$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Bu çalışma, Hebei Genel Hastanesi Etik Komitesi tarafından onaylandı (Onay No.: 2025-LW-0265). Çalışmanın geriye dönük yapısı nedeniyle, anonimleştirilmiş klinik veriler kullanılarak müdahalesel olmayan çalışmalar için komite tarafından izin verilen veri toplama sürecinden sonra etik onayı alındı. Yazılı bilgilendirilmiş onay gerekliliği kaldırıldı.
Katılımcı seçimi
Potansiyel katılımcılar, Temmuz 2022 ile Mayıs 2024 arasında Hebei Genel Hastanesi Nefroloji Bölümü'nden seçildi. Tüm hastalar önceden tanımlanmış dahil etme ve dışlama kriterlerine göre tarandı.
Dahil etme kriterleri şöyleydi: Mogensen evre III23'te diyabetik nefropati (DN) tanısı, 3–6 ay boyunca toplanan üç nokta idrar örneğinden en az ikisinde idrar albümin-kreatinin oranı (UAlb/UCR) 30–300 mg/g olan kalıcı albüminüri olarak tanımlanmıştır; bu durum hematüri veya diyabetik olmayan böbrek fonksiyonu ile diyabetik olmayan böbrek fonksiyonu ile hızlı düşüş göstermektedir; tahmini glomerüler filtrasyon hızı (eGFR) ≥45 mL/min/1,73 m2 CKD-EPI denklemikullanılarak hesaplanmıştır; DN için ilk kez D vitamini, probukol veya bağışıklık baskılayıcı tedavi olmadan DN tanısı; yaş <75 yaş; ve kayıttan önceki 4 hafta içinde diyabetik ketoasidoz veya hiperglisemik hiperosmolar durum gibi akut diyabetik komplikasyonlar veya aktif ciddi enfeksiyonlar olmadan klinik olarak stabil durum. Kayıt için böbrek biyopsisi gerekmiyordu; Ancak, aktif idrar tortusu, hızlı ilerleyen glomerulonefrit veya sistemik otoimmün hastalık dahil olmak üzere şeker dışı böbrek hastalığı şüphesi olan hastalar dışlandı.
Dışlama kriterleri arasında kanserler, ağır kardiyovasküler hastalıklar veya otoimmün hastalıklar gibi ciddi sistemik hastalıklar yer alıyordu; D vitamini, probucol, valsartan, atorvastatin veya insüline karşı bilinen alerji; hamilelik veya emzirme; ve 4 hafta içinde çalışma sonuçlarını etkileyebilecek ilaçların son kullanımı, immünosupresanlar veya kortikosteroidler de dahil.
Grup dağılımı
Tarama doktoru, uygunluk onayına kadar nihai grup tahsisini görmedi.
Yaş, cinsiyet, diyabet ve DN süresi ile hipertansiyon veya hiperlipidemi öyküsü gibi başlangıç demografik ve klinik özellikler kaydedildi.
Bu çalışma, geriye dönük, rastgele olmayan kontrollü bir tasarım kullandı. Seçim yanlılığını en aza indirmek ve zamansal değişiklikler ile doktorla ilgili değişkenlik gibi olası karıştırıcı faktörleri ele almak için, grup tahsisi doktor veya hasta tercihi yerine kronolojik kabul sırasına dayanıyordu.
Temmuz 2022 ile Aralık 2023 arasında kabul edilen hastalar, valsartan, atorvastatin ve probucol içeren standart üçlü tedavi aldı ve kontrol grubuna (n = 56) atandı. Ocak 2024 ile Mayıs 2024 arasında kabul edilen ve dört katlı tedavi (valsartan, atorvastatin, probukol ve vitamin D) alan hastalar gözlem grubuna atanmıştır (n = 94).
Gözlem grubundaki hasta sayısının artması, 2024 başından itibaren araştırma merkezinde artan klinik uygulamanın ortaya çıkan kanıtlar üzerine ortaya çıktığını gösterdi. Başlangıç demografik ve klinik özellikler gruplar arasında karşılaştırılabilirdi (Tablo 1; P>0.05) ve çalışma süresi boyunca tanı kriterlerinde, laboratuvar yöntemlerinde veya doktor ekibi bileşiminde önemli bir değişiklik yaşanmadı.
Tedavi rejimi uygulaması
Tüm katılımcılar, 8 aylık çalışma süresi boyunca glisemik kontrol için standart günlük subkutan insülin infüzyon rejimi aldı. İnsülin dozu, günlük kapiller kan şekeri izleme uygulamalarına göre bireysel olarak ayarlandı. Kontrol grubundaki hastalar 8 ay boyunca aç karnıyla günde bir kez valsartan (80 mg), atorvastatin (günde bir kez 20 mg) ve probucol (günde iki kez 250 mg) aldılar. Gözlem grubundaki hastalar, aynı doz ve programlarla aynı valsartan, atorvastatin ve probucol rejimini aldı ve günlük oral D vitamini takviyesi aldı.
Vitamin D dozu, kayıt sırasında elektrokemilyüminsans immünotesti (ECLIA) kullanılarak ölçülen başlangıç serum 25-hidroksivitamin D [25(OH)D] seviyelerine göre belirlendi. Vitamin D yeterliliği 25(OH)D ≥30 ng/mL, yetersizlik 20 ng/mL ≤25(OH)D <30 ng/mL) olarak, eksiklik ise 25(OH)D <20 ng/mL olarak tanımlandı. Eksikliği önlemek için takviye alan hastalar günde 600–800 IU alırken, D vitamini eksikliği veya eksikliği olan hastalar ise günde 2000 IU aldı.
Güvenlik izleme ve durdurma kriterleri
8 aylık tedavi süresince katılımcıların güvenliğini sağlamak için, serum kalsiyum, fosfor ve paratiroid hormonu (PTH) seviyeleri başlangıçta ve her 4 haftada bir ölçülerek vitamin D kaynaklı hiperkalsemi ve kalsiyum-fosfor dengesizliği izlendi. Probukol ile ilişkili QTc aralığı uzatmasını değerlendirmek için başlangıçta ve 8 ay sonra 12 lead-elektrokardiyogram (EKG) yapıldı. Başlangıç QTc ≥450 ms erkeklerde veya kadınlarda ≥460 ms olan hastalarda, EKG 1. ayda tekrarlandı.
Serum kreatinin ve eGFR dahil olmak üzere böbrek fonksiyonu parametreleri, serum elektrolitleriyle birlikte, ilk ay boyunca ve ardından aylık olarak iki haftada bir izlendi. Katılımcılara yeni semptomları derhal bildirmeleri talimatı verildi. Tedavinin sonlandırılması kriterleri arasında düzeltilmiş serum kalsiyumu >10,5 mg/dL (2,62 mmol/L) ve 48 saat içinde tekrar testle doğrulanmıştı; QTc aralığı >500 ms veya iki ardışık EKG'de başlangıçtan >60 ms artma; Serum kreatinin başlangıçtan iki katına çıkarılması veya Kidney Disease: Improving Global Outcomes (KDIGO) kriterlerine göre akut böbrek hasarının gelişimi; ve Yaygın Terminoloji Kriterleri (CTCAE) kapsamında D vitamini veya probucol ile muhtemel, muhtemel veya kesinlikle ilişkili olduğu düşünülen ≥3. derece advers etki. Ciddi yan etkiler hastane etik komitesine 24 saat içinde bildirildi.
Biyolojik örnek toplama ve işleme
Kan ve idrar örnekleri, tedaviye başlamadan önce ve 8 aylık tedavi süresinin tamamlanmasından sonra alındı. Tüm örnekler sabah saatleri, 8–12 saat arası bir gece oruçundan sonra alındı. Yaklaşık 20 mL venöz kan standart flebotomi teknikleriyle serum ayırıcı ve EDTA tüplerine toplandı. Kan örnekleri oda sıcaklığında 30 dakika pıhtı tutuldu ve 1000 × g sıcaklığında 4 °C'de 15 dakika santrifüj edildi. Berrak serum süpernatantları, pıhtı veya buffy tüyünü rahatsız etmeden dikkatlice aspire edildi, farklı testler için kriyoviyallere aliquote edildi, katılımcı kimliği, tarih ve örnek tipiyle etiketlendi ve analiz yapılana kadar −80 °C'de saklandı. Serum örnekleri −80 °C'de 12 aya kadar saklanabilir.
24 saat idrar protein atılımı (24 saat UPE) için, katılımcılar ilk sabah idrar örneğini 1. gün saat 7:00'de attı ve ardından tüm idrarları, 2. gün saat 7:00'de ilk sabah idrar örneği dahil, sağlanan bir toplama kabına topladı. Katılımcılara, toplama süresi boyunca toplama kabını soğutultuğu için görevlendirildi. Toplam idrar hacmi kaydedildi, iyice karıştırıldı ve laboratuvar analizi için aliquote edildi. Örnekler, analiz edildiğinde 24 saat içinde veya daha sonraki analiz için −20 °C'de 4 °C'de saklandı.
İdrar albümin-kreatinin oranı (UAlb/UCR) için, ilk sabah orta akım idrar örnekleri steril kaplarda toplandı ve benzer şekilde işlendi. 8 aylık tedavi süresi tamamlandıktan sonra aynı prosedürler tekrarlandı.
Biyokimyasal ve klinik parametre analizi
Dondurulmuş serum örnekleri, serum kreatinin (SCr) analizinden önce buz üzerinde veya 4 °C'de çözüldü. SCr, üreticinin talimatlarına göre otomatik bir biyokimyasal analizörde enzimatik kolorimetrik test kullanılarak ölçüldü. Günlük kalibrasyon çok katmanlı kalibratörlerle yapıldı ve her partiye iki seviye ticari kalite kontrol malzemesi dahil edildi. Örnekler çift olarak analiz edildi ve %>5 varyasyon katsayısına sahip testler tekrarlandı. SCr için alt tespit sınırı 2.0 μmol/L idi.
24 saat idrar aliquotlarında protein konsantrasyonu pirogalol kırmızı-molibdat yöntemiyle ölçüldü. Örnekler çift olarak analiz edildi ve her denemede kalite kontrol materyalleri dahil edildi. Kalibrasyon aralığının (>3.0 g/L) üzerindeki örnekler normal salinle seyreltilip yeniden değerlendirildi. 24 saatlik UPE, idrar protein konsantrasyonu ve toplam idrar hacmi kullanılarak hesaplandı.
İlk sabah idrar örneklerindeki idrar albümin ve kreatinin konsantrasyonları biyokimyasal analizör kullanılarak ölçüldü ve ardından UAlb/UCR oranı hesaplandı.
Açlık plazma glikozu (FPG) ve 2 saat sonrası glukoz (2 saat-PPG), üreticinin talimatlarına göre doğrulanmış bir kan şekeri ölçer ve kapiller parmak ucu kan örnekleri kullanılarak ölçüldü.
Glikleşmiş hemoglobin (HbA1c), özel bir HbA1c analiz sistemi ile yüksek performanslı sıvı kromatografi kullanılarak analiz edildi. Katılımcılara, tedavi sonrası kan alımı öncesinde 7 gün boyunca lipid düşüren ilaçlardan ve 24 saat boyunca yüksek yağlı yemeklerden veya alkolden kaçınmaları talimatı verildi. Serum toplam kolesterol (TC), trigliseridler (TG), yüksek yoğunluklu lipoprotein kolesterol (HDL-C) ve düşük yoğunluklu lipoprotein kolesterol (LDL-C) enzimatik testlerle ölçüldü. İki seviyeli kalite kontrol malzemeleri günlük olarak analiz edildi. Lipid parametreleri başlangıçta tekli olarak ölçüldü ve >%10 varyasyon katsayısına sahip örnekler tekrar değerlendirildi. Tespit sınırları TC için 0.1 mmol/L, TG için 0.05 mmol/L, HDL-C için 0.08 mmol/L ve LDL-C için 0.10 mmol/L idi. LDL-C değerleri, trigliserid seviyeleri <400 mg/dL olduğunda doğrudan test veya Friedewald denklemi ile belirlendi.
Bağışıklık fonksiyonu ve inflamatuar belirteç analizi
Serum immünoglobulin G (IgG) konsantrasyonları, ticari bir insan IgG ELISA kiti kullanılarak ölçüldü. Analiz tespit aralığı 1,37–1000 ng/mL, hassasiyet 0,52 ng/mL, analiz içi varyasyon katsayısı %<6 ve analizler arası varyasyon katsayısı %<9 idi. Tüm örnekler çift olarak analiz edildi ve kit ile birlikte verilen yüksek ve düşük kaliteli kontrol malzemeleri her plakaya eklendi. Hedef değerlerden 2 standart sapmanın dışında QC değerlerine sahip plakalar reddedildi ve tekrarlandı. Üst standart sınırın üzerindeki örnekler 1:2 oranında seyreltildi ve yeniden değerlendirildi.
Tüm reaktifler ve serum örnekleri analiz öncesinde oda sıcaklığında dengelendi. Serum örnekleri kit talimatlarına uygun olarak, genellikle 1:100.000 derecesinde seyreltildi. Standartlar, seyreltilmiş örnekler ve boşluklar (100 μL) önceden kaplanmış mikroplakaların uygun kuyularına eklenip 37 °C'de 90 dakika boyunca kuluçka yapıldı. Kuyular inkubasyondan önce üç kez 37 °C'de 60 dakika boyunca biyotinile tespit antikoru ile yıkandı. Ek yıkamadan sonra, yaban turpu peroksidaz konjugatı eklendi ve karanlıkta 30 dakika kuluçka edildi. Yıkamadan sonra substrat çözeltisi eklendi ve karışım karanlıkta 15 dakika kuluçka altına alındı, ardından stop çözeltisi eklendi. Optik yoğunluk 450 nm olarak ölçüldü ve referans dalga boyları 570 nm veya 630 nm idi. IgG konsantrasyonlarını hesaplamak için standart eğriler oluşturuldu.
Lenfosit alt kümeleri, 488 nm ve 640 nm lazerlerle donatılmış bir BD FACSCanto II üzerinde akış sitometrisiyle analiz edildi. İleri saçılma voltajı 300 V, yan saçılma 350 V, FITC, APC ve PE kanalları için fotomultiplier tüp voltajları sırasıyla 400 V, 550 V ve 480 V olarak ayarlandı. Çiftler, FSC-A ile FSC-H gatingi kullanılarak hariç tutuldu.
Canlı boyama 7-aminoaktinomisin D (7-AAD) kullanılarak gerçekleştirildi ve sadece 7-AAD-negatif olaylar analiz edildi. Tam kan örnekleri lekelenmemiş, izotip kontrol ve test tüplerine dağıtıldı. İnsan karşıtı CD3-FITC, CD4-APC ve CD8-PE antikorları test tüplerine eklenirken, kontrol tüplerine eşleşen izotip-kontrol antikorları eklendi. Örnekler oda sıcaklığında karanlıkta 30 dakika kuluçka altına alındı. Tazminat kontrolleri BD CompBeads ile hazırlandı ve otomatik tazminat FACSDiva yazılımında gerçekleştirildi. Kırmızı kan hücreleri RBC lizis tamponu ile lizize edildi, ardından 7-AAD içeren boyama tamponunda yıkanıp yeniden süspansiyona alındı.
Kalite kontrolü için günlük sitometre kurulumu ve takip boncukları kullanıldı. Kapı hiyerarşisi, çift not dışlama, lenfosit seçimi, canlılık gatingi, CD3+ gating ve CD4/CD8 alt küme tanımlamasını içeriyordu. Her örnek başına en az 50.000 canlı lenfosit olayı alınmış, toplam edinilen olaylar 100.000–150.000 arasında değişmiştir. Veriler FlowJo yazılımı kullanılarak analiz edildi ve CD3+, CD4+ ve CD8+ hücrelerinin yüzde oranları ile CD4+/CD8+ oranları hesaplandı.
Serum hs-CRP, IL-6, TNF-α ve MCP-1 konsantrasyonları, ticari ELISA kitleri kullanılarak ölçüldü. Tespit aralıkları ve hassasiyetler şu şekildeydi: hs-CRP (0,07–12,5 ng/mL; hassasiyet 0,022 ng/mL), IL-6 (0,7–300 pg/mL; hassasiyet 0,35 pg/mL), TNF-α (1,6–100 pg/mL; hassasiyet 0,8 pg/mL) ve MCP-1 (5–1000 pg/mL; hassasiyet 2,5 pg/mL). Tüm testler ikili olarak gerçekleştirildi. Her plakada düşük ve yüksek kaliteli kontrol malzemeleri bulunuyordu. Analiz içi varyasyon katsayıları %<8, testler arası varyasyon katsayıları ise %<10 idi. Tespit sınırlarının altındaki değerler, nicel sınırının alt sınırının yarısı olarak kaydedilirken, en yüksek standartın üzerindeki değerler seyreltilip yeniden değerlendirildi. Örnekler analiz öncesi yalnızca bir donma-çözülme döngüsünden geçti. Sitokin ELISA prosedürleri, üretici talimatlarına göre IgG ELISA için tanımlananlarla aynı protokolleri takip etti; bu protokoller seyreltme faktörleri, kuluçka koşulları ve sıcaklıklarla ilgili olarak belirlendi.
Klinik sonuç değerlendirmesi ve veri yönetimi
8 aylık tedavi süresinin sonunda, grup dağılımı için kör olarak tedavi eden doktorlar katılımcıların klinik durumunu değerlendirdi. Hastalar, diyabetik nefropati için önceden belirlenmiş tüm klinik iyileşme kriterleri en az iki hafta ardışık karşılandığında taburcu edilmiş olarak sınıflandırıldı: 24 saat UPE'de başlangıç seviyesine göre ≥%30 azalma, başlangıçtan <5 mL/1,73 m2 düşüş olarak tanımlanan eGFR'de stabilizasyon veya iyileşme ve akut diyabetik komplikasyonlar veya devam eden yatarak bakım gerektiren diğer durumlar yokluğu. Tüm kriterleri karşılamayan katılımcılar taburcu edilmemiş olarak sınıflandırıldı. Her grup için klinik yanıt oranları daha sonra hesaplandı.
Toplanan tüm demografik, laboratuvar ve klinik veriler, iki bağımsız araştırmacı tarafından çift veri girişiyle elektronik bir veritabanına girildi. Veri doğruluğunu sağlamak için menzil ve tutarlılık kontrolleri yapıldı. Birincil son noktalar arasında, böbrek fonksiyonu parametrelerinde başlangıçtan 8 aya kadar olan değişiklikler (24 saat UPE ve UAlb/UCR) ve bağışıklık fonksiyonu parametreleri (CD3+ T-hücre yüzdesi ve CD4+/CD8+ oranı) yer alıyordu. İkincil son noktalar arasında glisemik parametrelerde (FPG, 2h-PPG, HbA1c), lipid profilinde (TC, TG, LDL-C, HDL-C), inflamatuar belirteçlerde (HS-CRP, IL-6, TNF-α, MCP-1) ve klinik yanıt oranında başlangıçtan 8 aya kadar değişiklikler yer aldı. Tüm sonuç ölçümleri, başlangıç aşamasında, tedaviye başlamadan 48 saat içinde ve tedavi sonrası 8 aylık tedavi süresinin tamamlanmasından sonraki 1 hafta içinde değerlendirildi.
İstatistiksel analiz
Tüm istatistiksel analizler SPSS yazılımı kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Normal dağılımlı sürekli değişkenler ortalama ± standart sapma olarak ifade edilirken, kategorik değişkenler frekans ve yüzde olarak ifade edilirdi. Gruplar arası karşılaştırmalar için bağımsız örneklemli t-testleri, kategorik değişkenler için ise ki-kare testleri kullanıldı. İstatistiksel anlamlılık P<0.05 olarak tanımlandı. Çalışmanın keşif niteliği ve değerlendirilen çok sayıda sonuç göz önüne alındığında, ikincil sonuçlar çokluluk açısından ayarlanmadı. Bu nedenle, P-değerleri onaylayıcı değil, tanımlayıcı olarak kabul edildi. Retrospektif, randomize olmayan çalışma tasarımı nedeniyle, kontrol ve gözlem grupları arasındaki tüm karşılaştırmalar potansiyel karıştırıcı faktörler açısından ayarlanmamış ve kalıntı karıştırma devam etmiş olabilir. Kayıtlı 150 hastanın tamamı (kontrol grubunda 56 ve gözlem grubunda 94) tam 8 aylık tedavi ve takip dönemini tamamladı. Kayıttan sonra hiçbir hasta takipten kaybedilmedi, çekilmedi veya dışlanmadı. Böbrek fonksiyonu, glikoz ve lipid profilleri, bağışıklık belirteçleri ve inflamatuar faktörler dahil olmak üzere başlangıç özellikleri veya sonuç ölçümleri için eksik veri tespit edilmedi. Bu nedenle, herhangi bir sümleştirme prosedürü gerekmemiştir.