Caenorhabditis elegans germ hattında endogen floresan etiketleme için CRISPR/Cas9 mikroenjeksiyon iş akışı, in vivo protein lokalizasyon analizi için homozigot knock-in çizgileri elde etmek.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Caenorhabditis elegans'ta CRISPR/Cas9 aracılı Endojen Floresan Etiketleme Germline-Spesifik Genlerin
* These authors contributed equally
Bu makalede
Özet
Özet
Caenorhabditis elegans (C. elegans) germ hattındaki protein lokalizasyonu, gametogenez sırasında gen fonksiyonunun yorumlanmasında merkeze girerken, geleneksel transgen yaklaşımları genellikle değişken ifadeler sağlar ve germ hücrelerde susturulabilir. Burada, floresan etiketi endogen lokusa yerleştiren pratik bir CRISPR/Cas9 iş akışı anlatılır; bu da doğal düzenleme altında protein dağılımını bildiren kararlı knock-in allellerin oluşturulmasını sağlar. Protokol, prosedürün temel aşamalarını kapsar: hedef proteine uygun bir etiketleme stratejisinin seçilmesi, genç yetişkin hermafroditlere gonadal mikroenjeksiyonla CRISPR reaktiflerinin iletilmesi ve enjekte edilen hayvanların tarama için kurtarılması. Knock-in adayları, homozigot solucanları izole etmek ve düzenlenmiş allelin doğrulanması için iki nesil boyunca PCR tabanlı genotipleme yoluyla tanımlanır. Son olarak, germ hattı floresansını doğrulamak ve subhücre lokalizasyonunu in vivo değerlendirmek için konfokal mikroskopi kullanılır. İş akışı, tekrarlanabilir ve germ hattı zenginleştirilmiş genlere geniş çapta uygulanabilir olacak şekilde tasarlanmıştır; bu da gelişimsel ve hücre-biyolojik analizler için homozigot etiketli suşların oluşturulmasını kolaylaştırır.
Giriş
Caenorhabditis elegans (C. elegans), kısa yaşam döngüsü, şeffaf gövdesi ve yüksek genetik yönetilebilirliği nedeniyle üreme gelişimi ve gametogenezi incelemek için iyi kurulmuş birmodeldir. C. elegans esas olarak kendi kendine döllenen hermafroditler olarak bulunur; onların gonadları önce spermatogeneze geçer, sonra ise oogenez'e geçer. Bu üreme modu, suş bakımını kolaylaştırır ve homozigothatlar 2'yi elde etmeyi kolaylaştırır. Son zamanlarda yapılan mekansal transkriptomikler, genlerde zenginleşen genlerin listesini önemli ölçüde genişletmiş ve C. elegans 3'te üreme sisteminde belirgin cinsiyete özgü ifade kalıpları ortaya çıkarmıştır. Daha yakın zamanda, tek hücreli RNA dizileme, germ hücre gelişim yörüngelerinin yeniden inşasını vespermatogenezi yöneten gen düzenleyici ağlarının çıkarımını mümkün kılmıştır 4. Bu veri setleri birlikte zengin aday listeler oluşturur, ancak fonksiyonel yorumlama genellikle protein davranışını in vivo gözlemlemeyi gerektirir—özellikle, ilgili proteinlerin ne zaman ve nerede lokalize olduğunu ve germ hattı gelişimi boyunca desenlerinin nasıl değiştiğini tanımlamak.
C. elegans'ta geleneksel transgenez, genellikle plazmid DNA'sının gonadal mikroenjeksiyonuna dayanır ve bu da çok kopyalı ekstrakromozom dizilerini kolaycaüretir 5. Ancak, germ hattında, bu diziler genellikle sağlam bir şekilde susturulur; bu mekanizmanın tekrarlayan DNA'dan ifadeyi kısıtlayarak germline bütünlüğünü korumaya yardımcı olduğu düşünülür; böylece germline fonksiyonu ve genetik bilginin nesil boyunca istikrarınıkorur 6,7. Sonuç olarak, somatik dokularda kolayca ifade edilen transgen ifade yapıları germ hattında zayıf veya tutarsız olabilir. İfade tespit edilebilir olsa bile, kopya sayı etkileri ve mühendislik edilmiş düzenleyici unsurlar protein dozunu ve zamanlamasını değiştirebilir, bu da doğal lokalizasyon ve dinamiklerle ilgili sonuçları karıştırabilir. Bu sınırlamaları gidermek için, mikroparçacık bombardımanı ve Mos1 aracılı Tek Kopya Yerleştirme (MosSCI), düşük/tek kopya entegre transgenikçizgiler 8,9,10 oluşturmak için yaygın olarak kullanılır. Bu yaklaşımlar germ hattında ekspresyonu artırabilir, ancak maliyet, verimlilik ve endogen düzenlemeyi ne kadar iyi ürettikleri açısından farklılık gösterirler. CRISPR/Cas9 genom düzenlemesi, homoloji yönlendirilmiş onarım yoluyla endogen lokusa floresan etiket yerleştirerek daha doğrudan bir yol sunar; böylece doğal düzenleyici kontrol altında protein lokalizasyonu ve dinamiklerini bildiren stabil knock-in allellerüretir.
Burada, C. elegans'ta CRISPR/Cas9 aracılı endogen floresan etiketleme için pratik bir iş akışı tanımlanır ve bildirilen germ hattı ile zenginleştirilmiş ekspresyon desenlerine göre seçilen genlere uygulanır. Protokol, hedef seçimi, donör şablonu ve rehber RNA tasarımını, gonadal mikroenjeksiyonu ve homozigot knock-in çizgilerini izole etmek için sonraki taramayı ve genotipleme ile doğrulamayı özetlemektedir. Bu yaklaşım, gelişim evreleri boyunca germline bağlı genler için geniş çapta uygulanabilir ve in vivo protein lokalizasyonu ve dinamiklerinin nicel analizlerini mümkün kılar. Bu iş akışı, tohum hattında ifade edilen genlerin etiketlenmesi ve protein lokalizasyonu ile dinamiklerinin in vivo olarak doğal düzenleyici kontrol altında analiz edilmesi için pratik bir strateji sunar.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Caenorhabditis elegans ile ilgili tüm deneyler, Pekin Normal Üniversitesi'nde laboratuvar organizmalarının bakımı ve kullanımı için kurumsal yönergelere uygun olarak gerçekleştirilmiştir.
Şekil 1: C. elegans'ta CRISPR/Cas9 aracılı endojen floresan etiketlemenin genel görünümü. Endojen floresan knock-in üretimi ve doğrulamasının ana aşamalarını gösteren şematik iş akışı. Tasarım ve yapım aşamasında, germ hattı ile zenginleştirilmiş hedef gen ve yerleştirme noktası seçilir, pDD162 Cas9 ve rehber RNA ekspresyonu için CRISPR/Cas99 plazmid olarak kullanılır ve pPD95.75, floresan etiket (örneğin, GFP) ile sol ve sağ homoloji kollarının subklonlandığı donör omurga olarak kullanılır. Mikroenjeksiyon aşamasında, CRISPR/Cas9 enjeksiyon karışımı (gRNA/Cas9 plazmidi, donör şablonu ve eş-enjeksiyon belirteçleri dahil) genç yetişkin hermafroditlerin gonadına gönderilir ve ardından tohumlanmış plakalarda geri kazanma işlemi yapılır. Doğrulama aşamasında, işaretleyici-pozitif nesller sonraki genotipleme için seçilir; bunlar arasında knock-in olaylarının PCR tabanlı tanımlanması ve DNA dizileme ile doğrulaması dahil, başarılı knock-in hatları daha sonra floresans mikroskopisiyle incelenerek etiketlenmiş proteinin germline ekspresyonunu ve subhücre lokalizasyonunu değerlendirir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
1. Germ hattıyla zenginleştirilmiş bir hedef gen seçin
- Gonad veya germ hücrelerde baskın ekspresyona sahip aday genleri kamu veri tabanları ve yayımlanmış literatür kullanarak belirlemek.
- Protein özelliklerine göre uygun bir etiketleme sitesi seçin. Seçilen izoform ve etiket yerleştirme pozisyonu için aşağı akış rehber RNA ve donör şablon tasarımı için kaydedin (Şekil 1).
2. Rehber RNA ve donör şablonunu tasarlayın
- Protospacer komşu motifin (PAM; NGG), Cas9 tanıma için gereken diziyi ve mümkün olduğunca hedef etiket yerleştirme yerine yakın konumlandırır.
- Aday gRNA'ları C . elegans genomu seçilmiş çevrimiçi bir tasarım aracı (örneğin IDT CRISPR tasarım aracı) kullanarak değerlendirin. Güçlü tahmini hedefte kesim verimliliği olan ve yüksek riskli tahmini hedef dışı alanlar olmayan bir rehber seçin.
- GRNA dizisini CRISPR ekspresyon plazmid omurgasında U6 promotoru ile gRNA iskeleti arasındaki bölgeye klonlayın.
NOT: gRNA dizisini taşlık olarak içeren primerler tasarla. PCR amplifikasyonu ve ardından homolog rekombinasyon tabanlı montaj uygulayın; bu, kısıtlama enzimi sindirimini ortadan kaldıran ve doğrudan ifadevektörüne tek adımlı klonlama imkanı sağlayan ligasyondan bağımsız bir klonlama yöntemidir. - Sanger dizileme ile doğru yerleştirmeyi onaylayın.
- Donör plazmidini, hedef lokusundan türetilen yaklaşık 1.000 bp sol ve 1.000 bp sağ homoloji kollarıyla çevrili floresan bir etiket kullanarak inşa edin.
NOT: Proteinaz K sindirimiyle solucan lizat olarak hazırlanan N2 genomik DNA'sından homoloji kollarını güçlendirin. Linearize vektör ve floresan etiketle 15–20 bp örtüşmelere sahip primerler tasarlar. Homoloji kollarını birleştirin ve tek bir reaksiyonda homolog rekombinasyonla omurga etiketi ekleyin. Floresan etiketi, N-terminal etiketleme için ATG başlangıç kodonundan hemen sonra veya C-terminal etiketleme için stop kodonundan önce yerleştirin. Doğru protein katlanmasını ve işlevini korumak için hedef gen ile floresan etiket arasında bir linker dizisi ekleyin. Füzyon partnerleri arasındaki sterik paraziti azaltmak için linkeri kullanın ve hem linker hem de etiketin kodlama dizisiyle birlikte çerçeveye yerleştirildiğinden emin olun. Bilinen veya tahmin edilen fonksiyonel alanların, sinyal peptidlerin veya transmembran bölgelerin bozulmamasını önlemek için yerleştirme yerini dikkatlice seçin (Ek Dosya 1). - Donör homolog şablon dizisine sessiz ikameler ekleyerek PAM veya rehber bağlanma dizisini protein dizisini değiştirmeden bozmak ve entegrasyondan sonra Cas9'un yeniden kesilmesini önlemek için sessiz ikameler ekleyin.
NOT: PAM bölgesindeki kodonları hedefleyen homoloji-kol amplifikasyonu için kullanılan primerlere eşanlamlı nokta mutasyonları dahil edin. - Sanger dizileme ile hem homoloji kolları hem de etiket birleşimleri boyunca donör dizisi bütünlüğünü doğrulayın.
NOT: Doğrulanmış plazmidleri kısa süreli depolama için −20 °C'de veya uzun süreli depolama için −80 °C'de saklayın.
3. Enjeksiyon karışımını hazırlayın
- Enjeksiyon karışımını, CRISPR ekspresyon plazmidi, donör plazmid (pPD95.75 temelinde üretilmiş) ve steril ddH₂O'daki ko-enjeksiyon belirteçlerini birleştirerek Tablo 1'de listelenen konsantrasyonlarda 10 μL nihai hacme ulaşarak birleştirin.
NOT: Konsantrasyonları ampirik olarak optimize ederek belirteç okunabilirliği, aday iyileşme ve enjeksiyon sonrası hayatta kalma dengesini sağlamak. - Enjeksiyon karışımını 10.000 × g. boyunca 10–20 dakika boyunca santrifüjlenerek pellet parçacık parçacıkları ile mikroenjeksiyon kapiler tıkanmasını önleyin.
| Bileşen | Fonksiyon | Çalışma yoğunluğu (ng/μL) |
| pDD162 | CRISPR/Cas9 plazmidi (Cas9 ve gRNA ekspresyonu) | 50-100 |
| Donör plazmid (pPD95.75 omurga) | ~1 kb homoloji kollarıyla çevrili floresan etiket taşıyan HDR donör şablonu | 50-100 |
| pRF4 | Eşenjeksiyon işaretleyicisi (Roller fenotipi) | 50-100 |
| pPD122.11 | Eşenjeksiyon belirteci (GFP ifadesi) | 5-10 |
| Steril ddH2O | Son cilde getir | – |
Tablo 1: Enjeksiyon karışımı bileşimi ve plazmid fonksiyonları. Enjeksiyon karışımı, belirtilen konsantrasyonlarda CRISPR ekspresyon plazmidi, donör plazmidi, pRF4 ve pPD122.11 içerir ve toplam hacim 10 μL'dir.
4. Enjeksiyon iğnesini yükleyin ve hazırlayın
- Cam kapillyarları, gonadal enjeksiyona uygun keskin uçlu uzun bir konik iğne üretmek üzere yapılandırılmış bir iğne çekicisi kullanarak mikroenjeksiyon iğnelerine çekin.
NOT: Çekici parametreleri ampirik olarak optimize edilsin. Başlangıç parametrelerine örnek: ısı = 540, çekme = 20, hız = 100.
DIKKAT: Delme yaralanmalarını önlemek için çekilen iğneleri dikkatlice kullanın. İğneleri tutarken pens kullanın ve kullanılmış iğneleri bir keskin kapta atın. - Bir mikrokapiller pipeti ısıtıp ikiye bölerek bir yükleme aracı oluşturun.
NOT: Alternatif olarak ticari yükleme uçları kullanılabilir. - Kısaltılmış mikrokapiler pipetin geniş ucuna bir kauçuk aspiratör ampulünü takın.
- Yaklaşık 1 μL derleşik enjeksiyon karışımı süpernatantını yükleyiciye aspire edin.
NOT: Kesin hacim kritik değildir. Çözeltinin iğne ucunu doldurduğundan emin olun. - Yükleyiciyi enjeksiyon iğnesinin arka ucuna yerleştirin ve enjeksiyon karışımını nazikçe dağıtın.
- Yüklü iğneyi yatay olarak 10 dakika boyunca yerleştirin, böylece çözelti ucuna doğru yerleşir ve sürekli bir sütun olur.
- İğneyi enjeksiyon mikroskobuna monte edin ve ucu parlak alan optikleriyle netleştirmek için kullanın.
- İğne ucunu halokarbon yağı ile koruyucu bir kapak kenarıyla nazikçe temas ederek açın ve test akışını yapın.
NOT: Enjeksiyon basıncını (30–80 psi) ayarlayarak yaklaşık 1 s16 içinde gonat çapına eşit bir baloncuk oluşturun.
5. Solucanları enjeksiyon için hazırlayın
NOT: Daha önce açıklandığı gibi Nematod Büyüme Ortamı (NGM) plakaları ve M9 tamponuhazırlanın 17. Escherichia coli OP50 (bundan sonra OP50) tohumlanmış plakalarda solucanlar bulundurun ve N2 arka planında enjeksiyonlar yapın.
- Sağlıklı bir plakadan L4 hermafroditleri seçip 20 °C'de 10 saat kuluçka yapın, böylece iyi gelişmiş germ hatlarına sahip genç yetişkinler elde edinin.
- Solucanları tohumlanmamış bir plakaya aktararak bakteri yayılmasını azaltın.
- Kuru %2 agaroz pedini cam bir sürgü üzerinde hazırlayın ve bir damla halokarbon yağı uygulayın.
- Kirpik tırmanı kullanarak agarose pedine bir solucan aktarın.
- Solucanı hareketsizleştirin ve gonadı enjeksiyon için yönlendirin.
DIKKAT: Kurumayı önlemek için 20–30 dakika içinde enjeksiyonları tamamlayın.
6. Gonadal mikroenjeksiyon yapın
Şekil 2: Genç yetişkin C. eleganshermafroditlerinde mikroenjeksiyon için distal gonad syncytium'un lokalizasyonu. (A) Monte edilmiş genç yetişkin hermafroditin düşük büyütmeli parlak alan görüntüsü. Her iki gonad kolu da görünür; Enjeksiyon bölgesi bir kol (ok) için temsil edilebilir. Kutulu bölge, panel B'de daha yüksek büyütmede gösterilen alanı işaretler. (B) Panel A'daki kutulu bölgeye karşılık gelen distal gonadın yüksek büyütmeli DIC görünümü. Ok, enjeksiyon karışımının verildiği distal gonadal sinsityum içindeki enjeksiyon pozisyonunu gösterir. Ölçek çubukları: 100 μm (A) ve 20 μm (B). Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
- Hareketsiz bir solucanı bulun ve düşük büyütme hedefiyle gonadı tanımlayın.
- İğneyi mikromanipülatör kontrolleri kullanarak konumlandırın.
- Solucanı iğneye göre 20–40° açı ile yönlendirin.
- Daha yüksek büyütme kullanarak distal germline odaklanın.
- Solucanı iğneye doğru ilerletin ve ucunu gonadal sinsityumun içine yerleştirin (Şekil 2).
- Çözeltiyi enjekte edin ve görünür gonad şişmesiyle doğumu doğrulayın.
NOT: Enjeksiyon basıncını (30–80 psi), telafi basıncını (0,1–0,5 psi) ve enjeksiyon süresini (0,1–0,3 s) optimize edin.
DIKKAT: Aşırı basınç veya hacim solucanın yırtılmasına neden olabilir. - İğneyi çekip sonraki enjeksiyonlar için yeniden konumlandırın.
NOT: Hayatta kalmayı en üst düzeye çıkarmak için tek taraflı enjeksiyon veya düzenleme verimliliğini artırmak için çift taraflı enjeksiyon yapın. - Solucanları serbest bırakmak için M9 tamponu ekleyin ve her solucanı ayrı bir kurtarma plakasına aktarın.
- 20–25 solucan için enjeksiyonları tekrarlayın.
NOT: İğne tıkanırsa veya hasar görürse onu değiştirin. - Enjekte edilen solucanları 20 °C'de 2–3 gün boyunca kuluçka için, böylece iyileşme sağlanır.
7. F1 adaylarını taramak için knock-in-pozitif çizgileri tespit edin
- F1 yavrularını ko-enjeksiyon belirteçleri için taramak ve marker-pozitif hayvanları seçmek.
NOT: Farklı doku özgüllüğü ve spektral özelliklere sahip alternatif floresan eş-enjeksiyon belirteçleri örnekleri Ek Tablo 1'de verilmiştir.
NOT: Daha yüksek güvenilirlik için her iki belirteçiyi ifade eden hayvanları seçin. Yüksek işaret sıklığına sahip yavrular ("jackpot yavruları") önceliklendirin. - Her F1 solucanını tek bir tabakaya aktarın ve 1–2 gün boyunca yumurtlamasına izin verin.
- Her F1 solucanını proteinaz K tamponunda lizleyerek PCR şablonları hazırlanır.
NOT: Lizatları hemen işlemezse −80 °C'de sakla. - Homoloji kolunun dışında bir genomik primer ve bir dahili etiket primer kullanarak birleşim PCR yapın.
NOT: PCR-pozitif F1 hayvanlardan ilgili plakaları kalın.
8. F2 yavrusunu taramak için homozigot knock-in hatlarını izole etmek ve entegrasyonu doğrulamak
- PCR-pozitif F1 çizgilerinden F2 koyunları bireysel plakalara izole edilir.
- F2 solucanlarının soy üretmesine izin verin ve genotipleme için yetişkinleri lizleyin.
NOT: Gerekirse lizatları −20 °C'de sakla. - Homoloji kollarının yanındaki primerlerle ürün boyutuna göre vahşi tip ve knock-in allelleri ayırt etmek için PCR yapın.
- Her iki yerleştirme birleşiminde Sanger dizileme ile doğru entegrasyonu doğrulayın.
- Floresan mikroskopisiyle germline floresans ifadesi ve lokalizasyonunu doğrulayın.
- Onaylanmış homozigot hatları genişletin ve stokları koruyun.
NOT: Cryopreserve uzun süreli depolama için doğrulanmış hatlar.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Protokole uygun olarak, genç yetişkin hermafroditlere CRISPR/Cas9 plazmidi (pDD162), yaklaşık 1 kb homoloji kolları (pPD95.75) ile çevrili GFP knock-in etiketi kodlayan plazmid donörü ve ko-enjeksiyon belirteçleri (pRF4 ve pPD122.11) gonadal olarak mikroenjeksiyon yapıldı. Genetik olarak germline zenginleştirilmiş bir hedef gen, doğal düzenleyici kontrol altında protein lokalizasyonunu bildiren stabil, homozigot bir knock-in allel oluşturmak için örnek olarak kullanıldı.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Bu iş akışı, doğal düzenleyici kontrol 5,6,7,8,9,10 altında protein lokalaşmasını bildirmek için endozen lokusa floresan etiket yerleştirildiği kararlı, homozigot knock-in çizgileri oluşturmak üzere tasarlanmıştır. Pratikte, başarı en iyi şekilde tek bir okuma yerine ardışık doğrulama zinciri...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.
Teşekkürler
Bu çalışma, Çin Ulusal Anahtar Araştırma ve Geliştirme Programı'ndan (2023YFA1801100 L.M.'ye), Çin Doğa Bilimleri Vakfı'ndan (32400698 P.W.'ye, 32270774 L.M.'ye kadar hibelerle desteklenmiştir.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Agar | Beijing Lablead Biotech Co., Ltd. | QZ02 | NGM agar plakalarını hazırlamak için bileşen |
| Agarose | NOVON | ZZ14011 | 2% agarose pedleri hazırlama |
| Caenorhabditis elegans suşu N2 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | Enjeksiyon arka plan suşu | |
| Santrifüj | Eppendorf | 5425 | Enjeksiyon karışımını temizle |
| Kolesterol | Beijing Chemical Reagents Company | 57-88-5 | NGM agar plakalarını hazırlamak için bileşen |
| Eş-enjeksiyon marker plazmiti rol-6 (su1006) (pRF4) | Guangshuo Ou Lab | Adayları zenginleştirmek için roller marker | |
| Konfokal mikroskop | ZEISS | LSM880 + Airyscan | GFP ekspresyonunu/lokalizasyonunu doğrula |
| Di-Potasyum hidrojen fosfat (K2HPO4) | Sinapharm | CAS: 7758-11-4 | NGM agar plakalarını hazırlamak için bileşen |
| Di-Sodyum hidrojen fosfat (Na2HPO4) | Sinapharm | CAS: 7558-79-4 | M9 tamponu hazırlamak için bileşen |
| DNA merdiven | Mei5 Biotechnology, Co., Ltd. | MF288-01 | Agarose jeller için boyut referansı |
| Donör plazmiti çerçevesi (pPD95.75) | Addgene | 1494 | HDR donör yapımı için çerçeve |
| Elektroforez Sistemi | Beijing Liuyi Biotechnology Co., Ltd. | 112-0630 | Junction taraması ve zigosite genotipi için PCR amplikonlarını agarose jeller üzerinde ayır |
| Escherichia coli OP50 suşu | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | Solucanlar için besin kaynağı | |
| Floresan eş-enjeksiyon marker plazmiti (pPD122.11) | Fire Lab | Adayları zenginleştirmek için GFP eş-marker | |
| Floresan stereomikroskop | SOPTOP | SZX12-HT | Canlı solucanları floresan eş-enjeksiyon markerları için tarala |
| GelRed Nükleik Asit Jel Boyası | Mei5 Biotechnology, Co., Ltd. | MF079-plus-01 | DNA bantlarının görselleştirilmesi |
| Cam kılcal damarlar | World Precision Instruments | 1B100F-4 | İğne çekici ile enjeksiyon iğneleri yapmak için kullanılır |
| Halocarbon yağı 700 | Sigma-Aldrich | H8898-50ML | Enjeksiyon sırasında kurumayı önle |
| İnkübator | Wuhan Ruihua Instrument & Equipment Co., Ltd. | HP400S | Solucanları standart sıcaklıkta muhafaza et |
| Magnezyum sülfat (MgSO4) | Sinapharm | CAS: 7487-88-9 | NGM agar plakalarını ve M9 tamponunu hazırlamak için bileşen |
| Mikrokapillar pipetler | KIMBLE | 71900-50 | Yükleme aracını oluşturmak için ısıtıldı ve kırpıldı |
| Mikroenjektör ünitesi | Eppendorf | FemtoJet 4i | Mikroenjeksiyon iğnesi ile distal gonada kontrollü basınç darbelerini ver (ayak pedalı tetiklenir) |
| Mikroskopik kapak camları | Fisherbrand | 12545A 22×30-1 | Mikroenjeksiyon sırasında solucanları monte etmek ve immobilize etmek için 2% agarose pedleri hazırla; Enjeksiyon iğne uçlarını kapak cam kenarına karşı aç |
| Mikroenjeksiyon için mikroskop | ZEISS | Axio Observer.A1 | Enjeksiyon mikroskop |
| İğne çekici | Sutter Instrument Company | Model P97 | Cam kılcal damarları enjeksiyon iğnelerine çek |
| PCR termosikler | Bio-Rad | C1000 Touch Thermal Cycler | PCR amplifikasyon |
| pDD162 (Peft-3::Cas9 + Boş sgRNA) | Addgene | 47549 | Cas9 + sgRNA ekspresyonu |
| Pepton | Gibco | 308723 | NGM agar plakalarını hazırlamak için bileşen |
| Potasyum dihidrojen fosfat (KH2PO4) | Sinapharm | CAS: 7778-77-0 | NGM agar plakalarını ve M9 tamponunu hazırlamak için bileşen |
| Sodyum klorür (NaCl) | Sinapharm | CAS: 7647-14-5 | NGM agar plakalarını ve M9 tamponunu hazırlamak için bileşen |
| Stereomikroskop | Motic | K400L | Agarose pedleri üzerinde solucanları seç ve monte et ve enjeksiyon sonrası kurtarma adımlarını gerçekleştir |
Kaynaklar
- Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. A transparent window into biology: a primer on Caenorhabditis elegans. Genetics. 200 (2), 387-407 (2015).
- Pazdernik, N., Schedl, T. Introduction to germ cell development in Caenorhabditis elegans. Adv Exp Med Biol. 757, 1-16 (2013).
- Ebbing, A., et al. Spatial transcriptomics of C. elegans males and hermaphrodites identifies sex-specific differences in gene expression patterns. Dev Cell. 47 (6), 801-813.e6 (2018).
- Li, L., et al. Spatiotemporal single-cell architecture of gene expression in Caenorhabditis elegans germ cells. Cell Discov. 11 (1), 26 (2025).
- Mello, C. C., Kramer, J. M., Stinchcomb, D., Ambros, V. Efficient gene transfer in C. elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences. EMBO J. 10 (12), 3959-3970 (1991).
- Kelly, W. G., Fire, A. Chromatin silencing and the maintenance of a functional germline in Caenorhabditis elegans. Development. 125 (13), 2451-2456 (1998).
- Robert, V. J., Sijen, T., van Wolfswinkel, J., Plasterk, R. H. A. Chromatin and RNAi factors protect the C. elegans germline against repetitive sequences. Genes Dev. 19 (7), 782-787 (2005).
- Merritt, C., Seydoux, G. Transgenic solutions for the germline. WormBook. , 1-21 (2010).
- Frøkjær-Jensen, C., et al. Single-copy insertion of transgenes in Caenorhabditis elegans. Nat Genet. 40 (11), 1375-1383 (2008).
- Vallin, E., et al. A genome-wide collection of Mos1 transposon insertion mutants for the C. elegans research community. PLoS One. 7 (2), e30482 (2012).
- Dickinson, D. J., Ward, J. D., Reiner, D. J., Goldstein, B. Engineering the Caenorhabditis elegans genome using Cas9-triggered homologous recombination. Nat Methods. 10 (10), 1028-1034 (2013).
- Friedland, A. E., et al. Heritable genome editing in C. elegans via a CRISPR-Cas9 system. Nat Methods. 10 (8), 741-743 (2013).
- Nance, J., Frøkjær-Jensen, C. The Caenorhabditis elegans transgenic toolbox. Genetics. 212 (4), 959-990 (2019).
- Wang, P., et al. Protocol for CRISPR-Cas9-mediated genome editing to study spermatogenesis in Caenorhabditis elegans. STAR Protoc. 4 (4), 102720 (2023).
- Khan, A. A., et al. A highly efficient ligation-independent cloning system for CRISPR/Cas9-based genome editing in plants. Plant Methods. 13, 86 (2017).
- Ghanta, K. S., Ishidate, T., Mello, C. C. Microinjection for precision genome editing in Caenorhabditis elegans. STAR Protoc. 2 (3), 100748 (2021).
- Rieckher, M., Tavernarakis, N. Caenorhabditis elegans microinjection. Bio Protoc. 7 (19), e2584 (2017).
- Medley, J. C., Hebbar, S., Sydzyik, J. T., Zinovyeva, A. Y. Single nucleotide substitutions effectively block Cas9 and allow for scarless genome editing in Caenorhabditis elegans. Genetics. 220 (1), iyab199 (2022).
- Berkowitz, L. A., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Generation of stable transgenic C. elegans using microinjection. J Vis Exp. (18), e833 (2008).
- Shaner, N. C., et al. A bright monomeric green fluorescent protein derived from Branchiostoma lanceolatum. Nat Methods. 10 (5), 407-409 (2013).
- Bajar, B. T., et al. Improving brightness and photostability of green and red fluorescent proteins for live cell imaging and FRET reporting. Sci Rep. 6, 20889 (2016).
- Bindels, D. S., et al. mScarlet: a bright monomeric red fluorescent protein for cellular imaging. Nat Methods. 14 (1), 53-56 (2017).
- He, S., Cuentas-Condori, A., Miller, D. M. NATF (native and tissue-specific fluorescence): a strategy for bright, tissue-specific GFP labeling of native proteins in Caenorhabditis elegans. Genetics. 212 (2), 387-395 (2019).
- Paix, A., Folkmann, A., Seydoux, G. Precision genome editing using CRISPR-Cas9 and linear repair templates in C. elegans. Methods. 121-122, 86-93 (2017).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
