Bölünmüş Brokoli RNA Raporlayıcıları Kullanılarak In vitro RNA Kümelerinde Moleküller arası RNA Eşleşmesinin Görselleştirilmesi ve Nicelendirilmesi

Summary

Bu protokol, RNA kümelerinde moleküller arası baz eşleşmesini in vitro tespit etmek ve nicelendirmek için bölünmüş Brokoli RNA raporlayıcıları kullanılarak görsel bir testi tanımlar.

Abstract

Çok valentli moleküller arası RNA–RNA etkileşimleriyle yönlendirilen RNA kümelenmesi, proteinlerin yokluğunda in vitro gerçekleşebilir. Bu etkileşimleri tahmin etmek için kimyasal probing ve hesaplamalı simülasyonlar kullanılsa da, RNA kümelerinde moleküller arası baz eşleşmesini doğrudan değerlendirme yöntemleri sınırlıdır. Bu çalışma, ilgi çekici floresan etiketli RNA'lara konjuge edilmiş bölünmüş Brokoli RNA raporlayıcılarına dayalı görsel bir analiz sunmaktadır. Bu test, RNA kümelerinde moleküller arası baz eşleşmesinin tespit edilmesini ve nicelendirilmesini sağlar. Bölünmüş Brokoli sistemi, Brokoli RNA aptamerini oluşturmak için dimerize olan tamamlayıcı raporlayıcı dizileri içerir. Ortaya çıkan dimerize RNA yapısı, bağlandığında yeşil floresan yayan bir florofor olan DFHBI-1T'ye bağlanır. RNA kümelenmesinde, yeşil floresansın ortaya çıkışı, ilgilenilen RNA'lar arasında tamamlayıcı raporlayıcı dizilerinin aracılık ettiği baz eşleşmesini bildirir. DFHBI-1T floresansının ölçümü, in vitro RNA kümelenme koşullarının bu raporlayıcı diziler arasındaki moleküller arası baz eşleşmesini nasıl etkilediğinin nicel değerlendirmesini mümkün kılar.

Introduction

In vitro transkripsiyonlu RNA'lar, tuzlar ve moleküler kalabalık^reaktifler 1,2,3,4,5 eklendiğinde görünür kümelere dönüşebilir. Özellikle, bu RNA kümeleri proteinler dahil diğer hücresel bileşenlerin yokluğunda oluşabilir; bu da belirli koşullar altında moleküller arası RNA–RNA etkileşimlerinin in vitro RNA yoğunlaşmasını tetiklemek için yeterli olduğunu gösterir.

Moleküller arası RNA–RNA etkileşimlerinin çeşitli türleri arasında, moleküller arası baz eşleşmesi kondensatlar alanında^{önemli ilgi görmüştür} 1,2,4,6,7,8,9,10. Bu etkileşimler, Ashbya gossypii² filamentli mantarında BNI1 ve SPA2 mRNA'larının birlikte kümelenmesi veya Drosophila melanogaster 6,7'de oskar mRNA'nın oligomerizasyonu ile gösterildiği gibi, transkriptler arasında maruz kalan tamamlayıcı diziler ("zipkodlar") tarafından yönlendirilebilir . Alternatif olarak, moleküller arası baz eşleşmesi RNA ikincil yapılarının yeniden modellenmesiyle teşvik edilebilir; böylece yapısal olarak gömülü olan tamamlayıcı diziler ortaya çıkarılır. Bu mekanizma, in silico⁹ ve guanidin riboswitch'lerde in vitro¹⁰ tekrarlanan RNA'larda gözlemlenmiştir. Hem maruz kalan tamamlayıcı diziler hem de RNA yapısal yeniden modellenmesi kimyasal^{probing 11,12} veya^{simülasyon yaklaşımları} 4,9,13,14 kullanılarak ölçülebilir. Ancak, in vitro RNA kümeleme testlerinde moleküller arası baz eşleşmesini doğrudan görselleştiren yöntemler sınırlıdır.

Baz eşleştirici çapraz^{bağlayıcılar} 15,16,17 ve jel elektroforezi ^4,6,7 kullanılarak yapılan RNA pull-down testleri, moleküller arası RNA baz eşleşmesini in vitro çalışmak için yaygın olarak kullanılır. Ancak bu yöntemler, kümeler içindeki bazları dış eşleşmelerden ayırt edecek mekansal çözünürlüğe sahip değildir. Ayrıca, RNA kümelerini aşağı akış analizi için izole etmek teknik olarak zordur; çünkü küme kararlılığının korunmasını ve sonraki testlerle tampon uyumluluğunu sağlamayı gerektirir.

İlgi çekici floresan etiketli RNA'lara konjuge edilmiş bölünmüş Brokoli RNA^{raporlayıcıları 18'e} dayalı görsel bir test, in vitro⁴ RNA yoğunlaşması sırasında moleküller arası baz eşleşmesinin doğrudan tespitini sağlamak için daha önce kullanılmıştır. Bu bağlamda, bölünmüş Brokoli sistemi, belirli in vitro kümeleme koşulları altında raporlayıcılar veya RNA'lar arasında moleküller arası etkileşimlerin olasılığını raporlar. Bu nedenle, test, RNA kümesi benzeri bir ortamda sekiz bağlamının ve çevresel faktörlerin moleküller arası baz eşleşme eğilimini nasıl etkilediğini araştırır.

Bölünmüş Brokoli sistemi, Brokoli RNA aptamerini yeniden oluşturmak için dimerleşen iki tamamlayıcı RNA dizisi olan üst ve alt ^kısımdan oluşur (Şekil 1A–C)18. Dimerizasyon sırasında aptamer, florofor DFHBI-1T'ye bağlanır ve yeşil floresans oluşur (Şekil 1A–C)¹⁸. Bu sistem kullanılarak, RNA kümeleri içindeki raporlayıcı tamamlayıcı diziler arasındaki moleküller arası baz eşleşmesinin kapsamının RNA katlanmasına bağlı olduğu gösterilmiştir. DFHBI-1T floresansının RNA seviyelerine oranı farklı deneysel koşullarda karşılaştırıldığında, in vitro koşulların RNA kümeleri içinde raporlayıcı aracılı moleküller arası baz eşleşmesi üzerindeki etkisi nicel olarak değerlendirilebilir.

Bu test, RNA kümelerinde moleküller arası baz eşleşmesini incelemek için RNA pull-down ve jel elektroforezi yaklaşımlarını tamamlar. Ancak, sağlam sinyal tespiti moleküler kalabalık reaktifleri gerektirebilir ve hassasiyet, bölünmüş Brokoli üst ve alt RNA'larının dimerizasyonu ve katlanma etkinliğiyle sınırlıdır.

Protocol

Bu protokol, bu testi uygulamak için adım adım bir yöntem sunar ve uygulamalarını tartışır. Kullanılan reaktifler ve ekipmanlar Malzeme Tablosu'nda listelenmiştir.

1. In vitro RNA transkripsiyonu için DNA şablonlarının hazırlanması

1. Her DNA şablonunun 5' ucuna in vitro RNA transkripsiyonu için bölünmüş Brokoli aptamer dizilerini içeren bir T7 promotor dizisi ekleyin. Bölünmüş Brokoli aptamer dizilerini (üst ve alt) tek başına kullanın veya T7 promotörünün aşağısındaki herhangi bir konuma, ilgilenen ek bir RNA dizisi olsun ya da olmasın, ekleyin.
   NOT: T7 promotör, bölünmüş brokoli raporlayıcıları ve DNA şablonlarını amplifikasyon için kullanılan primerler için diziler Tablo 1'de listelenmiştir.
   NOT: T7 RNA polimeraz, transkripsiyonu +1 pozisyonunda "G" ile başlatmayı şiddetle tercih eder. +2 ve +3 pozisyonlarında hemen aşağıda ek G'lerin varlığı, transkripsiyon^{verimini 19} artırabilir. Ancak, aşağı akış dizisi G ile başladığında, yani iki G ile başlayan üst ve alt yapılarda olduğu gibi, transkripsiyon farklı^{pozisyonlarda başlayabilir 20}. Sonuç olarak, transkriptler 5' ucunda bir, iki veya üç G taşıyabilir (örneğin GATCC, GGATCC veya GGGATCC), bu da tasarlanmış yapılarda baz eşleşmesinin yorumlanmasını etkileyebilir.
2. PCR için ticari olarak sentezlenen gen blokları, plazmidler veya DNA parçalarını şablon olarak kullanın. Orijinal şablonda T7 promoter bulunmuyorsa, 5′ T7 promotor çıkıntısı ile birlikte uygun ters primer ile öne bir primer kullanın.
3. Her biri 2,5 μL 10 μM ileri ve geri primer, 20 ng DNA şablonu, 25 μL 2 yüksek kaliteli master ×karışım ve nükleaz içermeyen su içeren 200 μL PCR tüpünde 50 μL PCR reaksiyonu hazırlayın. Pipetle yukarı aşağı iyice karıştırın ve 2.000 × g ile 2 saniye boyunca santrifüj yapın.
4. PCR reaksiyonunu termal döngücü içinde şu programla çalıştırın: 98 °C 30 saniye (1 döngü); 10 saniye için 98 °C, 30 saniye için optimize edilmiş tavlama sıcaklığı ve kilobaz başına 30 saniye için 72 °C (35 döngü); 72 °C 2 dakika (1 döngü).
   NOT: Optimize edilmiş tavlama sıcaklığını Tm hesaplayıcı gibi çevrimiçi bir araç kullanarak belirleyin. PCR ürünleri tamamlandıktan sonra 4 °C sıcaklıkta saklanabilir.
5. 2 μL PCR ürünü 8 μL nukleazsız su ve 2 μL 6× yükleme boyası ile karıştırın. Karışımı elektroforez için %1 agararoz jeline yükleyin.
   NOT: PCR ürünü tek bir bant olarak görünmelidir. Birden fazla bant gözlemlenirse, doğru bandı çıkarıp jel çıkarma kiti ile arıtın.
6. PCR ürünü veya jel ekstraksiyonlu DNA'yı bir DNA arıtma kiti kullanarak arındırın ve 20–30 μL nukleazsız suda 1,5 mL bir mikrosantrifüj tüpüne elüasyon yapın.
7. Mikrohacimli spektrofotometre kullanarak DNA konsantrasyonu ve saflığını ölçin. A260/A280'in yaklaşık 1.8 ve A260/A230'un 2.0'dan büyük olduğundan emin olun.
   NOT: A260/A230 2.0'ın altındaysa, ek bir arıtma adımı gerçekleştirin.
8. DNA şablonunu kullanana kadar −20 °C'de sakla.

2. In vitro RNA transkripsiyon reaksiyonunun hazırlanması

1. Çalışma yüzeyini, tüp raflarını ve pipetleri RNase dekontaminasyon çözeltisi ile silin. RNase içermemiş, filtrelenmiş uçlar kullanın.
2. T7 transkripsiyon kiti ile birlikte buz üzerinde UTP-Cy5 ile birlikte getirilen erime reaksiyonu tamponu ve nükleotid çözeltileri (ATP, CTP, GTP, UTP). Tüm tüpleri 2.000 × g ile 2 saniye santrifüjle yapın.
   NOT: UTP-Cy5'i ışıktan koruyun.
3. DNA şablonundaki timin bazlarının sayısını hesaplayın (T7 promotör hariç) ve 20 μL transkripsiyon reaksiyonu için gerekli UTP ve UTP-Cy5 hacimlerini belirleyin. RNA türleri arasında etiketleme yoğunluğunu tutarlı tutun.
   NOT: Örneğin, yaklaşık üç Cy5 etiketli urasil içeren 100 urasil içeren bir RNA'yı etiketlemek için 4,5 μL 1 mM UTP-Cy5 ve 1,9 μL 75 mM UTP ekleyin.
4. 20 μL transkripsiyon reaksiyonu hazırlayarak, her biri 2 μL ATP, CTP ve GTP, hesaplanan UTP hacimleri (hepsi kit ile birlikte sağlanır) ve UTP-Cy5, 2 μL 10× reaksiyon tamponu, 2 μL enzim karışımı, 200 ng DNA şablonu ve nükleaz içermeyen su birleştirilerek hazırlanır. Pipetle yukarı aşağı karıştırın ve 2.000 × g ile 2 saniye santrifüj yapın.
5. Reaksiyonu 37 °C'de 6 saat kuluçka edin.
6. Kit ile birlikte verilen 1 μL DNaz ekleyin. Pipetle yukarı aşağı iyice karıştırın ve 2.000 × g ile 2 saniye boyunca santrifüj yapın.
7. 37 °C'de ek 15 dakika kuluçka yapın.
8. Reaksiyonu (~20 μL) 1.5 mL'lik bir tüpe aktarın. Kit ile birlikte verilen 115 μL nükleazsız su ve 15 μL amonyum asetat durdurma çözeltisi ekleyin. Pipetle yukarı aşağı iyice karıştırın ve 2.000 × g ile 2 saniye boyunca santrifüj yapın.
   NOT: Ticari bir RNA arıtma kiti Adım 2.9–3.7 yerine kullanılabilir.
9. 150 μL fenol/kloroform ekleyin ve nazikçe karıştırın.
   DIKKAT: Fenol/kloroformu kimyasal bir duman davlumbazında kullanın.
10. 16.000 × g sıcaklıkta 4 °C'de 10 dakika boyunca santrifüj yapın.
11. Üst sulu fazı yeni bir tüpe aktarın.
    NOT: Ara fazı bozmaktan kaçının; alt tabaka, inkorpore edilmemiş boya nedeniyle mavi görünebilir.
12. Eşit miktarda klorofom ekleyin ve iyice karıştırın.
    DIKKAT: Kloroformu kimyasal bir buhar davlumbazında kullanın.
13. Santrifüj 16.000 × g'de 4 °C'de 2 dakika sürdür.
14. 2.11–2.13 adımlarını tekrarlayın.
15. Sulu tabakayı (~100–150 μL) yeni bir tüpe aktarın. 900 μL izopropanol ekleyin ve iyice karıştırın.
16. Aliquot, ayrı tüplerde üç eşit hacme bölünür.
    NOT: Her aliquot, birden fazla RNA kümeleme reaksiyonu için yeterlidir.
17. −20 °C'de gece boyunca veya bir aya kadar saklanın.

3. In vitro transkripsiyonlu RNA'nın arındırılması

1. RNA örneğini izopropanolde 16.000 × g ile 4 °C'de 15 dakika boyunca santrifüj edin.
2. İzopropanolu dikkatlice RNA pelletini rahatsız etmeden çıkarın.
3. Nukleazsız suda hazırlanmış %70 etanol 1 mL ekleyin.
4. Santrifüj 16.000 × g'de 4 °C'de 2 dakika boyunca kullanın.
5. Etanolü çıkarın ve 3.3–3.4. adımları tekrarlayın.
6. Son etanol yıkama sırasında, etanolün büyük kısmını 1000 μL pipet ile çıkarın. Kısa süreliğine 2.000 × g sıcaklıkta bir tezgah üstü minisantrifüjde 2 saniye boyunca santrifüj yapın ve kalan etanolü 20 μL pipet ile çıkarın.
7. RNA peletini oda sıcaklığında (RT) 1–2 dakika hava ile kurutabilir.
8. RNA pelletini 20 μL nükleazsız suya yeniden süzülür. Örneği buz üzerinde tutun ve ışıktan koruyun.
9. Mikrohacimli spektrofotometre kullanarak RNA konsantrasyonu ve saflığını ölçin. A260/A280'in yaklaşık 2.0 ve A260/A230'un 2.0'dan büyük olduğundan emin olun.

4. In vitro RNA kümeleme reaksiyonunun hazırlanması

NOT: Bu protokolde, RNA kümelenmesinin indüklenmesi için spermin ve PEG 8000 gereklidir; önceki^{çalışmalar 2,4,5} dayandırılır. Özellikle, nükleaz içermeyen suda hazırlanan 100 mM spermin tetrahidroklorür stok çözeltisi, birden fazla 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne alikotasyon edilip −20 °C'de depolanmıştır.

1. 100 mM spermin solüsyesi ve %50 PEG 8000 içeren bir tüpü buz üzerinde çözüp çözelim.
   NOT: Açıldıktan sonra, %50 PEG 8000 muhtemelen bozulma nedeniyle iki aydan fazla kullanılmamalıdır.
2. 500 μL taze yapılmış 10× RNA yeniden katlama tamponu hazırlamak için 50 μL 2M KCl, 50 μL 1M_{MgCl 2}, 50 μL 1M Tris (pH 7.0) ve 350 μL nükleazsız su birleştirin. Pipetle yukarı aşağı iyice karıştırın. Santrifüj 2.000 × g ile 2 saniye için, bir tezgah üstü mini santrifüjde.
   NOT: Yeniden katlama tamponu RNA kümeleme deneyi günü hazırlanmalıdır.
   NOT: 4.3-4.4 adımları deneysel koşullara bağlıdır ve gerektiğinde ayarlanabilir. Bu çalışmada kullanılan RNA kümelenmesi için iki örnek koşul aşağıda açıklanmıştır. Birlikte katlanma durumu, antisens oligonukleotidlerin RNA^2'ye annelenmesi için kullanılan bir yöntemden uyarlanmıştır. Bu yöntemde, RNA'lar bir tuz tamponu içinde karıştırılır ve birlikte ısıtılır; böylece tamamlayıcı diziler taşıyan RNA'lar arasında moleküller arası baz eşleşmesi teşvik edilir. Buna karşılık, ayrı katlanma koşullarında, her RNA karışmadan önce tek tek katlanır. Bu durum, RNA'ların etkileşime girmeden önce katlandığı hücresel bir senaryoyu yaklaşık olarak yansıtmak için tasarlanmıştır.
3. Ortak katlama
   NOT: Bu durum, üst ve alt dizileri içeren RNA'lar arasında moleküller arası baz eşleşmesini teşvik eder. RNA kümeleme koşulları altında raporlayıcı odaklı moleküller arası baz eşleşmesi için pozitif bir kontrol görevi görür.
   1. 200 μL'lik bir PCR tüpünde, üst veya alt diziyi taşıyan her bir in vitro transkribe RNA'dan 16 pmol, 10× yeniden katlanan RNA tamponu 2 μL ve nükleaz içermeyen suyu son hacmi 14 μL olarak birleştirin. Pipetle yukarı aşağı iyice karıştırın. Santrifüj 2.000 × g ile 2 saniye için, bir tezgah üstü minisantrifüjde.
      NOT: 16 pmol'a karşılık gelen RNA kütlesini hesaplamak için.
   2. RNA örneğini 90 °C'de 2 dakika ısıtın.
   3. Numuneyi hemen RT'ye aktarın ve ışığa karşı koruyun. Reaksiyonu RT'de 1 saat kuluçka edin.
4. Ayrı katlama
   1. RNA örneğini 90 °C'de 2 dakika ısıtın ve hemen en az 15 dakika buzun üzerine koyun.
   2. 200 μL PCR tüpünde, üst veya alt diziyi taşıyan 16 pmol in vitro transkribe RNA, 1 μL 10× katlanan RNA tamponu ve nukleazsız su ile 7 μL nihai hacmi elde edin.
      NOT: 16 pmol'a karşılık gelen RNA kütlesini hesaplamak için.
   3. Reaksiyonu RT'de 30 dakika boyunca ışıktan korunarak inkübe edin.
   4. Üst ve alt dizileri içeren RNA örneklerini tek bir PCR tüpünde birleştirin. Pipetle yukarı aşağı iyice karıştırın. Santrifüj 2.000 × g ile 2 saniye için, bir tezgah üstü minisantrifüjde. RT'de 30 dakika kuluçka yapın.
5. 100 mM spermin ve %500 PEG 8000 içeren 1:2 (v/v) premiksiyle 6 μL ekleyin. Pipetle yukarı aşağı iyice karıştırın. Santrifüj 2.000 × g ile 2 saniye için, bir tezgah üstü mini santrifüjde.
   NOT: %50 PEG 8000 oldukça viskozdur. Pipetle yavaş ve dikkatli.
6. Reaksiyona 2 μL 1 mM DFHBI-1T ekleyin. Pipetle yukarı aşağı iyice karıştırın. Santrifüj 2.000 × g ile 2 saniye için, bir tezgah üstü mini santrifüjde. Reaksiyon sarı-yeşil görünmelidir.
   NOT: 1 mg DFHBI-1T (MW: 320.21) liyofilize boyadan 20 mM DFHBI-1T stok çözeltisi hazırlamak için, 156 μL moleküler biyoloji kalitesinde susuz DMSO eklenin. Stoku az miktarda birden fazla mikrosantrifüj tüpünde alıp -20 °C'de saklayın. Boyanın tekrar eden donma-çözülme döngülerinden kaçının. 20 mM stoku nukleazsız suda seyreltirip buz üzerinde saklayarak taze seyreltilmiş 1 mM DFHBI-1T çalışma çözeltisi hazırlayın.
7. Reaksiyonu cam odalı bir örtü camına yükleyin.
8. Buharlaşmayı en aza indirmek için kapağı açık şekilde RT rejiminde 4 saat kuluçka yapın.

5. Görüntülemeye hazırlanmak

1. Uygun lazerler ve objektiflerle donatılmış yapılandırılmış aydınlatma veya konfokal mikroskop kullanarak üç boyutlu görüntüler elde edin.
   NOT: Odak dışı ışığı en aza indirmek için konfokal mikroskopi gereklidir.
2. Mikroskobu ilgi gören her bölgeyi (ROI) önce her z-düzleminde Cy5 kanalı ile görüntüleyecek şekilde yapılandırın, ardından aynı ROI'yi GFP kanalı ile görüntüleyin.
3. Tüm kanallar için pozlama süresini 500 ms olarak ayarlayın. GFP için lazer gücünü %80, Cy5 için %40 olarak ayarlayın.
4. RT'de reaksiyon damlasının dışındaki bir örtü bölgesini 150 nm z-adım boyutuyla görsün.

6. Moleküller arası baz eşleşmesinin nicelendirilmesi

1. Görüntüleri görüntü analiz yazılımına aktar²¹. GFP (DFHBI-1T) ve Cy5 (RNA) kanallarını tanımlayın.
2. Bir RNA kümesi içinde 5 × 5 piksel yatırım getirisi çizin ve aynı z-düzleminde her iki kanal için entegre yoğunluğu ölçün. Her görüntüde farklı RNA kümelerinden 5–8 yatırım getirisi seçin.
   NOT: Kamera kurulumuna göre ROI boyutunu ayarlayın, ancak deneyler arasında tutarlılığı koruyun.
3. Arka plan ölçümü için reaksiyon damlasının dışındaki 5–8 yatırım getirisi seçin ve her iki kanal için ortalama entegre yoğunluğu hesaplayın.
4. Her yatırım getirisi için normalize DFHBI-1T yoğunluğunu şu yöntemlerle hesaplayın:
   

7. Yaygın sorunlar ve sorun giderme

1. Santrifüjasyondan sonra RNA peleti gözlemlenmezse, RNA bozulması, yetersiz transkripsiyon süresi, inaktif polimeraz, kalıntı tuzlar veya düşük RNA konsantrasyonu göz önünde bulundurulabilir. RNase içermeyen reaktifler kullanın, transkripsiyon süresini uzatın, taze enzim kullanın ve şablonları arındırın.
2. Eğer Cy5 etiketli RNA kümesi gözlemlenmezse, RNA bozulmasını veya bozunmuş PEG 8000 veya UTP-Cy5'i düşünün. Yeni reaktifler ve RNase içermeyen koşullar kullanın.
3. Eğer birlikte katlanma koşullarında DFHBI-1T sinyali gözlemlenmezse, kötü boya kalitesi, brokoli yapı oluşumunun eksikliği veya kesilmiş transkriptler göz önünde bulundurulabilir. Taze boya kullanın, doğru tampon bileşiminden emin olun ve transkript boyutunu jel analiziyle doğrulayın.
4. Floresan sinyali ağarırsa, lazer gücünü ve pozlama süresini azaltın, görüntüleme adımlarını en aza indirin ve inkubasyon sırasında örnekleri ışıktan koruyun.

Results

Bu gösteri deneyinde, üst ve alt RNA raporlayıcılarının tek başına baz çifti yapıp Brokoli yapısını oluşturma yeteneği ilk olarak daha önce tanımlanan in vitro RNA kümeleme^{protokolü 4} kullanılarak değerlendirildi. Üst ve alt taban arasındaki baz eşleşmesi, her biri bir DFHBI-1T molekülünü ara geçirebilen iki Brokoli kolu oluşturur (Şekil 1A–C)^18,22.

RNA'nın spermin ve PEG 8000 ile kümelenmesi sonucunda, her iki RNA da tek tek ya da birlikte küme oluşturdu (Şekil 1D–Eii). Üst veya alt RNA'lar izole olarak incelendiğinde, RNA kümelerindeki DFHBI-1T floresansı, iki RNA'nın ısı denatürasyonu ve yeniden katlanmadan önce birleştirildiği ko-katlanma durumundakinden oldukça daha düşüktü (Şekil 1F). Birlikte katlanma durumunda, DFHBI-1T (0,1 mM) ile üst (0,8 μM) ve alt (0,8 μM) arasındaki azı dişleri oranı 125:1:1 olarak tahmin edilmiştir. Bu, maksimum potansiyel Brokoli yapısına kıyasla yaklaşık 62,5 kat fazla DFHBI-1T ile eşleşir.

Sadece üst ve alt kısımlar için gözlemlenen düşük ama sıfır olmayan DFHBI-1T sinyali, her raporlayıcı bireysel olarak¹⁸ ifade edildiğinde minimum DFHBI-1T floresansını gösteren önceki raporlarla tutarlıdır. DFHBI-1T ayrıca RNA yokluğunda çok düşük ama tespit edilebilir arka plan floresansı göstermiştir (Şekil 1F). Bu sonuçlar birlikte, DFHBI-1T'nin in vitro RNA kümeleme testi ile uyumlu olduğunu ve birlikte katlamanın, üst ve alt RNA'lar arasında moleküller arası baz eşleşmesini artırdığını göstermektedir.

RNA yoğunluğuna normalleşmeden sonra, birlikte katlanma durumunda normalize edilmiş DFHBI-1T floresans yoğunluğu 1.03'e ulaştı; bu, üst ve alt seviyenin (sırasıyla 0.054 ve 0.023) oranından anlamlı derecede yüksekti (Şekil 1D, Şekil 1EI ve Şekil 1F). Üst ve alt RNA'ların karıştırılmasıyla oluşan ve kümelenmeden önce ayrı katlanmış RNA kümeleri incelendi (Şekil 1D, Şekil 1Eii ve Şekil 1F). Bu ayrı katlanma durumunda, normalleştirilmiş DFHBI-1T sinyali 0.031 olup, negatif kontrollerde (sadece üst veya alt kısım) gözlemlenen temel seviyelerle karşılaştırılabilir (Şekil 1F). Bu sonuçlar, birlikte katlanmanın üst ve alt RNA'lar arasında moleküller arası baz eşleşmesini teşvik ettiğini, ayrı katlanmanın ise bu etkileşimleri kısıtladığını göstermektedir.

Üst ve alt diziler daha sonra Drosophila melanogaster kapanmasının (shu) 3′ çevrilmemiş bölgesine (UTR), bir mikrop granüllü^{mRNA 4,23,24} ve onun antisens karşılığına (shu^anti) eklendi. Shu 3′ UTR, önceki çalışmaların bu RNA'nın ağırlıklı olarak Drosophila melanogaster'de monomer olarak bulunduğunu ve RNA jel^{testleri 4,24'te} yüksek azı konsantrasyonlarda bile dimerleşmediğini gösterdiği için seçildi. Ayrıca, shu-üst ve shu-bottom RNA^{jellerinde homodimer oluşturmaz;} bu da üst ve alt arasındaki moleküller arası etkileşimlerin ve shu'dan türetilen yan dizilerin etkisinin daha doğrudan değerlendirilmesini sağlar.
Shu-top, shu-bottom, shu^anti-top ve shu^anti-bottom için DNA şablonları Tablo 2'de listelenmiştir. Üst ve alt dizileri shu veya ^{shu anti} 3′ UTR'nin ortasına yerleştirildi; bu da etkileşimi kolaylaştırmak ve fizyolojik RNA-RNA etkileşimlerini daha iyi taklit etmek için yapısal yeniden yapılandırma gerektirdi; bu etkileşimli bölgeler genellikle transkript^4'ün içine gömülüyor.

RNA kümelenmesinin indüklenmesinde, shu-top, shu-bottom, shu^anti-top ve shu anti-bottom bireysel olarak minimal DFHBI-1T floresansı göstermiştir; bu da sadece üst ve alt kısımlara benzer (Şekil 2A ve 2B). Tutarlı olarak, shu-top'un shu-bottom ile veya shu anti-top'un shu anti-bottom ile birlikte katlanması, ayrı katlamadan daha yüksek DFHBI-1T sinyali üretmiştir (Şekiller 2Ci ve Cii). RNA yoğunluğu ve negatif kontrollere normalleşmeden sonra (yalnızca her RNA'dan ortalama normalize edilmiş DFHBI-1T sinyali olarak tanımlanır), shu-üst ve shu-bottom'un birlikte katlanması normalize edilmiş DFHBI-1T floresansında 5,63 kat artışa yol açmıştır (Şekil 2Di ve 2Dii). Buna karşılık, ayrı katlanma sadece 1,04 kat artış gösterdi; bu, shu-top ve shu-bottom için bireysel olarak gözlemlenen temel seviyelere benzer bir artış gösterdi. Benzer eğilimler, birlikte katlanma ve ayrı katlanma koşullarında shu^anti-üst ve shu^anti-bottom için gözlemlenmiştir (Şekil 2Di ve 2Dii). Bu sonuçlar, ayrı katlanmanın shu-top ve shu-bottom veya shu^anti-top ile shu^anti-bottom arasında moleküller arası baz eşleşmesini teşvik etmediğini, oysa birlikte katlanmanın bu etkileşimleri güçlendirdiğini, muhtemelen eklenen raporlayıcı dizilerinden kaynaklandığını göstermektedir.

Shu ve ^{shu anti'nin} baz çifti olup olmadığını test etmek için shu-top ile ^{shu anti-bottom}, shu^anti-top ise shu-bottom ile karıştırıldı. Her iki kombinasyon, hem birlikte katlanma hem de ayrı katlanma koşullarında shu-bottom ile shu-top veya shu anti-bottom ile shu anti-top ile karşılaştırıldığında daha yüksek DFHBI-1T floresansı göstermiştir (Şekil 2Ci ve 2Cii). Normalizasyondan sonra, shu-top'un shu^anti-bottom ve shu^anti-top ile shu-bottom ile birlikte katlanması DFHBI-1T floresansında sırasıyla 61,86 ve 82,60 kat artışa yol açmıştır (Şekil 2Di ve 2Dii). Buna karşılık, ayrı katlama sadece 2,69 ve 4,94 kat artış sağlamıştır (Şekil 2Di ve 2Dii). Birlikte katlanma koşullarına göre oldukça daha düşük olmalarına rağmen, bu değerler shu-bottom ile shu-top veya shu^anti-top ile shu^anti-bottom için gözlemlenenlerden daha yüksekti (sırasıyla 1.04 ve 1.16).

Bu sonuçlar birlikte, ek tamamlayıcı diziler taşıyan raporlayıcıların, böyle dizileri olmayanlara göre daha fazla baz çifti oluşturma kapasitesine sahip olduğunu göstermektedir. Bu etki, moleküller arası etkileşimleri teşvik eden ko-folding koşullarında daha da güçlendirilir.

Şekil 1: Üst ve alt RNA'ların tahmin edilen ikincil yapıları ve in vitro RNA kümelerinde moleküller arası baz eşleşmelerinin nicelendirilmesi. (A–B) RNAfold²⁵ tarafından öngörüldüğü gibi, üst (A) ve alt (B) ikincil yapılarının tek tek katlanmış örnekleri. Ayrı katlandığında, üst ve alt kısımlar Brokoli aptamerini yeniden oluşturmaz ve DFHBI-1T (gri yıldız) minimal floresans üretir. (C) RNAcofold²⁵ tarafından öngörüldüğü gibi baz çiftli üst ve alt RNA'ların ikincil yapısına örnek. İki RNA arasındaki moleküller arası baz eşleşmesi, iki Brokoli^{kolu 18'i} yeniden oluşturur; bu da DFHBI-1T bağlanmasını mümkün kılar ve güçlü yeşil floresans (yeşil yıldızlar) elde eder. (D) DFHBI-1T'nin (sadece boya kontrol) ve üst ve alt RNA'lar tarafından DFHBI-1T (yeşil) varlığında oluşturulan in vitro RNA kümelerinin (magenta) görüntüleri. (Ei, ii) DFHBI-1T (yeşil) varlığında üst ve alt RNA'lar tarafından oluşan in vitro RNA kümeleri (magenta). D ve E panelleri için RNA'lar Cy5 ile etiketlenmiştir; ortalama olarak RNA'ların yaklaşık üçte biri tek bir Cy5 etiketli urasil içerirken, kalan üçte ikisi etiketlenmemiştir. Görüntüler, 150 nm adım boyutunda alınan 27 dilimin ortalama Z-projeksiyonlarını temsil eder; her kanal için tüm koşullarda aynı pozlama ve lazer gücü kullanılır. DFHBI-1T floresansı koşullar arasında aynı yoğunluk aralığında normalleştirildi. Ölçek çubukları: 2 μm. (F) DFHBI-1T yoğunluğu, Cy5 floresansı ile ölçüldüğünde RNA bolluğuna normalize edildi. Veriler ortalama ± SEM olarak sunulmaktadır. İki kuyruklu t-testi için P-değerleri (**** vs. birlikte katlanma): 1.0 × 10⁻²² (sadece boya), 2.3 × 10⁻²² (üst), 4.9 × 10⁻²³ (alt) ve 7.0 × 10⁻²³ (ayrı katlama). n = sadece boya koşulları için 30 bölge ve diğer tüm koşullar için 30–31 RNA kümeleri. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Shu ve ^{shu anti} taşıyan üst ve alt muhabirler için moleküller arası baz eşleşmesinin temsil görüntüleri ve nicelikleri. (A) DFHBI-1T (yeşil) varlığında shu-top, shu-bottom, shu^anti-top ve shu^anti-bottom RNA'lar tarafından oluşturulan in vitro RNA kümelerinin (magenta) yalnızca (sadece boya kontrol) görüntüleri. RNA'lar, in vitro transkripsiyon sırasında ortalama olarak üç UTP-Cy5 urasilinin dahil edildiği Cy5 ile etiketlenmiştir. Görüntüler, 150 nm adım boyutunda alınan 27 dilimin ortalama Z-projeksiyonlarını temsil eder; her kanal için tüm koşullarda aynı pozlama ve lazer gücü kullanılır. DFHBI-1T floresansı koşullar arasında aynı yoğunluk aralığında normalleştirildi. Ölçek çubukları: 2 μm. (B) DFHBI-1T yoğunluğu, Cy5 floresansı ile ölçüldüğüne göre RNA bolluğuna normalleştirildi. Veriler ortalama ± SEM. n.s. olarak sunulur, anlamlı değildir. İki kuyruklu t-testi için P-değerleri (sadece boya ile karşılaştırıldığında): 3.1 × 10⁻³ (**; shu-top), 1.7 × 10⁻¹ (NS; şu-bottom), 2.9 × 10⁻³⁵ (***; shu anti-top), ve 2.2 × 10⁻² (; shu^anti-bottom). n = sadece boya koşulları için 30 bölge ve diğer tüm koşullar için 30–32 RNA kümesi. (Ci, ii) DFHBI-1T (yeşil) varlığında birlikte katlanma (i) ve ayrı katlanma altında şu üst ile shu-bottom, shu^anti-üst ile shu anti-bottom, shu anti-top ile shu-bottom ve shu^anti-top ile shu-bottom ile karıştırıldığında oluşan in vitro RNA kümelerinin (magenta) görüntüleri ( ii) koşullar. Görüntüler, 150 nm adım boyutunda alınan 27 dilimin ortalama Z-projeksiyonlarını temsil eder; her kanal için tüm koşullarda aynı pozlama ve lazer gücü kullanılır. Düşük aralık için, DFHBI-1T floresansı Şekil 1D–Eii ve Şekil 2A ile aynı yoğunluk aralığına normalize edilmiştir. Yüksek aralık için, DFHBI-1T floresansı paneller Ci ve Cii'de tüm koşullarda daha yüksek ama tutarlı bir yoğunluk aralığına normalize edilmiştir. Ölçek çubukları: 2 μm. (Di, ii) DFHBI-1T yoğunluğu önce RNA yoğunluğuna, ardından negatif kontrollere normalleştirildi; bu da yalnızca her RNA'dan ortalama normalize edilmiş DFHBI-1T sinyali olarak tanımlandı. Veriler ortalama ± SEM. n.s. olarak sunulur, anlamlı değildir. (i) İki kuyruklu t-testi için P-değerleri (**** vs. shu-top + shu-bottom): 1.1 × 10⁻³¹ (shu^anti-top + shu^anti-bottom), 1.1 × 10⁻²² (shu-top + shu^anti-bottom) ve 4.3 × 10⁻²⁷ (shu^anti-üst + shu-bottom). (ii) İki kuyruklu t-testi için P-değerleri (shu-üst + shu-bottom karşılaştırması): 2.2 × 10⁻¹ (n.s.; shu anti-üst + shu anti-bottom), 1.9 × 10⁻9 (; shu-top + shu^anti-bottom), ve 1.3 × 10⁻¹⁵ (; shu^anti-üst + shu-bottom). n = tüm koşullar için 29–32 RNA kümesi. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

İsim	Diziler (5′-3′)
T7 organizatörü	TAATACGACTCACTATAG
üst	GGATGATGGAGACGGTCGGGTCGGTC CAGGATCATTCATGGCAAGAC GGTCGGGTCCAGATGCGGAT
alt	GGATCCGCATCATCTGTCGAGTAG AGTGTGGGCTTGCCATGTGTAT GTGGGTCAACCCACATACTCTGAT GATCCTGTCGAGTAGAGTGTGGGGC TCCATCATCC
üst düzey T7 forvet	TAATACGACTCACTATAG GGATGATGATGGAGACGGTCG
Top-Reverse	ATCCGCATCATCTGGACCC
alt-T7 forvet	TAATACGACTCACTATAGG GATCCGCATCATCTGTCGA
alt-Ters	GGATGATGGAGCCCACACT
Öndeki primerler, T7 promoter dizisinin çıkıntısı (kalın yazılmış) içerir, ardından RNA'nın 5′ ucunu hedefleyen diziler gelir.

Tablo 1: T7 promotoru dizileri, bölünmüş brokoli raporlayıcıları ve T7 transkripsiyonu için DNA şablonlarını amplifikasyonda kullanılan primerler. Listelenen primerler, üst ve alt RNA'ların in vitro transkripsiyonu için DNA şablonları oluşturmak için kullanıldı ve bu şablonlar, bu çalışmada tanımlanan RNA kümeleme testlerinde kullanıldı.

İsim	Diziler (5′-3′)
shu-top	GCTTACTAAGAAGCCCCAGTATTTCATATTTCATATCTTACTCAAAAAGGATGATGGAG ACGGTCGGGTCCAGGATCATTCATGGCAAGAGACGGTCGGGTCCAGATGCGGA TAAAAAACATACCAAACATGAAGGTAATTTAGTTCCAAGTTCTAGAAGAGCAGTATCATT AGTTATTTCGATATTAGCAACATGAATATCGTAAGCCCAGAGAATGTTAACGTTTTTTGT TATTTAGAGCAACGTAGACCTTAAGTTGTTAAAAACCACAATAAAAGTAATGCACGGCAGCTACAT
shu-bottom	GCTTACTAAGAAGCCCCAGTATTTCATATTTCATATCTTACTCAAAAAGGATCCGCATCATCATC TGTCGAGTAGAGTGTGGGCTCTTGCATGTGTATGTGTGTGGTCAACCCACATACTCTGATG ATCCTGTCGAGTAGAGTGTGGGCTCCATCCAAAAAACACATACCAAACAAGGTAAT TTAGTTCCAAGTTCTAGAAGAGCAGTATCATTAGTTATTCGATATTAGCAACAGAATATCG TAAGCCCAGACGAATGTTAACGTTTTTTTTTTTTTTTTTTGTTATTTAGAGCAACGTAGACCTTAAGTTGTTAA AAACCACAATAAAAAGTAATGCACGGCAGCTACAT
ShuAnti-Top	ATGTAGCTGCCGTGTGCATTACTTTTATTGTGGTTTTTAACAACTTAAGGTCTACGTTGCTCTAA ATAACAAAAAAAACGTTAACATTCGTCTCTGGGGCTTACGATATTCATGTTGCTAATATCGAAATAAC TAATGATACTGCTCTTCTAGAACTTGGAACTAAATTACCTTCATGTTTGTTGTATTTTTTTGGA TGATGGAGACGGTCGGGTCCAGGATCATTCATGGCAAGAGACGGTCGGGTCCAGATGATGATGATGAT GCGGATTTTTTTGAGTAAGAAGATAATAATATGAAATGAATACTGGGGCTCTTAGTAAGC
ShuAnti-Bottom	ATGTAGCTGCCGTGTGCATTACTTTTATTGTGGTTTTAACAACTTAAGGTCTACGTTGCTCTA AATAACAAAAAAAACGTTAACATTCGTCTGGGGCTTACGATATTCATGTTGCTAATATCGAAATA ACTAATGATACTGCTCTTCTAGAACTTGGAACTAAATTACCTTCATGTTTGTTGTATGTTTTTT GGATCCGCATCTCTCTCGAGTAGAGTGTGGGCTCTTGCATGTGTGTGTGGGTCAAC CCACATACTCTGATCCTGTCGAGTAGAGTGTGGGCTCCATCATCATCTTTTTTGAGTAA GATATGAAATATGAAATACTGGGGCTTCTTAGTAAGC
shu-top veya shu-bottom-T7 ileri	TAATACGACTCACTATAGGGCTTACTAAGAAGCCCCCAGT
shu-top ya da shu-bottom-Ters	ATGTAGCTGCCGTGCATTAC
shuanti-top veya shu anti-bottom-T7 forward	TAATACGACTCACTATAGGGATGTAGCTGCCGTGTGCATTA
shuanti-top ya da shuanti-bottom-Ters	GCTTACTAAGAAGCCCCAGTA
Öndeki primerler, T7 promoter dizisinin çıkıntısı (kalın yazılmış) içerir, ardından RNA'nın 5′ ucunu hedefleyen diziler gelir. T7 promoatörü ve shu-top ile shu-bottom veya shuanti-top ve shuanti-bottom arasında sırasıyla bir veya iki ek G eklendi. Bunun nedeni, +2 ve +3 pozisyonlarında G'lerin olması, transkripsiyonverimini 19 önemli ölçüde artırabilir. Ancak, bu ek G'ler tasarlanmış yapılarda baz eşleşmesinin yorumlanmasını etkileyebilir. Adım 1.1'deki nota bakınız.

Tablo 2: T7 transkripsiyonu için DNA şablonlarını amplifikasyonda kullanılan shu-top, shu-bottom, shu ^anti-top, shu ^anti-bottom ve primerlerin dizileri. Listelenen primerler, üst ve alt raporlayıcıları taşıyan shu ve shu ^anti RNA'ların in vitro transkripsiyonu için DNA şablonları oluşturmak için kullanıldı ve bu çalışmada tanımlanan RNA kümeleme testlerinde kullanıldı.

Discussion

Bu çalışmada, bölünmüş Brokoli aptamer^{sistemi 18}, in vitro RNA kümeleme koşullarında moleküller arası baz eşleşmesinin doğrudan görselleştirilmesi ve nicelendirilmesi için uyarlanmıştır. Bu yaklaşım, farklı in vitro koşullarda moleküller arası baz eşleşmesinin değerlendirilmesini sağlar ve RNA çekme deneyleri gibi baz eşleştirme çapraz^{bağlayıcıları} 15,16,17 ve jel^{elektroforezi 4,6,7} gibi sonraki biyokimyasal testleri tamamlar. Bu biyokimyasal yöntemlerin aksine, RNA kümeleri içindeki baz eşleşmesini dışarıda gerçekleşenlerden ayırt etmek için mekansal çözünürlüğe sahip olmadıkları için, bu yaklaşım kümeler içindeki etkileşimlerin doğrudan mekansal görselleştirilmesini sağlar. Özellikle, üst ve alt RNA'lar veya bu raporlayıcıları taşıyan RNA'lar arasındaki baz eşleşmesinin tanımlanmış RNA kümeleme koşulları altında izlenmesine olanak tanır. Ayrıca, çapraz bağlama veya RNA çıkarımı gerektirmeden raporlayıcı RNA'lar arasında baz eşleşmesinin gerçek zamanlı, nicel bir okumasını sağlar; böylece örnek kaybı ve tampon uyumsuzluğunu en aza indirir.

Flüoresans mikroskobu kullanılarak, bölünmüş Brokoli aptamer dizileri arasındaki moleküller arası baz eşleşmesi DFHBI-1T sinyali aracılığıyla nicel olarak ölçüldü ve DFHBI-1T'nin in vitro RNA kümeleme protokolü ile uyumluluğunu gösterdi. Moleküller arası baz eşleşmesinin kapsamı, RNA katlanma koşullarına bağlı olarak değişiyordu; bu durum hem ortak katlanma hem de ayrı katlanma koşullarında gözlemlenmiştir (Şekil 1F ve Şekil 2Di–2Dii). Bu bulgular, RNA katlanma koşullarının moleküller arası RNA etkileşimlerini kritik şekilde etkilediğini ve deneysel sonuçlar yorumlanırken dikkatlice değerlendirilmesi gerektiğini göstermektedir.

Bu test, üst ve alt raporlayıcıların yanındaki dizilerin şu kullanılarak gösterildiği gibi moleküller arası baz eşleşmesini artırıp artırmadığını değerlendirmek için bir platform sağlar. DFHBI-1T floresansı, shu^anti-bottom ile shu-top ve shu ^anti-top ile shu-bottom ile shu-top veya shu^anti-top ile shu anti-bottom ile olan bu da shu ile shu anti alt içeren moleküller arası etkileşimlerin daha yüksekti; bu da shu ve ^{shu anti} içeren moleküller arası etkileşimlerin Brokoli sinyalini daha da güçlendirir. Bu gözlemler, üst ve alt raporlayıcıların birlikte katlanmasından elde edilen DFHBI-1T floresans sinyalinin yalnızca testin üst sınırını temsil etmediğini göstermektedir.

Bu deneylerde ölçülen DFHBI-1T floresansı geniş bir dinamik aralıktı; 1,04 kat artıştan (ayrı katlanma altında shu-bottom ile shu-bottom) 82,60 kat artışa kadar (shu ^anti-üst ile shu-bottom ko-katlanma koşullarında) arasında geniş bir dinamik aralık kapsıyordu. Bu dinamik aralık, bu raporlayıcıları taşıyan RNA'lar arasındaki moleküller arası RNA etkileşimlerindeki farkların tespit edilmesini sağlar.

Bu protokoldeki birkaç adım, RNA kümelerinde bölünmüş Brokoli üst ve alt RNA'ları arasında moleküller arası RNA bazı eşleşmesinin başarılı bir şekilde tespit edilmesi için kritiktir. PEG 8000'in taze aliquotları RNA kümelenmesini güvenilir şekilde indüklemek için kullanılmalı ve reaktif kararsızlığı nedeniyle tekrarlanan donma–erime döngüleri en aza indirilmelidir. DFHBI-1T, floresans özelliklerini korumak için aliquote edilip −20 °C'de depolanmalıdır. In vitro transkripsiyon ürünleri, kümelenmeden önce denatürleyici RNA jel üzerinde analiz edilmek için doğru transkript boyutunu doğrulamalıdır. Ayrıca, RNA damlacıklarının görüntülemeden önce uzun süre oda sıcaklığında inkübe edildiği için, temiz çalışma ortamı ve görüntüleme odası dahil olmak üzere RNase içermeyen koşulların korunması çok önemlidir.

Bu testin bir sınırlaması, DFHBI-1T'nin özellikle üst ve alt diziler aracılığıyla moleküller arası baz eşleşmesini rapor etmesidir. Farklı RNA bölgelerinde gerçekleşen diğer moleküller arası baz eşleşme olayları tespit edilemez. Ayrıca, üst ve alt iplikler arasındaki baz eşleşmesiyle oluşan Brokoli yapısı termodinamik olarak^{kararlıdır 26} ve Drosophila tohum granül mRNA kümelerinde gözlemlendiği gibi, dağınık, yüzeye maruz kalan bazlar gibi daha zayıf veya geçici etkileşimleri tam olarak yansıtmayabilir^.

Ayrıca, moleküller arası RNA–RNA etkileşimleri serbest ve spesifik olmayabilir, üstteki ve alt raporlayıcıların yanındaki diziler DFHBI-1T floresansını etkileyebilir. Bu yan bölgeler, raporlayıcı dizileriyle doğrudan etkileşime girerek Brokoli oluşumunu engelleyebilir veya RNA yapısını değiştirebilir; böylece raporlayıcıları taşıyan RNA'lar arasındaki etkileşimleri etkileyebilir. Buna göre, test, RNA yapısının, üst-alt bazın eşleşmesinin, yan diziler arasındaki etkileşimlerin ve yan diziler ile raporlayıcılar arasındaki etkileşimlerin birleşik etkilerini yansıtır.

Bu test, gelecekteki araştırmalar için fırsatlar sunar. Örneğin, raporlayıcıların yanındaki RNA dizilerini değiştirmek, RNA helikazlarını veya şaperonları eklemek veya tuz koşullarını değiştirmek, RNA kümelerinde moleküller arası baz eşleşmesini etkileyebilir. Bu etkiler, DFHBI-1T sinyalinin birlikte katlanma ve ayrı katlanma koşullarında ölçülmesiyle değerlendirilebilir. Benzer RNA aptamerlerinin hücrelerde, bakterilerde ve^maya 26,27,28,29,30'da kullanıldığı göz önüne alındığında, bu yaklaşım mRNA kümelerinde moleküller arası baz eşleşmesini incelemek için selülo sistemlere veya model organizmalara da genişletilebilir.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1M MgCl2	Millipore Sigma	M1028	10& Times hazırlamak için kullanılmıştır; RNA yeniden katlama tamponu.
2M KCl	Thermo Fisher Scientific	AM9640G	10& Times hazırlamak için kullanılmıştır; RNA yeniden katlama tamponu.
%50 PEG 8000	NEB	M0204S	T4 RNA ligaz kiti bileşeni; RNA kümelenmesini indüklemek için moleküler kalabalık reaktif olarak kullanılır.
Mutlak etanol, 200 kanıt	Thermo Fisher Scientific	T038181000CS	RNA yıkama tamponu hazırlamak için kullanılır.
Asit fenol:kloroform, pH 4.5 (IAA ile, 125:24:1)	Thermo Fisher Scientific	AM9722	RNA arıtması için kullanılır.
Aminoallyl-UTP-Cy5	Jena Bioscience	NU-821-CY5	In vitro transkripsiyon sırasında RNA etiketleme için kullanılır.
Odalı kaplama cam	Thermo Fisher Scientific	155409PK	RNA kümeleme reaksiyonları için görüntüleme odası.
Kloroform	Thermo Fisher Scientific	C298-500	RNA arıtması için kullanılır.
DFHBI-1T	Lucerna	410	Brokoli RNA aptamerinin tespiti için florofor olarak kullanılır.
DMSO	Thermo Fisher Scientific	D12345	Ansusuz; moleküler biyoloji notu; DFHBI-1T hazırlanmasında kullanılır.
DNA Temizliği & Konsantrasyon Kiti	Zymo	D4014	T7 transkripsiyonundan önce DNA ürünlerinin temizlenmesi için kullanılır.
DNA Jel Çıkarma Kiti	NEB	T1020L	Jel ekstraksiyonu için kullanılır.
Kuru banyo	Benchmark Scientific	BSH1001	Mikrosantrifüj tüplerinde RNA örneklerinin ısıtılması için kullanılır.
FIJI/ImageJ	NIH (Ulusal Sağlık Enstitüleri)	Yok	Açık kaynak görüntü analiz yazılımı; floresans yoğunluğu ve ROI analizinin nicelendirilmesi için kullanılır.
Jel elektroforez sistemi	Thermo Fisher Scientific	B2-BP	DNA jel elektroforezi çalıştırmak için kullanılır.
Jel yükleme boyası, mor (6 kez;)	NEB	B7024S	DNA jel elektroforezi için yükleme boya olarak kullanılır.
Anında yapılandırılmış aydınlatma mikroskobu	VisiTech uluslararası	VT-iSIM	GFP ve Cy5 floresansını görüntülemeye çalışan bir konfokal mikroskop.
İzopropanol	Thermo Fisher Scientific	327272500	RNA arıtması için kullanılır.
MEGAscript T7 Transkripsiyon Kiti	Thermo Fisher Scientific	AM1334	In vitro T7 transkripsiyonu için kullanılır. Kit, nukleotid çözeltileri (ATP, CTP, GTP, UTP) ve DNAZ'ı içerir.
Mikrosantrifüj tüpleri	Genesee Scientific	22-284	1.5mL tüp; in vitro transkripsiyon, RNA ürünleri ve spermin ile DFHBI-1T.  aliquotları için DNA şablonlarının depolanması için kullanılır;
Mini santrifüj	Benchmark Scientific	Z763845	Kısa süreli santrifüj için kullanılır.
Nanodrop One Spektrofotometre	Thermo Fisher Scientific	13-400-518	DNA ve RNA konsantrasyonu ile kalitesini ölçmek için mikrohacim spektrofotometresi.
Nükleazsız su	Thermo Fisher Scientific	AM9937	RNA peletlerinin yeniden süspansiyonu, RNA yıkama ve yeniden katlama tamponlarının hazırlanması, spermin ve DFHBI-1T'nin seyreltilmesi için kullanılır.
Çevrimiçi azı dişleri kütle hesaplayıcısı	New England Biolabs (NEB)	Yok	RNA kütlesini molyar miktardan hesaplamak için kullanılan çevrimiçi araç (örneğin, pmol).
Polipropilen PCR tüpleri	Corning	3745	200 μ PCR, in vitro transkripsiyon ve RNA kümeleme reaksiyonları için kullanılan L PCR tüpleri
PowerPac Temel Güç Kaynağı	Bio-rad	1645050	DNA jel elektroforezi çalıştırmak için kullanılır.
Proflex PCR termal döngücü	Thermo Fisher Scientific	44-840-73	PCR, in vitro transkripsiyon ve ısıtma RNA örnekleri için PCR tüplerinde kullanılır.
Q5 Yüksek Hassasiyet 2& kez; Master Mix	NEB	M0492S	2× olarak kullanıldı; Yüksek kaliteli master mix.
Soğutmalı santrifüj	Eppendorf	5424R	RNA arındırma ve peletleme için kullanılır.
RNase Dekontamminasyon Çözümü	Thermo Fisher Scientific	AM9782	Laboratuvar tezgahları ve yüzeylerinin temizlenmesinde RNase kontaminasyonunu en aza indirmek için kullanılır.
Spermin  tetrahidroklorür	Sigma-Aldrich	S1141-1G	RNA kümelenmesini indüklemek için kullanılır.
Tris Üssü	Millipore Sigma	T1503-1KG	Tris tamponu (pH 7.0) hazırlanmasında kullanılır.
Ultrasaf agaroz	Thermo Fisher Scientific	16500500	DNA jel elektroforezi için kullanılır.