Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Arabidopsis çekirdeklerinde tek moleküllü lokalizasyon mikroskopisi için sadeleştirilmiş bir protokol

348 görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/70891

⸱

8 Mayıs 2026

 ,  ,  , 
1Institut de Biologie Structurale, CEA, CNRS, Université Grenoble Alpes, 2Plant and Cell Physiology Lab (LPCV), Bioscience and Biotechnology Institute of Grenoble, Grenoble Alpes University - CNRS - INRAE - CEA, 3Integrated Structural Biology Grenoble (ISBG) CNRS, CEA, Université Grenoble Alpes

Bu makalede

Özet

Bu protokol, izole Arabidopsis çekirdeklerinin tek moleküllü lokalizasyon mikroskopik görüntülemesi için verimli bir iş akışı sunar; optimize edilmiş izolasyon, fiksasyon ve etiketleme kullanılarak kromatin ve RNA Polimeraz II'nin nano ölçekli görselleştirilmesini sağlar. Bu yaklaşım, yüksek çözünürlüklü görüntüleme için diğer kromatin ilişkili proteinlere veya histon modifikasyonlarına kolayca uyarlanabilir.

Özet

Konfokal floresan mikroskopisi, bitki çekirdeklerinde kromatin organizasyonu hakkında değerli bilgiler sağlamış olsa da, difraksiyon sınırlı çözünürlüğü kromatin mimarisinin araştırılmasını engellemiş ve Tek Molekül Lokalizasyon Mikroskopisi (SMLM) gibi süper çözünürlüklü tekniklerin kullanılmasını teşvik etmektedir. Bu yaklaşımlar arasında, doğrudan stokastik optik rekonstrüksiyon mikroskobu (dSTORM), bireysel hücrelerde nano ölçekli çözünürlük sağlar ve kromatin alanlarının, histon modifikasyonlarının ve nükleer organizasyonun hassas görselleştirilmesini sağlar. Bu yöntemler memeli sistemlerinde giderek daha fazla uygulansa da, bitki biyolojisinde kullanımı sınırlı kalır; bu durum büyük ölçüde örnek hazırlığındaki teknik zorluklar nedeniyle gerçekleşmektedir.

Burada, Arabidopsis thaliana'dan izole edilmiş çekirdeklerin SMLM görüntülemesi için sadeleştirilmiş ve tekrarlanabilir bir iş akışını sunuyoruz. Bu protokol, nükleer morfolojiyi korumak için fide fiksasyonu ile başlar, ardından nazik doku kesimi ve santrifüjleme ile sağlam çekirdekleri zenginleştirir. İzole çekirdekler daha sonra sıvı ortamda florofor etiketiyle işlenmiş ve düşük eriyen agaroz pedlerinde immobilize edilir; bu strateji uzun süreli tek moleküllü görüntüleme seanslarında stabiliteyi artırır. Bu adımlar topluca arka plan floresansını en aza indirir, etiketleme tutarlılığını artırır ve biyolojik kopyalar arasında tekrarlanabilirliği artırır.

Ortaya çıkan hazırlıklar, bitkilerde kromatin modifikasyonları ve nükleer mimariyi görselleştirmek için daha fazla netlik sağlar. Arabidopsis'te SMLM görüntülemenin uygulanmasındaki teknik engelleri azaltarak, bu protokol nano ölçekte epigenetik düzenleme, kromatin organizasyonu ve nükleer topolojik varyasyonları incelemek için çok yönlü bir yöntem sunar. Bu çalışma, SMLM'nin bitkilere uygulanması için metodolojik bir temel oluşturur, memeli hücre biyolojisiyle arasındaki boşluğu kapatır ve nükleer mimarinin bitki sistemlerindeki gelişimsel ve çevresel ipuçlarına yanıt olarak genom düzenlemesine nasıl katkıda bulunduğunu incelemek için yeni fırsatlar sunar.

Giriş

Mikroskopi, kromatin organizasyonu ve nükleer mimariyi incelemek için uzun süredir temel taşı olup, DNA ve histonla ilişkili proteinlerin 3D nükleer uzayda nasıl düzenlendiğini ve gendüzenlemesini nasıl etkilediğini ortaya koymuştur 1,2. Geleneksel floresan mikroskopisi, kromozom bölgeleri, kromosentrler ve nükleercisimler 3,4 gibi büyük ölçekli kromatin alanları hakkında özellikle bitkiler için kökdokularında (3,5,6) mümkün olan büyük ölçekli kromatin alanları hakkında değerli bilgiler sağlamıştır. Ancak, bu teknikler ışığın kırınım bariyeri tarafından temelde sınırlıdır; bu da mekânsal çözünürlüğü yaklaşık 200 nm yan ve 500 nm eksenlesınırlar 7. Bu sınırlama, epigenetik düzenlemenin temelini oluşturan kromatin katlanması, histon modifikasyon desenleri ve transkripsiyonel bölmenleşme gibi nano ölçekli detayları gizler. Bu engeli aşmak için, yapılandırılmış aydınlatma mikroskobu (SIM)8, uyarılmış emisyon azalması (STED)9,10 ve tek moleküllü lokalizasyon mikroskobu (SMLM)11,12 gibi süper çözünürlüklü mikroskopi (SRM) yaklaşımları geliştirilerek 100 nm'den birkaç nm13'e kadar değişen çözünürlükler elde edilmiştir.

SRM teknikleri arasında, SMLM—Fotoaktif Lokalizasyon Mikroskopisi (PALM)13 ve doğrudan Stokastik Optik Yeniden Yapılandırma Mikroskopisi (dSTORM) dahil—olağanüstü mekansal çözünürlük ile molekülerözbaşıklık 14 sunar. Bireysel floroforların zaman içindeki konumlarını tespit ederek, SMLM tek hücrelerdeki kromatin alanları, histon işaretleri ve nükleer yapıların yüksek hassasiyetli nano ölçekli görüntüleriniyeniden inşa eder 15,16. Bu yetenek, SMLM'nin uygulandığı memeli sistemlerinde kromatin araştırmalarını dönüştürmüştür; burada SMLM uygulanarak nükleozom kümelenmesi, kromatin sıkıştırması ve histon modifikasyon desenlerini benzeri görülmemiş detaylarlagörselleştirmiştir 15,16,17. Buna karşılık, SMLM'nin bitki çekirdeklerine uygulanması sınırlı kalır; bunun nedeni büyük ölçüde bitki dokusu özellikleriyle ilgili teknik zorluklar — yüksek otofloresans, hücre duvarı rijitliği ve nişasta ile klorofil18 gibi ışık saçıcı bileşiklerin varlığı. Ayrıca, izolasyon ve etiketleme sırasında çekirdeklerin hassas yapısı, yapısal bütünlüğü korumak ve uzun süreli görüntüleme seanslarında arka plan floresansını en aza indirmek için optimize edilmiş iş akışlarını gerektirir.

Burada tanımlanan protokol, ilk olarak Elizabeth Kracik-Dyer ve Célia Baroux tarafından uyarılmış emisyon azalması (STED)mikroskopisi için geliştirilmiştir 19. Daha sonra, yayımlanmış mikrobiyoloji uygulamalarından elde edilen bilgilerin entegrasyonuyla STORM görüntülemenin özel gereksinimlerini karşılamak üzere optimize edilip uyarlandı(20,21,22). Genel amaç, izole Arabidopsis thaliana çekirdeklerinin SMLM görüntülemesi için daha verimli ve tekrarlanabilir bir iş akışı sağlamaktır. Optimize edilmiş fiksasyon, hafif mekanik bozulma ve florofor etiketlemenin süspansiyonda entegre edilmesiyle, bu yöntem nükleer morfolojiyi korur ve görüntüleme kalitesini sıklıkla olumsuz etkileyen sitoplazmik kirleticileri verimli şekilde uzaklaştırır. Düşük eriyen agaroz pedlerinde işaretlenmiş çekirdeklerin immobilizasyonu, edinim sırasında mekanik stabiliteyi sağlar ve nano ölçekli hassasiyetle uzun vadeli tek moleküllü görüntüleme imkanı sağlar. Bitki çekirdekleri için daha önce tanımlanan SRM protokolleriyle karşılaştırıldığında—özellikle STEDmikroskopisi 19,23'e dayananlar—bu iş akışı foto-değiştirilebilir floroforlar (örneğin, AF647, JF549) kullanır ve klorofil ile doku kalıntılarını atan yıkama adımları sayesinde arka plan floresansını azaltır ve etiketleme moleküllerini doğrudan sabit ve permeabilize çekirdeklere ekleyerek etiketleme homojenliğini artırır. Sonuç olarak, bireysel çekirdeklerdeki kromatin modifikasyonlarının, nükleer bölmelerin ve epigenetik desenlerin tutarlı görselleştirilmesini sağlar. Bitkilerde SMLM'nin uygulanmasındaki teknik engelleri azaltarak, bu yöntem nano ölçekli görüntülemenin erişilebilirliğini genişletir ve kromatin organizasyonu ile nükleer mimarinin gelişimsel ve çevresel ipuçlarına yanıt olarak gen düzenlemesine nasıl katkıda bulunduğunu incelemek için bir temel sağlar.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

NOT: Bu protokolde kullanılan malzemeler ve aletler hakkında ayrıntılı bilgiler Materyaller Tablosu'nda mevcuttur. Aksi belirtilmedikçe, tamponlar apirojenik 0.2 μm filtrelerde temizlenir. Bu protokol boyunca çift damıtılmış ultra-saf H2O (ddH2O) kullanılır. Santrifüj adımları, sabit açılı bir rotor kullanılarak 1,5 mL mikrotüplerde gerçekleştirilir.

1. Fidelerin fiksasyonu ve çekirdeklerin serbest bırakılması

  1. Duman başlığının altına buzun üzerine 6 delikli bir kültür plakası yerleştirin, ardından her kuyuğa yaklaşık 4 mL buz soğukluğu fiksasyon çözeltisi ekleyin; bu çözelti buhar kapüşonunun altında improvizasyon olarak hazırlanmış (%4 (v/v) metanol stabilize formaldehit, %0,1 Triton X-100 1× Fosfat-Tamponlu Salin [PBS]).
  2. Temiz forseps kullanarak, sert (%0,8 agar) yarı güçlü Murashige ve Skoog Medium 2,2 g/L MS tuzları, %1 sakaroz (w/v), pH 5,7 (referans24'te MS fideleri için tanımlandığı gibi) çimlenmeden sonra 8 ila 15 gün arasında yetiştirilen fideleri çıkarın ve hemen fiksasyon çözeltisine batırın. Yaklaşık 20 fide için bir kuyu kullanın (her örnek için yeterli malzeme elde etmek için 3 kuyu gerekiyordu).
  3. Plakayı buzla dolu vakum odasına koyup 0.2 bar ile 0.8 bar arasında bir basınç değişiminde 15 dakika boyunca vakum uygulayın; böylece hapsalanmış hava gider ve fiksatif bitkidokularına derin nüfuz edebilir 25. Vakumu yavaşça serbest bırakın, numuneyi karıştırın ve ardından vakumu 15 dakika daha uygulayın.
  4. Duman kapağının altında, fiksasyon çözeltisini pipetle çıkarın ve her kuyuyu 10 dakika boyunca 3 kez yuyum, hafif çalkalama altında 5 mL buz gibi soğuk PBS kullanın.
  5. PBS çıkarın ve sabit dokuyu 120 mm × 120 mm Petri kabına aktarmak için forseps kullanın. Sabit fidelere Kracik-Dyer ve Baroux tarafından tanımlandığı şekilde hazırlanmış 50 μL Çekirdek İzolasyon Tamponu (NIB) eklenin (45 mMMgCl 2, 20 mM MOPS, 30 mM sodyum sitrat, %0,3 Triton X-100). 1 N HCl)19 kullanarak pH 7'ye ayarlayın. Bıçaklı çip.
    NOT: Mikrotom bıçakları, bu görev için geleneksel jilet bıçaklarından daha verimli çıktı.
  6. Aynı bıçakla Petri kabının bir kenarına doğranmış dokuyu kazıyın ve 600 μL NIB ekleyin, bıçakta yapışan dokuları da yıkamaya dikkat edin.
  7. Doku bulagını 2 mL Dounce homojenizer tüpüne aktarın ve küçük havanla 5–10 kez vurun, ardından büyük havanla yumuşak hareket edene kadar (genellikle yine 5–10 darbe gerektirir).
  8. Ortaya çıkan homojenleştirilmiş örnek, 30 μm mesh filtresinden 1,5 mL bir mikrotüp içine filtreleyin.
  9. Süspansiyonu 800 × g'de 10 dakika boyunca santrifüjlen, hem ivmelenme hem de yavaşlama için en düşük rampayı kullanarak. Yeşil doku kalıntıları arasında küçük beyaz bir pelet görünür.
  10. Süpernatantı atın ve pelleti 150 μL NIB'de yeniden askıya alın.
  11. 800 × g'de 10 dakika boyunca tekrar santrifüj yapın ve süpernatantı çıkarın. Görünür yeşil kalıntı varsa, ikinci kez yıkayın. Pelletin boyutuna göre 50 μL'den 150 μL'ye kadar NIB arasında yeniden süzülür.
  12. Elde edilen izole çekirdek süspansiyonunu boyamadan önce en fazla 1 hafta boyunca 4 °C'de saklayın. Ancak, derhal harekete geçmeniz önerilir.

2. (İmmüno)lekelenme

NOT: Aşağıdaki adımlarda, protokol genellikle 20 fideye karşılık gelen 50 μL çekirdek süspansiyonu hacmine uygulanır. Belirtilmedikçe, aşağıdaki adımlar oda sıcaklığında gerçekleştirilir.

  1. Çözeltiyi 800 × g'de 10 dakika santrifüjle yapın ve süpernatantı atın. Pellete dokunmamaya dikkat et.
  2. Çekirdekleri, 50 μL bloklama tamponu (143 mM NaCl, %4 BSA PBS, 4 °C'de depolanan) içine nazik pipetle yeniden süzülür. Nazik bir tahrikasyon altında 30 dakika kuluçka yapın.
  3. Çözeltiyi 800 × g sıcaklığında 10 dakika santrifüjle edin ve çekirdek pelletine dokunmadan üst kısmı atın.
  4. Çekirdekleri 1× PBS 50 μL içinde nazik pipetleme ile yeniden süspansiyona alın. 800 × g'de 10 dakika boyunca tekrar santrifüj yapın. Yukarıdaki üst yüzeyi at.
  5. Çekirdekleri, 143 mM NaCl, %1 BSA, %0,05 Tween 20 içeren immünboyayan tamponda hazırlanmış 50 μL primer antikor çözeltisiyle yeniden süzülür (antikor ve çalışan seyreltiler Malzeme Tablosu'nda detaylandırılmıştır). Örnekleri hafif bir çaltlama altında 60 dakika kuluçka altına alın.
  6. İki yıkama ile devam edin (2.3 ve 2.4. adımları tekrarlayın).
  7. Çekirdekleri 50 μL keçi anti-tavşan AF647 ikincil antikorunda 1/200seyreltme 26 ile yeniden askıya alın. Floroforu ışıktan korumak için tüpleri alüminyum folyoya sarın. Tüpleri hafif bir çaltlama altında 60 dakika kuluçka edin.
  8. İki yıkama ile devam edin (2.3 ve 2.4. adımları tekrarlayın).
  9. Pelleti 50 μL NIB'de yeniden süsküyünüz. Süspansiyonu alüminyum folyoya sarılmış 1.5 mL mikrotüplerde sakla. Etiketleme 4 °C'de birkaç hafta boyunca stabildir.

3. Montaj

  1. STORM görüntülemesi için, tozu 50 mM Tris pH 8, 10 mM NaCl, %10 glikozdan oluşan 1,25× tampon B'de çözerek düşük eriyen bir agaroz çözeltisi (LMA %1,5 w/v) hazırlayın. 1.25× stok çözeltisi hazırlayın ve 4 °C'de saklayın.
  2. Tozun çözülmesi ve berrak bir çözelti elde etmek için 90 °C'de 1 dakika ısıtın. Eritilmiş LMA çözeltisini soğutun ve 37 °C'de tutun, ardından bir sonraki adıma geçin; böylece glikoz oksidaz (GLOX) tamponunun ısı denatürasyonu önlenir (10x stok çözeltisi hazırlanır ve -20°C'de saklanır ve 100 mM Tris pH 7.5, 25 mM KCl, 1 mM TCEP pH 7.0, 5 mg/mL Glikoz oksidaz, 0.4 mg/mL Katalaz içerir, %50 v/v gliserol).
  3. LMA çözeltisi 37 °C'ye ulaştıktan sonra, sıcak LMA çözeltisine 100 mM Mercaptoethylamine (MEA) ve GLOX ekleyerek STORM tamponunu hazırlayarak 1× nihai konsantrasyon elde edilir. MEA 1 M stok çözeltiyi 4 °C'de 1 aya kadar saklayın, ancak taze hazırlanmış bir çözeltinin kullanılması önerilir. Nazikçe karıştır.
    NOT: İstereğe bağlı DNA etiketleme için, JF549 konjuge Hoechst'in 1,5 nM (son konsantrasyon, 1 mM stok çözeltisi DMSO) ekleyin. Süspansiyonu 37 °C'de kullanana kadar tutun.
  4. Çekirdek süspansiyonunu nanoelmasla 1/1500 seyreltmede nazikçe karıştırın. Numuneyle birlikte 5 dakika kuluçka yapın.
    NOT: Nanoelmaslar, örnek kaymasını düzeltmek için fiducial işaretleyici olarak hizmet eder.
  5. Karışımın 10 μL'sini ozonla işlenmiş 1.5H örtülü bir örtüye (Ultraviyole Ozon temizleme sisteminde 20 dakika) biriktirin ve çekirdeklerin örtü üzerine birikmesini 3 dakika bekleyin.
  6. Fazla sıvıyı çıkarın, 2 dakika bekleyin. 3.3. adımda hazırlanan LMA'dan 10 μL kapağıya ekleyin ve hemen mikroskop slaytıyla örtün.
  7. Kapak örtüsünü silikon sızdırmazlık maddesi ile kapatın. Küçük bir Petri kabında eşit miktarda A ve B çözeltisini mikropipet ucu kullanarak karıştırın. Karışımı örtü kenarlarına uygulayarak numuneyi kapatın. Silikon sızdırmazlık maddesi 5 dakika içinde sertleşiyor.
  8. Monte edildikten sonra, montaj pedinin oksijen toplama özelliğinin kaybını önlemek için gecikmeden ve nihayetinde sonraki 4–5 saat içinde kaydırmaların görüntülenmesini gerçekleştirin.

4. Görüntüleme

NOT: Görüntüleme parametreleri, numunenin doğasına, floroforların foto-fiziksel özelliklerine ve mikroskobun optik konfigürasyonuna göre dikkatlice optimize edilmelidir. Her florofor için yüksek sinyal-gürültü oranı sağlamak ve floresan kanallar arasında spektral kanama ve çapraz uyarışmayı en aza indirmek çok önemlidir. Örnekler, yüksek NA 100x yağ daldırma hedefi, odak tutma ünitesi ve parlak alan görüntülemesi için beyaz LED ile donatılmış ters floresans mikroskopla gözlemlendi. Floresan etiketler AlexaFluor647 (AF647) 640 nm'de ve JF549-Hoechst 561 nm'de uyarıldı. Yayılan ışık, uyumlu bir dikromik ayna ve bant geçirici filtre(ler) ile filtrelendi ve son olarak, bilimsel bir Tamamlayıcı Metal-Oksit-Yarı İletken (sCMOS) kamerayla görüntüler toplandı.

  1. Örnek slaytı monte edin ve odak bulun. Sistemde varsa odak tutma modülünü aktive edin (uzun alımlar için şiddetle tavsiye edilir).
  2. Bir çekirdek bulun ve ona odaklanın. Yeniden yapılandırma sırasında sürüklenmeyi daha verimli düzeltmek için ilgilenilen çekirdeğin yakınında bir veya birkaç nanoelmas bulundurmak daha iyidir.
  3. (İsteğe bağlı) Parlak alan ve her floresan kanalın düşük lazer gücünde difraksiyon sınırlı anlık görüntülerini yakalayın.
  4. İki renkli görüntüleme yapılırken, daha uzun dalga boylu kanalın alınmasıyla başlayın ve ardından daha kısa dalga kanalına geçin (yani JF549'dan önce AF647 kanalını alın).
    NOT: Bu çalışmada kullanılan satın alma parametrelerine örnek:
    Kanal A - epitop etiketleme - AF647
    Pozlama süresi: 20 ms
    Lazer yoğunluğu: 640 nm – 2.2 kW/cm2
    Uyarılma modu: HiLo27
    Kanal B - DNA etiketleme - JF549-Hoechst
    Pozlama süresi: 50 ms
    Lazer yoğunluğu: 561 nm - 1 kW/cm2
    Uyarılma modu: Epi
    Kaydedilen görüntü sayısı: Kanal başına 10.000-30.000, bu da kare başına floroforların yoğunluğunun doğru tek molekül lokalizasyonu için yeterince seyrek kalmasını sağlarken, topallaştırma sayısı ise Süper çözünürlüklü QUantitative Image Rating and Reporting of Error Locations (SQUIRREL)28 kullanılarak ampirik olarak belirlenmiştir; bu da yeterli kare sayısını gösterir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Yukarıda açıklanan protokol, SMLM için uygun yüksek kaliteli Arabidopsis thaliana çekirdeklerinin hazırlanmasını sağlar. Nükleer bütünlüğü artırmak ve görüntü kalitesini bozan sitoplazmik ve hücresel kalıntıları azaltmak için birkaç kez optimizasyon turu gerçekleştirildi. Her optimizasyon adımından sonra, nükleer preparatların kalitesi Olympus IX81 döner disk mikroskobu kullanılarak konfokal görüntüleme ile değerlendirildi ve ardından süper çözünürlüklü alıma geçildi.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Arabidopsis thaliana çekirdeklerinin tek moleküllü lokalizasyon mikroskobu (SMLM) için hazırlanması, nihai örnek kalitesini güçlü şekilde etkileyen birkaç kritik adım gerektirir. Daha öncebelirtildiği gibi, 19,35, sağlam çekirdeklerin iyileşmesini maksimize etmek için kapsamlı ve tutarlı doku kesimleri gereklidir. Standart jilet yerine mikrotom bıçaklarının kullanılması, daha temiz ve düzgünlü doku parçalanması sağlar ve...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar çıkar çatışması olmadığını belirtmektedir.

Teşekkürler

JF ve JFX boyalarını cömertçe sağladıkları için Lavis Laboratuvarı ve Janelia Açık Kimya ekibine teşekkür ederiz. Ayrıca, protokollerini nazikçe paylaşan Elizabeth Kracik-Dyer ve Célia Baroux'a, ayrıca Aline Probst ve Guillermo Orsi'ye de içgörülü tavsiyeleri için minnettarız. Optik görüntüleme, Grenoble Instruct-ERIC merkezinin (ISBG; UAR 3518 CNRS-CEA- UGA- EMBL) kapsamında, Grenoble Yapısal Biyoloji Ortaklığı bünyesinde yer almakta olup, Fransız Entegre Yapısal Biyoloji Altyapısı (ANR-10-INBS-0005-02) ve Grenoble Entegre Yapısal ve Hücre Biyolojisi İttifakı Labex tarafından desteklenmektedir; bu da Grenoble Alpes Üniversitesi Yüksek Lisans Okulu (Ecoles Universitaires de Recherche) CBH-EUR-GS (ANR-17-EURE-0003) projesidir. TU Delft Uygulamalı Bilimler Fakültesi, Görüntüleme Fiziği Bölümü (ImPhys)'de geliştirilen AnalyzeFRC Python paketi için Tip ten Brink'i teşekkür ediyoruz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Anti-RNA polymerase II CTD repeat YSPTSPS (phospho S2) antibodyAbcamab5095Polymerazın aktif formunu görselleştirmek için immün boyama tamponunda 1/200 seyreliğinde kullanılan birincil antikor (Tavşanda üretilmiş poliklonal antikor)
Alım yazılımıAbbelightNEO LiveImaging v2.18
Sığır Serum AlbuminiSigma-AldrichA7906  
KatalazSigma-AldrichC40
Sertifikalı Düşük Erime Noktalı AgarozBio-Rad1613111
1.5H kalınlığında kapak camlarıMarienfeld117640Ø: 24 mm
D-(+)-Glukoz, susuz, %99Thermo ScientificA16828-36 
Dikroiik aynaSemrockDi03-R405/488/561/635-t1Uyarma/emiş ayrımı için dikroik ayna
Dulbecco’s Fosfat Tamponlu Salin 10´biowestX0515 - 500 Steril koşullarda çalışma
Epredia Ultra Tek Kullanımlık Mikrotom BıçaklarıFisherScientific12191830Düşük profilli, tek kullanımlık
Falcon 6-kuyuluk Şeffaf Düz Tabanlı TC-tedavi edilmiş Çoklu Kuyu Hücre Kültürü Plakası, Kapaklı Falcon353046
Formaldehit çözeltisi %37Carl Roth7398Duman başlığı altında çalışın
Glükoz oksidazSigma-AldrichG2133
GliserolVWR24388.295
Keçi anti-Tavşan IgG (H+L) Yüksek Çapraz Adsorpsiyonlu İkincil Antikor, Alexa Fluor Plus 647Thermo ScientificA32733TRAF647'ye bağlı ikincil antikor olarak 1/200'de kullanılır
Hoechst 33258 çözeltisiSigma-Aldrich94403DNA'yı karşı boyalama için 1/500 seyreliğinde kullanılır, agarose pedine eklenir
Hidrolorik Asit ÇözeltisiChem-LabCL05.0311.1000 
JF549-HoechstLavis lab ve Open Chemistry ekibi (Janelia)JF549-HoechstDNA'yı karşı boyalama için kullanılır, agarose pedine 1.5 nM son konsantrasyonunda eklenir
KIMBLE Dounce doku öğütücü setiSigma-AldrichD8938Her ikisi de büyük (0.0030-0.0050 inç) ve küçük (0.0005-0.0025 inç) açıklıklı havanın olduğu 2 mL tüp
Lazer ünitesiOxxiusL6CcAltı lazerle donatılmıştır: 405 nm - 100 mW, 488 nm - 200 mW, 532 nm - 500 mW, 561 nm - 300 mW, 640 nm - 500 mW ve 730 nm - 30 mW
Magnezyum klorür heksahidratCarl RothHN03
Merkaptoetilamina (MEA)Sigma-Aldrich30070
MOPS sodyum tuzu %98Fisher Scientific SAS352590010
Çok bantlı emisyon filtresiSemrockFF01-446/523/600/677Lazer dağınık ışığı engellemek için çok bantlı emisyon filtrasyonu
NanoelmaslarAdamas NanotechnologiesNDNV100nmHiWGA2mlStok 1 mg/mL
ORCA-Fusion Dijital CMOS kameraHamamatsuC14440-20UP 
Petri kabı, 100/20 mm, PS, şeffaf, havalandırmalı, sterilGreiner Bio-One6641611/2 MS ortamında bitki yetiştirmek için kullanılır
Petri kabı, kare, PS, şeffaf, 120/120/17 mm, sterilGreiner Bio-One688161Bitki fidelerini keserek kullanılır
PluriStrainer Mini hücre süzgecipluriSelect43-10030-50Ağ boyutu 30 µm, 1.5 mL Eppendorf tüpü için uygun
Potasyum KlorürSigma-AldrichP9333
Tek bantlı emisyon filtresiSemrockFF01-698/70AF647 kanalı için özel emisyon filtresi
Tek bantlı emisyon filtresiChromaET600/50mJF549 kanalı için özel emisyon filtresi
Sodyum klorür (%99,5%) Euromedex1112-A
Star-Frost slaytlar 76 x 26 mmKnittel VS112711FKB.01
Sterilizasyonlu şırınga filtresiø 33 mm gözeneklilik 0.2 µm Luer Lock koniClearLine146560
Süper çözünürlük sistemiAbbelightSAFe360Olympus IX83, 100x NA1.5 yağ-daldırmalı objektif ile donatılmış
Tri-Sodyum Sitrat 2H2O Gen-Apex BiomoleProlaboPRO-33615.268
Tris Bazı Moleküler Biyoloji SınıfıPromegaH5135
Tris(2-karboksietil)fosfin hidroklorür (TCEP)Thermo Scientific20491
Triton X-100Euromedex2000-B
Tween 20Euromedex2001-B
Twinsil HızPicodent13001002Sil

Kaynaklar

  1. Misteli, T. Beyond the sequence: cellular organization of genome function. Cell. 128 (4), 787-800 (2007).
  2. Rowley, M. J., Corces, V. G. Organizational principles of 3D genome architecture. Nat Rev Genet. 19 (12), 789-800 (2018).
  3. Fransz, P., de Jong, J. H., Lysak, M., Castiglione, M. R., Schubert, I. Interphase chromosomes in Arabidopsis are organized as well defined chromocenters from which euchromatin loops emanate. Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (22), 14584-14589 (2002).
  4. Tessadori, F., Chupeau, M. C., Chupeau, Y., Knip, M., Germann, S. Large-scale dissociation and sequential reassembly of pericentric heterochromatin in dedifferentiated Arabidopsis cells. J Cell Sci. 120 (7), 1200-1208 (2007).
  5. Caballero, L., Pasternak, T., Riyazuddin, R., Pérez-Pérez, J. M. Connecting high-resolution 3D chromatin maps with cell division and cell differentiation at the root apical meristem. Plant Cell Rep. 43 (10), 232 (2024).
  6. Pavlova, P., van Zanten, M., Snoek, B. L., de Jong, H., Fransz, P. 2D morphometric analysis of Arabidopsis thaliana nuclei reveals characteristic profiles of different cell types and accessions. Chromosome Res. 30 (1), 5-24 (2022).
  7. Shao, L., Kner, P., Rego, E. H., Gustafsson, M. G. L. Super-resolution 3D microscopy of live whole cells using structured illumination. Nat Methods. 8 (12), 1044-1046 (2011).
  8. Gustafsson, M. G. L. Nonlinear structured-illumination microscopy: Wide-field fluorescence imaging with theoretically unlimited resolution. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (37), 13081-13086 (2005).
  9. Hell, S. W., Wichmann, J. Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy. Opt Lett, OL. 19 (11), 780-782 (1994).
  10. Klar, T. A., Hell, S. W. Subdiffraction resolution in far-field fluorescence microscopy. Opt Lett, OL. 24 (14), 954-956 (1999).
  11. Hugelier, S., Colosi, P. L., Lakadamyali, M. Quantitative Single-Molecule Localization Microscopy. Annu Rev Biophys. 52, 139-160 (2023).
  12. Schermelleh, L., Ferrand, A., Huser, T., Eggeling, C., Sauer, M. Super-resolution microscopy demystified. Nat Cell Biol. 21 (1), 72-84 (2019).
  13. Hess, S. T., Girirajan, T. P. K., Mason, M. D. Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy. Biophys J. 91 (11), 4258-4272 (2006).
  14. Heilemann, M., van de Linde, S., Schüttpelz, M., Kasper, R., Seefeldt, B. Subdiffraction-resolution fluorescence imaging with conventional fluorescent probes. Angew Chem Int Ed Engl. 47 (33), 6172-6176 (2008).
  15. Ricci, M. A., Manzo, C., García-Parajo, M. F., Lakadamyali, M., Cosma, M. P. Chromatin fibers are formed by heterogeneous groups of nucleosomes in vivo. Cell. 160 (6), 1145-1158 (2015).
  16. Xu, J., Ma, H., Jin, J., Uttam, S., Fu, R. Super-resolution imaging of higher-order chromatin structures at different epigenomic states in single mammalian cells. Cell Rep. 24 (4), 873-882 (2018).
  17. Nozaki, T., Imai, R., Tanbo, M., Nagashima, R., Tamura, S. Dynamic organization of chromatin domains revealed by super-resolution live-cell imaging. Molecular Cell. 67 (2), 282-293.e7 (2017).
  18. Komis, G., Šamajová, O., Ovečka, M., Šamaj, J. Super-resolution microscopy in plant cell imaging. Trends in Plant Science. 20 (12), 834-843 (2015).
  19. Kracik-Dyer, E., Baroux, C. 3D STED Imaging of isolated Arabidopsis thaliana nuclei. Methods Mol Biol. 2873, 263-280 (2025).
  20. Gaifas, L., et al. Combining live fluorescence imaging with in situ cryoelectron tomography sheds light on the septation process in Deinococcus radiodurans. Proceedings of the National Academy of Sciences. 122 (19), e2425047122 (2025).
  21. de Jong, I. G., Beilharz, K., Kuipers, O. P., Veening, J. W. Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated time-lapse microscopy. J Vis Exp. (53), e3145 (2011).
  22. Vauclare, P., Wulffelé, J., Lacroix, F., Servant, P., Canfalonieri, F., et al. Stress-induced nucleoid remodeling in Deinococcus radiodurans is associated with major changes in Heat Unstable (HU) protein dynamics. Nucleic Acids Res. 52 (11), 6406-6423 (2024).
  23. Schubert, V. Super-resolution microscopy – Applications in plant cell research. Front Plant Sci. 8, 531 (2017).
  24. Carles, C. C., Ha, C. M., Jun, J. H., Fiume, E., Fletcher, J. C., Hennig, L., Köhler, C. Analyzing Shoot Apical Meristem Development. Plant Developmental Biology: Methods and Protocols. , 105-129 (2010).
  25. Chincinska, I. A. Leaf infiltration in plant science: old method, new possibilities. Plant Methods. 17 (1), 83 (2021).
  26. Tse-Kang, S. Y., et al. Intestinal immunity in C. elegans is activated by pathogen effector-triggered aggregation of the guard protein TIR-1 on lysosome-related organelles. Immunity. 57 (10), 2280-2295.e6 (2024).
  27. Lim, D., Ford, T. N., Chu, K. K., Mertz, J. Optically sectioned in vivo imaging with speckle illumination HiLo microscopy. J Biomed Opt. 16 (1), 016014 (2011).
  28. Culley, S., et al. Quantitative mapping and minimization of super-resolution optical imaging artifacts. Nat Methods. 15 (4), 263-266 (2018).
  29. Xue, M., et al. Single amino acid mutations in histone H3.3 illuminate the functional significance of H3K4 methylation in plants. Nat Commun. 16 (1), 4408 (2025).
  30. Rueden, C. T., et al. ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data. BMC Bioinformatics. 18, 529 (2017).
  31. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  32. Ovesný, M., Křížek, P., Borkovec, J., Švindrych, Z., Hagen, G. M. ThunderSTORM: a comprehensive ImageJ plugin for PALM and STORM data analysis and super-resolution imaging. Bioinformatics. 30 (16), 2389-2390 (2014).
  33. Thompson, R. E., Larson, D. R., Webb, W. W. Precise nanometer localization analysis for individual fluorescent probes. Biophys J. 82 (5), 2775-2783 (2002).
  34. Van Heel, M. Similarity measures between images. Ultramicroscopy. 21 (1), 95-100 (1987).
  35. Loureiro, J., et al. Isolation of plant nuclei for estimation of nuclear DNA content: Overview and best practices. Cytometry Part A. 99 (4), 318-327 (2021).
  36. Deal, R. B., Henikoff, S. The INTACT method for cell type-specific gene expression and chromatin profiling in Arabidopsis thaliana. Nat Protoc. 6 (1), 56-68 (2011).
  37. Duncan, S., Olsson, T. S. G., Hartley, M., Dean, C., Rosa, S. A method for detecting single mRNA molecules in Arabidopsis thaliana. Plant Methods. 12, 13 (2016).
  38. Gutzat, R., Mittelsten Scheid, O. Preparing chromatin and RNA from rare cell types with fluorescence-activated nuclear sorting (FANS). Methods Mol Biol. 2093, 95-105 (2020).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Kromatin OrganizasyonuSüper Çözünürlüklü MikroskopidSTORM GörüntülemeNükleer MimariKromatin ModifikasyonlarıFlorofor EtiketlemeÇekirdek İzolasyonuEpigenetik Düzenleme
Arabidopsis çekirdeklerinde tek moleküllü lokalizasyon mikroskopisi için sadeleştirilmiş bir protokol
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.