici ışık/yansımaları azaltmak
Dama tahtası kafes şablonu	Genel	Yok	Mekansal kalibrasyon referans görüntüsü
DeepLabCut (v3.0.0rc13)	Açık kaynak	Yok	Pozisyon tahmini yazılımı
Dijital video kamera (HD, 16:9; ≥60 fps)	Genel	Yok	Oturumlar arasında sabit ayarlar
Nvidia GPU iş istasyonu	Özel yapım	Yok	Model eğitimi/çıkarımı için donanım
Lüks ölçer	Genel	Yok	Arena düzeyinde aydınlatmayı doğrulamak
PyTorch	Pytorch Foundation	Yok	DeepLabCut'un gerektirdiği çerçeve
Şeffaf akrilik açık alan arenası (42 × 42 × 42 cm)	Özel yapım / Şirket içi	Yok	Açık alan arenası
Arena altı kamera montajı (90° görüş)	Özel yapım / Şirket içi	Yok	Alt taraf kayıt için stabil montaj
CUDA	Nvidia Corporation	Yok	GPU hızlandırılmış paralel işleme
R programlama dili	R Foundation	Yok	Veri analizi için programlama dili