Bilgi Akışı Modellemesi Kullanarak Transkriptomik Verilerden Bağlama Özgü Protein Etkileşim Ağları Oluşturmak İçin NetDecoder Protokolü

Özet

Burada, bağlama özgü protein etkileşim ağları oluşturmak ve gen fayda modelleri (GUM) oluşturmak için bir ağ modelleme aracı olan NetDecoder'ı kullanmak için bir protokol sunuyoruz. Transkriptomik veriler kullanılarak, kürenmiş protein-protein etkileşim (PPI) ağlarıyla birleşerek NetDecoder, anahtar hedeflerin ve alt ağıların tanımlanmasını sağlar.

Özet

Diferansiyel ifade analizi, potansiyel terapötik hedefleri belirlemek için yaygın kullanılan bir tekniktir, ancak biyolojik yollar boyunca gen ağlarının karmaşıklığını göz ardı eder. Çoğu zaman, yüksek ekspresyonlu genler biyolojik fenotipin özelliklerini açıklamaz. NetDecoder, transkriptomik verileri protein-protein etkileşim (PPI) ağlarıyla entegre ederek bağlama özgü bilgi akışını, gen faydalılığını ve anahtar kenarları ile farklı olarak kullanılan gen ağlarını modelleyen bir ağ biyolojisi aracı olan NetDecoder, bu diferansiyel ifade analizinin sınırlamasını gidermek için geliştirilmiştir.

Bu protokol, veri ön işleme, NetDekoder çalıştırma ve çıktı analizini kapsayan kapsamlı yönergeler içeren yeni başlayanlar için uygun ve adım adım bir rehberdir. İş akışı, biyolojik koşullar arasındaki gen (düğüm) ve gen-gen etkileşimi (kenar seviyesi) farklarını niceleyen yazılım yapılandırması, ağ oluşturma ve akış tabanlı modelleme analizini içerir. Ortaya çıkan çıktılar arasında ana hedefler ve yönlendiriciler, farklı akış alt ağları ve kenar akış dağılımları bulunur; bu da belirli biyolojik durumlarla ilişkili temel düzenleyici genlerin ve yolların tanımlanmasını sağlar. Belirlenen adımları takip ettikten sonra, araştırmacılar transkriptomik veriler ve özenli PPI ağları kullanarak fenotipler arasında fenotipik gen akışını ortaya çıkarmak için bağımsız araştırmalar yapabileceklerdir.

Giriş

Terapötik araştırma için genlerin ve ilişkili yolların seçimi genellikle farklı ifade analizleriyle^{yönlendirilir 1}. Bu analiz yöntemi, iki veya daha fazla durum arasında gen ifadesinin nasıl farklılaştığını belirlemede etkilidir. Ancak, genler karmaşık ve birbirine bağlı biyolojik ağlar içinde çalışır; bu da bireysel gen ifadesinin genlerin bir ağda nasıl etkileşime girdiğini ve gen-gen ilişkilerini tam olarak yansıtmadığı^{anlamına gelir 2}. Ağ yayılım yöntemleri, gen ifadesini etkileşim ağlarıyla entegre ederek sadece farklı ifadelerle kaçırılabilecek biyolojik olarak önemli genleri^{belirler 3}. Mevcut yaklaşımlar, genlerin fonksiyonel önemini ve biyolojik bilginin biyolojik koşullar arasında protein-protein etkileşim (PPI) ağlarında nasıl yeniden dağıtıldığını açıkça niceleştirmiyor. Bu nedenle, koşula özgü ağ davranışını modellemek ve biyolojik sistemler arasında bilgi akışındaki değişiklikleri nicelendirmek için bir yönteme ihtiyaç duyuldu. Genlerin daha geniş bir biyolojik ağ içinde nasıl etkileşime girdiğini açıklamak için, netDecoder adlı bir ağ biyolojisi platformu, koşullar arasında en büyük bilgi akışı farkına sahip genleri ortaya çıkarmak için geliştirildi. NetDecoder, insan PPI ağının mevcut bilgisini toplu RNA dizileme verileriyle birleştirerek bilgi akışına dayalı etkileşimler modeli oluşturmak için süreç rehberli bir akış algoritması^{kullanır 4}.

Fenotipik ağlar için bilgi akışı verileri kullanılarak, yüksek bilgi akışına sahip genleri, farklı ifade değerlerinden bağımsız olarak ağ içinde en yüksek genel gen faydasına sahip genler olarak tanımlamak için bir gen fayda modeli (GUM)⁵ geliştirilebilir. Bu yaklaşım, daha etkili hedef önceliklendirme stratejilerini ve tanımlamayı destekler; geleneksel analizlerin sıklıkla gözden kaçırdığı içgörüler sağlar. Geleneksel diferansiyel ifade veya korelasyon tabanlı ağ yöntemlerinin aksine, NetDecoder bilgi akışında hem gen (düğüm seviyesi) hem de etkileşim (kenar seviyesi) değişikliklerini nicelikle ölçülür; böylece büyük ifade değişiklikleri olmasa bile fonksiyonel olarak önemli genlerin tanımlanmasını^{sağlar 4,5}. NetDecoder, iki biyolojik koşul arasında karşılaştırmalı analizleri içeren toplu RNA dizileme veri setlerine geniş çapta uygulanabilir ve bilgi akışındaki değişikliklerin tanımlanmasını sağlar. NetDecoder, proteomik ve epigenomik dahil olmak üzere diğer omik veri setlerinin entegrasyonunu desteklese de, mevcut protokol transkriptomik verilerin kullanıldığı iş akışını özellikle göstermektedir. Bu uygulamalarda kullanıcılar, protein veya epigenetik olarak düzenlenmiş genlere dayalı kaynak genleri tanımlayabilir ve bu moleküler özelliklerden bilgi akışı analizinin başlatılmasına olanak tanır. Bu esneklik, çoklu omik kanıtların ağ tabanlı analizlere dahil edilmesini sağlar ve fenotipik farklılıkların altında yatan çapraz modal düzenleyici mekanizmaların keşfedilmesini kolaylaştırır.

Yaygın çalışma tasarımları, hastalık ve sağlıklı durumlar, tedavi yanıtçıları ve yanıt vermeyenler, ilaç tedavileri, knockdown veya nakavt ile kontrol deneyleri ve gelişimsel veya hücresel durum geçişlerinin analizlerini içeren ikili karşılaştırmaları içerir. Bu protokolün amacı, biyolojik koşullar arasında ağ etkisi değişmiş genleri ortaya çıkarmak için NetDecoder'ı uygulamak için tekrarlanabilir bir çerçeve göstermektir. Bu, NetDecoder'ı kurmak ve çalıştırmak için kolay takip edilen adımlarla, temel sorun giderme teknikleriyle takip edilecek örneklerle ve protokolde sonuç yorumlama yöntemleri de sunularak sağlanır.

Protokol

Bu çalışma, halka açık RNA dizileme veri setlerini kullandı ve doğrudan insan veya hayvan denekleri dahil etmedi. Bu nedenle, kurumsal inceleme kurulu onayı ve bilgilendirilmiş onay gerekmiyordu.

NOT: NetDecoder aşağıdaki giriş dosyalarını gerektirir: iki tanımlanmış biyolojik koşulda normalize edilmiş gen ifadesi; biyolojik koşulları tanımlayan bir meta veri dosyası; ağ inşası ve modelleme için kaynak genlerin listesi; kamu alanından bir protein-protein etkileşimi (PPI) ağı; ve her biyolojik durum için oluşturulmuş bir kenar ağırlıklı ağ (EWN) içerir.

1. Veri hazırlığı

1. Toplu RNA dizileme ifadesi verisi ve meta verileri alın
   1. RNA dizileme verilerini (ham gen ifade sayıları ve örnek isimlerinin matrisi) ve ilgili meta verileri (örnek isimleri, koşullar vb.) Gen İfadesi Omnibusu (GEO) gibi kamuya açık bir depodan indirin veya laboratuvarda oluşturulan deneysel veri setlerini kullanın. Genellikle, bu bir matristir; burada satırlar gen isimlerine, sütunlar ise örnek isimlerine karşılık gelir.
      NOT: Bu protokolü göstermek için kullanılan örnek veri seti, Ulusal Omics Veri Ansiklopedisi (NODE) deposundan (BioSino veritabanı) erişim OEP001105⁶ kapsamında alınmıştır. Kullanıcılar, kendi toplu RNA dizileme veri setlerini değiştirebilirler.
   2. Örnek isimleri ve grupları veya ilgili koşulları dahil ederek örnek bir açıklama dosyası (meta veri) oluşturmak; örneğin, "kontrol" ve "hastalık" yaygın durum türleridir. Örnek isimlerinin metaveri ile ifade dosyaları arasında eşleştiğini doğrulayın.
2. Toplu ifade verileri ve meta veriler
   1. Oluşturulan veri matrisinin ifade sayıları, gen isimleri ve örnek isimleri ile koşulları içeren bir meta veri dosyası içerdiğinden emin olun. Gerekirse, org gibi bir R paketi kullanın. Hs.eg.db (insan) veya AnnotationDbi farklı gen tanımlayıcılarını eşleştirmek için kullanılır.
   2. Meta veri dosyasından gerekli olmayan bilgileri R veya benzer bir programlama dili kullanarak çıkarın.
   3. İfade sayısı dosyalarından gelen bilgileri kolayca manipüle etmek için tek bir dosyada birleştirin.
3. Filtre ifade verisi
   1. Gen ifade veri matrisini ön işleyerek gen kopyaları, null değerler (NA), düşük ifadeler (<10 toplam sayı) ve/veya düşük varyans genleri vb. hariç tutun.
4. Veri ön işleme
   1. RNA dizileme normalizasyonu ve diferansiyel ifade analizi
      NOT: Bu adım, toplu RNA dizileme verilerinden analiz başlatılırken Edge Weighted Network (EWN) oluşturulması ve kaynak gen seçimi için gen seçimi (adımlar 1.5–1.6) için iki (1.4.1) yaklaşımdan biridir. Alternatif olarak, Pearson korelasyon tabanlı şablon eşleştirmesi, 1.4.3. adıma atlayarak kullanılabilir.
      1. Bu aşamada Gen Kimliği dönüşümleri R paketi olan AnnotationDbi kullanılarak bireysel organizma paketleriyle uyum içinde gerçekleştirilir. NetDecoder, örnek PPI ile eşleşen gen sembolleri (yani Gen Kimliği) kullanır.
      2. R paketleri olan limma, edgeR, DESeq2 veya benzer araçlarla iki koşul arasında normalizasyon ve diferansiyel ifade analizi yapın.
      3. DESeq2 kullanıyorsanız, DESeqDataSetFromMatrix() fonksiyonunu kullanarak bir DESeq veri seti oluşturun; bu fonksiyon bir sayı matrisi (genler ve örnekler) ve örnek meta verileri (koşullar) giriş olarak alın.
      4. Diferansiyel ifade değerlerini hesaplamak için 1.4.1.3 adımında oluşturulan nesnede varsayılan ayarlarla DESeq() fonksiyonunu kullanın.
      5. Sonuçları, gen tanımlayıcıları (Gen Kimliği) ile bir veri matrisine satır adları ve log2 katlama değişimi (log2FC), p-değeri ve ayarlanmış p-değeri dahil olmak üzere anahtar çıktılar olarak sütun olarak kaydedin.
      6. Isteğe bağlı olarak, sonuçları ayarlanmış p-değeri (<0.05) ve/veya log2FC değerleriyle (örneğin: |log2FC| > 1) dplyr veya benzer bir araç kullanarak filtreleyin.
      7. Tüm işlenen gen listeleri ve log2 kat değişim matrislerinin NetDecoder'a girmek üzere sekme-ayrılmış (.txt veya .csv) dosyalar olarak dışa aktarıldığından emin olun.
      8. Eğer 2'den fazla biyolojik koşul kullanılıyorsa, 1.4.1. adım için çiftli karşılaştırmalar yapın ve 1.4.1.5'te oluşturulan DESeq nesnesinden results() fonksiyonunu kullanarak çiftli sonuçlar alın.
   2. Mikroarray ifade normalizasyonu - Isteğe bağlı
      NOT: Mikroarray veri kullanıyorsanız, veri normalizasyonu için bu adımı gerçekleştirin.
      1. NetDecoder normalizasyon bebesini açarak verileri normalize edin (HuLiLab/NetDecoder_Example/raw_data/NetDecoder_normalize. R), https://github.com/HuLiLab/NetDecoder_Example/tree/main'den erişilebilir ve italik kısmı hücre yoğunluğu dosyalarını (CEL) içeren çalışma dizinine uyacak şekilde düzenler.
         setwd(~/NetDecoder_Example/raw_data/CEL_files)
   3. Şablon eşleştirme - Isteğe bağlı
      NOT: Bu, diferansiyel ifade analizi ("Veri Hazırlığı" bölümünün 1.1–1.4.1 adımlarında belirtildiği gibi) yapılmazsa ikinci isteğe bağlı yaklaşımdır.
      1. Limma, edgeR ve DESeq2 ile işlenmeyen RNA dizileme verileri için, şablon eşleştirme uygulamadan önce harici normalizasyon yapılabilir. Mikroarray verileri için, 1.1–1.4.2. adımlarda oluşturulan normalize ifade değerlerini doğrudan kullanın.
      2. Gen ifadesi için temel şablon olarak kontrol koşulu seçin ve ilgilendiğiniz diğer tüm koşullardan normalize edilmiş gen ifade değerlerini karşılaştırın.
      3. Her genin ifade profili ile seçilen şablon arasındaki Pearson korelasyon katsayılarını hesaplayın. İstatistiksel olarak anlamlı korelasyonlar gösteren genlerin (p < 0.05) ve kullanıcı tanımladığı eşik (örneğin |r| > 0.7) üzerinde mutlak korelasyon katsayısı bulunan genlerin korunması önerilir.
5. Kaynak genlerin seçimi
   NOT: Bu adımın girdisi, 1.1–1.4. adımlarda geliştirilen normalize gen ifade matrisinden oluşmaktadır.
   1. Kaynak gen olarak kullanılacak önemli genlerden oluşan bir seti seçin. Diferansiyel ifade tabanlı iş akışları için, ayarlanmış p-değeri ve log2FC eşiklerini seçin (örneğin adj p-değeri < 0.05 ve |log2FC| > 2). Şablon eşleştirme iş akışları için, seçilen korelasyon ve anlamlılık eşikleri kullanılarak adım 1.4.3.3'te tanımlanan anlamlı korelasyonlu genlerden kaynak genleri seçin. Eşikler, aşağı akış ağ inşası için yaklaşık 300–1.000 gen üretecek şekilde seçilmelidir.
      NOT: Kaynak genler, bilgi akışının başladığı ve ağ boyunca yayıldığı yerdir.
6. Her fenotip için bir kenar ağırlıklı ağ (EWN) oluşturun
   NOT: Bu adım için aşağıdaki girdiler gereklidir: 1.1–1.4. adımlarda geliştirilen normalize edilmiş gen ifade matris; kenar listesi olarak biçimlendirilmiş protein-protein etkileşimi (PPI) ağı (geneA-geneB çiftleri); Her örnek için biyolojik durum etiketlerini belirten örnek bir açıklama dosyası (metadata). PPI ağı, bir R nesnesi olarak paylaşılır ve iRefIndex protein veritabanı temelinde oluşturulmuştur. Bu protokolte kullanılan sürüm tüm doğrudan etkileşimleri içerir, ancak kendi döngüleri ve çoklu kenarlar hariç tutulur. PPI ağı 15.608 protein ve 180.044 etkileşim içerir. Ek detaylar için NetDecoder-Yöntemleri bölümü^4'e bakınız.
   1. NetDecoder Edge Weighted Network (EWN) bebesini açın (HuLiLab/NetDecoder_Example/input/NetDecoder_Create_EWN. R, https:/github.com/HuLiLab/NetDecoder_Example/tree/main)⁴ adresinden erişilebilir ve R-geliştirme platformunda.
   2. Yorumlarla belirtilen (aşağıda italik yazılmış) betik bölümleri düzenleyerek EWN geliştirme için kullanıcıya özel yollar ve giriş dosyaları ayarlayın.
      Yol<~/NetDecoder_Example/giriş/
      Bu, çalışma dizinine giden yoldur
      expQuery <- get(load("expBreastCancer_15Set2014.R"))
      Bu, normalize edilmiş ifade matrisi Rdata nesnesine bir örnektir
      stQuery < read.csv("s tBreastCancer.csv")
      Bu örnek meta veridir
   3. İfade matrisini filtreleyin, sadece PPI ağında bulunan genleri koruyun.
   4. Her koşul için, fenotipe göre alt küme örnekleri alın ve Pearson korelasyonu kullanılarak PPI ağında tanımlanan tüm kenarlar boyunca çiftli gen-gen korelasyonları hesaplanmaktadır. Adımda oluşturulan işlenmiş, normalize ifade matrisi kullanılarak korelasyonları hesaplayın.
   5. Her gen çifti için korelasyon katsayısı, mutlak korelasyon ve ilgili p-değeri hesaplanın.
   6. Eksik vakaları (örneğin, NA değerleri) kaldırın.
   7. Her koşul başına bir kenar ağırlıklı ağ olarak sekme-ayrılmış bir dosya olarak (başlık olmadan) aşağıdaki sütunlarla dışa aktarın: proteinA, proteinB, abs_cor, cor ve pvalue.
   8. Tüm ilgili koşullar için ortak ifade ağları oluşturmak üzere R bebesini çalıştırın.

2. NetDecoder'ın Kurulumu ve Yapılandırması

1. NetDecoder'ı indir
   1. NetDecoder yazılımına (https://netdecoder.hulilab.org/#ver numaralı telefondan erişin, R veya Java seçeneğini seçebilirsiniz.
2. Gerekli yazılımı kur
   1. Çalışma/analiz ortamları için Oracle JDK ve R kurun.
   2. NetDecoder dokümantasyonunda listelenen gerekli R paketlerini, Bioconductor (https://netdecoder.hulilab.org/#ver)⁴ kullanılarak kurun.
3. İndirme bağımlılıkları
   1. NetDecoder için gerekli bağımlılıkları indirin; bunlar gen ontoloji verilerini (https://geneontology.org/docs/download-ontology/'dan erişilebilir) ve gen ilişkilendirme referans rehberini (https://www.ebi.ac.uk/GOA/human_release'dan erişilebilir) içerir.
4. Çalışma dizinini kur
   1. İndirilen tüm dosyaları (ifade verisi, her koşul için oluşturulan ortak ifade ağları, gen ontolojisi verileri ve ilişkilendirme referans rehberi) tek bir klasöre taşıyor; bu klasör NetDecoder çalışma dizini olacaktır.
5. Gerekli klasörü ekle
   1. NetDecoder klasörünü (https://netdecoder.hulilab.org/wp-content/uploads/2025/07/NetDecoder_Example.zip) NetDecoder çalışma dizinine indirin.
   2. NetDecoder klasörünü açın.

3. NetDecoder'ı çalıştırmak

1. Analiz bash script'i aç
   1. GNU Bash çalıştıran bir terminal açın ve NetDecoder çalışma dizinine gidin.
   2. Bash script'i açmak için nano NetDecoder_Analysis.sh komutunu çalıştırın.
2. Scriptleri değiştirin
   NOT: Kodun çoğu zaten yazılmış. Bu adımda, belirtilen konumlarda gerekli parametreler scriptte belirtilir.
   1. Kısa bir isim koyun:
      İtalik kısmı karşılaştırılan koşullar olarak düzenleyin: myshortname='Your_shortname_here'
   2. Yazılım yollarını belirleyin:
      Aşağıdaki üç yol tanımını italik kısımları düzenleyerek doğru yollara düzenleyin:
      JAVA="/your/path/here"
      export R="/senin/yolun/burada"
      takma ad R="/your/path/here"
   3. Çalışma dizini ayarla:
      İtalik kısmı, tüm dosyaların erişileceği çalışma dizini olarak düzenleyin: INPUT_DIR="/your/path/here"
   4. NetDecoder kütüphanesini ayarla:
      İtalik kısmı, zip dosyasından 2.4. adımda kurulan NetDecoder kütüphanesine giden yol olarak düzenleyin: LIB_DIR="/your/path/here/netdecoder_lib"
   5. Gen ontolojisi ve ilişki yollarını belirleyin:
      İki dizinin aşağıdaki italik bölümlerini tercih edilen gen ontolojisi/ilişkilendirme dosyalarının konumlarına göre düzenleyin.
      SYMBOL=$LIB_DIR/gene_association_file
      GO=$INPUT_DIR/gene_ontology_file
   6. Giriş argümanlarını kümeyin:
      Aşağıdaki beş satırın italik kısımlarını, referans NetDecoder bebesinde bulunan yorum talimatlarına göre verilere göre güncelleyin.
      geneList=$INPUT_DIR/gene_file
      state_trt=Tedavi Edilen Durum
      state_ref=Referans Koşulu
      PPI_trt=$INPUT_DIR/treated_co_expression_network_file
      PPI_ref=$INPUT_DIR/referans_co_expression_network_file
   7. Doğru sahneyi kurun:
      İstenen uygulama aşamasını (# sembolünü kaldırarak) yorumdan çıkar ve aşama tamamlandığında tekrar yorum yap. Birinci aşama gen_net_trt, ardından gen_net_ref, ardından analiz aşaması ve son olarak toplama aşamasıdır.
      Birinci aşamadan başlayarak istediğiniz aşamayı ayarlayın.
      #STAGE="gen_net_trt"
      #STAGE="gen_net_ref"
      #STAGE="analiz"
      #STAGE="toplamak"
   8. Ana Bash terminaline gidin:
      Bash script'i kaydedip çıkmak için Ctrl+X, sonra Y tuşlarına basın.
3. Execute NetDecoder.
   NOT: Başarılı çalışırsa, terminalde kayıt mesajları görünür.
   1. Terminale gidin ve ./NetDecoder_Analysis.sh çalıştırın.
   2. Aşamaları, 3.2.7 adımında belirtilen sırayla dört bölüm tek tek tamamlanana kadar yürütün.
4. Sonuçları alın
   1. Çıktı dosyalarına ve grafiksel özetlere gidin.

Sonuçlar

Şekil 1'de gösterildiği gibi, NetDecoder veri işleme, ağ yapılandırması ve akış tabanlı analizden oluşan yapılandırılmış bir iş akışı ile çalışır; çıktılar boru hattının her aşamasına uygun ayrı dizinlere düzenlenir. Bu modüler yapı, çıktıların sistematik olarak doğrulanmasını sağlar, sonuçların her hesaplama adımına kadar izlenmesini sağlar ve genel tekrarlanabilirliği destekler.

NetDecoder'ın başarılı yürütülmesi (Şekil 2), akış değerleri, alt ağlar ve diğer akış-etkileşim çıktıları için şekiller ve nicel çıktılar dahil olmak üzere çeşitli koşullara karşılık gelen verileri içeren dört dizinde (Şekil 1, Şekil 2 ve your_shortnameŞekil 3) çıktı üretir). Bu dizinlerde doldurulmuş dosya ve şekillerin varlığı, boru hattının doğru şekilde çalıştığını gösterir. Buna karşılık, başarısız çalışmalar eksik çıktılar ve/veya eksik rakamlarla karakterize edilir. NetDecoder, PPI ağındaki binlerce geni değerlendirdiği için, başarılı çalışmalar genellikle veri seti boyutuna ve mevcut kaynaklara bağlı olarak birkaç saatlik hesaplama gerektirir. Burada sunulan temsilli insan safra yolu kanseri analizi için, NetDecoder'ın uygulanması Linux tabanlı Puget3 (Puget Systems) iş istasyonunda yaklaşık 4–6 saat çalışma süresi gerektiriyordu. Alışılmadık derecede kısa çalışma süreleri, yanlış biçimlendirilmiş giriş verilerini veya boru hattı yürütülmediğini gösterebilir. Yanlış biçimlendirilmiş giriş verileri veya başarısız boru hattı çalıştırılması, sorunun nedenine kadar izlenebilecek hata mesajlarına yol açabilir. Şekil 3, başarılı NetDekoder çalıştırmasından sonra mevcut olan temsil çıktıları göstermektedir. Burada sunulan temsili analiz, 255 safra yolu kanseri örneğinden (OEP001105)⁶ alınan RNA dizileme verilerini kullanarak, evre I–II ve evre III–IV hastalık durumlarının karşılaştırılmasını ve durumlar arasındaki değişen bilgi akışını mümkün kıldı.

Şekil 4'teki üç ısı haritası, genler arasında geneler arasında ağ bilgi akışındaki genel değişiklikleri özetler; bunlar arasında ağ içinde önemli bilgi akışı ileten yönlendirici genler, önemli aşağı akış hedef genleri veya yüksek derecede etkilenen genel genler dahil. Hem pozitif hem de negatif diferansiyel akışın geniş bir dağılışı, bilginin ağ genelinde yeniden dağıtıldığını, eşit şekilde artırılıp azalmadığını gösterir. Bu heterojenlik ve gen tiplerinin çeşitliliği, NetDecoder'ın fenotipler arasında fonksiyonel önemi değişen genleri tanımlama yeteneğini destekler.

Şekil 4 ayrıca, koşullar arasında bireysel gen-gen çift etkileşimleri için akış değişikliklerini niceleyen kenar seviyesindeki çubuk grafiklerini gösterir. Bu sonuçlar, belirli etkileşimlerin koşullara göre değişebileceğini ve bağlama bağlı ağ yeniden kablolamasını yansıttığını göstermektedir. Böylece, kenar akışı bilgi transferindeki etkileşim düzeyindeki değişiklikleri yakalarken, diferansiyel akış bu değişikliklerin düğüm düzeyinde bir özetini sunar ve ağ etkisinde en büyük genel kaymaya sahip genlerin önceliklendirilmesini sağlar.

Bu çıktılar birlikte, NetDecoder'ın biyolojik ağlar içindeki bilgi akışındaki gen (düğüm seviyesi), gen-gen (kenar seviyesi) ve ağ düzeyindeki değişiklikleri yakalarken göstermektedir (Şekil 4). Isı haritaları, ağda değişen bilgi yayımı, yönlendirme ve alımına sahip genleri tanımlarken, kenar düzeyindeki analizler bu değişiklikleri tetikleyen spesifik etkileşimleri ortaya koyar. Fenotipe özgü bilgi ağları, düğümlerin genleri temsil ettiği ve kenar kalınlığının bilgi akışının büyüklüğüne karşılık geldiği koşullar arasında ağ yeniden yapılandırmasının görsel bir temsili sunar (Şekil 4). Bu sistem düzeyinde temsil, incelenen koşullarla ilişkili temel düzenleyici genlerin ve yolların tanımlanmasını destekler. Ayrıca, bu figürlerin başarılı şekilde üretilmesi, NetDecoder'ın doğru şekilde uygulandığını göstermektedir.

NetDecoder çok sayıda çıktı dosyası ürettiği için, en ilgili sonuçları belirlemek yorumlama için gereklidir. Örneğin, koşullar arasındaki akış farklarını incelemek için (örneğin, düşük aşama ile yüksek aşama) iki anahtar dosya kullanılabilir (gezinme adımları Şekil 3'teki dosya yapısına göre yönlendirilir). İlki, "EDGE_CENTERED_SUBNET_flowDifference_Hastalık.txt" (analiz/Hastalık dizininde yer alır), koşullar arasındaki akışta en büyük değişikliklere sahip etkileşimleri (kenarları) tanımlar. İkincisi "flowDifference_PRIORITIZED_NETWORK.txt" ("your_shortname" dizininde yer alır), en büyük akış farklarına sahip genleri (düğümleri) tanımlar. Bu dosyalar birlikte, ağ davranışındaki hem etkileşim düzeyinde hem de gen düzeyindeki değişikliklerin kapsamlı bir görünümünü sunar.

Daha geniş anlamda, "analiz" klasörü ağ yönlendiricileri, ana hedefler ve önemli diferansiyel akış genleri hakkında bilgi içerir. "your_shortname" klasörü, toplam akış değerleri, ana hedefler ve yönlendiriciler gibi fenotipe özgü verilerle ham metin dosyalarını içerir. Ağ klasörü, NetDecoder tarafından oluşturulan alt ağları içerir; bunlar Cytoscape^7'de daha fazla analiz edilip görselleştirilebilir. Son olarak, "toplama" klasörü, sonuçların genel bir özetini sunan birleştirilmiş veriler ve rakamlar içerir. NetDekoder sonuçlarının daha fazla görselleştirmesi ve analizi, ggplot2, igraph, pheatmap gibi R paketleri kullanılarak yapılabilir.

Şekil 1: NetDecoder Pipeline ve Genel Fonksiyonellik Temsili. NetDecoder, üç genel aşama (sarı kutu) gerektirir: veri işleme, NetDecoder yapılandırması ve NetDecoder çalıştırma. Bu aşamaların her adımı başarılı sonuçlar için yakından takip edilmelidir. NetDecoder, yüksek bilgi akışı ve gen faydalılığı ile ilişkili olabilecek genlerin öngörülmesi için iki koşuldan (yeşil kutudaki örnekler) ifade verilerini gerektirir. Su musluğu benzetmesinde, gen ifade seviyeleri musluğun boyutu, yani ne kadar geniş açılabileceği ile gösterilirken, gen faydası veya aktivitesi musluktan geçen gerçek su akışını yansıtır ve bu yolun işlevsel olarak ne kadar kullanıldığını gösterir. Şekilde gösterildiği gibi, yüksek ekspresyon edilen bir gen (büyük musluk boyutu) düşük gen kullanımına (düşük su akışı seviyesi) sahip olabilirken, düşük ifadeye sahip bir gen (küçük musluk boyutu) yüksek gen faydasına sahip olabilir (yüksek su akışı seviyeleri). Bu, genlerin belirli bir durumda genel olarak daha yüksek öneme sahip olabileceğini, hatta başka bir genin ifade seviyelerinden daha düşük olsa bile, göstermektedir. Alt ortadaki illüstrasyon, genlerin nasıl birbirine bağlı olabileceğini ve ne kadar ifade edildiklerine (boyutlara) bakılmaksızın farklı seviyelerde akış (renk) yaşayabileceğini gösterir. BioRender'da oluşturuldu. Blissenbach, E. (2026) https://BioRender.com/8okynbu. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: NetDecoder Genel İş Akışı. NetDecoder algoritmasının temel prensibi, protein ve protein etkileşim (PPI) ağında gen faydasını bilgi akışı analiziyle modellemektir. İş akışı, veri ön işleme ve kenar ağırlıklı ağ (EWN) oluşturma ile başlar. İki biyolojik durumdan, fenotip 1 (P1) ve fenotip 2 (P2) gen ifade verileri, kaynak genleri ya diferansiyel ifade veya şablon eşleştirme yaklaşımlarıyla tanımlanır. Normalize ifade matrisleri, kenar ağırlıklarının her fenotipte gen-çift ilişkilerini yansıttığı koşul-spesifik EWN'ler oluşturmak için kullanılır. NetDecoder, daha sonra durumlar arasındaki bilgi akışındaki farkları nicelikle ölçüyor; böylece ağ yeniden kablolama olayları ve gen kullanımındaki değişiklikler tespit ediliyor. Çıktılar arasında farklı bilgi akışı puanları, bağlama özgü bilgi ağları, etki puanı ısı haritaları ve sonraki biyolojik yorumlama ile mekanik keşifleri kolaylaştıran ek ağ düzeyinde ve gen düzeyinde metrikler bulunur. BioRender'da oluşturuldu. Correia, C. (2026) https://BioRender.com/29cmswf. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: NetDekoder çıktıları ve klasör yapısı. Bu diyagram, yorum için sonuç dosyalarına erişmek için kullanılan çıktı dizin yapısını temsil eder. İtalik ile gösterilen klasör isimleri (klasör simgelerinde) yer alır; tırnak içindeki isimler ise analiz isimlendirmesine özgüdür. Gelen kutusu simgelerindeki değerler, renk kodlamasına bağlı olarak dosya veya dosya türlerini gösterir. Kırmızı, her klasörde bulunabilen dosya türlerini gösterirken, anahtar dosyalar kalın ve altı çizilmiş (flowDifference_PRIORITIZED_NETWORK.txt ve EDGE_CENTERED_SUBNET_flowDifference_Hastalık.txt) ile gösterilir. Klasör simgeleri icons8 (https://icons8.com) kaynaklı olarak alınmıştır. BioRender'da oluşturuldu. Blissenbach, E. (2026) https://BioRender.com/8okynbu. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: NetDecode tarafından üretilen sonuçlara örnek. Etki genleri (A), ağ yönlendiricileri (B) ve anahtar hedefler (C) ısı haritaları, ayrıca bağlama özgü ağlar (D) ve kenar akış çubuk grafikleri (E), NetDecoder'ın temel çıktılarıdır. Bu örnekte, erken evre hastalığı (evre I-II, düşük) ve ileri evre hastalığı (evre III-IV, yüksek) olan hastalar karşılaştırmak için safra yolu kanseri ekspresyon veri seti (OEP001105) kullanıldı ve iki grup arasında yüksek diferensial bilgiye sahip genleri belirlemek için NetDecoder kullanıldı. Her grafikte kırmızı artan akışı, mavi ise azalmış akışı gösteriyor. Ağ yönlendiricileri (B), büyük miktarda akışın geçtiği (toplama/Disease_Network_routers.pdf), ana hedefler (C) önemli aşağı akış düzenleyicileridir (toplama/Disease_Key_targets.pdf) ve akış farkı ısı haritası, koşullar arasında gen düzeyindeki bilgi akışındaki genel değişimi temsil eder (analiz/flowDifference_heatmap.pdf). Fenotipe özgü bir bilgi ağı (D) görselleştirilebilir; her gen bir düğümü temsil eder ve gen-gen etkileşimleri kenarlar (çizgiler) olarak temsil edilir (analiz/EDGE_CENTERED_SUBNET_Disease). Kenar kalınlığı, genler arasındaki bilgi akışının büyüklüğüne karşılık gelir. Bar grafik (E), seçilmiş iki fenotip arasındaki gen-gen etkileşimleri arasındaki kenar akışındaki farkları gösterir; düşük evreli çiftler turuncu renkte, yüksek evre çiftleri ise turuncu renkte temsil edilir (analiz/Disease_keyEdges.pdf). Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

Bu protokol, gen ifade verilerini protein-protein etkileşim (PPI) ağlarıyla entegre eden NetDecoder'ın uygulamasını özetlemektedir; bu çerçeve, koşullara özgü bilgi akışını modellemekte ve genleri biyolojik sistemlerdeki fonksiyonel etkilerine göre önceliklendirmek için tasarlanmıştır. Bu yöntemin başarılı uygulanması, birkaç kritik adıma, dikkatli metodolojik seçimlere ve çıktıların doğru yorumlanmasına bağlıdır.

Protokolün ilk aşamaları ifade verisinin alınmasını, meta veri oluşturulmasını ve birleşik bir ifade matrisi oluşturulmasını içerir. Bu adımlar, aşağı akış analiziyle uyumluluğu sağlamak için kritiktir. İfade matrisi, genlerin satırlar ve örnekler sütun olarak biçimlendirilmesi, matristeki örnek isimleri ve meta veri dosyası ile aynı şekilde eşleşmesi gerekir. Bu aşamadaki tutarsızlıklar (örneğin, uyumsuz örnek tanımlayıcıları veya çoğaltılmış gen isimleri) boru hattında yayılır ve sonraki adımlarda arızalara yol açar.

Düşük kaliteli verilerin (örneğin, düşük sayıya sahip genler, eksik değerler veya düşük varyanslı genler) filtrelenmesi özellikle önemlidir, çünkü bu özellikler korelasyon temelli ağ yapısına gürültü getirebilir. Başarılı bir ön işleme adımı, eksik değerleri olmayan temiz bir ifade matrisi ve PPI ağında kullanılanlarla uyumlu tutarlı gen tanımlayıcılarıyla gösterilir.

Protokolteki önemli bir karar noktası, Kenar Ağırlıklı Ağ (EWN) yapısında kullanılan kaynak genlerin seçilmesinde diferansiyel ifade analizi ile şablon eşleştirme arasında seçim yapmaktır. Diferansiyel ifade analizi, yeterli tekrara sahip iyi tanımlanmış deneysel grupları karşılaştırırken en uygun usuldür. Bu yaklaşım, koşullar arasında istatistiksel olarak anlamlı ifade değişiklikleri olan genleri tanımlar ve log2 katlama değişimi (log2FC) ve ayarlanmış p-değerler gibi nicel çıktılar sağlar. Başarılı uygulama, hem anlamlı hem de anlamsız genlerin dağılımı ile gösterilir; sonuç tamamen sıfır değildir. Buna karşılık, şablon eşleştirme daha uygun, amaç sürekli veya referans profiliyle ilişkili ekspresyon desenlerine sahip genleri tanımlamak olduğunda daha uygundur. Bu yöntem, genleri diferansiyel ifadenin büyüklüğünden ziyade korelasyon gücüne göre korelasyon gücüne göre korelasyon olarak koralır. Başarılı bir şablon eşleştirme adımı, referans koşulu ile istatistiksel olarak anlamlı korelasyona sahip bir dizi gen elde eder. Bu yaklaşımlar arasındaki seçim, aşağı akış ağ topolojisini etkiler; Diferansiyel ifade büyüklük değişikliklerini vurgularken, şablon eşleştirme koordineli ifade desenlerini vurgular.

EWN yapım adımı, protokolün en kritik bileşenlerinden biridir. Burada, normalize edilen gen ifade verileri, ağda bulunan tüm etkileşimler için çiftli gen-gen korelasyonları hesaplamak amacıyla PPI ağı ile entegre edilir. Sadece ifade veri seti ile PPI ağı arasında paylaşılan genler korunur, bu da biyolojik önem ve hesaplama tutarlılığını sağlar. Her koşul için, Pearson korelasyon katsayıları tüm kenarlar boyunca hesaplanır; ayrıca karşılık gelen p-değerleri ve mutlak korelasyon değerleri de bulunur. Bu metrikler, NetDecoder'ın kullandığı kenar ağırlıklarını tanımlar. Başarılı EWN yapısı, binlerce gen-gen korelasyonu, geniş korelasyon dağılımı ve filtreleme sonrası minimum eksik değerlerle gösterilir. Bu aşamadaki başarısızlık genellikle uyumsuz gen tanımlayıcıları, yetersiz örneklem büyüklüğü veya yanlış normalize edilmiş ifade verilerinden kaynaklanır. Yaygın NetDekoder arıza noktaları genellikle giriş dosyalarının ve yazılım yapılandırmasının metodik doğrulamasıyla çözülebilir. NetDecoder beklenmedik şekilde sona ererse veya eksik çıktılar üretirse, kullanıcıların örnek tanımlayıcılarının ifade matrisleri ile meta veri dosyaları arasında aynı olduğunu, gen tanımlayıcılarının ifade veri setleri, kaynak gen listeleri ve PPI ağı arasında tutarlı olduğunu ve ifade matrislerinin eksik değer içermediğini kontrol etmeleri gerekir. Hata veya kısaltılmış sonuçlar ortaya çıkarsa, kullanıcılar yazılım kurulumu ve sürüm uyumluluklarını doğrulayabilir, yürütme sırasında oluşturulan günlük mesajlarını inceleyebilir ve her ara adımın başarılı tamamlandığını onaylayabilir, ardından sonraki analizlere geçebilirler. Çıkış dosyalarının ve/veya konsol mesajlarının incelenmesi, sonraki analizler denenmeden önce hatanın kaynağını belirlemeye yardımcı olabilir. NetDecoder, dosya yolları, giriş argümanları ve bağımlılıkların titizlikle yapılandırmasını gerektirir. Önemli adımlar arasında çalışma dizini ve kütüphane yolları, gen ontolojisi ve açıklama dosyaları, kohale özgü EWN girdileri ve kaynak gen listeleri belirtilmekte yer alır.

Boru hattı aşamalar halinde yürütüldüğü için (her iki durumun ağ üretimi, analiz ve sonuç toplama), önceki aşamalardaki hatalar sonraki aşamaların başarıyla tamamlanmasını engeller. Düzgün çalışan bir çalıştırma, her biri koşulla ilgili sonuçlar içeren dört dizin (analiz, toplama, ağlar, "your_shortname") üretir. Doğru uygulamanın bir diğer pratik göstergesi çalışma zamanıdır. Başarılı çalışmalar genellikle birkaç saat sürer çünkü NetDecoder büyük etkileşim ağlarını değerlendirir; Son derece kısa çalışma süreleri genellikle yanlış yapılandırılmış girişleri veya atlanmış hesaplama adımlarını gösterir.

NetDecoder, geleneksel gen önceliklendirme ve ağ analizi yaklaşımlarından temelde farklıdır. Ağırlıklı Gen Ortak İfade Ağı Analizi (WGCNA) ^{gibi yöntemler,} genleri korelasyon yapısına göre kümeler, ancak yönsel akışı içermez veya bilginin ağda nasıl yayıldığını nicelikle ölçmez. Benzer şekilde, yol zenginleştirme^{analizleri 9} fonksiyonel aşırı temsiliyeti tanımlar, ancak etkileşim düzeyindeki dinamikleri veya ağ bağlantılarındaki değişiklikleri hesaba katmaz.

NetDecoder, koşula özgü bilgi akışını modellemek için gen ifade verilerini PPI ağlarıyla birleştirerek entegre bir yaklaşım kullanır. Bireysel gen (düğüm seviyesi) puanlarını ve etkileşim (kenar seviyesi) akış değişikliklerini niceleştirerek, ağ yapısının ve bilgi yönlendirmesinin koşullar arasında nasıl yeniden kablolandığını yakalar. Bu, güçlü diferansiyel ifade göstermeyen genlerin tanımlanmasını sağlarken, ağ davranışını arabuluculukta merkezi bir rol oynamaya devam ederken, yüksek diferansiyel bilgi akışına sahip genlerin koşul-spesifik ağ fonksiyonunu yönlendirdiğini öne süren gen fayda ^{modeli (GUM)5} ile uyumludur.

Güçlü yanlarına rağmen, NetDecoder'ın birkaç sınırlaması vardır. Birincisi, genlerin önemini doğrudan deneysel kanıt yerine modellenmiş ağ bilgi akışına göre çıkaran hesaplamalı bir^{çerçevedir 10}. Bu nedenle, onun tahminleri, biyolojik deneylerle doğrulama gerektiren hipotezler olarak yorumlanmalıdır. Gen etkisi dışı^{çalışmaları 11} veya hedefli bozulma^{testleri 12} gibi fonksiyonel doğrulama yaklaşımları, NetDecoder tarafından yüksek fayda sağlayan genlerin incelenen biyolojik süreçleri veya hastalık durumlarını gerçekten etkileyip etkilemediğini doğrulamak için gereklidir. İkinci olarak, yöntem altta yatan PPI ağının kalitesi ve tamlığına büyük ölçüde bağlıdır. PPI veritabanları genellikle iyi incelenmiş genlere yöneldiği için, daha az karakterize edilen etkileşimler az temsil edilebilir ve yeni düzenleyici ilişkilerin keşfini sınırlayabilir. Örneklem büyüklüğü, deneysel tasarım ve veri kalitesindeki değişkenlik de ağ inşası ve aşağı akış hesaplamalarını etkileyebilir. Üçüncü olarak, NetDecoder statik kenarların dinamik bilgi akışını tamamen yakaladığını varsaymaz. Bunun yerine, NetDecoder, bağlama özgü faaliyet çıkarır ve PPI ağını yapısal bir ön olarak kullanarak bilgi akışını niceliklendirir; bu ağı, biyolojik olarak makul etkileşimlerin alanını tanımlamak için bir iskele görevi görür. Dinamik davranış, duruma özgü moleküler verilerin (örneğin, gen ifadesi) üst üste bindirilmesiyle tanıtılır; böylece ağın alt kümeleri bağlam bağımlı şekilde yeniden ağırlıklandırılır veya aktive edilir.

NetDecoder'ın temel amacı, genler (düğümler) arasındaki niceliksel ve sürekli ilişkileri korurken statik bir PPI iskeleti üzerinde bilgi yayılımını modellemektir. Buna karşılık, Boolean ağları gibi yaklaşımlar, protein aktivitesini mantıksal etkileşimlerle yönetilen ayrık açma/kapanma durumları olarak modelleyerek dinamiklerin basitleştirilmiş ve yorumlanabilir bir temsili^{sunar 13}. Bu yaklaşımlar, gen düzenleyici ve sinyal ağlarının çeşitli koşullar altında incelenmesinde yaygın olarak^{kullanılmıştır} 14,15,16. Ancak, genellikle önceden tanımlanmış mantıksal kurallar ve protein durumlarının ayrıştırılması gerektirir; bu da büyük, heterojen biyolojik PPI ağları için ölçekte tanımlamak zor^{olabilir 17}. Bu bağlamda, Boolean ağ modellemesi NetDecoder'a tamamlayıcı bir yönü temsil eder. NetDecoder sürekli, nicel bilgi akışını yakalarken, mantıksal kural tabanlı dinamikleri veya hibrit ayrık-sürekli modelleri entegre etmek, koşula özgü sinyal davranışlarının yorumlanabilirliğini artırabilir. Bu nedenle, Boolean tarzı bilgi akışı algoritmalarının geliştirilmesi, gelecekteki çalışmalar için umut verici bir yol sunar.

NetDecoder'ın gelecekteki yönleri arasında ek omik veri tipleriyle entegre olmak ve çözünürlüğü ile biyolojik bağlamı iyileştirmek için tek hücreli transkriptomiklere genişletmek yer almaktadır. Örneğin, mekansal transkriptomik ifade tahmini ve emputasyonu için derin öğrenme tabanlı yaklaşımlar, veri kalitesini ve sinyal kurtarımını iyileştirmeyi amaçlar, ancak etkileşim ağları arasında bilgi akışını açıkça modellememektedir^18,19. Çok omik düzeyde analiz dahil etmek, hem tahmin gücünü daha da artırabilir hem de daha güvenilir sonuçlar elde edebilir. Sürekli metodolojik geliştirmeyle, NetDecoder birden fazla katmanlı bilgi akışı üretebilecek ve araştırma bilimcilerine ilgi duydukları veriler için çoklu omik doğrulama sağlayacak.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
AnnotationDbi	Bioconductor	version 1.68.0	Anotasyon ve gen eşleme
Bioconductor	Bioconductor	version 3.19	transkriptomik veri analizi için çerçeve ve DESeq2, edgeR, limma, AnnotationDbi ve organizma veritabanlarını destekleyen paket ekosistemi
Cytoscape	The Cytoscape Consoritum	version 3.10.4	Ağ görselleştirme ve analizi
DESeq2	Bioconductor	version 1.46.0	Diferansiyel ekspresyon analizi (negatif binom modelleme ile)
dplyr	Posit Software, PBC formerly RStudio, PBC	version 1.1.4	Veri manipülasyonu ve dönüşümü
edgeR	Bioconductor	version 4.4.2	Sayım tabanlı diferansiyel ekspresyon analizi
ggplot2	Posit Software, PBC formerly RStudio, PBC	version 4.0.0	Veri görselleştirme ve çizim
GNU Bash	GNU Project	Sistem varsayılan	Bash, NetDecoder pipeline scriptlerinin çalıştırılması
igraph	igraph Development Team	version 2.1.4	Ağ yapımı ve grafik analizi
Limma	Bioconductor	version 3.62.2	Gen ekspresyon analizi için doğrusal modelleme
NetDecoder	Hu Li Laboratory, Mayo Clinic	(2024 Hu Li Lab)	Bilgi akışı modellemesi yoluyla bağlam-özgü protein etkileşim ağlarının yapımı
org.Hs.eg.db	Bioconductor	version 3.20.0	İnsan gen anotasyonu veritabanı
Oracle JDK	Oracle Corporation	≥ version 1.8	NetDecoder çalıştırması için çalışma ortamı
pheatmap	Raivo Kolde	version 1.0.13	Ekspresyon ve korelasyon yapısının görselleştirilmesi
R	The R Foundation	version 4.4.2	Transkriptomik ve ağ analizi için temel ortam