$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Caenorhabditis elegans ile ilgili tüm deneyler, Pekin Normal Üniversitesi'nde laboratuvar organizmalarının bakımı ve kullanımı için kurumsal yönergelere uygun olarak gerçekleştirilmiştir.
Şekil 1: C. elegans'ta CRISPR/Cas9 aracılı endojen floresan etiketlemenin genel görünümü. Endojen floresan knock-in üretimi ve doğrulamasının ana aşamalarını gösteren şematik iş akışı. Tasarım ve yapım aşamasında, germ hattı ile zenginleştirilmiş hedef gen ve yerleştirme noktası seçilir, pDD162 Cas9 ve rehber RNA ekspresyonu için CRISPR/Cas99 plazmid olarak kullanılır ve pPD95.75, floresan etiket (örneğin, GFP) ile sol ve sağ homoloji kollarının subklonlandığı donör omurga olarak kullanılır. Mikroenjeksiyon aşamasında, CRISPR/Cas9 enjeksiyon karışımı (gRNA/Cas9 plazmidi, donör şablonu ve eş-enjeksiyon belirteçleri dahil) genç yetişkin hermafroditlerin gonadına gönderilir ve ardından tohumlanmış plakalarda geri kazanma işlemi yapılır. Doğrulama aşamasında, işaretleyici-pozitif nesller sonraki genotipleme için seçilir; bunlar arasında knock-in olaylarının PCR tabanlı tanımlanması ve DNA dizileme ile doğrulaması dahil, başarılı knock-in hatları daha sonra floresans mikroskopisiyle incelenerek etiketlenmiş proteinin germline ekspresyonunu ve subhücre lokalizasyonunu değerlendirir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
1. Germ hattıyla zenginleştirilmiş bir hedef gen seçin
- Gonad veya germ hücrelerde baskın ekspresyona sahip aday genleri kamu veri tabanları ve yayımlanmış literatür kullanarak belirlemek.
- Protein özelliklerine göre uygun bir etiketleme sitesi seçin. Seçilen izoform ve etiket yerleştirme pozisyonu için aşağı akış rehber RNA ve donör şablon tasarımı için kaydedin (Şekil 1).
2. Rehber RNA ve donör şablonunu tasarlayın
- Protospacer komşu motifin (PAM; NGG), Cas9 tanıma için gereken diziyi ve mümkün olduğunca hedef etiket yerleştirme yerine yakın konumlandırır.
- Aday gRNA'ları C . elegans genomu seçilmiş çevrimiçi bir tasarım aracı (örneğin IDT CRISPR tasarım aracı) kullanarak değerlendirin. Güçlü tahmini hedefte kesim verimliliği olan ve yüksek riskli tahmini hedef dışı alanlar olmayan bir rehber seçin.
- GRNA dizisini CRISPR ekspresyon plazmid omurgasında U6 promotoru ile gRNA iskeleti arasındaki bölgeye klonlayın.
NOT: gRNA dizisini taşlık olarak içeren primerler tasarla. PCR amplifikasyonu ve ardından homolog rekombinasyon tabanlı montaj uygulayın; bu, kısıtlama enzimi sindirimini ortadan kaldıran ve doğrudan ifadevektörüne tek adımlı klonlama imkanı sağlayan ligasyondan bağımsız bir klonlama yöntemidir.
- Sanger dizileme ile doğru yerleştirmeyi onaylayın.
- Donör plazmidini, hedef lokusundan türetilen yaklaşık 1.000 bp sol ve 1.000 bp sağ homoloji kollarıyla çevrili floresan bir etiket kullanarak inşa edin.
NOT: Proteinaz K sindirimiyle solucan lizat olarak hazırlanan N2 genomik DNA'sından homoloji kollarını güçlendirin. Linearize vektör ve floresan etiketle 15–20 bp örtüşmelere sahip primerler tasarlar. Homoloji kollarını birleştirin ve tek bir reaksiyonda homolog rekombinasyonla omurga etiketi ekleyin. Floresan etiketi, N-terminal etiketleme için ATG başlangıç kodonundan hemen sonra veya C-terminal etiketleme için stop kodonundan önce yerleştirin. Doğru protein katlanmasını ve işlevini korumak için hedef gen ile floresan etiket arasında bir linker dizisi ekleyin. Füzyon partnerleri arasındaki sterik paraziti azaltmak için linkeri kullanın ve hem linker hem de etiketin kodlama dizisiyle birlikte çerçeveye yerleştirildiğinden emin olun. Bilinen veya tahmin edilen fonksiyonel alanların, sinyal peptidlerin veya transmembran bölgelerin bozulmamasını önlemek için yerleştirme yerini dikkatlice seçin (Ek Dosya 1).
- Donör homolog şablon dizisine sessiz ikameler ekleyerek PAM veya rehber bağlanma dizisini protein dizisini değiştirmeden bozmak ve entegrasyondan sonra Cas9'un yeniden kesilmesini önlemek için sessiz ikameler ekleyin.
NOT: PAM bölgesindeki kodonları hedefleyen homoloji-kol amplifikasyonu için kullanılan primerlere eşanlamlı nokta mutasyonları dahil edin.
- Sanger dizileme ile hem homoloji kolları hem de etiket birleşimleri boyunca donör dizisi bütünlüğünü doğrulayın.
NOT: Doğrulanmış plazmidleri kısa süreli depolama için −20 °C'de veya uzun süreli depolama için −80 °C'de saklayın.
3. Enjeksiyon karışımını hazırlayın
- Enjeksiyon karışımını, CRISPR ekspresyon plazmidi, donör plazmid (pPD95.75 temelinde üretilmiş) ve steril ddH₂O'daki ko-enjeksiyon belirteçlerini birleştirerek Tablo 1'de listelenen konsantrasyonlarda 10 μL nihai hacme ulaşarak birleştirin.
NOT: Konsantrasyonları ampirik olarak optimize ederek belirteç okunabilirliği, aday iyileşme ve enjeksiyon sonrası hayatta kalma dengesini sağlamak.
- Enjeksiyon karışımını 10.000 × g. boyunca 10–20 dakika boyunca santrifüjlenerek pellet parçacık parçacıkları ile mikroenjeksiyon kapiler tıkanmasını önleyin.
| Bileşen | Fonksiyon | Çalışma yoğunluğu (ng/μL) |
| pDD162 | CRISPR/Cas9 plazmidi (Cas9 ve gRNA ekspresyonu) | 50-100 |
| Donör plazmid (pPD95.75 omurga) | ~1 kb homoloji kollarıyla çevrili floresan etiket taşıyan HDR donör şablonu | 50-100 |
| pRF4 | Eşenjeksiyon işaretleyicisi (Roller fenotipi) | 50-100 |
| pPD122.11 | Eşenjeksiyon belirteci (GFP ifadesi) | 5-10 |
| Steril ddH2O | Son cilde getir | – |
Tablo 1: Enjeksiyon karışımı bileşimi ve plazmid fonksiyonları. Enjeksiyon karışımı, belirtilen konsantrasyonlarda CRISPR ekspresyon plazmidi, donör plazmidi, pRF4 ve pPD122.11 içerir ve toplam hacim 10 μL'dir.
4. Enjeksiyon iğnesini yükleyin ve hazırlayın
- Cam kapillyarları, gonadal enjeksiyona uygun keskin uçlu uzun bir konik iğne üretmek üzere yapılandırılmış bir iğne çekicisi kullanarak mikroenjeksiyon iğnelerine çekin.
NOT: Çekici parametreleri ampirik olarak optimize edilsin. Başlangıç parametrelerine örnek: ısı = 540, çekme = 20, hız = 100.
DIKKAT: Delme yaralanmalarını önlemek için çekilen iğneleri dikkatlice kullanın. İğneleri tutarken pens kullanın ve kullanılmış iğneleri bir keskin kapta atın.
- Bir mikrokapiller pipeti ısıtıp ikiye bölerek bir yükleme aracı oluşturun.
NOT: Alternatif olarak ticari yükleme uçları kullanılabilir.
- Kısaltılmış mikrokapiler pipetin geniş ucuna bir kauçuk aspiratör ampulünü takın.
- Yaklaşık 1 μL derleşik enjeksiyon karışımı süpernatantını yükleyiciye aspire edin.
NOT: Kesin hacim kritik değildir. Çözeltinin iğne ucunu doldurduğundan emin olun.
- Yükleyiciyi enjeksiyon iğnesinin arka ucuna yerleştirin ve enjeksiyon karışımını nazikçe dağıtın.
- Yüklü iğneyi yatay olarak 10 dakika boyunca yerleştirin, böylece çözelti ucuna doğru yerleşir ve sürekli bir sütun olur.
- İğneyi enjeksiyon mikroskobuna monte edin ve ucu parlak alan optikleriyle netleştirmek için kullanın.
- İğne ucunu halokarbon yağı ile koruyucu bir kapak kenarıyla nazikçe temas ederek açın ve test akışını yapın.
NOT: Enjeksiyon basıncını (30–80 psi) ayarlayarak yaklaşık 1 s16 içinde gonat çapına eşit bir baloncuk oluşturun.
5. Solucanları enjeksiyon için hazırlayın
NOT: Daha önce açıklandığı gibi Nematod Büyüme Ortamı (NGM) plakaları ve M9 tamponuhazırlanın 17. Escherichia coli OP50 (bundan sonra OP50) tohumlanmış plakalarda solucanlar bulundurun ve N2 arka planında enjeksiyonlar yapın.
- Sağlıklı bir plakadan L4 hermafroditleri seçip 20 °C'de 10 saat kuluçka yapın, böylece iyi gelişmiş germ hatlarına sahip genç yetişkinler elde edinin.
- Solucanları tohumlanmamış bir plakaya aktararak bakteri yayılmasını azaltın.
- Kuru %2 agaroz pedini cam bir sürgü üzerinde hazırlayın ve bir damla halokarbon yağı uygulayın.
- Kirpik tırmanı kullanarak agarose pedine bir solucan aktarın.
- Solucanı hareketsizleştirin ve gonadı enjeksiyon için yönlendirin.
DIKKAT: Kurumayı önlemek için 20–30 dakika içinde enjeksiyonları tamamlayın.
6. Gonadal mikroenjeksiyon yapın
Şekil 2: Genç yetişkin C. eleganshermafroditlerinde mikroenjeksiyon için distal gonad syncytium'un lokalizasyonu. (A) Monte edilmiş genç yetişkin hermafroditin düşük büyütmeli parlak alan görüntüsü. Her iki gonad kolu da görünür; Enjeksiyon bölgesi bir kol (ok) için temsil edilebilir. Kutulu bölge, panel B'de daha yüksek büyütmede gösterilen alanı işaretler. (B) Panel A'daki kutulu bölgeye karşılık gelen distal gonadın yüksek büyütmeli DIC görünümü. Ok, enjeksiyon karışımının verildiği distal gonadal sinsityum içindeki enjeksiyon pozisyonunu gösterir. Ölçek çubukları: 100 μm (A) ve 20 μm (B). Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
- Hareketsiz bir solucanı bulun ve düşük büyütme hedefiyle gonadı tanımlayın.
- İğneyi mikromanipülatör kontrolleri kullanarak konumlandırın.
- Solucanı iğneye göre 20–40° açı ile yönlendirin.
- Daha yüksek büyütme kullanarak distal germline odaklanın.
- Solucanı iğneye doğru ilerletin ve ucunu gonadal sinsityumun içine yerleştirin (Şekil 2).
- Çözeltiyi enjekte edin ve görünür gonad şişmesiyle doğumu doğrulayın.
NOT: Enjeksiyon basıncını (30–80 psi), telafi basıncını (0,1–0,5 psi) ve enjeksiyon süresini (0,1–0,3 s) optimize edin.
DIKKAT: Aşırı basınç veya hacim solucanın yırtılmasına neden olabilir.
- İğneyi çekip sonraki enjeksiyonlar için yeniden konumlandırın.
NOT: Hayatta kalmayı en üst düzeye çıkarmak için tek taraflı enjeksiyon veya düzenleme verimliliğini artırmak için çift taraflı enjeksiyon yapın.
- Solucanları serbest bırakmak için M9 tamponu ekleyin ve her solucanı ayrı bir kurtarma plakasına aktarın.
- 20–25 solucan için enjeksiyonları tekrarlayın.
NOT: İğne tıkanırsa veya hasar görürse onu değiştirin.
- Enjekte edilen solucanları 20 °C'de 2–3 gün boyunca kuluçka için, böylece iyileşme sağlanır.
7. F1 adaylarını taramak için knock-in-pozitif çizgileri tespit edin
- F1 yavrularını ko-enjeksiyon belirteçleri için taramak ve marker-pozitif hayvanları seçmek.
NOT: Farklı doku özgüllüğü ve spektral özelliklere sahip alternatif floresan eş-enjeksiyon belirteçleri örnekleri Ek Tablo 1'de verilmiştir.
NOT: Daha yüksek güvenilirlik için her iki belirteçiyi ifade eden hayvanları seçin. Yüksek işaret sıklığına sahip yavrular ("jackpot yavruları") önceliklendirin.
- Her F1 solucanını tek bir tabakaya aktarın ve 1–2 gün boyunca yumurtlamasına izin verin.
- Her F1 solucanını proteinaz K tamponunda lizleyerek PCR şablonları hazırlanır.
NOT: Lizatları hemen işlemezse −80 °C'de sakla.
- Homoloji kolunun dışında bir genomik primer ve bir dahili etiket primer kullanarak birleşim PCR yapın.
NOT: PCR-pozitif F1 hayvanlardan ilgili plakaları kalın.
8. F2 yavrusunu taramak için homozigot knock-in hatlarını izole etmek ve entegrasyonu doğrulamak
- PCR-pozitif F1 çizgilerinden F2 koyunları bireysel plakalara izole edilir.
- F2 solucanlarının soy üretmesine izin verin ve genotipleme için yetişkinleri lizleyin.
NOT: Gerekirse lizatları −20 °C'de sakla.
- Homoloji kollarının yanındaki primerlerle ürün boyutuna göre vahşi tip ve knock-in allelleri ayırt etmek için PCR yapın.
- Her iki yerleştirme birleşiminde Sanger dizileme ile doğru entegrasyonu doğrulayın.
- Floresan mikroskopisiyle germline floresans ifadesi ve lokalizasyonunu doğrulayın.
- Onaylanmış homozigot hatları genişletin ve stokları koruyun.
NOT: Cryopreserve uzun süreli depolama için doğrulanmış hatlar.