Yeşil CuO/ZnO Nanopartikülleri: Mısırda AFB1 translokasyonu ve birikimini azaltma

Özet

Bu çalışma, yeşil sentezlenen CuO/ZnO hibrit nanopartiküllerinin mısırda aflatoksin B₁ (AFB₁) birikimini ve translokasyonunu azaltmadaki etkinliğini araştırmış ve 125 mg/kg tedavisinin AFB₁ seviyelerini önemli ölçüde düşürdüğünü ve insan ile hayvan beslenme maruziyet risklerini en aza indirdiğini göstermiştir.

Özet

Aflatoksin B₁ (AFB₁), Aspergillus türleri tarafından üretilen güçlü bir kanserojendir ve mısır ürünlerini kirleterek diyet maruziyeti nedeniyle insan ve hayvanlar için ciddi sağlık riskleri oluşturur. Geleneksel hasat sonrası yönetim ve kimyasal müdahaleler, büyüme sırasında topraktan gelen toksinlerin bitkiye aktarılmasını önlemede genellikle maliyetli veya etkisiz olur. Bu protokolün temel amacı, yeşil sentezlenen bakır oksit/çinko oksit (CuO/ZnO) hibrit nanopartiküllerini (NP'ler) hasat öncesi sürdürülebilir bir toprak düzeltme yöntemi olarak değerlendirmekti. Çalışmanın amacı, bu NP'lerin mısır dokularında AFB_1'in translokasyonunu ve birikimini etkili bir şekilde engelleyip engelleyemeyeceğini ve böylece yenilebilir tahıllarda toksin birikimini azaltıp azaltamayacağını belirlemeyi amaçladı. İki farklı saha alanında rastgele tam blok tasarımı kullanılarak, mısır AFB₁ veya Aspergillus flavus sporlarıyla aşılanmış toprakta yetiştirildi ve farklı konsantrasyonlarda NP (0–125 mg/kg) işlendi. Protokol, çevre dostu sağlamak için Pleurotus ostreatus substratı ile yeşil sentezi kullandı. Bitki dokuları,_{AFB 1} seviyelerini ölçmek ve insan ile hayvan risk değerlendirmelerini hesaplamak için Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografi (HPLC) kullanılarak farklı fizyolojik aşamalarda analiz edildi. 125 mg/kg yeşil hibrit NP ile yapılan tedavi (p < 0.05) tüm büyüme evrelerinde AFB₁ konsantrasyonlarını önemli ölçüde azaltmıştır. Kampüs içindeki sahada, AFB₁ vejetatif aşamada %68, çiçeklenmede %82 ve olgunlukta %76 oranında pozitif kontrol oranına göre azalmıştır. Önemli olarak, tahıl AFB₁ seviyeleri 6,91 ppb'ye düştü ve bu da insanların tahmini günlük alımını önemli ölçüde azalttı. Ancak, potansiyel nanopartikül kalıntılarını ve uzun vadeli toksisiteyi değerlendirmek için daha fazla araştırma gereklidir. Bu yöntem, yeşil CuO/ZnO hibrit NP'lerin etkili bir biyoremediasyon ajanı olarak işlev gördüğünü ve toksinlerin bitkinin yenilebilir bölgelerine taşınmasını engellediğini göstermektedir. Bu yaklaşım, aflatoksin eğilimli bölgelerde gıda güvenliğini artırmak ve AFB₁ maruziyetini azaltmak için ölçeklenebilir ve çevre açısından güvenli bir strateji sunar.

Giriş

Aflatoksinler, özellikle Aflatoksin_{B 1} (AFB₁), yaygınlıkları, toksisiteleri ve insanlar üzerindeki etkileri nedeniyle en önemli mikotoksinler arasındadır. Özellikle Aspergillus ^türü 1,2,3'e ait mantarlar olmak üzere belirli mantarlar tarafından üretilirler. _{AFB 1} hepatosellüler kanserle bağlantılıdır ve tüm aflatoksinler arasında en tehlikelidir⁴. Bu güçlü kanserojenler, mısır (Zea mays L.) dahil olmak üzere çeşitli tarım ürünlerini enfekte eder ve ciddi gıda güvenliği endişelerine^{yol açar 5,6}. Mısırda AFB_1'in varlığı sadece ürün verimini ve kalitesini etkilemekle kalmaz, aynı zamanda beslenme maruziyeti nedeniyle hem insan hem de hayvan sağlığı için ciddi bir tehdit^{oluşturur 7,8}.

Şu anda aflatoksin yönetimi ağırlıklı olarak hasat sonrası stratejilere dayanmaktadır; örneğin, doğru kurutma, hasarlı çekirdeklerin ayırılması, kimyasal işlemler (örneğin amonyak veya ozon), ışınlama ve mantar büyümesini önlemek için hermetik depolama gibi^. Stratejiler arasında iyi ürün yönetimi, biyokontrol ajanları (kireç gibi) ve geliştirilmiş depolama tesisleri^{yer alır 10}. Mikrodalga, ultraviyole (UV), darbeli ışık, elektrolizlenmiş su, soğuk plazma, ozon, elektron ışını ve gama ışını gibi fiziksel ve kimyasal tedaviler de test^{edilmiştir 11}. Ancak, bu hasat sonrası yöntemler genellikle maliyetli, enerji yoğun veya yaygın kullanım için pratik değildir ve büyüme sırasında bitki içinde aflatoksin translokasyonunu engellemezler.

Kullanılan hasat öncesi yaklaşımlar arasında dirençli çeşitler, zamanında ekim, kuraklık stresini azaltmak için sulama ve toksigen suşları rekabet ederek ekilen ancak tekrar uygulanan ve toprak yoluyla yapılan translokasyonu tam olarak ele alamayabilecek aflatoksigen A. flavus suşları (örneğin, Aflasafe) biyokontrol gibi agronomik uygulamalar yer^alır 11,12,13 . Bu yöntemler genellikle sınırlamalarla karşılaşır: hasat sonrası müdahaleler önceden var olan kirliliği geri çeviremez, kaynak sınırlı ortamlarda ayırma/depolama altyapısı için yüksek maliyetler taşır, kimyasallardan kaynaklanan besin kaybı veya kalıntıları riski taşır ve biyokontrol etkinliği çevresel koşullara göre^değişir.

Buna karşılık, yeşil sentezlenen CuO-ZnO hibrit nanopartiküller, hasat öncesi yeni bir toprak düzeltme stratejisi sunar. Geleneksel kimyasal NP'lerin aksine, bitki özleri (örneğin mantar substratı) kullanılarak yapılan yeşil sentez, toksik çözücülerden kaçınır, maliyetleri azaltır ve biyouyumlulukları artırır, böylece çevresel olarak sürdürülebilir^{hale gelir 15,16}. CuO-ZnO hibridizasyonu, reaktif oksijen türleri (ROS) üreterek, mantar zarlarını bozarak ve AFB₁ adsorpsiyonu için yüksek bir yüzey alanı sağlayarak antifungal aktiviteyi sinerjik olarak artırır; böylece tane gibi yenilebilir bitki parçalarına alım ve translokasyonu önler. Bu, mevcut stratejilerden farklıdır; toprak-bitki arayüzünde erken müdahale mümkün kılarak düşük dozlarda (örneğin 125 mg/kg) %80-99'a kadar AFB₁ azaltımı sağlanır; bu oranda ürün verimi zarar vermeden veya zararlı kalıntılar bırakmaz^. Temel avantajlar, kimyasal fungisitlere kıyasla çevre dostu olması, değişken saha koşullarında tek metal NP'lere veya biyokontrole kıyasla üstün verimlilik ve Sahra Altı Afrika gibi aflatoksin eğilimli bölgelerde tarım uygulamalarına ölçeklenebilir entegrasyon potansiyeli yer alır.

Metal oksit NP'leri, özellikle çinko oksit (ZnO) ve bakır oksit (CuO), antifungal özellikleri ve toksinleri emme kapasiteleri nedeniyle bu malzemeler arasında dikkat^{çekmiştir 18,19}. Örneğin, Cu NP'lerin bakteriyel ve mantar biyolojik makromoleküllerine zarar verebilen ROS üretme yeteneğine sahip^{olduğu bildirilmiştir 20}. Ayrıca, başka bir deneyde, F. Solani kitosan bazlı CuO NP'lerle tedavi edildiğinde mantar suşlarının belirgin bir değişim ve belirgin bir sıralama artışı eğilimi olduğu gösterilmiştir; bu da en büyük sıralanma^{etkisini 21} ortaya çıkarmıştır. NP'lerin yeşil sentezi, geleneksel kimyasal yöntemlere karşı daha güvenli ve sürdürülebilir bir alternatif olarak dikkat çekerek toksik yan ürünleri ve çevresel etkiyi en aza^{indirmiştir 15,22}.

CuO ve ZnO NP'lerin hibritleşmesi, her iki metalin faydalı özelliklerini birleştirir ve AFB₁^23,24'ün parçalanma veya adsorbasyonunda etkililiğini artırabilir. Şu anda, bu yeşil sentezlenmiş NP'ler esas olarak in vitro deneylerde mantar suşlarında AF üretimini kontrol etmek için kullanılmaktadır; örneğin, Sheik ve Awad, AgNP'lerin, AuNP'lerin ve bunların karışımının aflatoksijenik A. flavus ^{suşunun 25'in} büyümesi ve aflatoksin B₁ birikimi üzerindeki etkisini incelediler. Ancak, A. flavus büyümesini kontrol etmek için gereken konsantrasyon bilinmemektedir. Bu nedenle, yeşil CuO-ZnO hibritlerinin, toprakla değiştirilmiş kaynaklardan mısır dokularına AFB₁ translokasyonu üzerindeki etkisi nedeniyle, sahaya uygun koşullarda değerlendirilmesi kritik bir ihtiyaç vardır; geleneksel NP'lere kıyasla. Bu nedenle, bu çalışmanın amaçları, farklı CuO/ZnO yeşil hibrit NP konsantrasyonlarının mısır bitki dokularındaki AFB₁/A. flavus konsantrasyonu üzerindeki etkisini belirlemek ve AFB₁ riskini değerlendirmekti mısırın CuO/ZnO yeşil hibrit NP'lerle işlenmesinden sonra mısırda. Araştırma hipotezleri, yeşil sentezlenmiş CuO-ZnO hibrit NP'lerin gözlemlenen etkinliğine mekanik bir temel sağlamayı amaçladı. Bu çalışma aşağıdaki ölçülebilir hipotezleri test etmektedir: 1) Hibrit NP'lerin toprakta A. flavus sporulasyonunu ve ardından de novo AFB₁ üretimini tek metal NP'lere kıyasla önemli ölçüde azaltacağı antifungal inhibitisyon hipotezi; bu hipotezler, Molelwane alanında daha düşük mantar yükü ve toksin seviyeleriyle tanımlanmıştır. 2) Adsorpsiyon-translokasyon hipotezi: önceden var olan toksinlerin varlığı (kampüs alanı) olduğunda, NP'lerin AFB_1'e yüksek bağlanma eğilimi göstermesi ve topraktan mısır kök sistemine toksin transferinin oranını önemli ölçüde azaltması beklendi. 3) Biyouyumluluk (fitotoksisite) hipotezi: yeşil sentezlenen hibrit NP'ler, geleneksel kimyasal ölçütlere kıyasla mısır dokularında daha az kalıntı metalik birikim ve azaltılmış oksidatif stres belirteçleri ile sonuçlanacak, böylece ürün biyogüvenliğini artıracaktı.

Protokol

Deneysel alanlar
Denemeler, birbirinden 7 km uzaklıkta bulunan iki noktada gerçekleştirildi; Bölgeler farklı tedavilerle aşılandı. İlk denemede, Güney Afrika'nın Kuzeybatı Eyaleti'ndeki Molelwane, Kuzeybatı Üniversitesi (NWU) Araştırma Çiftliği'nde (25.810°G, 25.630°D, 1276 m) %40 gölgeli bir ağ evi tesisi kuruldu. Kırmızı kumlu toprak Hutton formu olarak sınıflandırıldı ve %75 kum, %4 silt ve %21 kil^{içeriyordu 25}. İkinci deney, NWU Mafikeng kampüsünün (25. 8278 °G, 25. 6079 °E, 1276 m) ağ evi tesisinde gerçekleştirildi. İkinci alandaki topraklar ise %82 kum, %3 silt, %15 kil içeren kumlu topraklardan oluşuyordu ve daha önce Arcadia form²⁵ olarak sınıflandırılmıştı. CuO/ZnO yeşil hibrit NP'ler, Güney Afrika'daki NWU Doğal ve Tarım Bilimleri Fakültesi, Fizik ve Kimya Bilimleri Fakültesi, Kimya Bölümü laboratuvarında sentezlenmiştir.

CuO/ZnO yeşil hibrit NP'lerin Sentezi
100 ml deiyonize suya on (10) g kurutulmuş Pleurotus ostreatus harşılmış mantar substratı (SMS) eklendi, 70 °C'de ısıtıldı ve 2 saat²⁶ karıştırıldı. Karışım daha sonra oda sıcaklığına soğutuldu, filtrelendi ve 30 mL filtrat, 30 mL damıtılmış suda 2,5 g bakır asetat ve 2 g çinko asetat içeren bir çözeltiye eklendi. Bu çözeltinin pH'ı sodyum hidroksit (NaOH) kullanılarak 8'e ayarlandı, 2 saat 80 °C'ye kadar ısıtıldı, reaksiyondan sonra santrifüj edildi, gece boyunca fırında kurutuldu ve 650 °C'de 2^{saat 26} kalsinasyon yapıldı. Sentezlenen NP'ler CuO/ZnO yeşil hibrit NP'ler olarak tanımlandı ve doğrulandı.

Toprak örnekleme ve analiz
Molelwane Üniversitesi Çiftliği ve kampüs deneme alanından 0–15 cm ve 15–30 cm derinliklerde toprak örnekleri toplandı. Daha sonra bu kişiler kategorize edilip fiziksel ve kimyasal özellikleri açısından incelendi;^{bu özellikler 27'nin} tanımladığı gibi.

Deneysel tasarım
Çalışma, üç replikadan oluşan rastgele tam blok tasarımında (RCBD) düzenlenmiş bir faktöryal deney kullandı. Yeşil sentezlenen CuO-ZnO hibrit NP'lerin çeşitli kirlenme senaryoları altında etkinliğini değerlendirmek için, ayrı alanlarda iki bağımsız maruziyet modu oluşturuldu: Site 1 (Kuzeybatı Üniversitesi Kampüsü), NP'lerin doğrudan adsorpsiyon ve translokasyon koruma yeteneklerini değerlendirmek için 160 ppb/kg oranında ekstra AFB₁ ile toprağın artırıldığı dışsal bir kirlenme modelini temsil etti. Site 2 (Molelwane Araştırma Çiftliği): Toprak 160 spor/kg oranında A. flavus sporlarıyla aşılanarak NP'lerin de novo mikotoksin üretimi ve ardından bitki alımı üzerindeki antifungal etkisini araştırdı. Toz gibi NP'ler, aşılamadan sonra (AFB₁ veya A. flavus sporları) 1 kg toprakla bir ekim plastik torbasında tartıldı ve eşit şekilde karıştırıldı. Her tedavi ayrı ayrı yapıldı ve tedaviler arasında eller dezenfekte edildi. Daha sonra, her saksıya ilk olarak dört mısır tohumu ekildi (9 cm üst çap, 6,5 cm alt çap). Her saksıda üç sağlıklı fide tutmak için, fideler çıktıktan bir hafta sonra kesildi. Toprak analizinden elde edilen optimal mısır üretimi önerilerine uygun olarak, toprak gübrelendi. Saksılar sıralar arası ve iç sıralar arası 0,75 m × 0,3m aralıklarla yerleştirildi, toplamda 216 saksı oluşuyordu. Tohumlar ekildikten sonra saksılardaki toprak %60 tarla kapasitesine kadar sulanıyordu. Toprak ve bitki örnekleri üç gelişim aşamasında toplanmıştır: V10 (gelişim), R1 (çiçeklenme) ve R6 (olgunluk). Örnekler daha sonra buzla dolu bir soğutucu kutusunda laboratuvara getirildi ve daha ileri incelemeler için -20 °C'de tutuldu. Kahverengi kağıt torbalar, kalan bitki örneklerini depolamak ve derin dondurma yoluyla AFB₁ konsantrasyonları ve diğer testler için kullanıldı. AFB₁ konsantrasyonları ve diğer analizler için kalan bitki örnekleri kahverengi kağıt torbalarda saklanıp analiz yapılana kadar derin dondurularak tutuldu.

Mısır aflatoksin analizi
Mısır gelişim bileşenleri (kök, sap, yaprak ve tane) çeşitli büyüme evrelerinde steril plastik poşetlere toplanmış, dikkatle etiketlenmiş ve laboratuvara taşınmıştır. Büyüme verilerinin bütünlüğünü korumak ve her gelişim aşaması için bağımsız gözlemler sağlamak amacıyla yıkıcı örnekleme protokolü uygulandı. Nanopartikül konsantrasyonları ile aşılama türleri arasındaki çapraz kontaminasyonu önlemek için, hasat aletleri ve eldivenler %70 etanol ile temizlendi ve her işlem grubu arasında deiyonize suyla durulandı. Harç ve tokan kullanılarak, 10 g bitki malzemesi ve 1 g sodyum klorür (NaCl) 25 mL %80 metanol ve %20 damıtılmış suda 10 dakika boyunca ezildi. Mısır tanesi ve mısır çekirdeği için, 25 g öğütülmüş örnek ve 2,5 g NaCl, 100 mL %80 metanol:20 damıtılmış su ile yüksek hızda 10 dakika karıştırıldı. Daha sonra, homojenize ekstrakt cam mikrofiber filtreden süzüldü ve ardından fosfatla tamponlanmış tuzlu (PBS) 20 mL %20 Tween-2 ile yıkandı. Aflatoksinler, elülasyonun ardından bağışıklık affinite kolonundan saniyede bir damla akış hızıyla çıkarıldı ve süpernatant (sitoplazma) amber bir şişeye toplandı. Daha sonra, AFB₁ ve diğer aflatoksinler, aflatoksinlerin o-ftaldiyadelhit çözeltisi ile türetilmesini ve türevlenmiş bileşiklerin yüksek performanslı sıvı kromatografi (HPLC) sistemine enjekte edilmesini içeren sıvı kromatografi^{yöntemi 28} ile ölçüldü. HPLC sistemi, 362 nm uyarıma ve 425 nm emisyona ayarlanmış Jasco FP-920 floresans dedektörüyle donatılmıştı. AFB₁ , doğası gereği fizyolojik olarak 362 nm uyarılma dalga boyunda tespit edilebilecek şekilde yapılandırılmıştır. 5 μm parçacıklı bir Hichrom sütunu (4,6 mm × 150 mm) kullanıldı ve türev reaktörü 100 μA'da bir KOBRA Hücre programıydı. Kromatografik zirvelerin ayrılması, benzer sabit faza ön kolonunun takılmış Hichrom kolonunda yapıldı. İnersil ODS-3 ve ODS-3 V sırasıyla koruma ve analitik kartuş olarak kullanılırken, enjektör ise reodin valfli bir otosamplerdan oluşuyordu. Hareketli faz sudan oluşuyordu: metanol (65:35, v/v), potasyum bromid (119 mg) ve litrede 4 M nitrik asit (350 μL) ve izokratik bir programda 1,0 mL/dakika akış hızıyla pompalanıyordu. Aflatoksin tespiti, her bir zirve için standartlara benzer bir tutma süresinde ve temel gürültüden beş kat daha yüksek^{yükseklikte pozitif olarak kabul edildi 29}.

HPLC'nin analitik yaklaşımını doğrulamak için tespit sınırları (LOD), nicelendirme sınırı (LOQ) ve yüzde (%) geri kazanım, sırasıyla denklemler 1, 2 ve 3 kullanılarak hesaplandı. LOD, arka plan gürültüsünden güvenilir şekilde ayırt edilebilen en düşük aflatoksin konsantrasyonudur; LOQ ise kabul edilebilir hassasiyet ve doğrulukla niceliksel olarak ölçülebilen en düşük aflatoksin^{konsantrasyonudur 30}. AFB₁ ve metabolitleri, negatif mısır kontrol örneklerine üçlü olarak toplam aflatoksin standartlarından (AFB₁, AFB₂, AFG₁ ve AFG₂) 10 μL eklenerek geri kazanıldı. Örnekler, daha önce belirtilen prosedürler kullanılarak HPLC kullanılarak çıkarıldı.

LOD = X + 3s 1

LOQ = X + 10s 2

3

Burada: "X" güçlendirilmiş örnek boş değerlerinin ortalama konsantrasyonu, "s" ise örnek standart sapmasıdır.

AFB1 Maruziyet Tahmini
Mısır diyetindeki ortalama aflatoksin seviyeleri, günlük mısır alımı ve ortalama vücut ağırlığı (çocuklar, yetişkinler, sığır, süt inekleri ve civcivler) tahmini günlük alım (EDI) hesaplanmıştır. Ortalama aflatoksinler için EDI, denklem 2'ye göre hesaplandı ve (ng/kg vücut ağırlığı/gün) cinsinden ifade edildi; Tehlike indeksi (HI) hesaplaması için, EDI değerleri TD5032³¹ birimlerine uydurmak üzere ng/kg vücut ağırlığı/güne dönüştürüldü (1 ppb/kg/gün = 1.000 ng/kg vücut ağırlığı).

4

Risk değerlendirmesi ve karakterizasyonu
Tehlike indeksi (HI), EDI'nin TD50'ye bölünmesi ve 50.000 güvenlik faktörü ile çarpılması ile hesaplandı. Ortalama toksik doz (TD) 50, sıfır dozda tümör gelişmeyecek test hayvanlarının %50'sinde tümör oluşturmak için gerekli dozdur (ng/kg/vücut ağırlığı/gün).

Veri analizi
Toplanan büyüme ve verim verileri üzerinde VARYANS analizi, SAS 9.4 (SAS Institute Inc., Cary, NC, ABD) rutininde RCBD prosedürü kullanılarak gerçekleştirildi. Tukey'nin dürüstçe anlamlı fark (HSD) testi³³ kullanılarak en küçük kare ortalamalarının çoklu karşılaştırmaları yapıldı.

Sonuçlar

Büyüme bileşenlerindeki aflatoksin konsantrasyonu
Sonuçlar, büyüme bileşenlerinde ve yeşil sentezlenmiş CuO/ZnO NP'lerle işlenmiş mısır tahılında aflatoksin konsantrasyonlarının tespit edildiğini gösterdi ve bu, tüm ana aflatoksin tiplerinin (AFG₂, AFG₁, AFB₂ ve AFB₁) varlığını gösterdi. Aflatoksin konsantrasyonlarının hesaplanması için kullanılan kalibrasyon eğrileri, farklı aflatoksinler a...

Tartışma

Bu protokolün mısırda_{AFB 1} translokasyonu ve birikimini azaltmadaki başarısı, hem biyolojik etkinliği hem de analitik güvenilirliği sağlayan birkaç kritik adıma^{bağlıdır 16,27}. Sonuçlar, yeşil sentezlenmiş CuO-ZnO hibrit NP'lerin 125 mg/kg'nın, her iki deneysel modelde de AFB₁ konsantrasyonlarını önemli ölçüde azalttığını göstermektedir; ancak bu potansiyel olarak farklı mekanizmalar^{yoluyla ...}

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Bakır(II) asetat [Cu(CO2CH3)2]	Sigma-Aldrich Pty, St Louis, MO, ABD	10,53,753	Koyu mavi-yeşil kristal katı (%98 saflık)
Cam mikrofiber filtre & nbsp;	Sigma-Aldrich Pty, St Louis, MO, ABD	1703965	Borosilikat cam
Yüksek performanslı sıvı kromatografi (HPLC) sistemi	Shimadzu	20H2	Analizler 'nin ayrılması ve nicelendirilmesi için;
HPLC sınıfı Etanol	Sigma-Aldrich Pty, St Louis, MO, ABD	34923	Yüksek saflıkta renksiz çözücü ( ≥ %99
HPLC derecesi Metanol	Merck KGaA, Darmstadt, Almanya	322415	Yüksek saflıkta renksiz çözücü ( ≥ %99
Bağışıklık eğilimi sütunu	Shimadzu	KJ524	Hedef analitlerin seçici arıtımı için
PAN 5R-590R'nin mısır tohumları	NWK	Yok	Küçük, sert çekirdekler ve beyaz koluor
Fosfat tamponlu tuzlu (PBS)	Merck KGaA, Darmstadt, Almanya	3526580	İzotonik tampon çözümü
Plastik poşetler	Eco-Agro Enterprise (Pty) Ltd	Yok	Delikli
Saflaştırılmış AFB1, AFB2, AFG1, AFG2 ve AF'ler - toplamda yerinde	Trilogy Analytical Laboratory, Inc (Vossbrink Drive, WA, ABD)	TAS-M12DA1-10	Beyazdan off-white kristal katı ile beyaza kadar
Sodyum klorür (NaCl)	Sigma-Aldrich Pty, St Louis, MO, ABD	Yok	Beyaz kristal katı
Çinko asetat [Zn(CH3COO2)2H2O]	VWR kimyasalları	2331 210 2	Beyaz kristal katı (%99 saflık)