Arabidopsis çekirdeklerinde tek moleküllü lokalizasyon mikroskopisi için sadeleştirilmiş bir protokol

Summary

Bu protokol, izole Arabidopsis çekirdeklerinin tek moleküllü lokalizasyon mikroskopik görüntülemesi için verimli bir iş akışı sunar; optimize edilmiş izolasyon, fiksasyon ve etiketleme kullanılarak kromatin ve RNA Polimeraz II'nin nano ölçekli görselleştirilmesini sağlar. Bu yaklaşım, yüksek çözünürlüklü görüntüleme için diğer kromatin ilişkili proteinlere veya histon modifikasyonlarına kolayca uyarlanabilir.

Abstract

Konfokal floresan mikroskopisi, bitki çekirdeklerinde kromatin organizasyonu hakkında değerli bilgiler sağlamış olsa da, difraksiyon sınırlı çözünürlüğü kromatin mimarisinin araştırılmasını engellemiş ve Tek Molekül Lokalizasyon Mikroskopisi (SMLM) gibi süper çözünürlüklü tekniklerin kullanılmasını teşvik etmektedir. Bu yaklaşımlar arasında, doğrudan stokastik optik rekonstrüksiyon mikroskobu (dSTORM), bireysel hücrelerde nano ölçekli çözünürlük sağlar ve kromatin alanlarının, histon modifikasyonlarının ve nükleer organizasyonun hassas görselleştirilmesini sağlar. Bu yöntemler memeli sistemlerinde giderek daha fazla uygulansa da, bitki biyolojisinde kullanımı sınırlı kalır; bu durum büyük ölçüde örnek hazırlığındaki teknik zorluklar nedeniyle gerçekleşmektedir.

Burada, Arabidopsis thaliana'dan izole edilmiş çekirdeklerin SMLM görüntülemesi için sadeleştirilmiş ve tekrarlanabilir bir iş akışını sunuyoruz. Bu protokol, nükleer morfolojiyi korumak için fide fiksasyonu ile başlar, ardından nazik doku kesimi ve santrifüjleme ile sağlam çekirdekleri zenginleştirir. İzole çekirdekler daha sonra sıvı ortamda florofor etiketiyle işlenmiş ve düşük eriyen agaroz pedlerinde immobilize edilir; bu strateji uzun süreli tek moleküllü görüntüleme seanslarında stabiliteyi artırır. Bu adımlar topluca arka plan floresansını en aza indirir, etiketleme tutarlılığını artırır ve biyolojik kopyalar arasında tekrarlanabilirliği artırır.

Ortaya çıkan hazırlıklar, bitkilerde kromatin modifikasyonları ve nükleer mimariyi görselleştirmek için daha fazla netlik sağlar. Arabidopsis'te SMLM görüntülemenin uygulanmasındaki teknik engelleri azaltarak, bu protokol nano ölçekte epigenetik düzenleme, kromatin organizasyonu ve nükleer topolojik varyasyonları incelemek için çok yönlü bir yöntem sunar. Bu çalışma, SMLM'nin bitkilere uygulanması için metodolojik bir temel oluşturur, memeli hücre biyolojisiyle arasındaki boşluğu kapatır ve nükleer mimarinin bitki sistemlerindeki gelişimsel ve çevresel ipuçlarına yanıt olarak genom düzenlemesine nasıl katkıda bulunduğunu incelemek için yeni fırsatlar sunar.

Introduction

Mikroskopi, kromatin organizasyonu ve nükleer mimariyi incelemek için uzun süredir temel taşı olup, DNA ve histonla ilişkili proteinlerin 3D nükleer uzayda nasıl düzenlendiğini ve gen^{düzenlemesini nasıl etkilediğini ortaya koymuştur 1,2}. Geleneksel floresan mikroskopisi, kromozom bölgeleri, kromosentrler ve nükleer^{cisimler 3,4} gibi büyük ölçekli kromatin alanları hakkında özellikle bitkiler için kök^dokularında (^3,5,6) mümkün olan büyük ölçekli kromatin alanları hakkında değerli bilgiler sağlamıştır. Ancak, bu teknikler ışığın kırınım bariyeri tarafından temelde sınırlıdır; bu da mekânsal çözünürlüğü yaklaşık 200 nm yan ve 500 nm eksenle^{sınırlar 7}. Bu sınırlama, epigenetik düzenlemenin temelini oluşturan kromatin katlanması, histon modifikasyon desenleri ve transkripsiyonel bölmenleşme gibi nano ölçekli detayları gizler. Bu engeli aşmak için, yapılandırılmış aydınlatma mikroskobu (SIM)⁸, uyarılmış emisyon azalması (STED)^9,10 ve tek moleküllü lokalizasyon mikroskobu (SMLM)^11,12 gibi süper çözünürlüklü mikroskopi (SRM) yaklaşımları geliştirilerek 100 nm'den birkaç nm^13'e kadar değişen çözünürlükler elde edilmiştir.

SRM teknikleri arasında, SMLM—Fotoaktif Lokalizasyon Mikroskopisi (PALM)¹³ ve doğrudan Stokastik Optik Yeniden Yapılandırma Mikroskopisi (dSTORM) dahil—olağanüstü mekansal çözünürlük ile moleküler^{özbaşıklık 14} sunar. Bireysel floroforların zaman içindeki konumlarını tespit ederek, SMLM tek hücrelerdeki kromatin alanları, histon işaretleri ve nükleer yapıların yüksek hassasiyetli nano ölçekli görüntülerini^{yeniden inşa eder 15,16}. Bu yetenek, SMLM'nin uygulandığı memeli sistemlerinde kromatin araştırmalarını dönüştürmüştür; burada SMLM uygulanarak nükleozom kümelenmesi, kromatin sıkıştırması ve histon modifikasyon desenlerini benzeri görülmemiş detaylarla^{görselleştirmiştir} 15,16,17. Buna karşılık, SMLM'nin bitki çekirdeklerine uygulanması sınırlı kalır; bunun nedeni büyük ölçüde bitki dokusu özellikleriyle ilgili teknik zorluklar — yüksek otofloresans, hücre duvarı rijitliği ve nişasta ile klorofil¹⁸ gibi ışık saçıcı bileşiklerin varlığı. Ayrıca, izolasyon ve etiketleme sırasında çekirdeklerin hassas yapısı, yapısal bütünlüğü korumak ve uzun süreli görüntüleme seanslarında arka plan floresansını en aza indirmek için optimize edilmiş iş akışlarını gerektirir.

Burada tanımlanan protokol, ilk olarak Elizabeth Kracik-Dyer ve Célia Baroux tarafından uyarılmış emisyon azalması (STED)^{mikroskopisi için geliştirilmiştir 19}. Daha sonra, yayımlanmış mikrobiyoloji uygulamalarından elde edilen bilgilerin entegrasyonuyla STORM görüntülemenin özel gereksinimlerini karşılamak üzere optimize edilip uyarlandı⁽20,21,22). Genel amaç, izole Arabidopsis thaliana çekirdeklerinin SMLM görüntülemesi için daha verimli ve tekrarlanabilir bir iş akışı sağlamaktır. Optimize edilmiş fiksasyon, hafif mekanik bozulma ve florofor etiketlemenin süspansiyonda entegre edilmesiyle, bu yöntem nükleer morfolojiyi korur ve görüntüleme kalitesini sıklıkla olumsuz etkileyen sitoplazmik kirleticileri verimli şekilde uzaklaştırır. Düşük eriyen agaroz pedlerinde işaretlenmiş çekirdeklerin immobilizasyonu, edinim sırasında mekanik stabiliteyi sağlar ve nano ölçekli hassasiyetle uzun vadeli tek moleküllü görüntüleme imkanı sağlar. Bitki çekirdekleri için daha önce tanımlanan SRM protokolleriyle karşılaştırıldığında—özellikle STED^mikroskopisi 19,23'e dayananlar—bu iş akışı foto-değiştirilebilir floroforlar (örneğin, AF647, JF549) kullanır ve klorofil ile doku kalıntılarını atan yıkama adımları sayesinde arka plan floresansını azaltır ve etiketleme moleküllerini doğrudan sabit ve permeabilize çekirdeklere ekleyerek etiketleme homojenliğini artırır. Sonuç olarak, bireysel çekirdeklerdeki kromatin modifikasyonlarının, nükleer bölmelerin ve epigenetik desenlerin tutarlı görselleştirilmesini sağlar. Bitkilerde SMLM'nin uygulanmasındaki teknik engelleri azaltarak, bu yöntem nano ölçekli görüntülemenin erişilebilirliğini genişletir ve kromatin organizasyonu ile nükleer mimarinin gelişimsel ve çevresel ipuçlarına yanıt olarak gen düzenlemesine nasıl katkıda bulunduğunu incelemek için bir temel sağlar.

Protocol

NOT: Bu protokolde kullanılan malzemeler ve aletler hakkında ayrıntılı bilgiler Materyaller Tablosu'nda mevcuttur. Aksi belirtilmedikçe, tamponlar apirojenik 0.2 μm filtrelerde temizlenir. Bu protokol boyunca çift damıtılmış ultra-saf H₂O (ddH₂O) kullanılır. Santrifüj adımları, sabit açılı bir rotor kullanılarak 1,5 mL mikrotüplerde gerçekleştirilir.

1. Fidelerin fiksasyonu ve çekirdeklerin serbest bırakılması

1. Duman başlığının altına buzun üzerine 6 delikli bir kültür plakası yerleştirin, ardından her kuyuğa yaklaşık 4 mL buz soğukluğu fiksasyon çözeltisi ekleyin; bu çözelti buhar kapüşonunun altında improvizasyon olarak hazırlanmış (%4 (v/v) metanol stabilize formaldehit, %0,1 Triton X-100 1× Fosfat-Tamponlu Salin [PBS]).
2. Temiz forseps kullanarak, sert (%0,8 agar) yarı güçlü Murashige ve Skoog Medium 2,2 g/L MS tuzları, %1 sakaroz (w/v), pH 5,7 (referans^24'te MS fideleri için tanımlandığı gibi) çimlenmeden sonra 8 ila 15 gün arasında yetiştirilen fideleri çıkarın ve hemen fiksasyon çözeltisine batırın. Yaklaşık 20 fide için bir kuyu kullanın (her örnek için yeterli malzeme elde etmek için 3 kuyu gerekiyordu).
3. Plakayı buzla dolu vakum odasına koyup 0.2 bar ile 0.8 bar arasında bir basınç değişiminde 15 dakika boyunca vakum uygulayın; böylece hapsalanmış hava gider ve fiksatif bitki^{dokularına derin nüfuz edebilir 25}. Vakumu yavaşça serbest bırakın, numuneyi karıştırın ve ardından vakumu 15 dakika daha uygulayın.
4. Duman kapağının altında, fiksasyon çözeltisini pipetle çıkarın ve her kuyuyu 10 dakika boyunca 3 kez yuyum, hafif çalkalama altında 5 mL buz gibi soğuk PBS kullanın.
5. PBS çıkarın ve sabit dokuyu 120 mm × 120 mm Petri kabına aktarmak için forseps kullanın. Sabit fidelere Kracik-Dyer ve Baroux tarafından tanımlandığı şekilde hazırlanmış 50 μL Çekirdek İzolasyon Tamponu (NIB) eklenin (45 mM_{MgCl 2}, 20 mM MOPS, 30 mM sodyum sitrat, %0,3 Triton X-100). 1 N HCl)¹⁹ kullanarak pH 7'ye ayarlayın. Bıçaklı çip.
   NOT: Mikrotom bıçakları, bu görev için geleneksel jilet bıçaklarından daha verimli çıktı.
6. Aynı bıçakla Petri kabının bir kenarına doğranmış dokuyu kazıyın ve 600 μL NIB ekleyin, bıçakta yapışan dokuları da yıkamaya dikkat edin.
7. Doku bulagını 2 mL Dounce homojenizer tüpüne aktarın ve küçük havanla 5–10 kez vurun, ardından büyük havanla yumuşak hareket edene kadar (genellikle yine 5–10 darbe gerektirir).
8. Ortaya çıkan homojenleştirilmiş örnek, 30 μm mesh filtresinden 1,5 mL bir mikrotüp içine filtreleyin.
9. Süspansiyonu 800 × g'de 10 dakika boyunca santrifüjlen, hem ivmelenme hem de yavaşlama için en düşük rampayı kullanarak. Yeşil doku kalıntıları arasında küçük beyaz bir pelet görünür.
10. Süpernatantı atın ve pelleti 150 μL NIB'de yeniden askıya alın.
11. 800 × g'de 10 dakika boyunca tekrar santrifüj yapın ve süpernatantı çıkarın. Görünür yeşil kalıntı varsa, ikinci kez yıkayın. Pelletin boyutuna göre 50 μL'den 150 μL'ye kadar NIB arasında yeniden süzülür.
12. Elde edilen izole çekirdek süspansiyonunu boyamadan önce en fazla 1 hafta boyunca 4 °C'de saklayın. Ancak, derhal harekete geçmeniz önerilir.

2. (İmmüno)lekelenme

NOT: Aşağıdaki adımlarda, protokol genellikle 20 fideye karşılık gelen 50 μL çekirdek süspansiyonu hacmine uygulanır. Belirtilmedikçe, aşağıdaki adımlar oda sıcaklığında gerçekleştirilir.

1. Çözeltiyi 800 × g'de 10 dakika santrifüjle yapın ve süpernatantı atın. Pellete dokunmamaya dikkat et.
2. Çekirdekleri, 50 μL bloklama tamponu (143 mM NaCl, %4 BSA PBS, 4 °C'de depolanan) içine nazik pipetle yeniden süzülür. Nazik bir tahrikasyon altında 30 dakika kuluçka yapın.
3. Çözeltiyi 800 × g sıcaklığında 10 dakika santrifüjle edin ve çekirdek pelletine dokunmadan üst kısmı atın.
4. Çekirdekleri 1× PBS 50 μL içinde nazik pipetleme ile yeniden süspansiyona alın. 800 × g'de 10 dakika boyunca tekrar santrifüj yapın. Yukarıdaki üst yüzeyi at.
5. Çekirdekleri, 143 mM NaCl, %1 BSA, %0,05 Tween 20 içeren immünboyayan tamponda hazırlanmış 50 μL primer antikor çözeltisiyle yeniden süzülür (antikor ve çalışan seyreltiler Malzeme Tablosu'nda detaylandırılmıştır). Örnekleri hafif bir çaltlama altında 60 dakika kuluçka altına alın.
6. İki yıkama ile devam edin (2.3 ve 2.4. adımları tekrarlayın).
7. Çekirdekleri 50 μL keçi anti-tavşan AF647 ikincil antikorunda 1/200^{seyreltme 26} ile yeniden askıya alın. Floroforu ışıktan korumak için tüpleri alüminyum folyoya sarın. Tüpleri hafif bir çaltlama altında 60 dakika kuluçka edin.
8. İki yıkama ile devam edin (2.3 ve 2.4. adımları tekrarlayın).
9. Pelleti 50 μL NIB'de yeniden süsküyünüz. Süspansiyonu alüminyum folyoya sarılmış 1.5 mL mikrotüplerde sakla. Etiketleme 4 °C'de birkaç hafta boyunca stabildir.

3. Montaj

1. STORM görüntülemesi için, tozu 50 mM Tris pH 8, 10 mM NaCl, %10 glikozdan oluşan 1,25× tampon B'de çözerek düşük eriyen bir agaroz çözeltisi (LMA %1,5 w/v) hazırlayın. 1.25× stok çözeltisi hazırlayın ve 4 °C'de saklayın.
2. Tozun çözülmesi ve berrak bir çözelti elde etmek için 90 °C'de 1 dakika ısıtın. Eritilmiş LMA çözeltisini soğutun ve 37 °C'de tutun, ardından bir sonraki adıma geçin; böylece glikoz oksidaz (GLOX) tamponunun ısı denatürasyonu önlenir (10x stok çözeltisi hazırlanır ve -20°C'de saklanır ve 100 mM Tris pH 7.5, 25 mM KCl, 1 mM TCEP pH 7.0, 5 mg/mL Glikoz oksidaz, 0.4 mg/mL Katalaz içerir, %50 v/v gliserol).
3. LMA çözeltisi 37 °C'ye ulaştıktan sonra, sıcak LMA çözeltisine 100 mM Mercaptoethylamine (MEA) ve GLOX ekleyerek STORM tamponunu hazırlayarak 1× nihai konsantrasyon elde edilir. MEA 1 M stok çözeltiyi 4 °C'de 1 aya kadar saklayın, ancak taze hazırlanmış bir çözeltinin kullanılması önerilir. Nazikçe karıştır.
   NOT: İstereğe bağlı DNA etiketleme için, JF549 konjuge Hoechst'in 1,5 nM (son konsantrasyon, 1 mM stok çözeltisi DMSO) ekleyin. Süspansiyonu 37 °C'de kullanana kadar tutun.
4. Çekirdek süspansiyonunu nanoelmasla 1/1500 seyreltmede nazikçe karıştırın. Numuneyle birlikte 5 dakika kuluçka yapın.
   NOT: Nanoelmaslar, örnek kaymasını düzeltmek için fiducial işaretleyici olarak hizmet eder.
5. Karışımın 10 μL'sini ozonla işlenmiş 1.5H örtülü bir örtüye (Ultraviyole Ozon temizleme sisteminde 20 dakika) biriktirin ve çekirdeklerin örtü üzerine birikmesini 3 dakika bekleyin.
6. Fazla sıvıyı çıkarın, 2 dakika bekleyin. 3.3. adımda hazırlanan LMA'dan 10 μL kapağıya ekleyin ve hemen mikroskop slaytıyla örtün.
7. Kapak örtüsünü silikon sızdırmazlık maddesi ile kapatın. Küçük bir Petri kabında eşit miktarda A ve B çözeltisini mikropipet ucu kullanarak karıştırın. Karışımı örtü kenarlarına uygulayarak numuneyi kapatın. Silikon sızdırmazlık maddesi 5 dakika içinde sertleşiyor.
8. Monte edildikten sonra, montaj pedinin oksijen toplama özelliğinin kaybını önlemek için gecikmeden ve nihayetinde sonraki 4–5 saat içinde kaydırmaların görüntülenmesini gerçekleştirin.

4. Görüntüleme

NOT: Görüntüleme parametreleri, numunenin doğasına, floroforların foto-fiziksel özelliklerine ve mikroskobun optik konfigürasyonuna göre dikkatlice optimize edilmelidir. Her florofor için yüksek sinyal-gürültü oranı sağlamak ve floresan kanallar arasında spektral kanama ve çapraz uyarışmayı en aza indirmek çok önemlidir. Örnekler, yüksek NA 100x yağ daldırma hedefi, odak tutma ünitesi ve parlak alan görüntülemesi için beyaz LED ile donatılmış ters floresans mikroskopla gözlemlendi. Floresan etiketler AlexaFluor647 (AF647) 640 nm'de ve JF549-Hoechst 561 nm'de uyarıldı. Yayılan ışık, uyumlu bir dikromik ayna ve bant geçirici filtre(ler) ile filtrelendi ve son olarak, bilimsel bir Tamamlayıcı Metal-Oksit-Yarı İletken (sCMOS) kamerayla görüntüler toplandı.

1. Örnek slaytı monte edin ve odak bulun. Sistemde varsa odak tutma modülünü aktive edin (uzun alımlar için şiddetle tavsiye edilir).
2. Bir çekirdek bulun ve ona odaklanın. Yeniden yapılandırma sırasında sürüklenmeyi daha verimli düzeltmek için ilgilenilen çekirdeğin yakınında bir veya birkaç nanoelmas bulundurmak daha iyidir.
3. (İsteğe bağlı) Parlak alan ve her floresan kanalın düşük lazer gücünde difraksiyon sınırlı anlık görüntülerini yakalayın.
4. İki renkli görüntüleme yapılırken, daha uzun dalga boylu kanalın alınmasıyla başlayın ve ardından daha kısa dalga kanalına geçin (yani JF549'dan önce AF647 kanalını alın).
   NOT: Bu çalışmada kullanılan satın alma parametrelerine örnek:
   Kanal A - epitop etiketleme - AF647
   Pozlama süresi: 20 ms
   Lazer yoğunluğu: 640 nm – 2.2 kW/cm²
   Uyarılma modu: HiLo²⁷
   Kanal B - DNA etiketleme - JF549-Hoechst
   Pozlama süresi: 50 ms
   Lazer yoğunluğu: 561 nm - 1 kW/cm²
   Uyarılma modu: Epi
   Kaydedilen görüntü sayısı: Kanal başına 10.000-30.000, bu da kare başına floroforların yoğunluğunun doğru tek molekül lokalizasyonu için yeterince seyrek kalmasını sağlarken, topallaştırma sayısı ise Süper çözünürlüklü QUantitative Image Rating and Reporting of Error Locations (SQUIRREL)²⁸ kullanılarak ampirik olarak belirlenmiştir; bu da yeterli kare sayısını gösterir.

Results

Yukarıda açıklanan protokol, SMLM için uygun yüksek kaliteli Arabidopsis thaliana çekirdeklerinin hazırlanmasını sağlar. Nükleer bütünlüğü artırmak ve görüntü kalitesini bozan sitoplazmik ve hücresel kalıntıları azaltmak için birkaç kez optimizasyon turu gerçekleştirildi. Her optimizasyon adımından sonra, nükleer preparatların kalitesi Olympus IX81 döner disk mikroskobu kullanılarak konfokal görüntüleme ile değerlendirildi ve ardından süper çözünürlüklü alıma geçildi.

Konfokal...

Discussion

Arabidopsis thaliana çekirdeklerinin tek moleküllü lokalizasyon mikroskobu (SMLM) için hazırlanması, nihai örnek kalitesini güçlü şekilde etkileyen birkaç kritik adım gerektirir. Daha önce^{belirtildiği gibi, 19,35}, sağlam çekirdeklerin iyileşmesini maksimize etmek için kapsamlı ve tutarlı doku kesimleri gereklidir. Standart jilet yerine mikrotom bıçaklarının kullanılması, daha temiz ve düzgünlü doku parçalanması sağlar ve...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-RNA polymerase II CTD repeat YSPTSPS (phospho S2) antibody	Abcam	ab5095	Primary antibody used at 1/200 dilution in immunostaining buffer to visualize the active form of the polymerase (Polyclonal antibody raised in rabbit )
Acquisition software	Abbelight	NEO LiveImaging v2.18
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A7906
Catalase	Sigma-Aldrich	C40
Certified Low Melting Agarose	Bio-Rad	1613111
Coverslips thickness 1.5H round	Marienfeld	117640	Ø: 24 mm
D-(+)-Glucose, anhydrous, 99%	Thermo Scientific	A16828-36
Dichroic mirror	Semrock	Di03-R405/488/561/635-t1	Dichroic mirror for excitation/emission separation
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline 10´	biowest	X0515 - 500	Work in sterile conditions
Epredia Ultra Disposable Microtome Blades	FisherScientific	12191830	Low profile, single use
Falcon 6-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Cell Culture Plate, with Lid	Falcon	353046
Formaldehyde solution 37%	Carl Roth	7398	Work under the fume hood
Glucose oxidase	Sigma-Aldrich	G2133
Glycerol	VWR	24388.295
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 647	Thermo Scientific	A32733TR	Used at 1/200 as secondary antibody coupled to AF647
Hoechst 33258 solution	Sigma-Aldrich	94403	Used at 1/500 to counterstain the DNA, added to the agarose pad
Hydrochloric Acid Solution	Chem-Lab	CL05.0311.1000
JF549-Hoechst	Lavis lab and Open Chemistry team (Janelia)	JF549-Hoechst	Used to counterstain DNA, added to the agarose pad at 1.5 nM final concentration
KIMBLE Dounce tissue grinder set	Sigma-Aldrich	D8938	2 mL tube with both large (0.0030-0.0050 inch) and small (0.0005-0.0025 inch) clearance pestles
Lasers unit	Oxxius	L6Cc	Equipped with six lasers: 405 nm - 100 mW, 488 nm - 200 mW, 532 nm - 500 mW, 561 nm - 300 mW, 640 nm - 500 mW and 730 nm - 30 mW
Magnesium chloride hexahydrate	Carl Roth	HN03
Mercaptoethylamine (MEA)	Sigma-Aldrich	30070
MOPS sodium salt 98%	Fisher Scientific SAS	352590010
Multiband emission filter	Semrock	FF01-446/523/600/677	Multiband emission filtration to block laser scatter light
Nanodiamonds	Adamas Nanotechnologies	NDNV100nmHiWGA2ml	Stock 1 mg/mL
ORCA-Fusion Digital CMOS camera	Hamamatsu	C14440-20UP
Petri dish, 100/20 mm, PS, clear, with vents, sterile	Greiner Bio-One	664161	Used to grow plants on 1/2 MS medium
Petri dish, square, PS, clear, 120/120/17 mm, sterile	Greiner Bio-One	688161	Used when chopping the plant seedlings
pluriStrainer Mini cell strainer	pluriSelect	43-10030-50	Mesh size 30 µm, suitable for 1.5 mL Eppendorf tube
Potassium Chloride	Sigma-Aldrich	P9333
Single band emission filter	Semrock	FF01-698/70	Specific emission filter for AF647 channel
Single band emission filter	Chroma	ET600/50m	Specific emission filter for JF549 channel
Sodium chloride (99,5%)	Euromedex	1112-A
Star-Frost slides 76 x 26 mm	Knittel	VS112711FKB.01
Sterile syringe filterø 33 mm porosity 0.2 µm Luer Lock cone	ClearLine	146560
Super-resolution system	Abbelight	SAFe360	Olympus IX83 equipped with 100x NA1.5 oil-immersion objective
Tri-Sodium Citrate 2H2O Gen-Apex Biomole	Prolabo	PRO-33615.268
Tris Base Molecular Biology Grade	Promega	H5135
Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride (TCEP)	Thermo Scientific	20491
Triton X-100	Euromedex	2000-B
Tween 20	Euromedex	2001-B
Twinsil Speed	Picodent	13001002	Silicone sealant
Ultraviolet Ozone cleaning system UVOCS oven	UVOCS Inc.	T10X10	20 min exposure for coverslip cleaning
Vacuum pump	Vacuubrand	VP 100C
Heraeus Megafuge 16R Centrifuge	Thermo Scientific		Rotor TX-400 75003629. Centrifugation performed with Eppendorf tubes.