Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Sıtma Yeniden Enfeksiyesi Sırasında Periferik Kan Mononükleer Hücre CD4+ T Hücrelerinin Tek Hücreli RNA Dizileme Analizi İçin Tekrarlanabilir Seurat Tabanlı Protokol

106 görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/70858

⸱

31 Temmuz 2026

 ,  , 
1Department of Biochemistry, University of Ilorin

Bu makalede

Özet

Burada, periferik kan mononükleer hücre CD4⁺ T hücrelerinden tek hücreli RNA dizileme verilerinin analizi için tekrarlanabilir bir Seurat tabanlı protokol sunuyoruz; böylece sıtma yeniden enfekte sırasında transkripsiyonel heterojenlik ve fonksiyonel bağışıklık programları karakterize edilmektedir. Bu protokol, dinamik CD4⁺ T-hücre durumlarının ve bağışıklık yanıtlarının koşullar arasında tutarlı tanımlanması, karşılaştırılması ve biyolojik yorumlanmasını sağlar.

Özet

Burada, sıtma yeniden enfekte zaman noktalarında PBMC CD4⁺ T-hücreli tek hücreli RNA dizileme verilerini analiz etmek için tekrarlanabilir bir Seurat tabanlı protokol sunuyoruz. Bu protokol, PBMC CD4⁺ T-hücre scRNA-seq verilerini sıtma yeniden enfekte zaman noktalarında analiz etmek için tekrarlanabilir bir iş akışını sergiler; uygulamalarını göstermek için temsilli halka açık veri setleri kullanılır: Plasmodium-spesifik TCR-transgenik CD4⁺ T-hücre veri seti (GSE233703) ve polisklonal CD4⁺ T-hücre veri seti (GSE233713; D27₍₃₎ ile D30). İş akışı, birleşik bir hesaplama çerçevesinde standartlaştırılmış ön işleme, entegrasyon, kümeleme ve sonraki transkriptomik analizleri içerir. Bu yöntem, önceden tanımlanmış bağışıklık ve CD4⁺ T hücresi programları için modül puanlarının sistematik olarak hesaplanmasına, küme-spesifik belirteç genlerinin tanımlanmasını, zaman noktasına göre çözülen diferansiyel ifade analizini ve aşağı akış Gen Ontolojisi ile KEGG yol zenginleştirmesini mümkün kılar. Bu iş akışının uygulanması, CD4⁺ T hücresinin fonksiyonel durumlarını belirler ve sıtma yeniden enfekte zaman noktaları boyunca dinamik transkripsiyonel değişiklikleri ortaya koyar. Protokol, standartlaştırılmış görselleştirme çıktıları ve tablolanmış sonuçlar üretir ve parametre seçimi ile sorun giderme konusunda pratik rehberlik sağlar; böylece sıtma ve ilgili immünolojik bağlamlarda CD4⁺ T-hücre scRNA-seq veri setlerinin tutarlı ve tekrarlanabilir analizini kolaylaştırır. Bu protokol, bağışıklık yanıtlarının tekrarlanabilir ve biyolojik olarak yorumlanabilir analizini mümkün kılar ve immünolojik araştırmalarda benzer tek hücreli veri setlerine uygulanabilir.

Giriş

Sıtma hâlâ önemli bir küresel sağlık yükü olmaya devam ediyor; tekrarlayan enfeksiyonlar konak bağışıklığını karmaşık ve eksik anlaşılamayan şekillerdeşekillendiriyor 1. CD4⁺ T hücreleri, etkitör sitokin üretimini koordine ederek, B-hücre yardımını destekler ve iltihabı düzenleyerek antimalaryal bağışıklıkyanıtlarında merkezi bir rol oynar 2,3. Sıtma yeniden enfekte olmasında, CD4⁺ T hücreleri dinamik transkripsiyonel yeniden programlanmaya geçer; bu, hem parazit kontrolü hem de immünopatolojiyi etkileyen efektör, düzenleyici, hafıza, proliferatif ve tükenmiş durumlar arasındakideğişimleri yansıtır 4,5. Bu heterojenliği doğru şekilde çözmek, bağışıklık koruması, bağışıklık işlev bozukluğu ve doğal olarak edinilen veya aşı kaynaklı Plasmodium enfeksiyonuna karşı bağışıklık dayanıklılığını anlamak için gereklidir. Burada, sıtma yeniden enfeksiyon zaman noktalarında CD4⁺ T-hücresi scRNA-seq verilerini analiz etmek için tekrarlanabilir bir Seurat tabanlı protokol sunuyoruz.

Tek hücreli RNA dizileme (scRNA-seq), bağışıklık heterojenliğinin yüksek çözünürlüklü karakterizasyonunu sağlar ve sıtma 6,7,8,9'da parazite duyarlı CD4⁺ T hücresi alt kümelerini, tükenme programlarını ve düzenleyici ağları tespit etmiştir. Ancak, kalite kontrolü, normalizasyon, kümeleme ve entegrasyondaki analitik değişkenlik, tekrarlanabilirliği sınırlayabilir ve çapraz çalışma karşılaştırmalarınıkarmaşıklaştırabilir 10,11. Ancak, sıtma yeniden enfeksiyonu sırasında CD4⁺ T hücresi dinamiklerini analiz etmek için özel olarak optimize edilmiş standartlaştırılmış ve biyolojik rehberli bir iş akışı eksiktir.

Seurat ve Scanpy dahil olmak üzere scRNA-seq analizi için mevcut hesaplama çerçeveleri, tek hücreli verilerin ön işlemesi, kümelenmesi ve sonraki yorumlanması için kapsamlı araçsetleri sağlar 12,13,14. R ile uygulanan Seurat, heterojen bağışıklık veri setlerinde sinyal algılamanı iyileştiren SCTransform gibi varyans dengeleyici yaklaşımlar da dahil olmak üzere normalizasyon, veri entegrasyonu ve görselleştirme için sıkı entegre işakışları sunar 13. Python'da uygulanan Scanpy, büyük veri setleri ve verimli bellek kullanımı için optimize edilmiş ölçeklenebilir çözümler sunar; bu da onu özellikle yüksek verimlilikli veya bulut tabanlı analizler için uygunkılar 12,14. Bu gelişmelere rağmen, enfeksiyon ortamlarında biyolojik soruları açıkça ele alan, veri setleri arasında şeffaflık, uyum ve tutarlılığı koruyan standartlaştırılmış, tekrarlanabilir iş akışlarına ihtiyaç devam etmektedir. Mevcut protokol, Seurat tabanlı ön işlemenin sağlamlığını, sıtma yeniden enfeksiyonu sırasında CD4⁺ T-hücre yanıtlarına uyarlanmış yapılandırılmış biyolojik yorumlama ile birleştirerek bu boşluğu kapatmaktadır. Mevcut genel amaçlı iş akışlarına kıyasla, bu protokol tekrarlanabilirlik, biyolojik olarak bilinçli parametre seçimi ve enfeksiyon modellerine uyarlanmış tutarlı çapraz zaman noktası analizini vurgular.

Bu protokolün temel özelliklerinden biri, tekrarlanabilirlik ve pratik kullanılabilirlik üzerine verdiği önemdir. Kalite kontrol eşikleri sabit değildir, ancak medyan mutlak sapmaya dayalı veriye uyarlayıcı yaklaşımlarla türetilir; bu da transkript karmaşıklığı, dizileme derinliği ve mitokondriyal içerik eşiklerinin veri setine özgü dağılımlarla ölçeklenmesine olanak tanır. Bu tasarım, iş akışını genellikle birkaç bin ile on binlerce hücre arasında değişen farklı boyutlarda veri setlerinde ve damla tabanlı scRNA-seq deneylerinde sıkça karşılaşılan geniş bir dizileme derinliklerinde uygulanabilir kılar. İş akışına gömülü rehberlik, boyut azaltma, kümeleme çözünürlüğü ve entegrasyon için uygun parametre seçimini destekler; böylece analizler hem biyolojik anlamlı hem de teknik olarak sağlam kalır. Buna rağmen, iş akışı veri kalitesine ve dizileme derinliğine bağlıdır ve aşırı seyreklik veya toplu etkilere sahip veri setleri için ayarlama gerektirebilir.

Bu protokol, R ve tek hücre analizine temel aşina olan orta ve ileri düzey kullanıcılar için tasarlanmıştır; ancak yapılandırılmış, adım adım uygulanabilir ve tamamen tekrarlanabilir çıktıları sayesinde motive olan yeni başlayanlar için erişilebilir kalır. İş akışı, her aşamada kalite kontrol özetleri, kümeleme çıktıları, farklı ifade sonuçları ve zenginleştirme analizleri dahil olmak üzere standartlaştırılmış tablolar ve şekiller oluşturur; böylece şeffaflık, doğrulama ve iş birliği veya çoklu çalışma bağlamlarında yeniden kullanımı kolaylaştırır. Bu protokol, enfeksiyon ve immünoloji araştırmalarında zaman noktaları veya koşullar arasında bağışıklık heterojenliğini araştıran çalışmalar için özellikle uygundur.

Bu yöntem, sıtma yeniden enfekte zaman noktalarında CD4⁺ T-hücre scRNA-seq analizi için uçtan uca Seurat tabanlı tekrarlanabilir bir iş akışı sağlar. Uyarlanabilir kalite kontrolü, varyans stabilizasyonu, boyutsal indirgeme, kümeleme ve uygun olduğunda çoklu örnek entegrasyonunuentegre eder 13,15. Biyolojik yorumlanabilirliği artırmak için, iş akışı bağışıklık ve CD4⁺ T-hücre alt kümesi gen modülü puanlamasını içerir; bu da Th1, Tfh, Tr1, Treg, merkezi hafıza, efektör hafıza, proliferasyon, sitotoksisite ve tükenme 16,17,18 gibi fonksiyonel programları niceldir. Tamamlayıcı küme belirteç tanımlaması, zaman noktası diferansiyel ifade analizi ve Gen Ontolojisi ile KEGG veritabanları kullanılarak yol zenginleştirmesi, T-hücre durumlarının sağlam açıklaması ve karşılaştırmasını desteklemekiçin dahil edilmiştir 19,20. Kamuya açık Plasmodium scRNA-seq veri setleri kullanılarak gösterilmiş olsa da, bu protokol CD4⁺ T hücrelerinin tekrarlanabilir ve yorumlanabilir tek hücreli analizinin gerektirdiği diğer sıtma yeniden enfeksiyon modelleri ve immünolojik bozulmalar için geniş çapta uygulanabilir. Genel olarak, bu protokol CD4⁺ T-hücre yanıtlarının tek hücre analizi için tekrarlanabilir ve biyolojik olarak yorumlanabilir bir çerçeve sunar ve sıtma ile ilgili sistemlerde bağışıklık dinamiklerinin kapsamlı bir şekilde araştırılmasını destekler.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Etik beyan:

Bu çalışmada kullanılan tüm veriler, kamuya açık veri setlerinden (GSE233703 ve GSE233713) alınmıştır. Orijinal çalışmalar, hayvan deneyleri için kurumsal ve etik yönergelere uyuyordu. Bu çalışma, Gen İfadesi Omnibusu (GEO) deposundan (GSE233703 ve GSE233713) elde edilen kamuya açık ve kimliği belirsiz tek hücreli RNA dizileme veri setlerinin ikincil biyoinformatik analizini içeriyordu. Bu çalışmada yeni insan katılımcılar, klinik örnekler veya tanımlanabilir hasta bilgileri yer almamıştır. Kamuya açık anonimleştirilmiş veri setlerini içeren araştırmalar için kurumsal ve ulusal yönergelere göre, bu biyoinformatik analiz için ek etik onay ve bilgilendirilmiş onay gerekmemektedir. Bu veri setleriyle ilişkili orijinal çalışmalar, ilgili kurumsal etik standartlar ve biyomedikal araştırmalar için geçerli yönergeler doğrultusunda yürütülmüştür.

1. GSE233703 ve GSE233713 için tekrarlanabilir Seurat tabanlı CD4⁺ T-hücreli scRNA-seq analiz iş akışı

NOT: Bu iş akışı Ek Dosya S1 olarak sağlanmıştır. Ayrıca, tüm iş akışına genel bir bakış sunan bir şemaya da bakın (Şekil 1).

  1. Protokole başlamadan önce kapsamı ve hedef kullanıcıları tanımlayın
  2. Hedef kullanıcıları tanımlayın
    1. Kullanıcı R ve tek hücreli RNA dizileme (scRNA-dizi) analizine orta veya ileri düzeyde aşina sahipse bu protokolü kullanın.
    2. Bu iş akışını, 10x tarzı matris formatında oluşturulan fare dalağı CD4⁺ T-hücre veri setlerine uygulayın. Her aşamayı doğrulamak için adımlı yapıyı ve beklenen çıktıları kullanın.
      NOT: Büyük dizileme veri setleriyle çalışırken uygun veri işleme uygulamaları ve güvenli depolama sağlanın.
  3. scRNA-seq'i tanımlayın
    1. Tek hücreli RNA dizileme (scRNA-seq) yöntemini, bireysel hücrelerde gen ifadesini niceleyen bir transkriptomik yöntem olarak ele alın.
    2. Karmaşık dokular içindeki ayrık hücre durumlarını, geçiş popülasyonlarını ve heterojen bağışıklık programlarını tanımlamak için scRNA-seq kullanın.
  4. Yazılım ve paket gereksinimlerini hazırla
  5. Çekirdek yazılımı kur
    1. R 4.2 veya daha sonrasını kur.
    2. RStudio arayüzünü açın. Çalışma dizinini setwd() ile ayarlayın.
    3. Scriptleri source() fonksiyonunu kullanarak ardışık olarak çalıştırın. Proje notlarında R, RStudio ve işletim sisteminin tam sürümlerini kaydedin.
  6. R paketlerini kur
    1. Gerekli CRAN paketlerini kurun: Seurat, Matrix, tidyverse, patchwork, pheatmap, RColorBrewer, cluster, glmGamPoi ve ggplot2.
    2. Gerekli Bioconductor paketlerini yükleyin: clusterProfiler, org. Mm.eg.db, enrichplot ve DESeq2.
    3. Sadece gerekirse isteğe bağlı paketleri kurun: DoubletFinder çift kaldırma için ve monocle3 yörünge analizi için. Analiz oturumunun başında gerekli tüm paketleri yükleyin.
  7. Kayıt versiyonları
    1. Paket ve oturum bilgilerini iş akışının sonunda sessionInfo() veya eşdeğer bir fonksiyon kullanarak kaydedin.
    2. El yazmasında anahtar analiz bileşenlerini, R versiyonu, Seurat versiyonu, DESeq2 versiyonu ve clusterProfiler versiyonu dahil olmak üzere açıkça bildirin.
  8. Ek dosya 2'de bahsedilen örnek kurulum komutlarını çalıştırın
  9. Donanım ve depolama gereksinimlerini doğrulayın
  10. Minimum kaynakları onaylayın
    1. En az 16 GB RAM, 4 CPU çekirdeği ve 20 GB boş disk alanı bulunan bir iş istasyonu kullanarak birkaç bin ila on binlerce hücre içeren veri setlerinin rutin analizini yapın.
  11. Önerilen kaynakları onaylayın
    1. Entegre analizler, tekrarlanan grafikler veya isteğe bağlı çift tespit için 32 GB veya daha fazla RAM kullanın.
    2. Büyük nesneler veya entegre veri setleri bellek kaynaklı hata üretiyorsa future.globals.maxSize'i artırın.
    3. Örnek bellek ayarı uygula
  12. Ek dosya 2'de belirtilen bellek seçeneklerini ayarlamak için aşağıdaki komutları çalıştırın

2. Proje yapısını oluşturun

  1. Kök proje dizinini oluştur
    1. Analiz için bir proje dizini oluşturun.
    2. data/, scripts/ ve results_spleen_cd4/ adında alt dizinler oluşturun.
  2. Standartlaştırılmış çıktı yapısı kullanın
    1. İş akışının çıktıyı aşağıdaki dizinlere yazdığından emin olun:
      results_spleen_cd4/GSE233703/fig/
      results_spleen_cd4/GSE233703/tablolar/
      results_spleen_cd4/GSE233703/rds/
      results_spleen_cd4/GSE233713/fig/
      results_spleen_cd4/GSE233713/tablolar/
      results_spleen_cd4/GSE233713/rds/
      results_spleen_cd4/post_markers/
  3. Tutarlı dosya isimlendirmesi kullanın
    1. GEO giriş dosyalarını, script tarafından beklenen yollara uygun şekilde yeniden adlandırın.
    2. Aşağıdaki tam dosya adlarını kullanın:
      data/GSE233703_matrix.mtx.gz
      data/GSE233703_genes.tsv.gz
      data/GSE233703_barcodes.tsv.gz
      data/GSE233713_d27_3_matrix.mtx.gz
      data/GSE233713_d27_3_features.tsv.gz
      data/GSE233713_d27_3_barcodes.tsv.gz
      data/GSE233713_d30_matrix.mtx.gz
      data/GSE233713_d30_features.tsv.gz
      data/GSE233713_d30_barcodes.tsv.gz
    3. İsteğe bağlı meta veri dosyalarını aşağıdaki gibi adlandırın:
      data/GSE233703_cell_metadata.csv
      data/GSE233713_cell_metadata.csv
  4. Meta veri gereksinimlerini onaylayın
    1. Her meta veri dosyasının bir barkod sütunu içerdiğini doğrulayın. Örnek, zaman noktası gibi isteğe bağlı sütunlar ekleyin ve mevcut olduğunda çoğaltın.
    2. Meta veri ile sayım matrisleri arasında tam barkod eşleşmeleri kullanın.
      Dikkat: İçe aktarmaya başlamadan önce beklenen yollarda matris üçlülleri ve meta veri dosyalarının var olduğunu doğrulayın.


3. Sayı matrislerini itiş ve giriş bütünlüğünü doğrulamak




    
	
  1. 10x tarzı matrisleri okuyun
      
		
    1. Her matrix.mtx.gz dosyayı seyrek bir matris olarak okuyun.
      2. 
		
    2. İlgili özellikler (veya genler) dosyasını ve barkod dosyasını sekmelerle ayrılmış tablolar olarak okuyun.
      3. 
		
    3. Gen sembollerini, özellikler dosyasının ikinci sütununu kullanarak matris satırlarına atayın. Benzersiz gen sembollerini make.unique() kullanarak zorunlu kılın.
      4. 
		
    4. Matris sütunlarına barkod tanımlayıcıları atamak.'
      5. 
	
    
	
    2. 
	
  2. Örnek içe aktarma fonksiyonunu çalıştır
      
		
    1. Ek dosya 2'de bahsedilen kodu çalıştırarak matrisi içe aktarın ve tanımlayıcıları atasın.
      2. 
	
    
	
    3. 
	
  3. Matris bütünlüğünü doğrulama
      
		
    1. Matris satırlarının sayısının özellikler sayısına eşit olduğunu doğrulayın. Matris sütunlarının sayısının barkod sayısına eşit olduğunu doğrulayın.
      2. 
		
    2. Herhangi bir uyumsuzluk tespit edilirse iş akışını durdurun.
      NOT: Uyumsuzluk tespit edilirse, dosya bütünlüğünü doğrulayın ve adımı tekrar çalıştırmadan önce özellik ve barkod dosyalarının doğru hizalandığından emin olun.
      Kontrol noktası: Sadece satır sayıları özelliklerle eşleşiyorsa ve sütun sayıları barkodlarla eşleşiyorsa devam edin.
      3. 
	
    
	
    4. 





4. İşaler ve modül panellerini tanımlayın




    
	
  1. Sıtma ile ilgili CD4⁺ T-hücre panellerini tanımlayın
      
		
    1. Adlandırılmış gen panellerini tanımlayın: Th1, Tfh, Tr1, Treg, Tcm, Tem, Exhaustion, Proliferation, Cytotoxic, Activation_early, Interferon_response, Immune_regulation
      2. 
		
    2. Bu panelleri, sonraki modül puanlaması için isimli bir R listesinde sakla.
      3. 
	
    
	
    2. 
	
  2. Gen panellerini tanımlamak için Ek dosya 2'de bahsedilen R kodunu çalıştırın.
    3. 
	
  3. Belirteç doğrulama genlerini tanımlayın
      
		
    1. Foxp3, Bcl6, Cxcr5, Il21, Ifng, Ctla4, Pdcd1, Lag3, Tbx21, Tcf7 ve Lef1 gibi kanonik işaretleyici genleri içeren ayrı bir doğrulama paneli tanımlayın.
      2. 
	
    
	
    4. 



5. Seurat nesneleri oluşturun ve kalite kontrol metriklerini hesaplayın




    
	
  1. Seurat nesnelerini başlatma
      
		
    1. Min.cells = 3 ve min.features = 0 kullanarak her veri seti için bir Seurat nesnesi oluşturun. İç aktarma sırasında keyfi özellik kesme sınırları koymayın.
      2. 
		
    2. Veri seti, örnek ve zaman noktası meta verileri ekleyin. İstereğe bağlı meta verileri barkod eşleştirme ile birleştirin.
      3. 
	
    
	
    2. 
	
  2. Çalıştır örneği Seurat nesne başlatma
      
		
    1. Ek dosya 2'de bahsedilen R kodunu çalıştırarak bir Seurat nesnesi oluşturuldu ve meta veri atayın.
      2. 
	
    
	
    3. 
	
  3. Kalite kontrol metriklerini hesapla
      
		
    1. Mitokondriyal transkript fraksiyonunu fare öneki ^mt- kullanılarak hesaplayın.
      2. 
		
    2. Aşağıdaki metrikleri nicelikle ölçer
      nFeature_RNA
      nCount_RNA
      percent.mt
      3. 
	
    
	
    4. 
	
  4. Ek dosya 2'de bahsedilen örnek kodu çalıştırın.
    5. 
	
  5. Ön filtre kalite kontrolünü görselleştirin
      
		
    1. nFeature_RNA, nCount_RNA ve percent.mt için keman hikayeleri oluşturun. nCount_RNA ile nFeature_RNA ve nCount_RNA ile percent.mt için özellik-dağılma grafikleri oluşturun.
      2. 
		
    2. QC_pre_filter_AllCells_vln.png ve QC_pre_filter_AllCells_scatter.png gibi standart isimlerle ön filtre rakamlarını kaydedin.
      Dikkat: Düşük kaliteli kuyruklar ve yüksek sayıya sahip istisna değerlerle geniş ön filtre dağılımları bekleyin.
      3. 
	
    
	
    6. 



6. Uyarlanabilir kalite kontrol eşikleri türetin ve düşük kaliteli hücreleri filtreleyin


    
	
  1. Veri setine özgü eşikler türetin
      
		
    1. Log-transform nFeature_RNA + 1 ve nCount_RNA + 1. Her iki dönüştürülmüş değişken için medyan ve medyan mutlak sapmayı (MAD) hesaplayın.
      2. 
		
    2. Aşağıdaki eşikleri tanımlayın:
      min_features = 10^(medyan - 3 × MAD) - 1
      max_features = 10^(medyan + 3 × MAD) - 1
      min_counts = 10^(medyan - 3 × MAD) - 1
      max_counts = 10^(medyan + 3 × MAD) – 1
      3. 
		
    3. Mitokondriyal eşiği, %5 ile %20 arasında sınırlanmış olan percent.mt %95'lik %× artı 3 MAD olarak tanımlayın.
      4. 
		
    4. Fonksiyonu çalıştırmadan önce dataset_id, sample_id ve out_dir terimlerinin doğru şekilde belirtildiğinden emin olun.
      qc_thr <- derive_qc_thresholds(seu, dataset_id = "GSE233703", sample_id = "AllCells", out_dir = "results_spleen_cd4/GSE233703")
      5. 
	
    
	
    2. 
	
  2. Filtreleme uygulayın
      
		
    1. Tüm uyarlanabilir kriterleri karşılayan hücreleri tutun:
      nFeature_RNA >= min_features
      nFeature_RNA <= max_features
      nCount_RNA >= min_counts
      nCount_RNA <= max_counts
      percent.mt <= max_percent_mt
      2. 
		
    2.  Ek dosya 2'de bahsedilen örnek kodu çalıştırın.
      3. 
	
    
	
    3. 
	
  3. Filtreleme çıktılarını kaydet
      
		
    1. QC_thresholds_*.csv ve cell_counts_summary_*.csv.
      DURAKLAMA NOKTASI: Ara çıktıları kaydedin ve gerekirse analizi bu adımdan devam ettirin.
      2. 
		
    2. Filtre sonrası QC keman ve dağılma grafiklerini oluşturup kaydedin.
      Kontrol noktası: Daha sıkı filtre sonrası dağılımlar, düşük karmaşıklıktaki hücrelerin kaldırılması ve aşırı istisnaların azaltılması bekleyin.
      3. 
	
    
	
    4. 



7. Verileri normalleştirin ve PCA uygulayın


    
	
  1. Normalize et ve varyans-stabilize et
      
		
    1. Hücre döngüsü puanlamadan önce RNA testini normalleştirin. Eğer açıksa, hücre döngüsü puanlamasını çalıştırın. Varyans stabilizasyonu için SCTransform() kullanın.
      2. 
		
    2. Mitokondriyal içeriği ancak biyolojik olarak gerekçelendirilmiş ve açıkça etkinleştirilmiş ise regresyon.
      3. 
		
    3. Hücre döngüsü puanlarını yalnızca çalışma tasarımı için gerekliyse regressin yapın.
      4. 
	
    
	
    2. 
	
  2. Ek dosya 2'de belirtildiği gibi örnek normalizasyonu çalıştırın.
    3. 
	
  3. Parametre değerlerini tanımlayın
      
		
    1. Kullanın n_variable_features = 3000.
      2. 
		
    2. dims_max_for_pca = 50 kullanın.
      3. 
		
    3. Bu değerleri el yazmasında açıkça belirtin.
      4. 
	
    
	
    4. 
	
  4. PCA çalıştırın ve ana bileşenleri seçin
      
		
    1. PCA'yı normalize testte çalıştırın. Başarılı PCA yürütülmesini varyans ve ana bileşen yüklemelerini inceleyerek doğrulayın.
      2. 
		
    2. Her ana bileşen tarafından açıklanan hesaplama varyansı.
      3. 
	
    
	
    5. 
	
  5. Üç kriterin tamamını kullanarak PC'leri seçin:
      
		
    1. En az %1 varyansı açıklayan oyuncu karakterlerini tutun,
      2. 
		
    2. Kümülatif varyansın yaklaşık %80'e ulaşmasını sağlamak
      3. 
		
    3. Son seçimi 10 ile 40 oyuncu arasında sınırlayın.
      4. 
		
    4. PCA_variance_table_*.csv, PCA_selection_rationale_*.csv ve PCA_Elbow_*.png tasarruf edin.
      5. 
	
    
	
    6. 
	
  6. PCA örneği çalıştır
      
		
    1. Ek dosya 2'de belirtildiği gibi örnek.
      Kontrol noktası: Seçilen kesme noktasından sonra marjinal varyans kazanımında gözle görülür bir azalma olan bir dirsek grafiki bekleyin.
      2. 
	
    
	
    7. 

















8. Mahalleler oluşturun, çözünürlük seçin ve hücreleri küme yapın


    
	
  1. Grafik yapısı
      
		
    1. Seçilen PC'ler kullanılarak paylaşılan bir en yakın komşunun grafiğini oluşturun.
      2. 
		
    2. Eğer çift tanım küme etiketleri gerektiriyorsa, başlangıçta düşük çözünürlüklü kümeleme çalıştırın.
      3. 
	
    
	
    2. 
	
  2. Isteğe bağlı olarak dubletleri çıkarın
      
		
    1. DoubletFinder'ı sadece kurulu ve uyumlu ise çalıştırın.
      NOT: Çift teşrift tespiti yalnızca çok sayıda artefaktın beklendiği yüksek hücre sayısına sahip veri setleri için gerçekleştirin.
      2. 
		
    2. Dublet çıkardıktan sonra normalizasyon ve PCA'yı yeniden hesaplayın.
      3. 
	
    
	
    3. 
	
  3. Kümeleme çözünürlüğünü seçin
      
		
    1. 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0 ve 1.2.8.3.2 çözünürlüklerini değerlendirin
      2. 
		
    2. Test edilen her çözünürlük için ortalama siluet genişliğini hesaplayın. En az iki küme içeren çözümler arasında en yüksek siluet puanına sahip çözünürlüğü seçin.
      3. 
		
    3. resolution_sweep_*.csv, resolution_selection_rationale_*.csv ve resolution_sweep_*.png tasarruf edin.
      4. 
	
    
	
    4. 
	
  4. Ek dosya 2'de bahsedilen kodu çalıştırarak örnek çözünürlük seçimini çalıştırın
    5. 
	
  5. UMAP ve son kümeleme çalıştırın.
      
		
    1. Seçilen PC'leri kullanarak UMAP çalıştırın.
      2. 
		
    2. En yakın komşu grafiğini yeniden oluşturun. Seçilmiş çözünürlükle hücreleri kümeleyin.
      3. 
		
    3. UMAP grafiklerini küme ile etiketlenmiş ve örnek veya zaman noktasına göre gruplanmış şekilde kaydedin. Ek dosya 2'de belirtilen aşağıdaki kodu çalıştırın.
      Dikkat: Stabil küme ayrımı ve ana bağışıklık durumlarıyla tutarlı yorumlanabilir UMAP yapısı bekleyin.
      4. 
	
    
	
    6. 



9. SCT tabanlı entegrasyon için GSE233713


    
	
  1. Ayrı nesneler hazırla
      
		
    1. D27_3 ve D30 için ayrı Seurat nesneleri oluşturun.
      2. 
		
    2. Her numuneye kalite kontrolü ve filtreleme işlemi bağımsız olarak uygulanır. Her örneği ayrı ayrı SCTransform() ile normalleştirin.
      3. 
	
    
	
    2. 
	
  2. Entegrasyonu Gerekçe
      
		
    1. Ortak biyolojik yapıyı korurken zaman noktaları arasındaki teknik farkları azaltmak için SCT tabanlı entegrasyon kullanın.
      2. 
		
    2. Entegrasyonun otomatik olarak faydalı olduğunu varsaymayın. Açıkça doğrulayın.
      3. 
	
    
	
    3. 
	
  3. Örnekleri entegre et
      
		
    1. SelectIntegrationFeatures() kullanarak entegrasyon özelliklerini seçin. PrepSCTIntegration() ile nesneleri hazırla.
      2. 
		
    2. FindIntegrationAnchors(normalization.method = "SCT") ile ankrajları bulun. IntegrateData(normalization.method = "SCT") ile veri setlerini entegre edin.
      3. 
	
    
	
    4. 
	
  4. Ek dosya 2'de bahsedilen örnek entegrasyonu çalıştırın
    5. 
	
  5. Validasyon entegrasyonu
      
		
    1. Zaman noktasına göre gruplanmış entegrasyon öncesi ve entegrasyon sonrası UMAP grafikleri oluşturun. Hücrelerin zaman noktaları arasında gelişmiş karışımını başarılı entegrasyonun kanıtı olarak yorumlayın.
      2. 
		
    2. Komşu karıştırmayı entegrasyondan önce ve sonra hesaplayın. Zaman noktasına göre küme bileşimi hesaplayın ve üst üste yığılmış kompozisyon grafikleri oluşturun.
      3. 
		
    3. Aşağıdaki çıktıları kaydedin:
      UMAP_preintegration_*
      UMAP_postintegration_*
      integration_diagnostics_*
      cluster_timepoint_composition_*
      Dikkat: Entegrasyondan sonra zaman noktası ayrımının azalması, komşu karışımının artması ve çoğu kümede çoklu zaman noktası katkısı bekleyin, biyolojik olarak anlamlı yapının tamamen kaybı olmadan.
      4. 
	
    
	
    6. 



10. Kümeleri açıklama yapın ve işaretleyici yapısını doğrulayın




    
	
  1. Sıtma ile ilgili modülleri skor
      
		
    1. Öntanımlanmış sıtma CD4⁺ T-hücre panelleri için AddModuleScore() çalıştırın.
      2. 
		
    2. Küme düzeyindeki modül araçlarını ve modül sıralamalarını kaydet.
      3. 
	
    
	
    2. 
	
  2. Ek dosya 2'de bahsedilen örnek modül puanlamasını çalıştırın
    3. 
	
  3. Tahmin edilen küme etiketlerini atama
      
		
    1. Her kümeye en üst sıralı modülü tahmini etiket olarak atayın.
      2. 
		
    2. Kurtar:
      cluster_module_score_means_*
      cluster_module_score_rankings_*
      cluster_predicted_labels_*
      3. 
	
    
	
    4. 
	
  4. Kanonik işaretleyicilerle kümeleri doğrulama
      
		
    1. Marker-validation DotPlots ve FeaturePlots'u kanonik işaret paneli kullanarak çalıştırın.
      2. 
		
    2. Kurtar:
      DotPlot_marker_validation_*
      FeaturePlot_marker_validation_*
      Dikkat: Fonksiyonel durum başına birden fazla kanonik genin uyumlu ifadesini bekleyin, izole tek gen sinyalleri değil.
      3. 
	
    
	
    5. 



11. Belirteçleri belirleyin ve farklı ifadeler yapın.




    
	
  1. Küme işaretleyicilerini bulun
      
		
    1. FindAllMarkers()'ı sadece pozitif işaretleyicilerle çalıştırın.
      2. 
		
    2. markers_all_clusters_*.csv tasarruf et.
      3. 
	
    
	
    2. 
	
  2. Ek dosyada bahsedilen kodu çalıştırarak örnek işaretçi tanımlamasını çalıştırın
    3. 
	
  3. Mevcut olduğunda replikasyona farkında diferansiyel ifadeler kullanın
      
		
    1. Geçerli replikat meta verilerinin mevcut olup olmadığını kontrol edin. Eğer replikalar mevcutsa, her bir çoğaltma ve koşulda toplam sayıları topla ve DESeq2 ile pseudobulk DE çalıştırın.
      2. 
		
    2. Save DE_pseudobulk_*.
      3. 
	
    
	
    4. 
	
  4. Replikalar yokken keşif hücre düzeyinde diferansiyel ifade kullanın
      
		
    1. Eğer replikasyon meta verileri eksikse veya yetersizse, keşif analizi olarak tek hücreli DE çalıştırın.
      2. 
		
    2. Keşif durumunu belgelemek için DE_WARNING_* kaydedin. Keşif sonuçlarını DE_exploratory_celllevel_* olarak kaydedin.
      3. 
	
    
	
    5. 
	
  5. Küresel diferansiyel ifade çıktıları üretin
      
		
    1. DE sonuçları için volkan grafikleri oluşturun ve Volcano_* kaydedin.
      2. 
		
    2. Önemli DE sonuçlarını filtrelenmiş tablolar olarak kaydedin.
      3. 
	
    
	
    6. 
	
  6. Fonksiyonel zenginleştirme çıktıları üretin
      
		
    1. GO Biyolojik Süreç Zenginleştirme programını çalıştır ve GO_BP_*'i kaydet. KEGG zenginleştirme çalıştır ve KEGG_*.
      2. 
		
    2. GSEA'yı ranked log2 katlama değişiklikleriyle çalıştır ve GSEA_GO_*'i kaydet. İlgili barplot ve nokta grafiklerini kaydet.
      3. 
	
    
	
    7. 
	
  7. Küme-özgül diferansiyel ifade çıktıları üretin
      
		
    1. Her küme içinde zaman noktaları arasında DE çalıştırın.
      2. 
		
    2. DE_cluster_* ve DE_cluster_specific_combined_* kaydet.
      3. 
	
    
	
    8. 
	
  8. İmmün odaklı diferansiyel ifade çıktıları üretin
      
		
    1. Ifng, Cxcl10, Ctla4, Il10, Foxp3, Bcl6, Cxcr5, Pdcd1, Lag3, Havcr2, Il21 ve Tbx21 gibi seçilmiş bağışıklık genleri için DE sonuçlarını çıkarın.
      2. 
		
    2. Save DE_immune_focus_*.
      3. 
		
    3. Aşağıdaki çıktıları üretin ve kaydedin:
      DotPlot_selected_genes_by_timepoint_*
      Heatmap_immune_focus_*
      Dikkat Küresel DE, zenginleştirme çıktıları, küme-spesifik DE ve bağışıklık odaklı imzalar arasında tutarlılık bekleyin.
      4. 
	
    
	
    9. 









12. Son çıktıları kaydet ve oturumu arşivle


    
	
  1. Seurat nesnelerini kaydet
      
		
    1. Her veri seti için son Seurat nesnelerini .rds formatında kaydedin.
      2. 
	
    
	
    2. 
	
  2. Oturum bilgilerini kaydet
      
		
    1. sessionInfo() kelimesini çıktı dizinindeki bir metin dosyasına yaz.
      2. 
	
    
	
    3. 
	
  3. Ek dosya 2'de bahsedilen kodu çalıştırarak örnek oturum dışına aktarma işlemi yapılabilir
    4. 
	
  4. Çıktı tamlığını doğrulayın
      
		
    1. Beklenen fig/, tablolar/ ve rds/ dizinlerinin ilgili dosyaları içerdiğini doğrulayın.
      2. 
		
    2. Scriptleri, oturum bilgilerini ve çıktıları birlikte arşivleyin.
      Dikkat: QC özetleri, PCA çıktıları, çözünürlük seçimi çıktıları, entegrasyon tanılamaları, modül notlama dosyaları, DE çıktıları ve zenginleştirme dosyaları mevcut ve dahili tutarlı olana kadar yazma raporuna devam etmeyin.
      3. 
	
    
	
    5. 











Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Dizileme kalitesi ve hücre düzeyinde kalite kontrolü (Antijen-spesifik (PcAS-reaktif) TCR-transgenik CD4⁺ T hücreleri (GSE233703))


Ön filtre kalite kontrol dağılımları (Şekil 2A) heterojen transkript karmaşıklığı gösterdi; çoğu hücre orta düzeyde gen ve UMI sayıları gösterirken, daha küçük bir alt küme potansiyel çoklu modellerle uyumlu yüksek sayıya sahip aykırı profiller gösterdi. Scatterplots (
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Bu çalışma, sıtma yeniden enfekte sırasında CD4⁺ T-hücre transkripsiyonel dinamiklerini analiz etmek için standartlaştırılmış ve tekrarlanabilir bir Seurat tabanlı iş akışı sunmaktadır. Protokol, uyarlanabilir kalite kontrolü, normalizasyon, boyut küçümleme, veri seti entegrasyonu, işaretçi doğrulama, modül puanlama ve diferansiyel ifade analizini birleşik bir hesaplama çerçevesinde entegre eder. Bu analitik adımlar birlikte, antijen-spesifik ve poliklonal verisetleri 1...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.
Malzemeler
Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Malzeme / Ekipman AdıŞirket / KaynakKatalog NumarasıYorumlar / Açıklama
10x Genomics–formatted sayım matrisleriNCBI GEOYokMatris Market dosyaları (matrix.mtx, features.tsv, barcodes.tsv)
clusterProfiler (R paketi)BioconductorYokRRID:SCR_016884; Fonksiyonel zenginleştirme analizi (GO, KEGG)
enrichplot (R paketi)BioconductorYokRRID:SCR_017030; Zenginleştirme analizi sonuçlarının görselleştirilmesi
GEO Veri Seti GSE233703NCBI Gene Expression OmnibusGSE233703PcAS-specific TCR-transgenik CD4+ T-hücre scRNA-seq veri seti
GEO Veri Seti GSE233713NCBI Gene Expression OmnibusGSE233713Poliklonal CD4+ T-hücre scRNA-seq veri seti (D273 vs D30)
GitHub (isteğe bağlı)GitHub Inc.YokRRID:SCR_002630; Sürüm kontrolü ve tekrarlanabilirlik (isteğe bağlı)
glmGamPoi (R paketi)BioconductorYokRRID:SCR_021001; Hızlandırılmış SCTransform model uyumlaması
Matrix (R paketi)CRANYokRRID:SCR_008389; scRNA-seq verileri için seyrek matris işleme
İşletim sistemiMicrosoft / Apple / LinuxYokWindows 10+, macOS veya Linux desteklenir
org.Mm.eg.db (R paketi)BioconductorYokRRID:SCR_002643; Fare gen ek açıklama veritabanı
patchwork (R paketi)CRANYokRRID:SCR_018787; Çok panelli şekil birleşimi
PDF görüntüleyiciHerhangiYokQC çizimlerini, UMAP'leri ve ısı haritalarını görüntüleme
Kişisel bilgisayar veya iş istasyonuHerhangiYokEntegrasyon için minimum 16–32 GB RAM önerilir
pheatmap (R paketi)CRANYokRRID:SCR_016418; Gen ekspresyonunun ısı haritası görselleştirmesi
R İstatistiksel Yazılımı (sürüm ≥ 4.2)R Foundation for Statistical ComputingYokRRID:SCR_001905; Temel hesaplama ortamı
RStudio DesktopPosit SoftwareYokRRID:SCR_000432; R için entegre geliştirme ortamı
Seurat (R paketi, v4 veya sonrası)Satija LabYokRRID:SCR_016341; Tek hücreli RNA-seq analizi
tidyverse (R paketi paketi)CRANYokRRID:SCR_019186; Veri manipülasyonu ve görselleştirme
Kaynaklar
    
	
  1. World Health Organization. WHO malaria policy advisory group (MPAG) meeting report, 18–20 April 2023. Geneva: World Health Organization; 2023.
    2. 
	
  2. Stevenson MM, Riley EM. Innate immunity to malaria. Nat Rev Immunol. 2004;4(3):169-80.
    3. 
	
  3. Langhorne J, Ndungu FM, Sponaas AM, Marsh K. Immunity to malaria: more questions than answers. Nat Immunol. 2008;9(7):725-32.
    4. 
	
  4. Perez-Mazliah D, Langhorne J. CD4 T-cell subsets in malaria: TH1/TH2 revisited. Front Immunol. 2015;5:671.
    5. 
	
  5. Illingworth J, et al. Chronic exposure to Plasmodium falciparum is associated with phenotypic evidence of B and T cell exhaustion. J Immunol. 2013;190(3):1038-47.
    6. 
	
  6. Tang F, et al. mRNA-Seq whole-transcriptome analysis of a single cell. Nat Methods. 2009;6(5):377-82.
    7. 
	
  7. Lönnberg T, et al. Single-cell RNA-seq and computational analysis using temporal mixture modeling resolves TH1/TFH fate bifurcation in malaria. Sci Immunol. 2017;2(9):eaal2192.
    8. 
	
  8. Butler NS, et al. Therapeutic blockade of PD-L1 and LAG-3 rapidly clears established blood-stage Plasmodium infection. Nat Immunol. 2012;13(2):188-95.
    9. 
	
  9. Soon MS, Haque A. Recent insights into CD4+ Th cell differentiation in malaria. J Immunol. 2018;200(6):1965-75.
    10. 
	
  10. Slovin S, et al. Single-cell RNA sequencing analysis: a step-by-step overview. RNA Bioinformatics. 2021:343-65.
    11. 
	
  11. Vieth B, Parekh S, Ziegenhain C, Enard W, Hellmann I. A systematic evaluation of single cell RNA-seq analysis pipelines. Nat Commun. 2019;10(1):4667.
    12. 
	
  12. Wolf FA, Angerer P, Theis FJ. SCANPY: large-scale single-cell gene expression data analysis. Genome Biol. 2018;19(1):15.
    13. 
	
  13. Hafemeister C, Satija R. Normalization and variance stabilization of single-cell RNA-seq data using regularized negative binomial regression. Genome Biol. 2019;20(1):296.
    14. 
	
  14. Stuart T, et al. Comprehensive integration of single-cell data. Cell. 2019;177(7):1888-902.
    15. 
	
  15. Satija R, Farrell JA, Gennert D, Schier AF, Regev A. Spatial reconstruction of single-cell gene expression data. Nat Biotechnol. 2015;33(5):495-502.
    16. 
	
  16. Crotty S. T follicular helper cell differentiation, function, and roles in disease. Immunity. 2014;41(4):529-42.
    17. 
	
  17. Wherry EJ, Kurachi M. Molecular and cellular insights into T cell exhaustion. Nat Rev Immunol. 2015;15(8):486-99.
    18. 
	
  18. Belkaid Y, Rouse BT. Natural regulatory T cells in infectious disease. Nat Immunol. 2005;6(4):353-60.
    19. 
	
  19. Ashburner M, et al. Gene ontology: tool for the unification of biology. Nat Genet. 2000;25(1):25-9.
    20. 
	
  20. Kanehisa M, Goto S. KEGG: kyoto encyclopedia of genes and genomes. Nucleic Acids Res. 2000;28(1):27-30.
    21. 
	
  21. Gulati GS, et al. Profiling cell identity and tissue architecture with single-cell and spatial transcriptomics. Nat Rev Mol Cell Biol. 2025;26(1):11-31.
    22. 
	
  22. Schofield L, Grau GE. Immunological processes in malaria pathogenesis. Nat Rev Immunol. 2005;5(9):722-35.
    23. 
	
  23. Plebanski M, Hill AV. The immunology of malaria infection. Curr Opin Immunol. 2000;12(4):437-41.
    24. 
	
  24. Crotty S. T follicular helper cell biology: a decade of discovery and diseases. Immunity. 2019;50(5):1132-48.
    25. 
	
  25. Vinuesa CG, Linterman MA, Yu D, MacLennan IC. Follicular helper T cells. Annu Rev Immunol. 2016;34:335-68.
    26. 
	
  26. Wherry EJ. T cell exhaustion. Nat Immunol. 2011;12(6):492-9.
    27. 
	
  27. Maizels RM, Smith KA. Regulatory T cells in infection. Adv Immunol. 2011;112:73-136.
    28. 
	
  28. Choudhary S, Satija R. Comparison and evaluation of statistical error models for scRNA-seq. Genome Biol. 2022;23(1):27.
    29. 
	
  29. Li M, et al. Rediscovering publicly available single-cell data with the DISCO platform. Nucleic Acids Res. 2025;53(D1):D932-8.
    30. 
	
  30. Islam MT, Xing L. Cartography of genomic interactions enables deep analysis of single-cell expression data. Nat Commun. 2023;14(1):679.
    31. 
	
  31. Luecken MD, Theis FJ. Current best practices in single-cell RNA-seq analysis: a tutorial. Mol Syst Biol. 2019;15(6):e8746.
    32. 

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
Etiketler
İmmünoloji ve EnfeksiyonSayı 233Sayı 233Boş DeğerSayıscRNA-seqPBMCTranskriptomik entegrasyonİmmün modül skorlama
Bu makale yayımlandı
Video yakında
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner
Gizlilik
Kullanım Koşulları
Politikalar
Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.