Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Boyut Dışlama Kromatografisi ile Küçük Ekstrasellüler Veziküllerin Fare, İskelet Kası ve Kemik Iliğinden İzole Edilmesi

207 görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/70894

⸱

23 Haziran 2026

 ,  ,  , 
1Integrated Program in Neuroscience, McGill University, 2McGill Group for Suicide Studies, Douglas Mental Health University Institute, 3Center for Applied Nanomedicine, Research Institute of the McGill University Health Center, 4Department of Psychiatry, McGill University

Bu makalede

Özet

Bu protokol, enzimatik sindirim ve boyut dışlama kromatografisi kullanılarak morin iskelet kası ve kemik iliğinden küçük ekstrasellüler veziküllerin izole edilmesini açıklar; böylece yapısal olarak karmaşık, düşük verimli dokulardan vezikülle zenginleştirilmiş fraksiyonların tekrarlanabilir şekilde geri kazanılmasını mümkün kılarak sonraki moleküler analiz için mümkün olur.

Özet

Küçük hücredışı veziküller (sEV'ler), proteinler, lipidler ve ribonükleik asitlerin (RNA) transferi yoluyla hücreler arası iletişimi aracılık eden nanoboyutlu, lipid bağlı parçacıklardır. İskelet kası (SkM) ve kemik iliği (BM) gibi katı dokulardan sEV'lerin izolasyonu, düşük verim ve veziküler olmayan bileşenlerden kaynaklanan kontaminasyon nedeniyle hâlâ zordur. Bu protokol, fare SkM ve BM'den sEV'lerin izole edilmesi için tekrarlanabilir bir iş akışını tanımlar. SkM enzimatik olarak sindirilirken, BM doğrudan işlenir ve ardından diferansiyel santrifüjleme ve boyut dışlama kromatografisine (SEC) tabi tutulur. SkM için, boşluk hacmi (~2,5 mL) atılır ve ardından gelen ~1,6 mL genellikle 400 μL ardışık kesirlere (F1–F4) alt bölünmüş EV zenginleştirilmiş fraksiyonlar olarak toplanır. BM için, 700 μL boşluk hacmi atılır, ardından ~850 μL EV ile zenginleştirilmiş bir fraksiyon toplanır; bu kesir, ~170 μL ardışık fraksiyonlara (F1–F5) bölünebilir ve EV işaretleyici zenginleştirmesine göre bir topara alınabilir. Bu yaklaşımla, sEV'ler küçük doku hacimlerinden (yaklaşık 500 μL tek bir quadriceps'ten ve 150 μL birikmiş femur ve tibia BM'den) izole edilebilir ve ~108 parçacık·mL−1·mg−1 parçacık üretir ve parçacık çapları ağırlıklı <200 nm'dir. Vezikül bütünlüğü ve saflığı, kanonik EV belirteçleri için transmisyon elektron mikroskobi, nanopartikül takip analizi ve Western blotting kullanılarak doğrulanır; ayrıca tetraspanin tanımlı vezikül alt popülasyonlarını nicelendirmek için tek parçacıklı interferometrik tespit ile ek karakterizasyon yapılır. Bu yöntem, minimal girdi materyali kullanarak yapısal olarak karmaşık dokulardan yüksek saflıkta sEV'lerin tekrarlanabilir izolasyonunu sağlar ve doku kaynaklı veziküllerin moleküler ve fonksiyonel analizlerini destekler.

Giriş

Küçük ekstrasellüler veziküller (sEV'ler), proteinler, lipidler ve nükleik asitlerin transferi yoluyla hücrelerarası iletişimi aracı eden nanoboyutlu, lipid bağlıparçacıklardır 1. Tüm hücre tipleri tarafından salınır ve neredeyse tüm biyolojik sıvılarda bulunur; burada peptitler ve mikro ribonüklein asitler (RNA) dahil olmak üzere biyoaktif yükün ana taşıyıcıları olarak işlev görürler.2. Yükleri seçici olarak sıralanır, bu da belirli sinyallerin hassasiletini sağlar 3 ve veziküler yapısı, yoğun moleküler yükleri uzun mesafelere konsantre moleküler yükler göndererek serbest salgılanan faktörlerin tipik gradyan ve seyrelme kısıtlamalarınıaşmalarını sağlar 4. Biyosıvılardan (örneğin plazma, serum ve tükürük) elde edilen EV'ler sistemik sinyalin uygun bir anlık görüntüsünü sağlamakla birlikte, birçok dokudan gelen oldukça karışık bir popülasyonutemsil ederler 5. Bu durum, hangi organın belirli bir biyolojik sinyali ürettiğini veya EV iletişiminin doku seviyesinde nasıl düzenlendiğini belirlemeyi zorlaştırır. Dolaşımdaki EV'ler bir havuzda olduğu için, dokuya özgü değişiklikler seyreltilebilir veya gizlenebilir, bu da sinyallerin gerçek kaynağını belirleme yeteneğinisınırlar.

İskelet kası (SkM) ve kemik iliği (BM), metabolik ve fonksiyonel olarak aktif olan başlıca dokulardır ve farklı hücresel bileşimlere ve sinyalrollerine sahiptir 7,8. Her iki doku da benzersiz, dokuya özgü yükle zenginleştirilmiş EV popülasyonları serbest bırakabilir; ancak bu sinyaller, bağışıklık hücreleri gibi yüksek dönüşümlü dokulardan gelen EV'ler tarafından plazmadakolayca gölgede bırakılabilir 8,9. EV'lerin kas veya BM'den doğrudan izole edilmesi hassasiyeti artırır ve dolaşımda gözlemlenemeyebilecek ince, dokuya özgü adaptasyonların tespitini sağlar. Bu nedenle, doku kaynaklı EV'ler temel tamamlayıcı bilgi sağlar; belirli bir organın ne zaman EV'ler salındığını, bu sinyallerin ne kadar sürede devam ettiğini ve hangi adaptasyonların akut ve kronik olduğunu ortaya koyar. EV'lere olan artan ilgiye rağmen, çoğu yerleşik izolasyon yöntemleri biyosıvılar (örneğin plazma ve serum) veya hücre kültürü sistemleri için geliştirilmiştir. Bu bağlamlarda, elektrikli araçlar nispeten yüksek verimli ve minimum yapısal bozulma ile elde edilebilir. Ancak, EV'leri doğrudan SkM ve BM gibi katı dokulardan izole etmek önemli teknik zorluklar yaratmaktadır. Bu dokular yapısal olarak karmaşık ve heterojendir; mekanik veya enzimatik ayrıştırma adımları gerektirir; bu adımlar yüksek çözünür proteinler, organel parçaları ve veziküler olmayan nanopartiküller gibi artefaktlar getirebilir; bu da yüksek saflıkta EV preparatlarının elde edilmesini zorlaştırır.

Doku kaynaklı EV izolasyonundaki bir diğer büyük zorluk, kesirin tanımı ve ayrımı için standart işakışlarının eksikliğidir. Sadece diferansiyel santrifüjleme genellikle protein agregaları ve büyük veziküllerin birlikte izolasyonuna yol açarken, ultrasantrifüj tabanlı yöntemler yaygın olarak kullanılsa da, rotor tipine ve deneysel koşullara bağlı olarak vezikül agregasyonu, deformasyon ve değişken geri kazanma ile sonuçlanabilir. Yoğunluk gradyanı yaklaşımları saflığı artırır ancak zaman alıcı, düşük verimlilik ve laboratuvarlar arasında standartlaştırılması zorolur 11. Sonuç olarak, şu anda yüksek saflıkta ve tutarlı verimli, katı dokulardan küçük EV'leri izole etmek için optimize edilmiş yaygın olarak benimsenen ve tekrarlanabilir bir yöntemyoktur.

Boyut dışlama kromatografisi (SEC), vezikülleri yüksek santrifüj kuvvetlerine maruz bırakmadan parçacıkları boyutlarına göre ayırdığı için umut verici bir alternatif olarak ortaya çıkmıştır. SEC, vezikül bütünlüğünü ve biyolojik işlevini korurken, küçük EV'lerin çözünür proteinlerden ve düşük moleküler ağırlıklı kirleticilerden verimli ayrılmasını sağlar. Önemli olarak, SEC, elülasyon fraksiyonlarının net tanımlanmasına olanak tanır; bu da EV ile zenginleştirilmiş fraksiyonların tekrarlanabilir tanımlanmasını ve deneyler arasında tutarlılığı artırır12. Ancak, SEC iş akışları, özellikle üst akış doku işleme, döküntü uzaklaştırma ve fraksiyon toplama konularında doku kaynaklı örnekler için dikkatli optimizasyon gerektirir. Bu sınırlamaları gidermek için, sEV'leri SkM ve BM'den izole etmek için tekrarlanabilir ve standartlaştırılmış bir protokol geliştirdik. Bu yöntem, lifli dokular için kontrollü enzimatik sindirimi, döküntü uzaklaştırmak için diferansiyel santrifüjü ve yüksek saflıktaki vezikülleri izole etmek için SEC tabanlı saflaştırmayı entegre eder. İş akışı, hücre içi bileşenlerden gelen kontaminasyonu en aza indirmek için özel olarak optimize edilmiştir; vezikül bütünlüğünü korurken ve düşük verimli dokulardan tutarlı bir iyileşme sağlar.

Bu protokol, nanoparçacık takip analizi (NTA), kanonik EV işaretleyicilerinin Western blottingi, morfolojik değerlendirme için elektron mikroskobu ve antikor yakalama, interferometrik boyutlandırma ve çok kanallı floresan görüntüleme kullanılarak tek parçacık EV analiziyle tanımlanmış fraksiyonlaşma ve doğrulanmış saflıkla doku kaynaklı sEV'lerin izole edilmesi için pratik ve ölçeklenebilir bir yaklaşım sunarak kritik bir metodolojik boşluğu doldurur. Özellikle biyosıvıdan türetilen veziküllerin sinyallerin hücresel kökenini çözmek için yetersiz olduğu dokuya özgü EV analizi gerektiren çalışmalar için oldukça uygundur. Araştırmacılar, amaç katı dokulardan yüksek saflıkta yüksek saflıkta sEV'ler elde etmek ve vezikül bütünlüğünü korumakta kullanmalıdır. Buna karşılık, ultrasantrifüj tabanlı yöntemler, saflığın daha az kritik olduğu yüksek verimli uygulamalarda tercih edilebilir ve yoğunluk gradyanı yaklaşımları, düşük veri verimliliğine rağmen belirli EV alt popülasyonları izole edilirken seçilebilir. Bu protokol birlikte, doku kaynaklı sEV'lerin izolasyonu ve karakterizasyonu için standart bir çerçeve sunar ve tekrarlanabilir moleküler, biyokimyasal ve fonksiyonel analizler yapılmasını sağlar.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Tüm hayvan prosedürleri McGill Üniversitesi Hayvan Bakım Komitesi (DOUG10029) tarafından onaylanmış ve Kanada Hayvan Bakımı Konseyi'nin yönergelerine uygun olarak gerçekleştirilmiştir.

1. SkM-den türetilen sEV (SkM-sEV) İzolasyon Protokolü

  1. Örnek Toplama ve Doku Dissosiyasyonu
    1. Doku hasadı ve korunması
      1. SkM dokusunu eksizyondan hemen sonra önceden soğutulmuş metilbütana batırarak snap-freeze yapın.
        NOT: Önceden soğutulmuş metilbütan hazırlamak için, bir metilbütan kapını kuru buz banyosuna yerleştirin ve yavaş yavaş küçük kuru buz parçalarını doğrudan sıvıya ekleyin. Çözeltinin soğumasına izin verdiğinizde, sıcaklık genellikle −70°C ile −80°C aralığındadır. Kullanım sırasında metilbütanı kuru buz banyosunda tutarak sıcaklığı koruyun. Dokuyu yaklaşık 3–4 saniye boyunca tamamen dondurana kadar batırın; bu, doku sertleşmesi ve esneklik kaybı ile gösterilir.
      2. Dokuyu kriyoviyallere aktarın.
      3. Numuneleri kuru buz üzerine koyun.
        NOT: Örnekleri −80°C'de saklayıp daha fazla işlem yapılana kadar saklanın. Tekrarlayan donma–erime döngülerinden kaçının. Hızlı snap-freeze, örnekler düzgün şekilde kapatıldığında elektrikli araçları etkili bir şekilde korur. Dokular açıkta kalırsa veya birden fazla donma-çözülme döngüsünden geçerse dehidrasyon veya vezikül hasarıoluşabilir 13.
    2. Doku ayrışması
      NOT: Tüm adımları steril aletler ve eldivenlerle bir biyogüvenlik kabininde yapın; böylece bulaşma EV saflığını tehlikeye atabilir.
      1. Tartı dokusu
        1. Cimbizleri %70 etanol ile sterilize edin ve hava kurumasına izin verin.
        2. Donmuş dokuyu önceden tartılmış bir süspansiyon kültürü kabına aktarın.
        3. Dokuyu miligram bir denge ile tartın (genellikle fare yaşı ve cinsiyetine bağlı olarak örnek başına ~80–120 mg).
          NOT: Protokol, ~80–120 mg giriş dokusu kütleleri için doğrulanmıştır. Bu aralıktaki örnekler için, Adım 1.2.3.1, 1.3.1.3 ve 1.3.2.1'de belirtilen reaktif hacimlerini değişiklik yapmadan kullanın. Bu aralık dışındaki örnekler için, RPMI-1640, kollagenaz D ve DNase I'in doğrulanmış oranını koruyarak tüm reaktif hacimlerini doku kütlesine orantılı olarak ölçeklendirin (1000 mg doku başına 1000:40:4 μL). Bu, doku başına yaklaşık 10 μL RPMI-1640, 0,4 μL kollagenaz D (100 mg/mL stok) ve 0,04 μL DNaz I (20.000 U/mL stok) ile karşılık gelir. Bu oranları koruyarak nihai reaksiyon içi enzim konsantrasyonlarını koruyun. 80–120 mg aralığının büyük ölçüde dışında çalışırken sindirim verimliliği ve EV verimi ampirik olarak doğrulanmalıdır.
        4. Örneği önceden soğutulmuş bir tüpe geri getirin ve buz üzerinde tutun.
      2. Enzimleri hazırlayın
        1. Kollajenaz D (100 mg/mL stok) ve DNase I (20.000 U/mL stok) aliquotlarını buz üzerinde eritin (bkz. Enzim stok hazırlığı için Ek Dosya 1, Adım 1.4). Bu enzimler, 1.3.2.1. Adımda eklenerek 3.8 mg/mL kollagenaz D ve 77 U/mL DNaz I nihai reaksiyon konsantrasyonlarına ulaşılır. Nihai sindirim hacmi 1.044mL'dir.
        2. DNase I'yi nazikçe ters çevirerek karıştırın. Vortex yapma.
      3. Sindirim için doku hazırlığı
        1. 800 μL RPMI-1640, buz üzerine yerleştirilmiş steril bir süspansiyon kültürü kabına ekleyin.
        2. Mendiliyi tabağa aktarın.
        3. Dokuyu yaklaşık eşit boyutta (her tarafı 2–3 mm) 6–8 parçaya steril tek kullanımlık bir skarpel kullanarak kesin. Kesim sırasında dokuyu steril forseps ile stabilize ederek eşit parçalanma sağlansın. Örnekler arasında tutarlılığı korumak için bu adımı 1 dakika içinde tamamlayın.
        4. Bozulmayı en aza indirmek için kabı işlem boyunca buzda tutun.
    3. Doku transferi ve enzimatik sindirim
      1. Doku transferi
        1. Steril bir P1000 pipet ucunun ucunu, steril bir bıçakla kesin; böylece 2–3 mm çapında bir açıklık oluşturulur; bu açıklık 1.2.3.3.3. Adımda üretilen doku parçalarının serbest geçişini sağlar.
          NOT: Alternatif olarak, standart bir açıklık (genellikle ~2–3 mm iç çap) sağlayan ve manuel kesimle ilgili değişkenliği ortadan kaldıran, ticari olarak mevcut geniş delikli (geniş delikli) 1 mL pipet uçları kullanın.
        2. Doku parçalarını ve RPMI-1640 ortamını, modifiye uçlu P1000 pipeti kullanarak önceden etiketlenmiş 1,5 mL tüplere aktarın. Kalıntı parçaları ve ortamı geri kazanmak için ardışık 2–3 aspirasyon gerçekleştirin. Transferden sonra kabı ve pipet ucunu görsel olarak inceleyin ve kalan parçaları steril forseps ile aktararak görünür doku kalmamasını sağlayabilirsiniz.
        3. Her tüpe 200 μL RPMI-1640 ekleyin.
      2. Enzimatik sindirim
        1. Her tüpte buzda çözülen aliquotlardan 40 μL kollagenaz D stoku (100 mg/mL) ve 4 μL DNase I stoku (20.000 U/mL) ekleyin. Bu, 3,8 mg/mL kollagenaz D ve 77 U/mL DNaz I nihai reaksiyon konsantrasyonları elde eder. 80–120 mg doku aralığı dışındaki örnekler için, ENZIM hacimlerini NOT'ta Adım 1.2.1.3'te tarif edildiği orantılı olarak ayarlayın.
          NOT: Bu hacimler, tipik 80–120 mg aralığındaki doku kütleleri için kalibre edilmiştir. Bu aralık dışındaki doku kütleleri için, tüm reaktif hacimlerini, NOT'ta tanımlandığı şekilde orantılı olarak ölçeklenin (doku kütlesi başına 0,4 μL kollagenaz D stoku ve 0,04 μL DNaz I stoku), bu da doku kütlesinden bağımsız olarak aynı son reaksiyon enzim konsantrasyonlarını korur.
        2. Birden fazla örnek işlenirken enzimleri tüm örneklere aynı anda ekleyin.
        3. Enzim ekleme sırasında tüpleri buzda tutun.
        4. Tüpleri nazikçe ters çevirerek karıştırın. Vortex yapma.
        5. Tüpleri 37°C'de nutatör mikserde 30 dakika kuluçka yapın (24 rpm, 20° eğim açısı; bkz. Malzemeler Tablosu). Kuluçka sırasında eşit karıştırmaya dikkat edin.
          NOT: Her örneği toplam 1.044 mL hacimde sindirin (1000 μL RPMI-1640, 40 μL kollagenaz D ve 4 μL DNaz I; ~25:1 tampon-kollajen oranına eşdeğer).
    4. Enkaz Uzaklaştırılması
      NOT: İlk santrifüjasyonun başında SEC sütun dengesini başlatın (Adım 1.4.1.1). SEC kolonu, yıkama ve dengeleme için 20–25 dakika gerektirir. Bu noktada dengeye başlamak, filtreleme aşaması tamamlandıktan hemen sonra kolonun örnek yüklemeye hazır olmasını sağlar (Adım 1.4.3).
      1. İlk santrifüj
        1. Örnekleri 300 × g sıcaklığında 10 dakika boyunca 4°C'de santrifüjlenerek sindirilmemiş kalıntıları, sağlam hücreleri ve kalan doku parçalarını pellet olarak parçalayın.
        2. Süpernatantı dikkatlice yeni steril 1,5 mL mikrosantrifüj tüplerine aktarın, pelleti rahatsız etmeden.
      2. İkinci santrifüj
        1. Örnekleri 2.000 × g sıcaklığında 15 dakika boyunca 4°C'de santrifüjlenerek büyük kalıntıları, ölü hücreleri, apoptotik cisimleri ve büyük vezikülleri pellet edin.
        2. Süpernatantı dikkatlice yeni steril 1,5 mL mikrosantrifüj tüplerine aktarın, pelleti rahatsız etmeden.
          NOT: İkinci santrifüj isteğe bağlıdır ve ek enkaz temizleme gerektiğinde dahil edilmelidir. Eğer üst gövde ilk santrifüjden sonra gözle görülür şekilde bulanık görünüyorsa veya arttık partikül madde içeriyorsa bu adımı gerçekleştirin. Bu adım, önceki preparatlarda EV ile zenginleştirilmiş SEC fraksiyonlarında hücre içi belirteçler (örneğin Calnexin veya BiP) tarafından kontaminasyon veya transmisyon elektron mikroskopisiyle veziküler olmayan partiküllerin varlığı tespit edildiyse de önerilir. Bu adımın gerekliliği, her doku tipi için ilk protokol optimizasyonu sırasında doğrulanmalıdır.
      3. Filtreleme
        1. Membranı dengelemek ve örnek kaybını en aza indirmek için RPMI-1640 ile durulayarak önceden ıslak steril 30 μm hücre süzgeçleri yapılır. Durulamayı at.
        2. Her örneği, önceden ıslanmış 30 μm hücre süzgecinden steril, düşük protein bağlayan 1,5 mL mikrosantrifüj tüplerine filtreleyin; böylece kalan hücresel kalıntılar ve büyük parçacıklar SEC'den önce çıkarılır.
        3. Örneklerin yerçekimiyle filtreden geçmesine izin verin.
        4. Filtreleme için her örnek için 10–15 dakika bekleyin.
          NOT: Filtreleme tamamlanır, filtre membranının üzerinde görünür bir sıvı kalmadığında ve toplama tüpündeki filtrat hacmi stabil hale geldiğinde. Filtreleme daha yavaşsa veya duruyorsa, bu kalıntı nedeniyle tıkanma anlamına gelebilir; Bu durumlarda, açıklama adımını tekrarlamak veya örnek yükünü azaltmak göz önünde bulundurun.
        5. 550–600 μL filtrelenmiş süpernatan toplanarak ardından SEC kolonuna yüklenin. Örnekler arasında tutarlılık için, toplam hacmin geri kazanılmasına bakılmaksızın, yükleme hacmini sütun başına 500 μL olarak normalize edin (bkz. Adım 2.2.1).
  2. Boyut dışlama kromatografisi (SEC)
    1. SEC sütununu dengeleyin
      NOT: Mümkünse bu adımı santrifüj sırasında yapın.
      1. SEC kolonunu 17 mL 1× PBS (0.22 μm filtreli) ile yuyun.
      2. Tüm hacmin yerçekimiyle sütundan geçmesine izin verin, beklenen akış hızı 0,75 mL/dakika (17 mL yıkama hacmi için toplam 20–25 dakika). Daha hızlı veya yavaş akış oranları, yanlış kolon dengesi veya tıkanıklığı gösterebilir.
      3. Denge sırasında kolon ve PBS oda sıcaklığında (RT, 21°C ± 2°C) tutularak tutarlı akış hızı ve optimal kolon performansı sağlanır.
      4. Tüm fraksiyonların toplanması için düşük protein bağlanan 1,5 mL mikrosantrifüj tüpleri hazırlanın.
      5. Gerekirse boşluk hacminin toplanması için ek bir tüp hazırlayın.
    2. Örnek yüklemesi ve elüsyonu
      1. SEC kolonuna 500 μL filtrelenmiş süpernatant yükleyin.
      2. Numunenin reçineye tamamen girmesine izin verin. Uç nokta, sıvı menisküs reçine yatağının yüzeyine ulaştığında elde edilir; reçine gözle görülür şekilde ıslak kalırken, reçine üzerinde görünür bir sıvı kalmaz.
      3. Menisküsün reçine yüzeyinin altına düşmesine veya sütunun kurumasına izin vermeyin, çünkü bu reçine yatağına hava girer ve elülasyonu bozar. Sıvı menisküs reçine yüzeyine ulaştığında (Adım 2.2.2'de tanımlandığı gibi), hemen 2.2.4. Adıma geçin.
      4. Hemen 2 mL PBS ekleyerek elusiyon başlatılır.
      5. Boşluk hacmini (~2.5 mL) toplayın.
      6. Boşluk hacmini atın veya EV olmayan bir fraksiyon olarak kalsın.
      7. 2.5 mL boşluk hacmi elüasyon ettikten hemen sonra EV ile zenginleştirilmiş fraksiyonu toplamaya başlayın.
      8. Boşluk hacmini takip ederek toplam 1,6 mL EV ile zenginleştirilmiş eluat toplayın; ya tek bir sürekli fraksiyon olarak bir tüpte ya da ardışık kesirler olarak ve ardından biriktirilecek.
      9. Alternatif olarak, verimle karşılaştırıldığında saflığı optimize etmek için ardışık 0,4 mL fraksiyonları toplayabilirsiniz. Daha yüksek saflık gerektiğinde (örneğin, proteomik analizler veya hassas sonraki uygulamalar için) daha küçük fraksiyon hacimleri önerilirken, genel EV verimini maksimize etmek için daha büyük fraksiyonlar kullanılabilir.
      10. EV zenginleştirme için fraksiyonları karakterizasyon yöntemleri kullanılarak değerlendirin (örneğin, EV belirteçleri ve kirleticiler için Western blot, ve NTA) ve karakterizasyon bölümünde tanımlanan EV ile zenginleştirilmiş fraksiyonları havuzlayın.
        NOT: Sütunu sürekli akıcı tutun. Bir fraksiyon bitiyorken, reçine yatağının üzerinde sabit sıvı tutmak ve kolonun kurumasını önlemek için PBS ekleyin. Toplama için düşük protein bağlanan, nükleaz içermeyen tüpler kullanın.
    3. Yoğunlaşma
      1. EV örneklerini, sonraki uygulamalar için (örneğin, RNA dizileme, proteomik veya Western blot) için santrifüj filtreler (100 kDa moleküler ağırlık kesmesi [MWCO]) kullanarak konsantre edin.
      2. Filtreleri kullanmadan önce PBS ile önceden durulayın.
      3. Örnekleri 4.000 × g sıcaklığında 4°C'de santrifüjle yaparak, istenen nihai hacme (genellikle 50–100 μL) ulaşılana kadar her 2–3 dakikada bir kontrol edilir. Daha yüksek konsantrasyon ve daha yüksek hacim gerektiren uygulamalarda (örneğin, ~100 μL) daha düşük nihai hacimler (örneğin, ~50 μL) kullanılır; çünkü en yüksek geri kazanım tercih edilir.
        DIKKAT: Hedef hacmi sağlandığında santrifüjü durdurarak aşırı konsantrasyondan kaçının.
      4. Retentatı nazik pipetle geri kazanın.
      5. Gerekirse geri kazanımı tahmin etmek için konsantrasyon öncesi ve sonrası örnek hacimlerini kaydedin. NTA, varsa, partikül konsantrasyonunu konsantrasyon öncesi ve sonrası değerlendirmek için kullanılabilir.
    4. Depolama
      1. EV ile zenginleştirilmiş fraksiyonları buz üzerinde veya 4°C'de tutarak hemen testler için (örneğin, NTA ve geçirim elektron mikroskopisi [TEM]) ve TEM için 24 saat, NTA için ise 48 saat içinde işlem yapın.
      2. Aliquot EV örnekleri depolama için düşük protein bağlanan tüplere yerleştirir.
      3. Uzun süreli kullanım için örnekleri −80°C'de sakla.
      4. Tekrarlayan donma–erime döngülerinden kaçının.

2. BM türetilmiş sEV (BM-sEV) İzolasyon Protokolü

  1. Örnek toplama ve doku ayrışması
    1. Doku hasadı ve korunması
      1. Kemikleri çıkardıktan hemen sonra dondurmayın, çünkü bu iliği sertleştirir ve dürtülme yöntemiyle ekstraksiyonu zorlaştırır. Bunun yerine, kemikleri işlem veya dondurma öncesi kısa tutma sürelerinde buzun üzerinde veya 4°C'de tutun; bu da Adım 3.1.1.4'te (−80°C depolamadan önce kuru buz üzerine yerleştirilme) tanımlanmıştır.
      2. Kesilmiş kemiklerden çevredeki kas ve bağ dokusunu çıkarın.
      3. Kemikleri kriyoviallere aktarın.
      4. Numuneleri kuru buz üzerine koyun.
        NOT: Örnekleri −80°C'de saklayıp daha fazla işlem yapılana kadar saklanın.
    2. BM işleme
      NOT: Tüm adımları steril aletler ve eldivenlerle bir biyogüvenlik kabininde yapın; böylece bulaşma EV saflığını tehlikeye atabilir.
      1. 1.5 mL santrifüj tüplerini malzeme eklemeden önce önceden tartın ve etiketleyin. Çekimden önce ve sonra tüp ağırlıklarını karşılaştırarak BM kütlesini hesaplayın.
      2. Dürtülmüş tüp kurulumunu, sıkı bir şekilde oturan 1.5 mL santrifüj tüpünün içine 0.2 mL PCR tüpünü (kapağı sağlam) yerleştirerek hazırlayın. 0,2 mL tüpün altını, tabana dik tutulan steril 16 G iğneyle bir kez delin, ~1,6 mm çapında tektek, tekdüz bir perforasyon elde edilir. Her fare için bir ayakta bir set hazırlayın.
      3. Tüm kaslardan ve çevresindeki dokulardan temizlenmiş bacağı, steril bir Petri kabına yerleştirin.
      4. Eklem boşluğunu keserek uyluk kemiği ve tibia'yı ayırın.
      5. Kırmızı iliği ortaya çıkarmak için uyluk kemiği ve tibianın her iki ucunu kesin. Kemikleri, 1.5 mL tüpün içinde konumlandırılan delinmiş PCR tüpüne yerleştirin ve santrifüj sırasında güvenli bir kurulum sağlamak için parafilm ile montajı kapatın.
      6. Örnekleri yaklaşık 8.000 × g veya kullanılan cihazın en yakın ayarında bir tezgah üstü mikrosantrifüjde 10 saniye boyunca oda sıcaklığında santrifüj edin.
      7. Başarılı ilik ekstraksiyonunu üç kriterle doğrulayın: (i) kemikler gözle görülür şekilde beyaz görünür ve kırmızı ilik kalıntısı yoktur, (ii) alt tüpteki pellet koyu kırmızı ve kompakt görünür, genellikle 1.5 mL tüpün konik ucunu doldurur ve (iii) ölçülen ilik kütlesi (Adım 3.1.2.9) fare başına beklenen ~15–30 mg aralığında yer alır.
      8. Kemikleri yeniden konumlandırın veya yeniden kesin ve kemik içinde görünür kırmızı ilik kalırsa kısa bir dönüş tekrarı yapılsın.
      9. Tüpleri tekrar tartarak çıkarılan ilik kütlesini belirleyin (genellikle fare yaşı, cinsiyet ve ekstraksiyon etkinliğine bağlı olarak örnek başına ~15–30 mg).
        NOT: Protokol, ilik verimleri için ~15–30 mg numune başına doğrulanmıştır. RPMI-1640 yeniden süspansiyon hacmi ilik kütlesinden bağımsız olarak 250 μL'de sabit tutulduğundan (Adım 3.1.2.10), EV verimi aşağı akış analizinde ölçülen başlangıç ilik kütlesine normalleştirilir (parçacıklar·mL−1·mg−1 doku). 15 mg'ın oldukça altında örnekler için, eşleştirilmiş farelerden (aynı yaş, cinsiyet ve kemik) ilikleri yeniden süspansiyondan önce toplanarak yeterli giriş için yeterli giriş sağlanır. 30 mg'nin büyük ölçüde üzerindeki örneklerde, ilik ya 250 μL değerinde iki ayrı resüspansiyona bölünür ya da RPMI-1640 hacmini orantılı olarak ölçeklendirerek (ilik başına ~12,5 μL) tam resüspansiyonu önler; Her iki durumda da, analiz sırasında aynı kütlebaşı normalizasyonu uygulayın.
      10. Her tüpe 250 μL RPMI-1640 ekleyin. İlik kütlesi ne olursa olsun, EV veriminin başlangıç ilik kütlesine normalleşmesini sağlamak için örnekler arasında sabit bir hacmi koruyun. Örnekleri buzda tutun.
      11. P1000 pipeti kullanarak iliği 10–15 kez yukarı ve aşağı nazikçe pipetle yeniden askıya alın, süspansiyon görsel olarak homojen görünene kadar, görünür bir küme veya sağlam doku parçası kalmayınca. Vezikül bütünlüğünü bozabilecek güçlü pipetleme veya kabarcık oluşumundan kaçının.
  2. Enkaz Uzaklaştırılması
    1. İlk santrifüj
      1. Örnekleri 300 × g sıcaklığında 10 dakika boyunca 4°C'de santrifüjlenerek sindirilmemiş kalıntıları, sağlam hücreleri ve kalan doku parçalarını pellet olarak parçalayın.
      2. Süpernatantı dikkatlice yeni steril 1,5 mL mikrosantrifüj tüplerine aktarın, pelleti rahatsız etmeden.
    2. İkinci santrifüj
      1. Örnekleri 2.000 × g sıcaklığında 15 dakika boyunca 4°C'de santrifüjlenerek büyük kalıntıları uzaklaştırın.
      2. Süpernatantı dikkatlice yeni steril 1,5 mL mikrosantrifüj tüplerine aktarın, pelleti rahatsız etmeden.
    3. Üçüncü santrifüj
      1. Örnekleri 10.000 × g'de 30 dakika boyunca 4°C'de santrifüjlenerek apoptotik cisimler ve büyük veziküller çıkarılır.
      2. Süpernatantı dikkatlice yeni steril 1,5 mL mikrosantrifüj tüplerine aktarın, pelleti rahatsız etmeden.
      3. Son olarak 200 μL süpernatantın elde edilmesinden emin olun.
  3. Boyut dışlama kromatografisi (SEC)
    1. Kolon hazırlığı
      1. SEC kolonunu 6 mL 1× PBS (0,22 μm filtreli) ile yıkama ile dengeleyin.
        NOT: Dengeleme hacmi sütun-bazdır ve Malzemeler Tablosu'nda listelenen sütun tipiyle eşleşmelidir. Bu sütun, SkM örnekleri için kullanılan sütundan farklı olan 6 mL dengeleme hacmi gerektirir.
      2. Tüm hacmin yerçekimiyle geçmesine izin verin.
      3. Denge sırasında kolon ve PBS RT konumunda tutularak optimal akış hızı ve kolon performansını sağlamaktır.
    2. Örnek yüklemesi ve elüsyonu
      1. SEC kolonuna 150 μL filtrelenmiş süpernatant yükleyin.
      2. Numunenin reçineye tamamen girmesine izin verin. Uç nokta, sıvı menisküs reçine yatağının yüzeyine ulaştığında reçine üzerinde görünür bir sıvı kalmadığında ve reçine ıslak kaldığında (Adım 2.2.2'de açıklandığı gibi) elde edilir.
      3. Menisküsün reçine yüzeyinin altına düşmesine veya sütunun kurumasına izin vermeyin (bkz. Adım 3.3.2.2'de tanımlanan son nokta), çünkü bu reçine yatağına hava girer ve eluasyonu bozar. Sıvı menisküs reçine yüzeyine ulaştığında, hemen 3.3.2.4. Adıma gecikmeden geçin.
      4. Hemen 550 μL PBS ekleyerek elusyum başlatılır.
      5. Boşluk hacmini (700 μL) toplayın.
      6. Boşluk hacmini atın veya EV olmayan bir fraksiyon olarak kalsın.
      7. 700 μL boşluk hacmi elüasyon ettikten hemen sonra EV ile zenginleştirilmiş fraksiyonu toplamaya başlayın.
      8. 700 μL boşluk hacminin ardından 850 μL EV ile zenginleştirilmiş eluat toplayın.
      9. Alternatif olarak, yaklaşık 170 μL aralıklı kesimler toplayarak verim yerine saflığı optimize edebilirsiniz.
        NOT: Daha yüksek saflık gerektiğinde (örneğin, proteomik analizler veya hassas sonraki uygulamalar için) daha küçük fraksiyon hacimleri önerilirken, genel EV verimini en üst düzeye çıkarmak için daha büyük fraksiyonlar kullanılabilir.
      10. EV işaretleyicileri için fraksiyonları değerlendirin ve gerekirse EV ile zenginleştirilmiş fraksiyonları havuzlayın.
        NOT: Sütunu sürekli akıcı tutun. Bir fraksiyon bitiyorken, reçine yatağının üzerinde sabit sıvı tutmak ve kolonun kurumasını önlemek için PBS ekleyin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Bu protokolün doku kaynaklı sEV'lerin izole edilmesindeki etkinliğini değerlendirmek için, SkM ve BM örneklerinden temsil edici sonuçlar sunulmaktadır. Başarılı izolasyon, (i) erken SEC fraksiyonlarında kanonik EV belirteçlerinin (TSG101, CD63, CD81 ve CD9) zenginleştirilmesi, (ii) hücre içi kirleticilerin (örneğin Calnexin ve BiP) minimal tespiti, (iii) parçacıkların çoğunluğu <200 nm, (iv) sağlam ve zar bağlı veziküllerin TEM ile görselleştirilmesi ile tanımlandı; (v) EV ile zenginleşt...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Bu protokol, düşük verimli ve yüksek heterojen doku olan SkM ve BM'den doğrudan sEV ile zenginleştirilmiş preparatların izole edilmesi için sağlam ve tekrarlanabilir bir yaklaşımı tanımlar. EV izolasyonu biyosıvılar ve hücre kültür sistemleri için iyi kurulmuş olsa da, doku kökenli EV'ler için standartlaştırılmış yöntemler, doku ayrışması, hücre içi materyalden kontaminasyon ve verim değişkenliği ile ilgili zorluklar nedeniyle sınırlı kalır. Burada, EV saflığı, verimi ve tekrarlanabilirl...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar çıkar çatışması belirtmemektedir.

Teşekkürler

Teknik yardım ve faydalı tartışmalar için Jennie Yang, Dariusz Żurawek ve Volodymyr Yerko'ya teşekkür ederiz. Özellikle Nadim Tawil ve Laura Montermini'ye ekstraselüler vezikül karakterizasyonu ve veri toplama konusundaki desteği için Uygulamalı Nanotıp Merkezi'nin platformuna minnettarız. Ayrıca hayvan tesisi personeli Guylaine Gadoury ve Tara Thomson'a fare yönetiminde yaptıkları yardımlar için teşekkür ederiz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
1.5 mL santrifüj tüpüSarstedt72.690.300Protokol boyunca kullanılan genel mikrosantrifüj tüpü
1.5 mL düşük protein bağlanma tüpüSarstedt72.706.600EV işleme, SEC fraksiyon toplama ve depolama için kullanılır
0.2 mL PCR tüpüFisher Scientific14-222-262Delinmiş tüp kemik iliği ekstraksiyon kurulumu için kullanılır
16 G iğneBD3051970.2 mL PCR tüpünü delmek için kullanılır
30 &mikron hücre süzgeciMiltenyi Biotec130-098-458İskelet kası örnek filtrasyonu için kullanılır
70% etanolSigma-Aldrich1.11727Cımbızları sterilize etmek için kullanılır
Biyolojik güvenlik kabiniNANASteril doku işleme için kullanılır
Kemik kesme aletiFisher Scientific10-001-976Femuru ve tibiayı ayırmak ve iliği açığa çıkarmak için kullanılır
Boğa serum albümini (BSA)BioShopALB001Western blot blokajı ve antikor seyreltme için kullanılır
Kalsiyum klorür dihidrat (CaCl2·2H2O)BioShopCCL302HEPES tamponu hazırlığı için kullanılır
Karbon kaplı bakır ızgara, 200-meshSigma-Aldrich930342TEM örnek hazırlığı için kullanılır
Santrifüj filtresi, 100 kDa MWCOMilliporeSigmaUFC810096EV konsantrasyonu için kullanılır
Kollajenaz DRoche11088858001İskelet kası enzimatik sindirimi için kullanılır
CryovialSarstedt72.690.300Dokunun ve kemiğin depolanması için kullanılır
Deiyonizasyonlu su (ultra saf)NANATampon hazırlığı ve TEM yıkama adımları için kullanılır
DNase IRoche11284932001İskelet kası enzimatik sindirimi için kullanılır
Kuru buzNANAÖrnek soğutma ve taşıma için kullanılır
Gelişmiş kimilüminesans substratıBiorad1705061Western blot tespiti için kullanılır
Filtre ünitesi, 0.22 &mikronSarstedt83.3941.501Uygulanabilir olduğunda PBS'yi filtrelemek için kullanılır
Forseps / cımbızMilliporeSigmaF3892Doku işleme için kullanılır
GlütaraldehitNANATEM fiksasyonu için kullanılır
GlisinNANATEM ızgara yıkama adımlarında kullanılır
Hank'in Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS)Gibco14175-095DNase I stok hazırlığı için kullanılır
HEPESBioShopHEP001.500HEPES-NaOH tamponu hazırlığı için kullanılır
At kestanesi peroksidaz-konjuge streptavidinThermo FisherS911Western blot tespiti için kullanılır
Kimilüminesans için görüntüleme sistemiBiorad12003153Western blot membranlarını görüntülemek için kullanılır
KClBioShopPOC308HEPES tamponu hazırlığı için kullanılır
Magnezyum klorür (MgCl2)BioShopMAG510.500HEPES tamponu hazırlığı için kullanılır
2-MetilbütanThermo Fisher78-78-4İskelet kası ani dondurma için kullanılır
Mikrogram dengeMilliporeSigmaZ741359Dokunun ve iliğin tartılması için kullanılır
NaClBioShopSOD004.1HEPES tamponu hazırlığı için kullanılır
Nano-parçacık izleme analizi cihazıMalvern PanalyticalNanoSight NS300NanoSight NS300, parçacık boyutlandırma ve sayma için kullanılır
NaOHBioShopSHY500.500pH ayarlaması için kullanılır
Nitroselüloz membranBioRad1704271Western blot transferi için kullanılır
Salınımlı karıştırıcıLabnetS0500Enzimatik sindirim sırasında kullanılır
P1000 pipetMilliporeSigmaFA10006M-1EADoku transferi için kullanılır
Pipet ucu, 1 mLSarstedt70.3050.275Dokunun ve doku parçacıklarının transferi için ucun açılması genişletilmiştir
Fosfat tamponlu salin (PBS)WisentINC 811.012-FLProtokol boyunca kullanılır; ayrıca SEC eşikleme ve elüsyon için kullanılır
Fosfataz inhibitörüMilliporeSigma4906845001Western blot lizası hazırlığı için kullanılır
Petri kabıMilliporeSigmaCLS351146Kemik iliği hazırlığı için kullanılır
Poliakrilamid jel, 4-20% gradyan lekesizBioRad4561094Western blot ayrımı için kullanılır
Proteaz inhibitörüMilliporeSigma11697498001Western blot lizası hazırlığı için kullanılır
RPMI-1640 ortamıSigma-AldrichR7388-500MLTakviye edilmemiş; FBS veya antibiyotik içermez
RIPA tampon

Kaynaklar

  1. Whitham, M., et al. Extracellular vesicles provide a means for tissue crosstalk during exercise. Cell Metab. 27 (1), 237-251.e4 (2018).
  2. Kumar, M. A., et al. Extracellular vesicles as tools and targets in therapy for diseases. Signal Transduct Target Ther. 9 (1), 27 (2024).
  3. Fonseka, P., Mathivanan, S. Extracellular vesicles biogenesis, cargo sorting and implications in disease conditions. Cells. 12 (2), (2023).
  4. Taraboletti, G., et al. Bioavailability of VEGF in tumor-shed vesicles depends on vesicle burst induced by acidic pH. Neoplasia. 8 (2), 96-103 (2006).
  5. Dakup, P. P., et al. Challenges and opportunities in state-of-the-art proteomics analysis for biomarker development from plasma extracellular vesicles. Proteomics. , (2025).
  6. Li, Y., et al. EV-origin: Enumerating the tissue-cellular origin of circulating extracellular vesicles using exLR profile. Comput Struct Biotechnol J. 18, 2851-2859 (2020).
  7. Shero, J. A., Lindholm, M. E., Sandri, M., Stanford, K. I. Skeletal muscle as a mediator of interorgan crosstalk during exercise: Implications for aging and obesity. Circ Res. 136 (11), 1407-1432 (2025).
  8. Vanhie, J. J., et al. The role of exercise- and high-fat diet-induced bone marrow extracellular vesicles in stress hematopoiesis. Front Physiol. 13, 1054463 (2022).
  9. Pinto, A. C., et al. Exploiting the therapeutic potential of contracting skeletal muscle-released extracellular vesicles in cancer: Current insights and future directions. J Mol Med (Berl). 102 (5), 617-628 (2024).
  10. Welsh, J. A., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles (MISEV2023): From basic to advanced approaches. J Extracell Vesicles. 13 (2), e12404 (2024).
  11. De Sousa, K. P., et al. Isolation and characterization of extracellular vesicles and future directions in diagnosis and therapy. Wiley Interdiscip Rev Nanomed Nanobiotechnol. 15 (1), e1835 (2023).
  12. Guo, J., et al. Establishment of a simplified dichotomic size-exclusion chromatography for isolating extracellular vesicles toward clinical applications. J Extracell Vesicles. 10 (11), e12145 (2021).
  13. Ahmadian, S., et al. Different storage and freezing protocols for extracellular vesicles: A systematic review. Stem Cell Res Ther. 15 (1), 453 (2024).
  14. Watanabe, S., et al. Skeletal muscle releases extracellular vesicles with distinct protein and microRNA signatures that function in the muscle microenvironment. PNAS Nexus. 1 (4), pgac173 (2022).
  15. Magalhaes-Gama, F., et al. Exploring cell-derived extracellular vesicles in peripheral blood and bone marrow of B-cell acute lymphoblastic leukemia pediatric patients: Proof-of-concept study. Front Immunol. 15, 1421036 (2024).
  16. Potter, D. R., et al. Mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles attenuate pulmonary vascular permeability and lung injury induced by hemorrhagic shock and trauma. J Trauma Acute Care Surg. 84 (2), 245-256 (2018).
  17. Osteikoetxea, X., et al. Differential detergent sensitivity of extracellular vesicle subpopulations. Org Biomol Chem. 13 (38), 9775-9782 (2015).
  18. Kim, T., Hong, J. W., Lee, L. P. Efficient methods of isolation and purification of extracellular vesicles. Nano Converg. 12 (1), 45 (2025).
  19. Bracht, J. W. P., et al. Choice of size-exclusion chromatography column affects recovery, purity, and miRNA cargo analysis of extracellular vesicles from human plasma. Extracell Vesicles Circ Nucl Acids. 5 (3), 497-508 (2024).
  20. Mo, W., et al. Extracellular vesicle-mediated bidirectional communication between the liver and other organs: Mechanistic exploration and prospects for clinical applications. J Nanobiotechnology. 23 (1), 190 (2025).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Vezik l zolasyonuDiferansiyel Santrif jlemeNanopar ac k TakibiTransmisyon Elektron MikroskobuWestern BlottingTetraspanin Mark rleri
Boyut Dışlama Kromatografisi ile Küçük Ekstrasellüler Veziküllerin Fare, İskelet Kası ve Kemik Iliğinden İzole Edilmesi
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.