Bu protokol, enzimatik sindirim ve boyut dışlama kromatografisi kullanılarak morin iskelet kası ve kemik iliğinden küçük ekstrasellüler veziküllerin izole edilmesini açıklar; böylece yapısal olarak karmaşık, düşük verimli dokulardan vezikülle zenginleştirilmiş fraksiyonların tekrarlanabilir şekilde geri kazanılmasını mümkün kılarak sonraki moleküler analiz için mümkün olur.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Boyut Dışlama Kromatografisi ile Küçük Ekstrasellüler Veziküllerin Fare, İskelet Kası ve Kemik Iliğinden İzole Edilmesi
Bu makalede
Özet
Özet
Küçük hücredışı veziküller (sEV'ler), proteinler, lipidler ve ribonükleik asitlerin (RNA) transferi yoluyla hücreler arası iletişimi aracılık eden nanoboyutlu, lipid bağlı parçacıklardır. İskelet kası (SkM) ve kemik iliği (BM) gibi katı dokulardan sEV'lerin izolasyonu, düşük verim ve veziküler olmayan bileşenlerden kaynaklanan kontaminasyon nedeniyle hâlâ zordur. Bu protokol, fare SkM ve BM'den sEV'lerin izole edilmesi için tekrarlanabilir bir iş akışını tanımlar. SkM enzimatik olarak sindirilirken, BM doğrudan işlenir ve ardından diferansiyel santrifüjleme ve boyut dışlama kromatografisine (SEC) tabi tutulur. SkM için, boşluk hacmi (~2,5 mL) atılır ve ardından gelen ~1,6 mL genellikle 400 μL ardışık kesirlere (F1–F4) alt bölünmüş EV zenginleştirilmiş fraksiyonlar olarak toplanır. BM için, 700 μL boşluk hacmi atılır, ardından ~850 μL EV ile zenginleştirilmiş bir fraksiyon toplanır; bu kesir, ~170 μL ardışık fraksiyonlara (F1–F5) bölünebilir ve EV işaretleyici zenginleştirmesine göre bir topara alınabilir. Bu yaklaşımla, sEV'ler küçük doku hacimlerinden (yaklaşık 500 μL tek bir quadriceps'ten ve 150 μL birikmiş femur ve tibia BM'den) izole edilebilir ve ~108 parçacık·mL−1·mg−1 parçacık üretir ve parçacık çapları ağırlıklı <200 nm'dir. Vezikül bütünlüğü ve saflığı, kanonik EV belirteçleri için transmisyon elektron mikroskobi, nanopartikül takip analizi ve Western blotting kullanılarak doğrulanır; ayrıca tetraspanin tanımlı vezikül alt popülasyonlarını nicelendirmek için tek parçacıklı interferometrik tespit ile ek karakterizasyon yapılır. Bu yöntem, minimal girdi materyali kullanarak yapısal olarak karmaşık dokulardan yüksek saflıkta sEV'lerin tekrarlanabilir izolasyonunu sağlar ve doku kaynaklı veziküllerin moleküler ve fonksiyonel analizlerini destekler.
Giriş
Küçük ekstrasellüler veziküller (sEV'ler), proteinler, lipidler ve nükleik asitlerin transferi yoluyla hücrelerarası iletişimi aracı eden nanoboyutlu, lipid bağlıparçacıklardır 1. Tüm hücre tipleri tarafından salınır ve neredeyse tüm biyolojik sıvılarda bulunur; burada peptitler ve mikro ribonüklein asitler (RNA) dahil olmak üzere biyoaktif yükün ana taşıyıcıları olarak işlev görürler.2. Yükleri seçici olarak sıralanır, bu da belirli sinyallerin hassasiletini sağlar 3 ve veziküler yapısı, yoğun moleküler yükleri uzun mesafelere konsantre moleküler yükler gönderere....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Tüm hayvan prosedürleri McGill Üniversitesi Hayvan Bakım Komitesi (DOUG10029) tarafından onaylanmış ve Kanada Hayvan Bakımı Konseyi'nin yönergelerine uygun olarak gerçekleştirilmiştir.
1. SkM-den türetilen sEV (SkM-sEV) İzolasyon Protokolü
- Örnek Toplama ve Doku Dissosiyasyonu
- Doku hasadı ve korunması
- SkM dokusunu eksizyondan hemen sonra önceden soğutulmuş metilbütana batırarak snap-freeze yapın.
NOT: Önceden soğutulmuş metilbütan hazırlamak için, bir metilbütan kapını kuru buz banyosuna yerleştirin ve yavaş yavaş küçük kuru buz parçalarını doğrudan sıvıya....
- SkM dokusunu eksizyondan hemen sonra önceden soğutulmuş metilbütana batırarak snap-freeze yapın.
- Doku hasadı ve korunması
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Bu protokolün doku kaynaklı sEV'lerin izole edilmesindeki etkinliğini değerlendirmek için, SkM ve BM örneklerinden temsil edici sonuçlar sunulmaktadır. Başarılı izolasyon, (i) erken SEC fraksiyonlarında kanonik EV belirteçlerinin (TSG101, CD63, CD81 ve CD9) zenginleştirilmesi, (ii) hücre içi kirleticilerin (örneğin Calnexin ve BiP) minimal tespiti, (iii) parçacıkların çoğunluğu <200 nm, (iv) sağlam ve zar bağlı veziküllerin TEM ile görselleştirilmesi ile tanımlandı; (v) EV ile zenginleşt.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Bu protokol, düşük verimli ve yüksek heterojen doku olan SkM ve BM'den doğrudan sEV ile zenginleştirilmiş preparatların izole edilmesi için sağlam ve tekrarlanabilir bir yaklaşımı tanımlar. EV izolasyonu biyosıvılar ve hücre kültür sistemleri için iyi kurulmuş olsa da, doku kökenli EV'ler için standartlaştırılmış yöntemler, doku ayrışması, hücre içi materyalden kontaminasyon ve verim değişkenliği ile ilgili zorluklar nedeniyle sınırlı kalır. Burada, EV saflığı, verimi ve tekrarlanabilirl.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar çıkar çatışması belirtmemektedir.
Teşekkürler
Teknik yardım ve faydalı tartışmalar için Jennie Yang, Dariusz Żurawek ve Volodymyr Yerko'ya teşekkür ederiz. Özellikle Nadim Tawil ve Laura Montermini'ye ekstraselüler vezikül karakterizasyonu ve veri toplama konusundaki desteği için Uygulamalı Nanotıp Merkezi'nin platformuna minnettarız. Ayrıca hayvan tesisi personeli Guylaine Gadoury ve Tara Thomson'a fare yönetiminde yaptıkları yardımlar için teşekkür ederiz.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 1.5 mL santrifüj tüpü | Sarstedt | 72.690.300 | Protokol boyunca kullanılan genel mikrosantrifüj tüpü |
| 1.5 mL düşük protein bağlanma tüpü | Sarstedt | 72.706.600 | EV işleme, SEC fraksiyon toplama ve depolama için kullanılır |
| 0.2 mL PCR tüpü | Fisher Scientific | 14-222-262 | Delinmiş tüp kemik iliği ekstraksiyon kurulumu için kullanılır |
| 16 G iğne | BD | 305197 | 0.2 mL PCR tüpünü delmek için kullanılır |
| 30 &mikron hücre süzgeci | Miltenyi Biotec | 130-098-458 | İskelet kası örnek filtrasyonu için kullanılır |
| 70% etanol | Sigma-Aldrich | 1.11727 | Cımbızları sterilize etmek için kullanılır |
| Biyolojik güvenlik kabini | NA | NA | Steril doku işleme için kullanılır |
| Kemik kesme aleti | Fisher Scientific | 10-001-976 | Femuru ve tibiayı ayırmak ve iliği açığa çıkarmak için kullanılır |
| Boğa serum albümini (BSA) | BioShop | ALB001 | Western blot blokajı ve antikor seyreltme için kullanılır |
| Kalsiyum klorür dihidrat (CaCl2·2H2O) | BioShop | CCL302 | HEPES tamponu hazırlığı için kullanılır |
| Karbon kaplı bakır ızgara, 200-mesh | Sigma-Aldrich | 930342 | TEM örnek hazırlığı için kullanılır |
| Santrifüj filtresi, 100 kDa MWCO | MilliporeSigma | UFC810096 | EV konsantrasyonu için kullanılır |
| Kollajenaz D | Roche | 11088858001 | İskelet kası enzimatik sindirimi için kullanılır |
| Cryovial | Sarstedt | 72.690.300 | Dokunun ve kemiğin depolanması için kullanılır |
| Deiyonizasyonlu su (ultra saf) | NA | NA | Tampon hazırlığı ve TEM yıkama adımları için kullanılır |
| DNase I | Roche | 11284932001 | İskelet kası enzimatik sindirimi için kullanılır |
| Kuru buz | NA | NA | Örnek soğutma ve taşıma için kullanılır |
| Gelişmiş kimilüminesans substratı | Biorad | 1705061 | Western blot tespiti için kullanılır |
| Filtre ünitesi, 0.22 &mikron | Sarstedt | 83.3941.501 | Uygulanabilir olduğunda PBS'yi filtrelemek için kullanılır |
| Forseps / cımbız | MilliporeSigma | F3892 | Doku işleme için kullanılır |
| Glütaraldehit | NA | NA | TEM fiksasyonu için kullanılır |
| Glisin | NA | NA | TEM ızgara yıkama adımlarında kullanılır |
| Hank'in Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS) | Gibco | 14175-095 | DNase I stok hazırlığı için kullanılır |
| HEPES | BioShop | HEP001.500 | HEPES-NaOH tamponu hazırlığı için kullanılır |
| At kestanesi peroksidaz-konjuge streptavidin | Thermo Fisher | S911 | Western blot tespiti için kullanılır |
| Kimilüminesans için görüntüleme sistemi | Biorad | 12003153 | Western blot membranlarını görüntülemek için kullanılır |
| KCl | BioShop | POC308 | HEPES tamponu hazırlığı için kullanılır |
| Magnezyum klorür (MgCl2) | BioShop | MAG510.500 | HEPES tamponu hazırlığı için kullanılır |
| 2-Metilbütan | Thermo Fisher | 78-78-4 | İskelet kası ani dondurma için kullanılır |
| Mikrogram denge | MilliporeSigma | Z741359 | Dokunun ve iliğin tartılması için kullanılır |
| NaCl | BioShop | SOD004.1 | HEPES tamponu hazırlığı için kullanılır |
| Nano-parçacık izleme analizi cihazı | Malvern Panalytical | NanoSight NS300 | NanoSight NS300, parçacık boyutlandırma ve sayma için kullanılır |
| NaOH | BioShop | SHY500.500 | pH ayarlaması için kullanılır |
| Nitroselüloz membran | BioRad | 1704271 | Western blot transferi için kullanılır |
| Salınımlı karıştırıcı | Labnet | S0500 | Enzimatik sindirim sırasında kullanılır |
| P1000 pipet | MilliporeSigma | FA10006M-1EA | Doku transferi için kullanılır |
| Pipet ucu, 1 mL | Sarstedt | 70.3050.275 | Dokunun ve doku parçacıklarının transferi için ucun açılması genişletilmiştir |
| Fosfat tamponlu salin (PBS) | Wisent | INC 811.012-FL | Protokol boyunca kullanılır; ayrıca SEC eşikleme ve elüsyon için kullanılır |
| Fosfataz inhibitörü | MilliporeSigma | 4906845001 | Western blot lizası hazırlığı için kullanılır |
| Petri kabı | MilliporeSigma | CLS351146 | Kemik iliği hazırlığı için kullanılır |
| Poliakrilamid jel, 4-20% gradyan lekesiz | BioRad | 4561094 | Western blot ayrımı için kullanılır |
| Proteaz inhibitörü | MilliporeSigma | 11697498001 | Western blot lizası hazırlığı için kullanılır |
| RPMI-1640 ortamı | Sigma-Aldrich | R7388-500ML | Takviye edilmemiş; FBS veya antibiyotik içermez |
| RIPA tampon |
Kaynaklar
- Whitham, M., et al. Extracellular vesicles provide a means for tissue crosstalk during exercise. Cell Metab. 27 (1), 237-251.e4 (2018).
- Kumar, M. A., et al. Extracellular vesicles as tools and targets in the....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
