Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

DESeq2 Kullanarak Deneysel Beyin Sıtma Beyin Dokusunda Artesunatla İlgili Transkriptomik Değişimleri Niceliklendirmek İçin Hesaplamalı Protokol

75 görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/70870

⸱

31 Temmuz 2026

 ,  , 
1Department of Biochemistry, University of Ilorin

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Deneysel serebral sıtma (ECM) nöroinflamasyon ve kan-beyin bariyeri işlev bozukluğuna neden olur. GSE162535 kullanılarak, bu tekrarlanabilir R tabanlı RNA dişimi kontrol (CB), ECM (MB) ve artesunat tedavisi (AB) beyinleri karşılaştırarak QC, PCA ve DESeq2 analizleri gerçekleştirir. ECM kaynaklı transkripsiyonel değişiklikleri tanımlar ve inflamatuar ve nörovasküler yolların artesunat aracılı modülasyonunu değerlendirir.

Özet

RNA dizileme (RNA-dizi) hastalıkla ilişkili transkripsiyon programlarını tanımlamak için yaygın olarak kullanılır, ancak deneysel gruplar arasında tekrarlanabilir karşılaştırmalar sağlamak ve biyolojik olarak yorumlanabilir çıktıları kolaylaştırmak için tutarlı, uçtan uca iş akışları gereklidir. Burada, deneysel beyin sıtmasında (ECM) beyin transkriptomik değişikliklerinin değerlendirilmesi ve artesunat tedavinin ardından kamuya açık veri seti GSE162535 kullanılarak tam bir RNA-sek analiz protokolü sunulmaktadır. İş akışı, kontrol beyni (CB), ECM beyni (MB) ve artesunat tedavisi gören ECM beyni (AB)—HTSeq-sayım matrisinden başlayarak üç grubu analiz eder. Ham sayıları içe aktarıp biçimlendirdikten sonra, protokol referans seviyesi olarak CB içeren bir DESeq2 veri seti oluşturur, düşük sayıdaki genleri filtreler ve kütüphane boyutunda görselleştirme, ana bileşen analizi ve örnek mesafesi kümeleme kullanarak kalite kontrolü gerçekleştirir. Diferansiyel ifade daha sonra üç birincil kontrast için hesaplanır (MB vs CB, AB vs MB, AB vs CB), stabil etki boyutu tahmini için log2 katlama değişimi küçülmesi uygulanır. Protokol, tam ve anlamlı diferansiyel ifade tablolarını dışa aktarır, volkan grafikleri ve MA grafikleri oluşturur ve kontrast başına en değişken genlerin ve en üst sırada bulunan farklı ekspresyon genlerin ısı haritalarını üretir. Mekanistik yorumu desteklemek için iş akışı hedefli bağışıklık belirteçleri çıkarımı (örneğin, sitokinler, kemokinler, mikroglial aktivasyon belirteçleri, BBB/endotel genler) içerir ve önemli ölçüde yukarı ve aşağı regülasyonlu gen setleri için Gen Ontolojisi ve KEGG zenginleştirme analizleri yapar. Bu protokol, ECM ile ilişkili nöroinflamatuar transkripsiyonel programların karakterizasyonu ve bu imzaların artesunat ilişkili modülasyonunun nicelendirilmesi için tekrarlanabilir bir şablon sağlar.

Giriş

Beyin sıtması (CM), Plasmodium falciparum enfeksiyonunun hayatı tehdit eden nörolojik komplikasyonudur ve vaka yönetimindeki gelişmelere rağmen sıtma ölümlerinde önemli bir katkı sağlamaktadır. CM, akut ensefalopati, mikrovasküler işlev bozukluğu, endotel aktivasyonu ve kan-beyin bariyeri (BBB) bozulması ile karakterize edilir; aşağı akım nöroinflamasyonu komaya yol açabilir ve hayatta kalanlar arasında kalıcı nörobilişsel sonuçlardoğurabilir. 1. CM'nin patogenezi çok faktörlüdür ve konak inflamatuar yanıtlarının nörovasküler arayüzdeki parazit ve konaktan türemiş faktörlerle etkileşimini içerir; bu da sadece klinik sonlandırma noktalarından nedensel mekanizmalar çıkarmayızorlaştırır 1.

Deneysel beyin sıtması (ECM) modelleri, özellikle C57BL/6 farelerinde Plasmodium berghei ANKA enfeksiyonu, kontrollü bir ortamda beyin spesifik immünopatoloji, BBB hasarı ve nöroinflamatuar sinyalleri sorgulamak için kolayca kontrol edilebilirbir platform sağlar 2,3. Bu modeller, hastalık evreleri arasında hücresel ve moleküler yanıtların haritalanmasını ve in vivo 2,3 yardımcı müdahaleleri test etmek için kullanılmıştır. Ancak, ECM patobiyolojisi karmaşık ve oldukça dinamiktir ve hedefe yönelik testler, birden fazla bağışıklık ve nörovasküler programda gerçekleşen koordineli, yol düzeyinde değişimleri kaçırabilir.

Artesunat, şiddetli sıtma için önerilen birinci basamak parenteral terapidir ve kilit kanıt tabanlarında kinine kıyasla önemli bir hayatta kalma faydasıgöstermiştir 4. Hızlı parazit temizlemesi artesunat etkinliğinin merkezi olmasına rağmen, nörolojik sonuçlar muhtemelen hem parazit azalmasını hem de inflamatuar ve nörovasküler yolların ikincil modülasyonunuyansıtmaktadır 1,4. Artemisinin tedavisinin ECM sırasında beyin transkripsiyon programlarını nasıl yeniden şekillendirdiğini anlamak, klinik etkinlik verilerini tamamlayan mekanik içgörüler sunabilir ve yardımcı nöroprotektif stratejiler için aday yolları belirleyebilir.

RNA dizileme (RNA-dizi), hastalık ve tedavi durumlarında transkripsiyonel yanıtların genom çapında tarafsız, profillenmesini sağlar; farklı ifade analizini ve sonraki fonksiyonel yorumu destekler. NCBI Gen İfadesi Omnibüsü (GEO) gibi kamu depoları, kontrol beyinlerinden (CB), ECM beyinlerinden (MB) ve artesunat tedavisi gören ECM beyinlerinden (AB) beyin RNA-seq'sini içeren GSE162535 dahil olmak üzere tekrarlanabilir yeniden analiz için uygun özenli veri setleri sunar. Bu veri setlerinden tekrarlanabilir keşifleri desteklemek için, sayıya dayalı diferansiyel ifade için sağlam istatistiksel çerçeveler gereklidir ve gen düzeyindeki değişiklikleri biyolojik yollar ve süreçler açısından yorumlamak için zenginleştirme araçları gereklidir.

Bu çalışma, kontrol (CB), deneysel beyin sıtması (MB) ve artesunat tedavisi (AB) gruplarında beyin dokusu için tekrarlanabilir, uçtan uca RNA dizi analiz akışı sunmaktadır. Bu makalenin yeniliği, önceden tanımlanmış biyolojik olarak ilgili kontrastları (MB vs CB, AB vs MB ve AB vs CB), titiz kalite kontrol çıktılarını (kütüphane boyutu değerlendirmesi, ana bileşen analizi ve örnek mesafesi ısı haritaları) ve Gen Ontolojisi (GO) ile KEGG yol zenginleştirmesi yoluyla entegre sonraki yorumu clusterProfiler 6,7 ile entegre bir sonraki yorumu içeren DESeq2 tabanlı üretim hattında yatmaktadır. Ayrıca, iş akışı yapılandırılmış bağışıklık paneli tabanlı yorumlama uygular ve nöroinflamatorik, bağışıklık ve nörovastik transkripsiyonel yanıtların sistematik karakterizasyonunu mümkün kılar. İstatistiksel titizlik, şeffaflık ve yayına hazır çıktıları birleştirerek, bu protokol ECM ile ilişkili transkriptomik düzensizlik analizi ve preklinik sıtma çalışmalarında tedavi odaklı modülasyonun değerlendirilmesi için sağlam ve yeniden kullanılabilir bir çerçeve sağlar.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Bu çalışma, halka açık RNA-seq verilerini kullandı ve yeni insan veya hayvan deneyleri içermedi. Bu nedenle, etik onay ve bilgilendirilmiş onay gerekmiyordu (Materyal Tablosu).

1. Hesaplama ortamını ve klasör yapısını hazırlayın

  1. Donanım ve işletim sistemi kurulumu
    1. İndirme ve çıkış için en az 8 GB RAM (16 GB önerilir) ve ≥10 GB boş disk alanı olan bir iş istasyonu veya dizüstü bilgisayar kullanın.
    2. Windows, macOS veya Linux kullanarak R paketlerini kurup çalışma dizine dosya yazabilirsiniz.
  2. Gerekli yazılımı kur
    1. R (sürüm 4.2 veya daha sonrası) kurun. İş akışını etkileşimli çalıştırmak ve proje dizinini yönetmek için RStudio Desktop'u (önerilen) kurun.
  3. Bir proje dizini oluşturun ve çıktı klasörleri oluşturun
    1. Analiz için yeni bir klasör oluşturun (örneğin, GSE162535_RNAseq_DESeq2). Bu klasörü R çalışma dizini olarak ayarlayın.
    2. Çıkış klasörlerini tam olarak aşağıdaki gibi oluşturun:
      1. Sonuç yaratın/. Sonuçlar/fig/ oluşturun. Sonuçlar/tablolar oluşturun.
  4. Gerekli R paketlerini kur
    1. CRAN paketlerini kurun: tidyverse, pheatmap ve RColorBrewer. Bioconductor paketlerini kurun: DESeq2, apeglm (isteğe bağlı), clusterProfiler ve org. Mm.eg.db.
    2. Gerekli paketleri betikin başında yükleyin: DESeq2, tidyverse, pheatmap, RColorBrewer, clusterProfiler, org. Mm.eg.db ve ggplot2. Tekrarlanabilirlik için set.seed(123) çalıştırarak bir tohum oluşturun.
  5. Veri bütünlüğü ve gizlilik korumalarını uygulayın
    1. İndirilen dosyaları sadece proje dizininde depolayın. Ortamda hassas veya ambargo edilmiş veriler varsa proje dizinine erişimi kısıtlayın. Yazılım sürümlerini iş akışının sonunda sessionInfo() ile sonuçlar/sessionInfo.txt'e aktararak kaydedin.
      NOT: Bu protokol, kamuya açık RNA dizisi sayısı verilerinin in silico analizini yapar ve biyolojik örneklerin işlenmesini içermez.

2. RNA-seq sayı matrisini elde edin ve deneysel grupları tanımlayın

  1. GEO veri seti dosyalarını indirin GSE162535
    1. GEO'dan GSE162535 için HTSeq sayım dosyasını indirin ve proje dizinine GSE162535_All.HTSeq.counts.txt.gz olarak kaydedin. Dosyanın hatasız açıldığını gzfile() ve read.delim() kullanarak doğrulayın.
  2. HTSeq sayımlarını R'ye yükleyin
    1. Sıkıştırılmış sayım tablosunu read.delim(gzfile(...), header = TRUE, check.names = FALSE, quote = "", comment.char = "" kullanarak içe aktarın. İçe aktarılan nesneyi str(), head() ve colnames() kullanarak inceleyin ve şu noktayı doğrulayın:
      1. İlk sütunda gen tanımlayıcıları (örneğin, AccID) bulunur. Kalan sütunlarda örnek düzeyinde sayılar bulunur.
  3. Veri tiplerini standartlaştırın ve çoğaltılmış gen tanımlayıcılarını çözün
    1. Örnek sütunlarını, gen tanımlayıcı sütunu (AccID) hariç tüm sütunlar olarak tanımlayın. Tüm örnek sütunlarını tam sayı sayılarına bağlamak. Aynı AccID'yi paylaşan satırlar arasında sayıları toplayarak çoğaltılmış gen tanımlayıcılarını çöktürmek.
    2. Çökeltilmiş tabloyu standart bir veri çerçevesine dönüştürün. Satır isimlerini gen tanımlayıcısına ayarlayın ve tanımlayıcı sütununu sayım matrisinden çıkarın.
  4. Sayım matrisi yapısını doğrulayın
    1. Sayım matrisinin 12 örnek sütunu olduğunu doğrulayın. Örnek sütun adlarının AB_1..AB_4, CB_1..CB_4 ve MB_1.MB_4 formatlarını takip ettiğini doğrulayın.
    2. Eğer sayım matrisi 12 sütundan yoksa, yürütmeyi durdurun.
  5. Örnek meta veri oluşturun ve doğrulayın
    1. Aşağıdaki sütunları içeren örnek bir metaveri tablosu (colData) oluşturun:
      1. örnek: sayım matrisinin sütun adlarına karşılık gelen benzersiz örnek tanımlayıcılar. Grup: Her örnekle ilgili biyolojik durum.
    2. Veri seti GSE162535 için ilgili örnek açıklamaları Gen İfadesi Omnibus'tan (GEO) alın.
    3. Her örnek kimliğini, deneysel durumu tanımlayan GEO erişim bilgileri ve örnek açıklama alanlarıyla doğrulayın. Sayım matrisindeki her örnek tanımlayıcıyı doğrulanmış GEO açıklamasına eşleyin.
    4. Her doğrulanmış örneği aşağıdaki gruplardan birine atanın: kontrol beyni (CB), deneysel serebral sıtma beyni (MB) veya artesunat tedavisi gören deneysel serebral sıtma beyni (AB).
    5. Meta veri tablosunu örnek sırasının sayım matrisinin sütun sırasıyla eşleştiği şekilde düzenleyin.
    6. Metaveri tablosunda örnek tanımlayıcıları sayım matrisi ile karşılaştırarak bire bir uyumluluğu doğrulayın. Grup değişkenini CB, MB ve AB olarak seviyelerle bir faktör olarak kodlayın.
    7. CB'yi, aşağı akış diferansiyel ifade analizi için temel olarak kontrol beyin grubunu tanımlamak için referans seviyesi olarak ayarlayın.
    8. Metaveri tablosunun satır adlarını örnek tanımlayıcılara eşit olarak ayarlayın.
      NOT:Grup etiketleri yalnızca sayım matrisindeki örneklerin sırasına göre atanmamıştır. Örnek kimlikleri, tekrarlanabilirliği artırmak ve örnek yanlış sınıflandırma riskini azaltmak için GEO meta verileri ve erişim bilgileri kullanılarak bağımsız olarak doğrulandı.

3. DESeq2 veri setini oluştur ve temel kalite kontrolü gerçekleştir

  1. Sayım matrisini temizleyin
    1. Sayım matrisinde eksik değerleri sıfır ile değiştirin. Eksik değerlerin olmadığını sütun bazında is.na() özetleriyle doğrulayın.
  2. DESeq2 veri setini oluştur
    1. DESeqDataSetFromMatrix() kullanarak bir DESeqDataSet oluşturun: countData = counts; colData = sample_info; tasarım = ~ grup.
  3. Düşük sayılı genleri filtreleyin
    1. Tüm örneklerde toplam sayıya sahip = 10, ] kullanarak çıkar. Nesne özetini basarak saklanan genlerin sayısını kaydedin.
  4. Kütüphane boyutlarını değerlendirin
    1. Kütüphane boyutlarını, filtrelenmiş sayım matrisinin sütun toplamları olarak hesaplayın. Bir kütüphane boyutunda bir barplot oluştur ve bunu results/fig/library_sizes.pdf olarak kaydet.
    2. Kütüphane boyut grafikini inceleyin ve hiçbir örneğin çalışma tasarımıyla tutarsız aşırı bir dizileme derinliği olmadığından emin olun.

4. DESeq2'yi çalıştırın ve görselleştirme için dönüşüm nesneleri oluşturun

  1. DESeq2 modeline uymak
    1. dds <- DESeq(dds) kullanılarak diferansiyel ifade modellemesi çalıştırın. Tüm sonraki sonuç çıkarımı için uygun DDS nesnesini koruyun.
  2. Dönüştürülmüş ifade matrisleri oluşturun
    1. Düzenli log dönüşümünü rld <- rlog(dds, kör = YANLIŞ) kullanarak hesaplayın. Varyans stabilizator dönüşümü vsd <- vst(dds, kör = YANLIŞ) kullanarak hesaplayın. PCA, kümeleme ve ısı haritaları için rld ve vsd kullanın.
      NOT: Grup bağımlı varyans yapısını korumak için kör = YANLIŞ kullanın.

5. PCA ve örnekten örnekle mesafe kümeleme kullanarak küresel kalite kontrolünü gerçekleştirin

  1. Ana bileşen analizi (PCA) üretin
    1. PCA'yı plotPCA(rld, intgroup = "grup", returnData = TRUE) kullanarak hesaplayın. PC1 ve PC2 için yüzde varyansı açıklaması. PC1 ve PC2 arasında ggplot2 kullanarak çizim, noktaları örnek adıyla etiketleyip gruplara göre renkleri gösterin.
    2. PCA grafikini sonuçlar/fig/PCA_samples.pdf olarak kaydedin. Biyolojik çoğaltmaların grup grup kümeleşip geçtiğini ve hiçbir örneklemin istisna olarak ayrılmadığını doğrulayın.
  2. Örnek mesafesi ısısı haritası oluşturun
    1. Çift ayrı bir örnek mesafesini dist(t(assay(vsd))) kullanarak hesaplayın. Uzaklık nesnesini görselleştirme için bir matrise dönüştürün. Her örnek için grup faktörünü içeren bir sütun açıklama tablosu oluşturun.
    2. Mesafe matrisini pheatmap() ile çizin ve sonuç/fig/sample_distance_heatmap.pdf olarak kaydedin. Örneklerin öncelikle grup bazında kümelendiğini doğrulayın.

6. Üç birincil zıtlık için diferansiyel ifadeyi hesaplayın

  1. Zıtlıkları tanımlayın
    1. Hastalık etkisini ECM vs kontrol olarak tanımlayın: MB vs CB. ECM içindeki tedavi etkisini artesunatla tedavi edilmiş ve ECM olarak tanımlayın: AB ve MB. Tedavi ile başlangıç düzeyini artesunatla tedavi edilmiş ve kontrol olarak tanımlayın: AB vs CB.
  2. Log2 katlanma değişimi ile DESeq2 sonuçlarını çıkarın
    1. Her kontrast için ham sonuçlar (dds, contrast = c("grup", grupA, grupB)) kullanılarak alın. lfcShrink(dds, contrast = c("group", groupA, groupB), res = res, type = "normal" kullanılarak küçültü log2 katlama değişiklikleri.
    2. Sonuçları bir veri çerçevesine dönüştürün ve gen tanımlayıcısını gene_id adlı bir sütun olarak depolayın. Kararlı raporlama için nominal p-değeriyle sipariş sonuçları.
    3. Her tam sonuç tablosunu sonuçlar/tablolar/sayfalara şu şekilde kaydedin:
      1. DESeq2_MB_vs_CB_all_genes.csv, DESeq2_AB_vs_MB_all_genes.csv, DESeq2_AB_vs_CB_all_genes.csv
        NOT: Paket yapılandırması nedeniyle küçülme başarısız olursa, yerel kurulumda desteklenen alternatif bir küçültme tipiyle tekrar çalıştırın.
  3. Anlamlılık eşiklerini tanımlayın ve önemli gen kümelerini ihraç edin
    1. Farklı olarak ifade edilen genleri (DEG) şu şekilde tanımlayın: ayarlanmış p-değeri (FDR) < 0.05 ve mutlak log2 kat değişimi ≥ 1. Her kontrastı, eksik ayarlanmış p-değerleri olan genleri hariç tutacak şekilde filtreleyin.
    2. Önemli DEG tablolarını şu yerlere aktarın: results/tables/DESeq2_MB_vs_CB_sig.csv, results/tables/DESeq2_AB_vs_MB_sig.csv, results/tables/DESeq2_AB_vs_CB_sig.csv
  4. Kontrast başına DEG sayılarını özetleyin
    1. Kontrast başına anlamlı gen sayısını hesaplayın. Özet tablosunu sonuçlar/tablolar/DE_summary_counts.csv olarak kaydedin.

7. Her zıtlık için volkan grafikleri oluşturun.

  1. Bir volkan grafik fonksiyonu oluşturun.
    1. Her gen için -log10 (ayarlanmış p-değeri) hesaplayın. Her geni şu eşiklerle Yukarı, Aşağı veya Anlamsız olarak sınıflandırın: FDR < 0.05 ve |log2FC| ≥ 1.
    2. log2FC (x ekseni) vs -log10(FDR) (y ekseni) ggplot2 kullanılarak çiz. log2FC = ±1 ve -log10(0.05) olarak kesikli eşik çizgileri ekleyin.
  2. İhracat volkan alanları
    1. Her grafiki sonuçlar/fig/: volcano_MB_vs_CB.pdf, volcano_AB_vs_MB.pdf, volcano_AB_vs_CB.pdf içinde PDF olarak kaydedin.
      NOT: Figürler arasında görsel karşılaştırmayı desteklemek için kontrastlar arasında tutarlı eksen sınırları kullanın.

8. Her kontrast için MA grafikleri oluşturun

  1. MA grafiklerini tek bir PDF'ye aktarın.
    1. results/fig/MA_plots.pdf adlı bir PDF cihazını açın. Her ham DESeq2 sonuç nesnesi için plotMA() kullanılarak MA grafiklerini çizin. Her grafiki karşılaştırma adıyla etiketleyin. PDF cihazını kapatın.

9. Küresel değişkenlik ve kontrast spesifik DE genleri için ifade ısı haritaları oluşturun.

  1. Tüm örnekler boyunca en üst değişken genleri çizin.
    1. VSD analiz matrisinden örnekler arasında sıralı varyansı hesaplayın. En değişken 100 geni seçin. Her geni örnekler arasında ortalamaya yerleştirin.
    2. Pheatmap() kullanarak örnek grup açıklamalarıyla bir ısı haritası oluşturun. Rakamı sonuçlar/fig/heatmap_top100_variable_genes.pdf olarak kaydedin.
  2. Her kontrast için en üst farklılıkla eksprese edilen genleri çizin.
    1. Her kontrast için ayarlanmış p-değeriyle en iyi 50 geni seçin. VSD ekspresyon matrisini ve ortalamasını gen ile çıkarın. Her kontrast için bir ısı haritası oluşturun ve şu şekilde kaydedin:
    2. Sonuçlar/Figür/heatmap_top50_MB_vs_CB.pdf, Sonuçlar/Figür/heatmap_top50_AB_vs_MB.pdf, Sonuçlar/Figür/heatmap_top50_AB_vs_CB.pdf
      NOT: Satır etiketleri etkinse, PDF genişliğini ve yüksekliğini artırın.

10. Hedefli bağışıklık belirteç analizi yapın.

  1. Kontrastlar arasında seçilmiş bağışıklık genlerini özetleyin.
    1. Bir bağışıklık belirteç seti tanımlayın: Il6, Il1b, Il10, Tnf, Ifng, Il21 ve Icam1. Her kontrast sonuç tablosundan bu genler için log2FC, p-değeri ve ayarlanmış p-değerini çıkarın.
    2. Üç kontrast özetini gen tanımlayıcısına göre birleştirin. Birleştirilmiş tabloyu sonuçlar/tablolar/immune_genes_summary.csv olarak kaydet.
  2. Bir bağışıklık belirteci ısı haritası (rlog) oluşturun.
    1. Dönüştürülmüş test matrisinde bulunan bağışıklık genlerini tanımlayın. Mevcut bağışıklık genleri için rlog ifade matrisini çıkarın.
    2. Gen tarafından orta-merkez ifadesi. Isı haritasını oluşturup sonuçlar/fig/heatmap_immune_genes.pdf olarak kaydedin.

11. Fonksiyonel kategoriye göre genişletilmiş bağışıklık paneli analizi yapmak

  1. Bağışıklık panellerini tanımlayın.
    1. Bağışıklık belirteç panellerini kategorilere göre tanımlayın; bunlar arasında Pro-inflamatuar sitokinler ve interferon yanıt genleri, anti-inflamatuar ve düzenleyici genler, kemokinler, mikroglial aktivasyon belirteçleri, astrosit belirteçleri, BBB ve endotel aktivasyon belirteçleri, T-hücre belirteçleri ve tükenme belirteçleri, monosit/makrofaj belirteçleri, tamamlayıcı yol genleri ve oksidatif stres ve hücre ölümü genleri yer alır.
  2. Her kontrast için bağışıklık paneli DE sonuçlarını çıkarın.
    1. Gen sembollerinden bağışıklık kategorilerine bir eşleme tablosu oluşturun. Her kontrast sonuç tablosunu bağışıklık paneli genleri için filtreleyin. Her filtrelenmiş sonuç tablosuna kategori eşlemesini ekleyin.
    2. Üç kontrast spesifik bağışıklık tablosunu tek bir tabloya birleştirin. Birleşik tabloyu sonuçlar/tablolar/immune_panels_DE_all_contrasts.csv olarak kaydedin. Sınıflandırılmış bir bağışıklık paneli ifade ısı haritası oluşturun.
    3. RLD test matrisinde bulunan bağışıklık panel genlerini tanımlayın. Şekildeki panel sınıflandırmasını korumak için satır adlarına kategori etiketleri ekleyin. Örnek grup açıklamalarıyla rlog ısı haritasını çizin.
  3. Çıktıları kaydet.
    1. Kayıt olarak: results/fig/heatmap_immune_panels_all.pdf, results/fig/heatmap_immune_panels_all.png

12. Bağışıklık üstleme volkan haritaları oluşturun

  1. Bağışıklık üstlenmiş volkan haritaları oluşturun.
    1. Genleri bağışıklık paneli eşlemesini her kontrast sonuç tablosuna bağlayarak immün veya immün olmayan olarak işaretleyin. Tüm bağışıklık dışı genleri gri arka plan noktaları olarak çizin. Bağışıklık kategorisine göre renklendirilmiş bağışıklık genlerini ön planda çizin. Eşik satırlarını log2FC = ±1 ve -log10(0.05) olarak ekleyin.
  2. İmmunel kaplamalı volkan alanlarını ihraç edin.
    1. MB ve CB bağışıklık üstleme volkan haritalarını şu şekilde kaydet:
      1. sonuçlar/fig/volcano_MB_vs_CB_immune_overlay.pdf
      2. sonuçlar/fig/volcano_MB_vs_CB_immune_overlay.png
    2. AB ve MB bağışıklık üstleme volkan grafiklerini şu şekilde kaydet:
      1. sonuçlar/fig/volcano_AB_vs_MB_immune_overlay.pdf
      2. sonuçlar/fig/volcano_AB_vs_MB_immune_overlay.png
        NOT: Seçilmiş bağışıklık gen panelleri önceden tanımlanmış ve fonksiyonel kategorilere ayrılmıştır; Annotasyonlarla birlikte gen sembollerinin tam listesi Ek Tablo S1'de sunulmaktadır. Bu tablo, şeffaflık ve tekrarlanabilirlik sağlar; panel tabanlı analizlerin çalışmalar arasında doğrudan yeniden kullanılması ve doğrulanmasına olanak tanır.

13. Fonksiyonel zenginleştirme analizi yapmak (GO ve KEGG)

  1. Zenginleştirme için gen kümelerini tanımlayın
    1. Her kontrast için (MB vs CB ve AB vs MB), ayarlanmış p<-değer eşiği 0.05 ve mutlak log₂ katlanma eşiği ≥ 1 kullanılarak anlamlı şekilde farklı şekilde ifade edilen genler (DEG) alın.
    2. DEG'leri yukarı düzenlenmiş genlere (log₂FC > 0) ve aşağı regülasyona edilmiş genlere (log₂FC < 0) ikiye ayırın.
  2. Arka plan (evren) gen setini tanımlayın
    1. DESeq2 veri setinde sayma filtresinden sonra kalan tüm genleri arka plan evreni olarak kullanın. Filtrelenen DESeq2 nesnesinden gen sembollerini çıkarın. Arka plan gen sembollerini org ile bitr() fonksiyonunu kullanarak Entrez tanımlayıcılarına dönüştürün. Mm.eg.db.
      NOT: Tutarlı bir arka plan gen setinin kullanılması, tarafsız zenginleştirme sonuçlarını sağlar.
  3. Zenginleştirme için gen tanımlayıcılarını haritalayın
    1. Her DEG kümesinin gen sembollerini bitr() kullanarak Entrez tanımlayıcılarına dönüştürün. KEGG zenginleştirmesi için yalnızca başarılı şekilde haritalanmış genleri tutun. Eğer bir gen başarılı şekilde haritalanmazsa, bir gen seti için zenginleştirme analizini atlayın.
      NOT: Gen Ontolojisi (GO) zenginleştirmesi gen sembolleri kullanırken, KEGG zenginleştirmesi Entrez tanımlayıcıları gerektirir.
  4. Gen ontolojisi (GO) zenginleştirmesi (Biyolojik Süreç) gerçekleştirin
    1. GO zenginleştirmesini enrichGO() ile OrgDb = org ile çalıştırın. Mm.eg.db. Ayarlanan keyType = "SEMBOL" ve ontoloji (ont) = "BP". Evreni, DESeq2 veri setinden filtrelenmiş tüm gen sembolleri olarak belirtin.
    2. Çoklu test düzeltmeleri için pAdjustMethod = "BH" kullanın. pvalueCutoff = 0.05 ve qvalueCutoff = 0.05 anlamlılık eşiklerini uygula. Gen kümesi boyutlarını minGSSize = 10 ve maxGSSize = 500 kullanarak kısıtlayın.
    3. GO zenginleştirme sonuçlarını sonuçlar/tablolar/dizinine aktarın. En iyi zenginleştirilmiş GO terimlerinin barplotlarını oluştur ve sonuçlar/fig/ sayfalarına kaydet.
  5. KEGG yol zenginleştirmesi gerçekleştirin
    1. KEGG zenginleştirmesini enrichKEGG() ile uygulayın; organizma = "mmu" ile çalışın. Giriş genleri olarak DEG kümelerinin Entrez tanımlayıcılarını sağla. Evren olarak haritalanmış Entrez arka planını kullanın.
    2. pAdjustMethod = "BH" uygula. pvalueCutoff = 0.05 ve qvalueCutoff = 0.05 anlamlılık eşiklerini kullanın. Gen kümesi boyutlarını minGSSize = 10 ve maxGSSize = 500 kullanarak kısıtlayın.
    3. KEGG zenginleştirme tablolarını sonuçlar/tablolar/'a aktarın. Zenginleştirilmiş KEGG yollarının barplotlarını oluştur ve sonuçlara/fig/ kaydet.
      NOT: KEGG zenginleştirmesi, gen haritalaması yetersiz ise sonuç vermeyebilir; bu tür durumlar iş akışını kesmeden ele alınır.

14. Sadece bağışıklık zenginleştirme analizi yapmak (isteğe bağlı modül)

  1. Bağışıklık spesifik gen setleri oluşturun
    1. Bağışıklık panel genlerini özenle işleyen fonksiyonel kategorilere göre tanımlayın. DEG listelerini bağışıklık panel genleriyle kesiştirin. Her kontrast için bağışıklık spesifik DEG'leri yukarı regülasyon ve aşağı regülasyonlu setlere ayırın.
  2. Bağışıklık spesifik gen setlerinde zenginleştirme yapılabilir.
    1. Bölüm 13'te tanımlanan aynı GO ve KEGG zenginleştirme prosedürlerini uygulayın. Aynı arka plan evreni ve parametre ayarlarını kullanın. Çıktıları, küresel zenginleştirme sonuçlarından ayırmak için "bağışık" etiketi içeren dosya adlarıyla kaydedin.

15. Zenginleştirme nokta grafikleri oluşturun (isteğe bağlı modül)

  1. Yük zenginleştirme sonuçları.
    1. Sonuçlar/tablolar/dizinden GO veya KEGG zenginleştirme tablolarını içe aktarın.
  2. Zenginleştirme metriklerini dönüştür.
    1. GeneRatio değerlerini kesirli formattan (x/y) sayısal oranlara dönüştürün. Görselleştirme için −log₁₀(adjusted p-values) hesaplayın.
  3. Nokta grafikleri oluşturun.
    1. X ekseninde gen oranını ve y ekseninde zenginleştirilmiş terim tanımlarını çizin. Nokta boyutunu gen sayısına göre ve rengi −log₁₀ (ayarlanmış p-değeri) ile ölçeklendirin.
    2. Ayarlanmış p-değer sıralamasına göre en iyi zenginleştirilmiş terimleri seçin. Nokta grafiklerini sonuçlar/fig/ dizininde PDF ve PNG dosyaları olarak kaydedin.

16. Oturum bilgilerini kaydet ve koşuyu tamamla

  1. Oturum bilgilerini dışa aktarın.
    1. sessionInfo() çıktısını sonuçlara/sessionInfo.txt R sürümünü belgelemek ve paketlemek için kaydet.
  2. Başarılı tamamlanma onayı
    1. İş akışının şu şekilde oluşturulduğunu doğrulayın: sonuçlar/fig/ içindeki şekiller, sonuçlar/tablolar içindeki tablolar.
    2. Üç ana kontrast çıktısının var olduğunu ve boş olmadığını doğrulayın: DESeq2_MB_vs_CB_all_genes.csv, DESeq2_AB_vs_MB_all_genes.csv, DESeq2_AB_vs_CB_all_genes.csv

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Veri kalitesi değerlendirmesi ve küresel transkriptomik yapı

12 beyin örneğinden (CB, MB, AB; n = 4 grup başında) RNA dizisi verileri standart iş akışı kullanılarak işlendi. Düşük sayıya sahip genler (≥10 toplam sayı) filtrelendikten sonra, veri seti sonraki analizler için tutuldu. Rlog-dönüştürülmüş sayıların ana bileşen analizi (PCA), deneysel gruplara göre örneklerin ayrıldığını gösterdi ve tekrarlar gruplar içinde tutarlı şekilde kümelendi...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Bu çalışma, önceden tanımlanmış biyolojik kontrastlar üzerinden toplu RNA-seq verilerinin analizi için tekrarlanabilir, DESeq2 tabanlı bir iş akışı sunmaktadır. Protokol, standartlaştırılmış ön işleme, doğrulanmış meta veri atama, normalleştirme, diferansiyel ifade testi ve yapılandırılmış aşağı akış çıktılarını entegre ederek transkriptomik sonuçların tutarlı ve şeffaf üretimini sağlar. Analitik adımları ve parametreleri açıkça tanımlayarak, iş akışı çalışmalar <...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların rekabet eden çıkarları yoktur.

Teşekkürler

Yazarların herhangi bir teşekkürü yoktur.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
clusterProfiler (R paketi)BioconductorRRID:SCR_016884İşlevsel zenginleştirme analizi (GO ve KEGG yolları)
DESeq2 (R paketi)BioconductorRRID:SCR_015687Sayım tabanlı RNA-seq verilerinin farklılaşmış ifade analizi
ggplot2 (R paketi)CRANRRID:SCR_014601PCA grafikleri, volkan grafikleri ve özet şekillerin görselleştirilmesi
GitHub (isteğe bağlı)GitHub Inc.RRID:SCR_002630Tekrarlanabilir komut dosyalarının sürüm kontrolü ve paylaşımı
HTSeq-count RNA-seq veri seti (GSE162535)NCBI Gene Expression Omnibus (GEO)RRID:SCR_005012Analizler için kullanılmış toplu RNA-seq sayım matrisi
matrixStats (R paketi)CRANRRID:SCR_016361Satır/sütun istatistiklerinin (örn. varyans) verimli hesaplanması
openxlsx (R paketi)CRANRRID:SCR_019215Sonuç tablolarının Excel formatına dışa aktarılması
İşletim sistemiMicrosoft / Apple / LinuxYokWindows 10+, macOS veya Linux desteklenir
org.Mm.eg.db (R paketi)BioconductorRRID:SCR_002815Gen kimlik eşlemesi için fare gen açıklama veritabanı
PDF görüntüleyiciHerhangi birYokÇıktı şekillerinin görüntülenmesi (PCA, ısı haritası, volkan grafikleri)
Kişisel bilgisayar veya iş istasyonuHerhangi birYokRNA-seq analizi için minimum 16 GB RAM önerilir
pheatmap (R paketi)CRANRRID:SCR_016418Gen ekspresyonu ve kümelendirme için ısı haritası görselleştirme
R İstatistik Yazılımı (sürüm ≥ 4.2)R Foundation for Statistical ComputingRRID:SCR_001905Tüm RNA-seq analizi için temel hesaplama ortamı
RColorBrewer (R paketi)CRANRRID:SCR_015742Isı haritaları ve grafikler için renk paletleri
RStudio DesktopPosit SoftwareRRID:SCR_000432Kodlama ve tekrarlanabilirlik için entegre geliştirme ortamı (IDE)
Örnek meta veri dosyası (CSV formatı)Oluşturulmuş / GEO açıklamalarıYokÖrneklerin CB, MB ve AB gruplarına bağlantısını sağlayan düzenlenmiş örnek ekleme
stringr (R paketi)CRANRRID:SCR_019195Zenginleştirme görselleştirme ve biçimlendirme için dize işleme
tibble (R paketi)CRANRRID:SCR_019186Veri çerçevesi işleme ve düzenli veri yapıları
tidyverse (R paketi paketi)CRANRRID:SCR_019186Veri manipülasyonu, dönüştürme ve görselleştirme

Kaynaklar

  1. Storm J, Craig AG. Pathogenesis of cerebral malaria—inflammation and cytoadherence. Front Cell Infect Microbiol. 2014;4:100.
  2. Hinduja S, Kunieda M. Modelling of ECM and EDM processes. CIRP Annals. 2013 Jan 1;62(2):775–97.
  3. Soares SMA, Gualberto ACM, da Costa AC, Gonçalves DA, Gameiro J. A high-fat diet protects C57BL/6 mice from Plasmodium berghei ANKA infection in an experimental malaria study. Front Trop Dis. 2023;4:1188902.
  4. Manzoni G, Try R, Guintran JO, Christiansen-Jucht C, Jacoby E, Sovannaroth S, Zhang Z, Banouvong V, Shortus MS, Reyburn R, Chanthavisouk C. Progress towards malaria elimination in the Greater Mekong Subregion: perspectives from the World Health Organization. Malaria Journal. 2024 Mar 1;23(1):64.
  5. Wang Q, Tang Y, Pan Z, Yuan Y, Zou Y, Zhang H, et al. RNA-seq-based transcriptome analysis of the anti-inflammatory effect of artesunate in early treatment of a mouse cerebral malaria model. Mol Omics. 2022;18(8):716–30.
  6. Love MI, Huber W, Anders S. Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2. Genome Biol. 2014;15(12):550.
  7. Anders S, Huber W. Differential expression analysis for sequence count data. Genome Biol. 2010;11(10):R106.
  8. Robinson MD, McCarthy DJ, Smyth GK. edgeR: a Bioconductor package for differential expression analysis of digital gene expression data. bioinformatics. 2010 Jan 1;26(1):139-40.
  9. McCarthy DJ, Chen Y, Smyth GK. Differential expression analysis of multifactor RNA-Seq experiments with respect to biological variation. Nucleic Acids Res. 2012;40(10):4288–97.
  10. Conesa A, Madrigal P, Tarazona S, Gomez-Cabrero D, Cervera A, McPherson A, et al. A survey of best practices for RNA-seq data analysis. Genome Biol. 2016;17:13.
  11. Yu G, Wang LG, Han Y, He QY. clusterProfiler: an R package for comparing biological themes among gene clusters. OMICS. 2012;16(5):284–7.
  12. Hänzelmann S, Castelo R, Guinney J. GSVA: gene set variation analysis for microarray and RNA-seq data. BMC Bioinformatics. 2013 Jan 16;14(1):7.
  13. Shen-Orr SS, Gaujoux R. Computational deconvolution: extracting cell type–specific information from heterogeneous samples. Curr Opin Immunol. 2013;25(5):571–8.
  14. Subramanian A, Tamayo P, Mootha VK, Mukherjee S, Ebert BL, Gillette MA, et al. Gene set enrichment analysis: a knowledge-based approach for interpreting genome-wide expression profiles. Proc Natl Acad Sci U S A. 2005;102(43):15545–50.
  15. Stark R, Grzelak M, Hadfield J. RNA sequencing: the teenage years. Nat Rev Genet. 2019;20(11):631–56.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

İmmünoloji ve EnfeksiyonSayı 233Sayı 233Boş DeğerSayıToplu RNA dizilemeTranskriptomik analiznöroinflamasyonArtesunat tedavisiDiferansiyel gen ekspresyonuİmmün yolak profilleme

Bu makale yayımlandı

Video yakında

Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.