Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Araştırma makalesi

SPRY2 ve miR-590-5p İfadesinin İnsan Osteoartrit Model Kondrositlerinde Otofaji Üzerindeki Düzenlemesinin Etkileri

108 görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/70883

⸱

31 Temmuz 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1The First Affiliated Hospital of Guangxi University of Chinese Medicine, 2Guangxi University of Chinese Medicine

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

IL-1β ile indüklenen C28/I2 kondrosit modelinde inflamatuar stres, miR-590-5p'yi artırdı ve SPRY2 ekspresyonunu azalttı. Bu eksenin modülasyonu, Beclin-1, LC3-II ve Bcl-2'nin ekspresyonu değişti; bu da osteoartritte otofaji ile ilişkili yanıtları ve kondrositlerin hayatta kalma durumunu etkileyebilecek varsayılan miR-590-5p/SPRY2 düzenleyici yolunun olduğunu düşündürdü.

Özet

Osteoartrit (OA), ilerleyici kıkırdak tahribatı ve kondrosit homeostazının kaybıyla karakterize edilen yaygın bir dejeneratif eklem hastalığıdır. Düzensiz otofaji OA patogenezine katkıda bulunsa da, kondrositlerde otofaji ile ilişkili yanıtları yöneten moleküler mekanizmalar henüz tam olarak anlaşılmamıştır. Bu çalışma, IL-1β indüklenmiş C28/I2 insan kondrositleri kullanılarak inflamatuar OA mikroortamında miR-590-5p/SPRY2 düzenleyici ekseninin rolünü araştırmıştır. C28/I2 hücrelerinin IL-1β ile işlenmesiyle in vitro OA modeli oluşturuldu. miR-590-5p ve SPRY2 ekspresyonu, nicel PCR ve Western blotting kullanılarak değerlendirildi. SPRY2 ve miR-590-5p'nin otofaji ile ilişkili belirteçler Beclin-1 ve LC3-II ile hayatta kalma ile ilgili protein Bcl-2 üzerindeki etkilerini değerlendirmek için kazanç ve fonksiyon kaybı yaklaşımları kullanıldı. miR-590-5p ile SPRY2 arasındaki düzenleyici ilişkiyi incelemek için biyoinformatik analiz ve kurtarma deneyleri kullanıldı. IL-1β tedavisi, miR-590-5p ekspresyonunu anlamlı şekilde artırırken SPRY2 mRNA ve protein seviyelerini azalttı (P < 0.05). SPRY2 aşırı ekspresyonu, Beclin-1 ve LC3-II ekspresyonunu belirgin şekilde azalttı; sırasıyla yaklaşık %65 ve %77 azalma gösterdi (P < 0.05). Buna karşılık, miR-590-5p aşırı ekspresyonunu Beclin-1, LC3-II ve Bcl-2 ekspresyonunu artırdı, miR-590-5p inhibisyonu ise bu etkileri tersine çevirdi ve SPRY2 ekspresyonunu geri getirdi. Fonksiyonel analizler, SPRY2'yi miR-590-5p'nin varsayılan bir aşağı akış düzenleyici hedefi olarak destekledi. Bu bulgular, miR-590-5p/SPRY2 eksenini otofaji ile ilişkili belirteç ifadesinin ve kondrositlerin inflamatuar koşullarda hayatta kalma oranının önemli bir düzenleyicisi olarak tanımlıyor ve OA'da terapötik bir hedef olarak potansiyel önemini öne sürmektedir.

Giriş

Dünya genelinde en yaygın artrit türü olan osteoartrit (OA), ağrı, hareket kısıtlığı ve fiziksel engelliliğin başlıca nedenlerinden biri olup, sağlık sistemleri ve toplum üzerinde önemli bir yük oluşturur. Patolojik olarak, OA, eklem kıkırdaklarının ilerleyici dejenerasyonu, sinovial iltihab ve subkondralkemik 1'in patolojik yeniden modellemesi ile karakterize edilir. Epidemiyolojik tahminler, dünya genelinde yaklaşık 303 milyon kişinin OA'dan etkilendiğini göstermekte olup, nüfusun yaşlanması ve obezite oranlarının artmasıyla bu sayının artmasıbeklenmektedir 2. Çin'de semptomatik diz OA yaygınlığı %8,1 olarak tahmin edilmektedir ve kadınlar ile kırsal nüfus arasında orantısız derecede daha yüksekbir yaygınlık vardır 3. Yüksek yaygınlığına rağmen, mevcut tedavi seçenekleri büyük ölçüde steroid olmayan anti-enflamatuar ilaçlar (NSAID'ler) ile semptom yönetimi ve ileri hastalık4 için cerrahi müdahaleyle sınırlıdır. Hastalık modifiye edici osteoartrit ilaçlarının (DMOAD) yokluğu, kondrosit homeostazını ve hayatta kalma sürecini düzenleyen moleküler mekanizmaların eksik anlaşılmasınıyansıtır. 5.

Eklem kıkırdaklarının yapısal ve fonksiyonel bütünlüğü, anabolik ve katabolik aktiviteler arasında denge yoluyla ekstraselüler matriks (ECM) dönüşümünü koruyan yerleşik kondrositlerebağlıdır 6. OA ilerlemesi sırasında, kondrositler anormal mekanik strese ve özellikle interleukin-1β (IL-1β) ve tümör nekroz faktörü-α (TNF-α) gibi pro-inflamatuar aracılara maruz kalırlar; bunlar matris sentezinden matriksbozulmasına doğru geçişi teşvik eder 6. IL-1 β, matriks metalloproteinazlar (MMP) ve aggrecanazların üretimini teşvik ederek kıkırdak yok oluşuna katkıda bulunur ve tip II kollajen ile proteoglikanların sentezinibaskılar. Ayrıca, IL-1 oksidatifstres ve mitokondriyal disfonksiyona β indükte olur; bu da kondrosit apoptozu veyaşlanmaya yol açar 8. Bu nedenle, inflamatuar koşullarda kondrositlerin hayatta kalmasını düzenleyen hücre içi sinyal yollarının tespit edilmesi, OA araştırmaları için öncelik olmaya devam etmektedir.

Otofaji, zararlı organellerin ve protein agregalarının çıkarılıp geri dönüştürülmesiyle hücresel homeostazı koruyan, evrimsel olarak korunan lizozomal bozunmayoludur 9. Bazal otofaji hücresel hayatta kalma ve enerji dengesi için gereklidir; Ancak, düzensiz otofaji hastalığın ilerlemesine katkıdabulunabilir 9. OA'da, otofaji genellikle kondrositlerin hücresel strese uyum sağlamasına ve apoptoza karşı direnç göstermesine yardımcı olan koruyucu bir yanıtolarak kabul edilir 10. Önceki çalışmalar, özellikle ileri evre hastalıklarda, OA ilerlemesi sırasında otofajik aktivitenin azaldığını, bunun hücresel kalite kontrolünün bozulduğunu ve kondrosit kaybının artmasına yol açtığınıgöstermiştir 11. Birçok protein genellikle otofaji ile ilişkili aktivitenin göstergesi olarak kullanılır. Beclin-1, otofagozom başlatımında yer alırken, mikrotübul ilişkili protein 1 hafif zincir 3'ün (LC3-I LC3-II'ye) dönüşümü otofagozomoluşumunun 12 belirteci olarak yaygın olarak kullanılır. Buna karşılık, B-hücreli lenfoma 2 (Bcl-2), Beclin-1'e bağlı otofajiyi inhibe ederken aynı zamanda anti-apoptotik etkileruygular 13. Buna rağmen, otofaji ile ilişkili belirteçlerin yorumlanması dikkatli olmalıdır çünkü LC3-II ve Beclin-1'in statik ölçümleri, gelişmiş otofagozom oluşumunu lizozomal bozunmadan bağımsız olarak ayırt edemez. Bu sınırlamalara rağmen, otofaji ile ilgili yolların modülasyonu OA için umut verici bir terapötik strateji olmaya devam etmektedir.

MikroRNA'lar (miRNA'lar), hedef haberci RNA'ların 3′-çevrilmemiş bölgelerindeki (3′-UTR) tamamlayıcı dizilere bağlanarak transkripsiyon sonrası gen ifadesini düzenleyen kısa kodlamayan RNA'lardır; bu da mRNA bozulmasına veya translasyonel baskılanmaya yol açar. Anormal miRNA ekspresyonu, iltihaplanma, apoptoz ve ECM yeniden şekillendirme üzerindeki etkiler yoluyla OA patogenezine dahiledilmiştir 15. Bu moleküller arasında miR-590-5p, kemik metabolizması ve diğer patolojik süreçlerdeki düzenleyici rolleri nedeniyle dikkat çekmiştir. Önceki çalışmalar, miR-590-5p'nin osteojenik farklılaşmayı teşvik ettiğini ve mezenkimal kök hücrelerde adipogenezi bastırdığınıgöstermiştir 16. Kanser modellerinde, miR-590-5p bağlam bağımlı işlevler sergileyerek onkojenik veya tümörü baskılayan bir düzenleyiciolarak 17. Ayrıca, miR-590 ailesine ait üyeler dahil olan değişmiş mikroRNA ekspresyon profilleri, OA18 sırasında eklem dokularının patolojik yeniden modellenmesinde rol oynamıştır. Ancak, kök hücre veya kanser modellerinden elde edilen kanıtlar doğrudan olgun eklem kondrositlerine ekstrapolasyon yapılamaz. Bu nedenle, miR-590-5p'nin inflamatuar OA mikroçevresinde kondrosit yanıtlarını düzenlemedeki rolü henüz tam olarak anlaşılmamıştır.

OA'da miR-590-5p'nin potansiyel aşağı akış mekanizmalarını incelemek için, in silico hedef tahmin analizleri yapıldı ve Sprouty2 (SPRY2) varsayılan bir aşağı akış hedefi olarak belirlendi. SPRY2, reseptör tirozin kinaz sinyalini olumsuz düzenleyen ve RAS/MAPK/ERK yolu19'un aktivasyonunu bastıran Sprouty protein ailesine dahildir. MAPK sinyalleri kondrositlerin farklılaşmasını, inflamatuar yanıtları ve otofajiyi etkilediği için, SPRY2 OA patofizyolojisinde önemli bir düzenleyici düğümolabilir 20. Önceki çalışmalar, SPRY2'nin romatoid artrit modellerinde inflamatuar yanıtlarıbastırabileceğini göstermektedir 21, epitel sistemlerde apoptozla ilişkilidüzenlemeye katılabilir 22 ve iskemik yaralanma modellerinde otofaji ile ilişkiliyanıtlarla ilişkilidir 23. Bu gözlemler SPRY2'nin hem apoptozun hem de otofajinin düzenlenmesinde rol aldığını gösterse de, eklem kondrositlerindeki rolü hâlâ yeterince tanımlanmamıştır. Bu nedenle, miR-590-5p ve SPRY2'nin, iltihap stres altında kondrositlerin hayatta kalma durumunu etkileyen düzenleyici bir eksen oluşturduğu varsayımlandı.

Bu gözlemlere dayanarak, miR-590-5p'nin SPRY2 ekspresyonunu düzenleyerek kondrositlerde otofaji ile ilişkili yanıtları modüle ettiği öne sürülmüştür. miR-590-5p ve SPRY2 her biri ayrı ayrı biyolojik bağlamlarda incelenmiş olsa da, OA kondrositlerindeki fonksiyonel ilişkileri henüz belirlenmemiştir. Mevcut çalışmada, C28/I2 insan kondrositlerinde IL-1β kaynaklı OA modeli, miR-590-5p ve SPRY2'nin ifade desenlerini incelemek ve Beclin-1, LC3-II ile Bcl-2 ekspresyonu üzerindeki etkilerini değerlendirmek için kullanılmıştır. miR-590-5p/SPRY2 düzenleyici eksenini inceleyerek, bu çalışma kondrositlerin hayatta kalma altındaki epigenetik mekanizmalara dair içgörü sağlar ve OA için potansiyel bir terapötik hedef belirler.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Bu çalışma, yalnızca ticari olarak mevcut olan insan kondrosit hücre hattı C28/I2 kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Bu araştırmada insan katılımcı, insan dokusu örnekleri, hasta kaynaklı materyaller veya canlı hayvanlar yer almamıştır. Bu nedenle, kurumsal ve ulusal yönergelere uygun olarak Kurumsal İnceleme Kurulu (IRB) ve Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) onayı gerekmemektedir. Protokolde kullanılan araçlar, kimyasallar, kitler ve reaktifler Malzeme Tablosu'nda listelenmiştir.

1. Hücre kültürü ve OA modeli yapısı

İnsan kondrosit hücre hattı C28/I2 (detaylar Malzeme Tablosu'nda verilmiştir) ticari bir tedarikçiden temin edilmiştir. Deneysel tekrarlanabilirliği sağlamak için hücreler kısa tandem tekrar (STR) profilleme ile doğrulandı ve mikoplazma kontaminasyonunun yokluğunu doğrulamak için rutin olarak test edildi. Tüm deneylerde 3 ve 8. pasajlar arasındaki hücreler kullanıldı. Hücreler, %10 fetal sığır serumu (FBS) ve %1 penisillin-streptomisin ile takviye edilmiş DMEM'de (tüm kültür reaktifleri Malzeme Tablosu'nda detaylandırılmıştır) 37 °C'de, %5CO2 içeren nemlendirilmiş bir atmosferde tutuldu.

In vitro osteoartrit (OA) modelini oluşturmak için C28/I2 hücreleri rekombinant insan IL-1β ile uyarıldı. Yerleşik literatüre dayanarak, aşırı acil sitotoksisite olmadan sağlam bir katabolik durum indükten önde gelen doz-yanıt optimizasyondeneylerine dayanarak, hücreler 24 saat boyunca 20 ng/mL IL-1β ile işlendi.

2. Deneysel gruplama ve transfeksiyon

Mekanistik yolları aydınlatmak için çalışma, her biri en az üç bağımsız biyolojik kopyaya sahip üç ana deneysel modüle ayrılmıştır:

  1. SPRY2 Kazancı/Fonksiyon Kaybı:
    Hücreler, girişim verimliliğini taramak için Control, OA modeli, OA + boş vektör (NC), OA + SPRY2 aşırı ekspresyon plazmidi (OE-SPRY2) ve buna karşılık gelen küçük interferantif RNA gruplarına (si-NC ve üç spesifik si-SPRY2 yapısı: si-695, si-800, si-896) atandı.
  2. miR-590-5p modülasyonu:
    Hücreler Kontrol, OA modeli, OA + mimik NC, OA + miR-590-5p mimik, OA + inhibitör NC ve OA + miR-590-5p inhibitör gruplarına ayrıldı.
  3. miR-590-5p/SPRY2 düzenleyici ilişkisinin fonksiyonel doğrulaması:
    miR-590-5p ile SPRY2 arasındaki önerilen düzenleyici ilişkiyi daha iyi değerlendirmek için, hücreler miR-590-5p taklitörü ve inhibitör koşullarına maruz kalarak miR-590-5p modülasyonunun OA modelinde SPRY2 ifadesini değiştirip değiştirmediğini belirlemek için kullanıldı.
    Transfeksiyon için, C28/I2 hücreleri 2 × 105 hücre/kuyu aralığında 6 delikli plakalara tohumlanmıştır. %70–%80 birleşime ulaştıktan sonra, transfeksiyonlar üretici protokolüne göre ticari lipid bazlı transfeksiyon reaktifi kullanılarak gerçekleştirildi ve kondrositlerde küçük RNA teslimatı içinprosedürler belirlendi 24. Kısaca, plazmidler (OE-SPRY2 ve NC; 2 μg/well) ve oligonukleotidler (miR-590-5p mimik/inhibitör ve siRNA'lar; 50 nM) azaltılmış serum ortamında seyreltildi. Lipid-DNA/RNA kompleksleri, serumsuz DMEM'deki hücrelere damla olarak eklendikten sonra oda sıcaklığında 15 dakika kuluçka altına alındı. Transfeksiyondan 6 saat sonra, ortam %10 FBS içeren tam DMEM ile değiştirildi ve hücreler RNA ve protein ekstraksiyonundan önce ek 48 saat kültürlendi.

3. qPCR tespiti

Toplam RNA ve miRNA, üreticinin protokolüne göre özel bir miRNA çıkarma kiti kullanılarak izole edildi. RNA saflığı ve konsantrasyonu UV-Vis spektrofotometresi kullanılarak değerlendirildi ve A260/A280 oranları 1.8–2.0 olan örnekler sonraki analizler için kullanıldı. cDNA sentezi için ticari ters transkripsiyon reaktifleri kullanıldı. QPCR döngü prosedürü şöyleydi: 10 dakika 95 °C; 40 döngü: 10 saniye için 95 °C, 30 saniye için 58 °C ve 30 saniye için 72 °C; ardından primer özgüllüğünü ve primer dimer eksikliğini doğrulamak için erime eğrisi analizi yapılır. β-aktin ve U6, sırasıyla mRNA ve miRNA için iç kontrol olarak hizmet verdi. Göreli gen ifadesi 2-ΔΔCt yöntemi 25 kullanılarak hesaplandı. Col-II, SPRY2, Beclin-1, LC3, Bcl-2, miR-590-5p ve referans genler dahil olmak üzere tüm primer dizileri, Tablo 1'de listelenmiştir.

Giriş adı Ön primer (5′-3′)Ters astar (5′-3′)
U6ATTGGAACGATACAGAAGATTGGAACGCTTCACGAATTTG
miR-590-5pGCGTAAGGCACCGGTGAGTGCAGGGTCCGAGGTATT
β-aktinTGGCACCCAGCACAATGAACTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA
SPRY2TAAGCCACTGAGCAAGGAAGATTGGAAGGTAACACCATAAACAAGG
BCL-2TGGGATTCCTGCGGATTGACTCAGTCTACTTCCTCTGTGTGATGTTG
Beclin-1TCCCGTGGAATGGAATGAGAGTAAGGAACAAGTCGGTATCTCTG
LC3-IICATCCAACCAAAATCCCGGTGAGCTGTAAGCGCCTTCTAA

Tablo 1: Nicel PCR (qPCR) analizi için kullanılan primer dizileri. Hedef transkriptlerin amplifikasyonu ve nicelenmesi ile qPCR ile iç referans kontrollerinin ileri ve geri primer dizileri.

Aksi belirtilmedikçe, veriler ortalama ± standart sapma (SD) olarak ifade edilir. İstatistiksel anlamlılık tek yönlü ANOVA ile belirlendi ve ardından S-N-K post hoc testi yapıldı. Semboller şunları gösterir: *P < 0.05 vs. Kontrol; #P < belirtilen model veya negatif kontrol grubuna karşı 0,05; &P < 0.05 vs. OA+inhibitör-NC.

4. Western Blot Tespiti

Hücreler, belirlenmiş protein ekstraksiyonu ve immünoblotasyon prosedürlerinin ardından proteaz ve fosfataz inhibitörü kokteylleriyle desteklenen RIPA tamponu kullanılarak toplanıp lizize edildi. 14.000 × g sıcaklıkta 4 °C'de 15 dakika boyunca santrifüjleme yapıldıktan sonra hücresel kalıntılar çıkarıldı, üstleme maddesi toplandı ve protein konsantrasyonları BCA protein test kiti kullanılarak nicelendirildi. Eşit miktarda protein lizat (30 μg) denatüre edildi, SDS-PAGE ile 1,5 saat çözüldü ve PVDF membranlarına 300 mA'da 1,5 saat26 boyunca aktarıldı. Zarlar, oda sıcaklığında %1 saat boyunca %0,1 Tween 20 (TBST) içeren %5 yağsız kuru sütle Tris tamponlu tuzlu suyda bloklandı, ardından 4 °C'de 16 saat boyunca spesifik birincil antikorlarla (örneğin, anti-SPRY2, 1:1000 seyreltme) kuluçka yapıldı. TBST'de üç yıkamadan sonra, zarlar uygun HRP ile konjuge edilmiş ikincil antikorlarla oda sıcaklığında 2 saat kuluçka edildi. Protein bantları ECL algılama sistemi kullanılarak görselleştirildi ve ImageJ yazılımı kullanılarak nicelendirildi.

5. İstatistiksel analiz

Veriler istatistiksel analiz yazılımı kullanılarak analiz edildi. Tüm deneyler en az üç bağımsız biyolojik kopya ile (n ≥ 3) yapıldı ve nicel veriler ortalama ± standart sapma (SD) olarak sunuldu. Parametrik testlerden önce, veri normalliği Shapiro-Wilk testi kullanılarak değerlendirilmiş ve varyansın homojenliği değerlendirilmiştir. Birden fazla grup arasındaki istatistiksel anlamlılık, tek yönlü varyans analizi (ANOVA) kullanılarak değerlendirildi ve ardından çoklu karşılaştırmalar için Student-Newman-Keuls (S-N-K) sonradan yapılan test yapıldı. P < 0.05 istatistiksel olarak anlamlı olarak kabul edildi.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

In vitro kondrosit inflamatuar modelinin kurulması

Osteoartrit patolojisinin altında yatan moleküler mekanizmaları araştırmak için, IL-1β ile uyarılmış C28/I2 insan kondrositleri kullanılarak in vitro bir inflamatuar model oluşturuldu. Bu modelin geçerliliği, hialin kıkırdak ekstrasellüler matriksinin birincil bileşeni ve sağlıklı kondrositlerin ayırt edici özelliği olan kolajen tip II alfa 1 zincirinin (Col-II) ekspresyonu değerlendi...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Önceki çalışmalar, miRNA'ların otofajiyi başlatma, vezikül uzaması ve olgunlaşma dahil olmak üzere birden fazla aşamadadüzenlediğini göstermiştir 27. OA patogenezinde miRNA rolü, özellikle iltihaplanma, apoptoz, ekstrasellüler matris yeniden modellenmesi ve otofaji ile ilgili yollar üzerindeki etkiler yoluyla giderek daha fazla belgelenmiştir. miR-590-5p hücresel homeostaz ve kanserle ilişkili süreçlerleilişkilendirilmiştir 28,29,30.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar rekabet eden çıkarlar belirtmemektedir.

Teşekkürler

Yazarlar, bu çalışma için deneysel olanaklar ve teknik destek sağladıkları için Guangxi Çin Tıp Üniversitesi Ruikang Hastanesi Geriatri Bölümü'ne teşekkür etmektedir. Yazarlar ayrıca laboratuvar personeline ve meslektaşlarına veri toplama ve analiz konusundaki yardımları için teşekkür etmektedir. Bu çalışma, Guangxi Çin Tıp Üniversitesi'nin Doğa Bilimleri Araştırma Projesi tarafından desteklenmiştir (Hibe No. 2022MS039; LncRNA-GAS5, fare dizindeki OA kondrositlerinde otofajiyi inhibe etmek için SPRY2 ifadesini aracılık eder: Huayu Qushi Reçetesinin Mekanizma Çalışması ve erken müdahale etkisi) ve Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (Bölgesel Vakf) (Grant No. 82160912; Skp2 ubiquitinasyonu, FoxO1'in bozunması, diz OA kondrosit otofagisinin inhibisyonu ve Huayu Qushi reçetesinin erken müdahale etkisi üzerine mekanizma tartışması.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Anti-β-actin antikoruProteintech66009-1-Ig ; RRID: AB_2687938Western blot analizi için iç yük kontrolü
Anti-SPRY2 antikoruProteintech11383-1-AP ; RRID: AB_2196324SPRY2 protein ekspresyonunun saptanması
BCA protein tahlili kitiThermo Fisher Scientific23225Toplam protein konsantrasyonunun belirlenmesi
C28/I2 insan kondrosit hücre hattıPunocelCP-H107Osteaoartirit çalışmaları için in vitro kondrosit modeli
Tam DMEMKeyGen BiotecKGM12800SRutin hücre kültürü için bazal ortam
CWBIO Ultrapure miRNA ekstraksiyon kitiCWBIOCW0627SToplam RNA ve miRNA'nın izolasyonu
ECL tespit sistemiThermo Fisher Scientific32106Protein bantlarının kimilüminesan görselleştirilmesi
Fetal Bovin Serum (FBS)Gibco1891605Hücre kültürü büyüme takviyesi
GraphPad Prism versiyon 9.0GraphPad SoftwareN/Aİstatistiksel analiz ve grafik oluşturma
HiScript II Q RT SuperMixVazymeR223-01mRNA'nın cDNA'ya ters transkripsiyonu
ImageJ yazılımıNational Institutes of HealthN/AWestern blot bant yoğunluğunun kantifikasyonu
Lipofectamine 3000InvitrogenL3000015Plasmidlerin ve oligonükleotidlerin transfeksiyonu
miR-590-5p benzeri, inhibitör ve NC'lerRiboBioÖzel sentezlenmişmiR-590-5p ekspresyonunun modülasyonu
miRNA 1. Aşama cDNA Sentez KitiVazymeMR101-02miRNA'nın cDNA'ya ters transkripsiyonu
Opti-MEM ortamıGibco31985-062Transfeksiyon komplekslerinin hazırlanması
Penisilin-streptomisinGibco15140122Hücre kültüründe bakteriyel kontaminasyonun önlenmesi
Proteaz ve fosfataz inhibitörü kokteylleriMedChemExpressHY-K0010Ekstraksiyon sırasında proteinlerin korunması
PVDF membranlarMillipore SigmaISEQ00010İmmunoblotting için protein transfer membranı
Rekombinant insan IL-1βMedChemExpressHY-P78459OA benzeri inflamatuar koşulların indüksiyonu
RIPA tamponuBeyotimeP0013BHücre lizisi ve protein ekstraksiyonu
si-SPRY2 yapıları ve si-NCGenePharmaÖzel sentezlenmişSPRY2 ekspresyonunun klon dışı çıkarılması
SPRY2 aşırı ekspresyon plazmiti (OE) ve boş vektör (NC)GeneChemÖzel yapılandırılmışSPRY2 aşırı ekspresyon etkilerinin değerlendirilmesi
UV-VIS spektrofotometre (NanoDrop 2000)Thermo Fisher ScientificND-2000RNA konsantrasyonu ve saflığının ölçülmesi

Kaynaklar

  1. Hunter DJ, Bierma-Zeinstra S. Osteoarthritis. Lancet. 2019;393:1745-59.
  2. GBD 2019 Diseases and Injuries Collaborators. Global burden of 369 diseases and injuries in 204 countries and territories, 1990-2019: A systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2019. Lancet. 2020;396:1204-22.
  3. Tang X, et al. The prevalence of symptomatic knee osteoarthritis in China: Results from the China Health and Retirement Longitudinal Study. Arthritis Rheumatol. 2016;68:648-53.
  4. Latourte A, Kloppenburg M, Richette P. Emerging pharmaceutical therapies for osteoarthritis. Nat Rev Rheumatol. 2020;16:673-88.
  5. Glyn-Jones S, et al. Osteoarthritis. Lancet. 2015;386:376-87.
  6. Kapoor M, et al. Role of proinflammatory cytokines in the pathophysiology of osteoarthritis. Nat Rev Rheumatol. 2011;7:33-42.
  7. Goldring MB, Otero M. Inflammation in osteoarthritis. Curr Opin Rheumatol. 2011;23:471-8.
  8. Lepetsos P, Papavassiliou AG. ROS/oxidative stress signaling in osteoarthritis. Biochim Biophys Acta. 2016;1862:576-91.
  9. Mizushima N, Komatsu M. Autophagy: Renovation of cells and tissues. Cell. 2011;147:728-41.
  10. Caramés B, Olmer M, Kiosses WB, Lotz MK. The relationship of autophagy defects to cartilage damage during joint aging in a mouse model. Arthritis Rheumatol. 2015;67:1568-76.
  11. Lotz MK, Caramés B. Autophagy and cartilage homeostasis mechanisms in joint health, aging and OA. Nat Rev Rheumatol. 2011;7:579-87.
  12. Kabeya Y, et al. LC3, a mammalian homologue of yeast Apg8p, is localized in autophagosome membranes after processing. EMBO J. 2000;19:5720-8.
  13. Pattingre S, et al. Bcl-2 antiapoptotic proteins inhibit Beclin 1-dependent autophagy. Cell. 2005;122:927-39.
  14. Bartel DP. MicroRNAs: Genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell. 2004;116:281-97.
  15. Miyaki S, Asahara H. Macro view of microRNA function in osteoarthritis. Nat Rev Rheumatol. 2012;8:543-52.
  16. Wu Z, Lin Y, Zhang Z, Pan Y. Melatonin-mediated miR-526b-3p and miR-590-5p upregulation promotes chondrogenic differentiation of human mesenchymal stem cells. J Pineal Res. 2018;65:e12483.
  17. Chen M, Wang S, Chen Y. miR-590-5p suppresses hepatocellular carcinoma chemoresistance by targeting YAP1 expression. EBioMedicine. 2018;35:142-54.
  18. Endisha H, Rockel J, Jurisica I, Kapoor M. The complex landscape of microRNAs in articular cartilage: biology, pathology, and therapeutic targets. JCI Insight. 2018;3:e98630.
  19. Guy GR, Jackson RA, Yusoff P, Chow SY. Sprouty proteins: Modified modulators, matchmakers or missing links? J Endocrinol. 2009;203:191-202.
  20. Loeser RF. Integrins and chondrocyte-matrix interactions in articular cartilage. Matrix Biol. 2014;39:11-6.
  21. Zhang W, Chen L, Xiong Y. Intraarticular gene transfer of SPRY2 suppresses adjuvant-induced arthritis in rats. Appl Microbiol Biotechnol. 2015;99:6727-35.
  22. Liu Y, et al. MicroRNA-124 facilitates lens epithelial cell apoptosis by inhibiting SPRY2 and MMP-2. Mol Med Rep. 2021;23:381.
  23. Wu Y, Gao Z, Zhang J. Transcription factor E2F1 aggravates neurological injury in ischemic stroke via microRNA-122-targeted Sprouty2. Neuropsychiatr Dis Treat. 2020;16:2633-47.
  24. Jiang P, Zheng Z, Tang Y. miR-590-5p affects chondrocyte proliferation, apoptosis, and inflammation by targeting FGF18 in osteoarthritis. Am J Transl Res. 2021;13:8728-41.
  25. Livak KJ, Schmittgen TD. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) method. Methods. 2001;25:402-8.
  26. Towbin H, Staehelin T, Gordon J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: Procedure and some applications. Proc Natl Acad Sci U S A. 1979;76:4350-4.
  27. Panagopoulos PK, Lambrou GI. The involvement of microRNAs in osteoarthritis and recent developments: A narrative review. Mediterr J Rheumatol. 2018;29:67-79.
  28. Barwal TS, Sharma P. miR-590-5p: A double-edged sword in the oncogenesis process. Cancer Treat Res Commun. 2022;32:100593.
  29. Mou K, Chen M. miR-590-5p inhibits tumor growth in malignant melanoma by suppressing YAP1 expression. Oncol Rep. 2018;40:2056-66.
  30. D'Adamo S, et al. Autophagy in osteoarthritis: a target for new therapies. Curr Rheumatol Rep. 2020;22:37.
  31. Agarwal V, Bell GW, Nam JW, Bartel DP. Predicting effective microRNA target sites in mammalian mRNAs. eLife. 2015;4:e05005.
  32. Friedman RC, Farh KK, Burge CB, Bartel DP. Most mammalian mRNAs are conserved targets of microRNAs. Genome Res. 2009;19:92-105.
  33. Lee CC, et al. Overexpression of sprouty 2 inhibits HGF/SF-mediated cell growth, invasion, migration, and cytokinesis. Oncogene. 2004;23:5193-202.
  34. Frank MJ, et al. Expression of sprouty2 inhibits B-cell proliferation and is epigenetically silenced in mouse and human B-cell lymphomas. Blood. 2009;113:2478-87.
  35. Cui S, et al. Hsa-miR-22-3p inhibits liver cancer cell EMT and cell migration/invasion by indirectly regulating SPRY2. PLoS One. 2023;18:e0281536.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

TıpSayı 233Sayı 233Boş DeğerSayıC28/I2 hücreleriinsan osteoartrit (OA) modelimiRNA-590-5pBeclin-1LC3IIBcl-2
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.