Method Article

Arabidopsis çekirdeklerinde tek moleküllü lokalizasyon mikroskopisi için sadeleştirilmiş bir protokol

DOI:

10.3791/70891

⸱

May 8th, 2026

 ,  ,  , 
1Institut de Biologie Structurale, CEA, CNRS, Université Grenoble Alpes, 2Plant and Cell Physiology Lab (LPCV), Bioscience and Biotechnology Institute of Grenoble, Grenoble Alpes University - CNRS - INRAE - CEA, 3Integrated Structural Biology Grenoble (ISBG) CNRS, CEA, Université Grenoble Alpes

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, izole Arabidopsis çekirdeklerinin tek moleküllü lokalizasyon mikroskopik görüntülemesi için verimli bir iş akışı sunar; optimize edilmiş izolasyon, fiksasyon ve etiketleme kullanılarak kromatin ve RNA Polimeraz II'nin nano ölçekli görselleştirilmesini sağlar. Bu yaklaşım, yüksek çözünürlüklü görüntüleme için diğer kromatin ilişkili proteinlere veya histon modifikasyonlarına kolayca uyarlanabilir.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Konfokal floresan mikroskopisi, bitki çekirdeklerinde kromatin organizasyonu hakkında değerli bilgiler sağlamış olsa da, difraksiyon sınırlı çözünürlüğü kromatin mimarisinin araştırılmasını engellemiş ve Tek Molekül Lokalizasyon Mikroskopisi (SMLM) gibi süper çözünürlüklü tekniklerin kullanılmasını teşvik etmektedir. Bu yaklaşımlar arasında, doğrudan stokastik optik rekonstrüksiyon mikroskobu (dSTORM), bireysel hücrelerde nano ölçekli çözünürlük sağlar ve kromatin alanlarının, histon modifikasyonlarının ve nükleer organizasyonun hassas görselleştirilmesini sağlar. Bu yöntemler memeli sistemlerinde giderek daha fazla uygulansa da, bitki biyolojisinde kullanımı sınırlı kalır; bu durum büyük ölçüde örnek hazırlığındaki teknik zorluklar nedeniyle gerçekleşmektedir.

Burada, Arabidopsis thaliana'dan izole edilmiş çekirdeklerin SMLM görüntülemesi için sadeleştirilmiş ve tekrarlanabilir bir iş akışını sunuyoruz. Bu protokol, nükleer morfolojiyi korumak için fide fiksasyonu ile başlar, ardından nazik doku kesimi ve santrifüjleme ile sağlam çekirdekleri zenginleştirir. İzole çekirdekler daha sonra sıvı ortamda florofor etiketiyle işlenmiş ve düşük eriyen agaroz pedlerinde immobilize edilir; bu strateji uzun süreli tek moleküllü görüntüleme seanslarında stabiliteyi artırır. Bu adımlar topluca arka plan floresansını en aza indirir, etiketleme tutarlılığını artırır ve biyolojik kopyalar arasında tekrarlanabilirliği artırır.

Ortaya çıkan hazırlıklar, bitkilerde kromatin modifikasyonları ve nükleer mimariyi görselleştirmek için daha fazla netlik sağlar. Arabidopsis'te SMLM görüntülemenin uygulanmasındaki teknik engelleri azaltarak, bu protokol nano ölçekte epigenetik düzenleme, kromatin organizasyonu ve nükleer topolojik varyasyonları incelemek için çok yönlü bir yöntem sunar. Bu çalışma, SMLM'nin bitkilere uygulanması için metodolojik bir temel oluşturur, memeli hücre biyolojisiyle arasındaki boşluğu kapatır ve nükleer mimarinin bitki sistemlerindeki gelişimsel ve çevresel ipuçlarına yanıt olarak genom düzenlemesine nasıl katkıda bulunduğunu incelemek için yeni fırsatlar sunar.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikroskopi, kromatin organizasyonu ve nükleer mimariyi incelemek için uzun süredir temel taşı olup, DNA ve histonla ilişkili proteinlerin 3D nükleer uzayda nasıl düzenlendiğini ve gendüzenlemesini nasıl etkilediğini ortaya koymuştur 1,2. Geleneksel floresan mikroskopisi, kromozom bölgeleri, kromosentrler ve nükleercisimler 3,4 gibi büyük ölçekli kromatin alanları hakkında özellikle bitkiler için kökdokularında (3,5,6)....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

NOT: Bu protokolde kullanılan malzemeler ve aletler hakkında ayrıntılı bilgiler Materyaller Tablosu'nda mevcuttur. Aksi belirtilmedikçe, tamponlar apirojenik 0.2 μm filtrelerde temizlenir. Bu protokol boyunca çift damıtılmış ultra-saf H2O (ddH2O) kullanılır. Santrifüj adımları, sabit açılı bir rotor kullanılarak 1,5 mL mikrotüplerde gerçekleştirilir.

1. Fidelerin fiksasyonu ve çekirdeklerin serbest bırakılması

  1. Duman başlığının altına buzun üzerine 6 delikli bir kültür plakası yerleştirin, ardından her kuyuğa yaklaşık 4 mL buz soğukluğu fiks....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yukarıda açıklanan protokol, SMLM için uygun yüksek kaliteli Arabidopsis thaliana çekirdeklerinin hazırlanmasını sağlar. Nükleer bütünlüğü artırmak ve görüntü kalitesini bozan sitoplazmik ve hücresel kalıntıları azaltmak için birkaç kez optimizasyon turu gerçekleştirildi. Her optimizasyon adımından sonra, nükleer preparatların kalitesi Olympus IX81 döner disk mikroskobu kullanılarak konfokal görüntüleme ile değerlendirildi ve ardından süper çözünürlüklü alıma geçildi.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Arabidopsis thaliana çekirdeklerinin tek moleküllü lokalizasyon mikroskobu (SMLM) için hazırlanması, nihai örnek kalitesini güçlü şekilde etkileyen birkaç kritik adım gerektirir. Daha öncebelirtildiği gibi, 19,35, sağlam çekirdeklerin iyileşmesini maksimize etmek için kapsamlı ve tutarlı doku kesimleri gereklidir. Standart jilet yerine mikrotom bıçaklarının kullanılması, daha temiz ve düzgünlü doku parçalanması sağlar ve.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar çıkar çatışması olmadığını belirtmektedir.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

JF ve JFX boyalarını cömertçe sağladıkları için Lavis Laboratuvarı ve Janelia Açık Kimya ekibine teşekkür ederiz. Ayrıca, protokollerini nazikçe paylaşan Elizabeth Kracik-Dyer ve Célia Baroux'a, ayrıca Aline Probst ve Guillermo Orsi'ye de içgörülü tavsiyeleri için minnettarız. Optik görüntüleme, Grenoble Instruct-ERIC merkezinin (ISBG; UAR 3518 CNRS-CEA- UGA- EMBL) kapsamında, Grenoble Yapısal Biyoloji Ortaklığı bünyesinde yer almakta olup, Fransız Entegre Yapısal Biyoloji Altyapısı (ANR-10-INBS-0005-02) ve Grenoble Entegre Yapısal ve Hücre Biyolojisi İttifakı Labex tarafından desteklenmektedir; bu da Grenoble Alpes Üniversitesi Yükse....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Anti-RNA polimeraz II CTD tekrarı YSPTSPS (fosfor S2) antikoruAbcamAB5095Polimerazın aktif formunu görselleştirmek için immünboyayan tamponda 1/200 seyreltme ile kullanılan primer antikorlar (tavşanda yetiştirilen poliklonal antikor).
Satın alma yazılımıAbbelightNEO LiveImaging v2.18
Sığır Serum AlbüminiSigma-AldrichA7906   
KatalazSigma-AldrichC40
Düşük Eriyen Onaylı AgarozBio-Rad1613111
Coverslip kalınlığı 1.5H yuvarlakMarienfeld117640&Oslak;: 24 mm
D-(+)-Glikoz, susuz olan, %99Termo BilimselA16828-36 
Dikroik aynaSemrockDi03-R405/488/561/635-t1Uyarılma/emisyon ayrımı için dikroik ayna
Dulbecco' s Fosfat Tamponlu Salin 10 ve akut;BiowestX0515 - 500 Steril koşullarda çalışma
Epredia Ultra Tek Kullanımlık Mikrotom BıçaklarıFisherScientific12191830Düşük profilli, tek kullanımlık
Falcon 6-kuyu şeffaf düz tabanlı TC ile işlenmiş çoklu kuyu hücre kültür plakası, kapaklı  Falcon353046
Formaldehit çözeltisi %37Carl Roth7398Duman kaputu altında çalış
Glikoz oksidazSigma-AldrichG2133
GliserolVWR24388.295
Keçi Anti-Tavşan IgG (H+L) Yüksek Çapraz Adsorbe İkincil Antikor, Alexa Fluor Plus 647Termo BilimselA32733TR1/200 seviyesinde AF647'ye bağlı ikincil antikor olarak kullanılır
Hoechst 33258 çözümüSigma-Aldrich944031/500 oranında DNA'yı karşı boyamak için kullanılır, agaroz pedine eklenir
Hidroklorik Asit ÇözeltisiKimya-LaboratuvarıCL05.0311.1000 
JF549-HoechstLavis laboratuvarı ve Açık Kimya ekibi (Janelia)JF549-HoechstDNA'yı karşı boyamak için kullanılır, agarose pedine 1.5 nM nihai konsantrasyonda eklenir
KIMBLE Dounce doku öğütücüsü setiSigma-AldrichD89382 mL tüp, hem büyük (0.0030-0.0050 inç) hem de küçük (0.0005-0.0025 inç) boşluk havası taşıyan tüpler
Lazerler birimiOxxiusL6CcAltı lazerle donatılmıştır: 405 nm - 100 mW, 488 nm - 200 mW, 532 nm - 500 mW, 561 nm - 300 mW, 640 nm - 500 mW ve 730 nm - 30 mW
Magnezyum klorür heksahidratCarl RothHN03
Merkaptoetilamin (MEA)Sigma-Aldrich30070
MOPS sodyum tuzu %98Fisher Scientific SAS352590010
Çok bantlı emisyon filtresiSemrockFF01-446/523/600/677Lazer saçılma ışığını engellemek için çok bantlı emisyon filtrasyonu
NanoelmasAdamas NanoteknolojileriNDNV100nmHiWGA2mlStok 1 mg/mL
ORCA-Fusion Dijital CMOS kameraHamamatsuC14440-20UP 
Petri kabı, 100/20 mm, PS, şeffaf, havalandırmalı, sterilGreiner Bio-One6641611/2 MS ortamında bitki yetiştirmek için kullanılırdı
Petri kabı, kare, PS, şeffaf, 120/120/17 mm, sterilGreiner Bio-One688161Bitki fidelerini doğururken kullanılır
pluriStrainer Mini hücre süzgecipluriSelect43-10030-50Mesh boyutu 30 & mikro; m, 1.5 mL Eppendorf tüpü için uygundur
Potasyum klorürSigma-AldrichP9333
Tek bantlı emisyon filtresiSemrockFF01-698/70AF647 kanalı için özel emisyon filtresi
Tek bantlı emisyon filtresiChromaET600/50mJF549 kanalı için özel emisyon filtresi
Sodyum klorür (%99,5) Euromedex1112-A
Star-Frost kaydırmaları 76 x 26 mmKnittel  VS112711FKB.01
Steril şırınga filtresi/slash; 33 mm gözeneklilik 0.2 ve mikro; m Luer Kilidi konisiClearLine146560
Süper çözünürlük sistemiAbbelightSAFe360100x NA1.5 yağ batdırma objektefiyle donatılmış Olympus IX83
Tri-Sodyum Sitrat 2H2O Gen-Apeks BiomolProlaboPRO-33615.268
Tris Temel Moleküler Biyoloji DerecesiPromegaH5135
Tris(2-karboksietil)fosfin hidroklorür (TCEP)Termo Bilimsel20491
Triton X-100Euromedex2000-B
Tween 20Euromedex2001-B
Twinsil HızıPicodent13001002Silikon sızdırmazlık maddesi
Ultraviyole Ozon temizleme sistemi UVOCS fırınUVOCS Inc.T10X10Örtü kayma temizliği için 20 dakikalık pozlama;
Vakum pompasıVacuubrandVP 100C
Heraeus Megafuge 16R SantrifüjTermo BilimselRotor TX-400 75003629. Santrifüjleme Eppendorf tüpleriyle gerçekleştirildi.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Single Molecule LocalizationArabidopsis NucleiChromatin OrganizationSuper Resolution MicroscopydSTORM ImagingNuclear ArchitectureChromatin ModificationsFluorophore LabelingNuclei IsolationEpigenetic Regulation

Related Articles