Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Fare Bin Mikrovasküler Endotel Hücrelerinin İzolasyonu ve Kültürü

165 görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/70909

⸱

17 Temmuz 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Basic Sciences, Vascular Physiology Laboratory, 2Biomedical Sciences Doctorate Program, Universidad de Talca, 3Faculty of Health Sciences, University of Talca, 4Group of Research and Innovation in Vascular Health, GRIVAS Health, 5Consortium for Research and Innovation Neurovascular (NEUROVAS)

Bu makalede

Özet

Beyin mikrovasküler endotel hücrelerinin (BMEC) neonatal fare beyin dokusundan izole edilmesi ve birincil kültürü için bir protokol sunulur; bu protokol kan-beyin bariyer fonksiyonunu fizyolojik ve patolojik koşullarda incelemek için sağlam bir in vitro model oluşturulur.

Özet

Beyin mikrovasküler endotel hücreleri (BMEC), kan-beyin bariyerinin (BBB) ana hücresel bileşenidir ve moleküler transferin düzenlenmesinde ve merkezi sinir sistemi homeostazının sürdürülmesinde kilit bir rol oynarlar. Beyin endotelinin güvenilir in vitro modelleri, nörolojik ve sistemik hastalıklarda BBB fizyolojisi ve işlev bozukluğunu incelemek için gereklidir. Neonatal serebral korteksinden BMEC'lerin izolyasyonu ve birincil kültürü için tekrarlanabilir bir protokol tanımlanmıştır. Yöntem, kortikal doku diseksiyonu, mekanik ve enzimatik ayrıştırmayı, sığır serum albümini (BSA) yoğunluk gradyantı kullanarak miyelin kalıntılarının çıkarılmasını ve CD31 tabanlı immünoseleksitasyon kullanılarak endotel hücrelerinin zenginleştirilmesini içerir. İzole hücreler daha sonra kollajen kaplı plakalar üzerinde kültürlenir ve morfolojik değerlendirme, endotel belirteçlerinin immünoflüoresans tespiti, anjiojenik tüp oluşumu testleri ve bariyer özelliklerini değerlendirmek için transendotel elektriksel direnç (TEER) ölçümleriyle karakterize edilir. Bu protokol, fizyolojik ve patolojik koşullarda BBB biyolojisi, endotel sinyalizasyonu ve nörovastik etkileşimleri incelemek için uygun birincil BMEC kültürlerinin elde edilmesinde güvenilir bir yaklaşım sunar.

Giriş

Kan-beyin bariyeri (BBB), merkezi sinir sistemi (CNS) ile sistemik dolaşım arasındaki madde değişimini sıkı bir şekilde düzenleyen son derece özel biryapıdır. BBB, esas olarak sıkı bağlantılarla bağlı beyin mikrovasküler endotel hücrelerinden oluşur. Bu endotel hücreleri, astrositler, perisitler, nöronlar, glial hücreler ve bazal membranı da içeren çok hücreli bir sistem (NVU) içinde işlevgörür. Bu bileşenler arasında, beyin mikrovasküler endotel hücreleri (BMEC'ler), sıkı birleşimler, binlerce seçici taşıyıcı sistem, sınırlı veziküler trafik ve bağışıklık hücresi infiltrasyonunu düşük şekilde ifade ederek bağışıklık hücresi infiltrasyonunu küçümserek, dar bağlantılı bağlantılar, binlerce seçici sistem, sınırlı veziküler trafik ve bağışıklık hücresi infiltrasyonunu kısıtlayarak merkezi bir rol oynar 3,4.

Fiziksel ve seçici bir engel olarak rollerinin yanı sıra, BMEC'ler sinyal sinyalizasyonu, beyin kan akışı düzenlemesi, yerel bağışıklık yanıtları ve özellikle beyin anjiyogenezgibi temel süreçlerde aktif olarak yer alır. Bu süreç embriyonik gelişim sırasında anahtardır, ancak felç, iskemi veya iltihaplanma gibi patolojik durumlarda da yeniden aktive olur. BMEC'ler, vasküler endotel büyüme faktörü (VEGF) ve plasenta büyüme faktörü (PLGF) gibi proanjijenik sinyallere yanıt verir ve yeni damarların oluşumunu ve olgunlaşmasınıkoordine eder 6,7. Bu nedenle, beyin endotel disfonksiyonu BBB'nin bütünlüğünü ve beyin homeostazını ciddi şekilde tehlikeye atacaktır.

BMEC'leri in vitro incelemek, hem BBB'nin fizyolojisini hem de beyin anjiyogenezini düzenleyen mekanizmaları modellememize olanak tanır. Ancak, bu hücrelerin beyin dokusundan izole edilmesi, sinir dokusunun karmaşıklığı, mielin bolluğu ve yüksek endotel saflığına sahip kültürlerin alınması ihtiyacı nedeniyle önemli teknik zorluklar yaratmaktadır. Ölümsüzleştirilmiş hücre hatları mevcut olsa da, fenotipik ve işlevsel temsiliyetleri açısından önemli sınırlamalarıvardır 8.

Bu bağlamda, neonatal fare modellerinden elde edilen BMEC'lerin birincil kültürü protokolleri, in vivo beyin endotelinin morfolojik, moleküler ve fonksiyonel özelliklerinin çoğunu koruduğu için güçlü bir deneysel araç oluşturur. Ancak, fare BMEC izolasyonu için kurulmuş birkaç protokol, mekanik ayrışmayı yoğunluk gradyanlarıyla (dextran veya Percoll) birleştirir ve genellikle değişken endotel zenginleşmesi ve perisitler, astrositler ve miyelin kalıntıları tarafından kalıntıkontaminasyonu sağlar 9. Puromisin kullanılarak antibiyotik bazlı arındırma, endotel saflığını (~%95'e kadar) artırır, ancak protein sentezini inhibe ettiği ve endotel fenotip10 üzerindeki potansiyel etkileri nedeniyle hücresel strese yol açabilir. Alternatif olarak, Floresans-Aktiflenmiş Hücre Ayırma (FACS) tabanlı yaklaşımlar yüksek arındırılmış popülasyonlar sağlar ancak özel ekipman ve kapsamlı işlem gerektirir; bu da canlılığı ve ölçeklenebilirliğiazaltabilir. Daha yeni doğumlu protokoller, yoğunluk gradyanlarını önler ve santrifüj adımlarının sayısını azaltır, verimi artırırken kirlenmeyisınırlar. 12.

Bu arka plan üzerine inşa edilen bu çalışma, yeni doğumlu fare beyin mikrovasktürlerinden endotel hücrelerinin izole edilmesi ve kültürlenmesi için optimize edilmiş bir protokolü tanımlar. Bu yöntem, hassas anatomik diseksiyon, verimli enzimatik sindirim, sığır serum albümini (BSA) gradyanı kullanarak miyelin çıkarımı ve CD31 belirteçiyle bağlanmış manyetik mikrokürelerle immünoseleksikasyon ile zenginleştirmeyi bir arada getirir. Protokol, hem fizyolojik hem de patolojik koşullarda beyin anjiyogenezi, nörovasküler etkileşim, endotel sinyal sinyal ve BBB disfonksiyonu çalışmaları için uygun, tekrarlanabilir ve zenginleştirilmiş birincil kültürlerin elde edilmesini sağlar.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Bío-Bío Üniversitesi Biyoetik ve Biyogüvenlik Komitesi bu projeyi onayladı (Fondecyt hibe 1240925). Hayvanlarla yapılan çalışmalar, deneysel hayvanların kullanımındaki üç R'nin temelilkelerine uygun olarak yürütülmüştür 13 ve Amerika Birleşik Devletleri Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından yayımlanan Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Yönergeleri'ninönerilerine uygun olarak gerçekleştirilmiştir 14. Hayvanlar, Bío-Bío Üniversitesi Biyoteryumu'nda uygun ortamlarda, standart barınma koşullarında (12 saat ışık/karanlık döngü, 22 ± 2 °C kontrollü sıcaklık, yem ve suya erişim ile uygun ortamlarda tutuldu.

Hücreleri elde etmek için, 4 ila 6 aylık yaşlarında vahşi tip (WT) hamile fareler (C57BL/6) kullanıldı. Doğumdan sonra yavrular doğum sonrası 5. güne (P5) kadar annenin yanında kaldı. Bu noktada, yavrular izofluran ile derin anestezi altına alındı ve ötenazi öncesi refleks kaybına kadar devam etti. Hipotermi hareketi en aza indirmek için yalnızca ek olarak kullanıldı ve hemen ardından kafa kesildi. Tüm işlemler, Amerikan Veterinerler Birliği (AVMA) Hayvanların Ötenazi Yönergeleri (2020)15 ve laboratuvar hayvanlarının bakımı ve kullanımı için uluslararası yönetmeliklere (NIH)14 uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Beyin korteks izole edildi ve bu deneysel protokolün geliştirilmesinde kullanıldı (bkz. Protokol Adım 3). Materyal Tablosu , bu protokolde kullanılan malzemeler ve antikorları listeler.

1. Endotel kültür ortamının hazırlanması

  1. Sare beyni endotel hücreleri için 500 mL kültür ortamı hazırlamak için, steril bir kapta 250 mL DMEM'i %10 fetal sığır serumu (FBS) ile takviye edilmiş, 250 mL endotel hücre kültür ortamı ve %10 FBS takviyesi ile karıştırın.
    NOT: Kültür ortamı, temel endotel büyüme faktörlerini sağlar ve hücre çoğalmasını destekler. Referans verilen ürün (bkz. Materyaller Tablosu) mevcut değilse, benzer büyüme koşulları elde etmek için DMEM + FBS'ye eşdeğer endotel hücre takviyeleri (örneğin EKG, hidrokortizon ve L-glutamin) eklenebilir16.
  2. Tüm ortamı (%10 FBS) steril filtreyle 0,22 μm filtreyle steril filtreleyin.
  3. Hazırlanan ortamı 4 °C'de kullanana kadar sakla. Büyüme faktörünün aktivitesini korumak için her 2–4 haftada bir taze ortam hazırlayın.

2. Kültür plakalarının kaplanması

NOT: Hücre yapışmasını teşvik etmek ve endotel fenotipini korumak için, kültür plakaları tip I kollajenle önceden kaplanmış olmalıdır. Bu sürecin adımları şunlardır:

  1. Ön kaplama çözeltisi, Tip I kolajen (0,1 mg/mL), M asetik asit ile kollageni çözünürmek için ve steril bazal ortamı karıştırarak toplam 15 mL hacme ulaşarak hazırlayın. Kolajen tamamen çözünene kadar nazikçe karıştırın ve gerekirse çözeltiyi pH 4.0'a ayarlayın. Çözeltiyi 0.22 μm filtreyle steril filtreleyin ve kolajen stabilitesini korumak için kullanılana kadar buzda tutun .
    NOT: Tip I kollajen bazaz zarını taklit eder, endotel hücre tutunmasını destekler ve hücre fenotipinin korunmasına yardımcı olur.
  2. Çözeltiyi steril koşullarda homojenleştirin. Çözeltiyi kültür plakalarının tüm yüzeyini örtecek şekilde eşit şekilde uygulayın.
    NOT: Sadece yüzeyi kaplayan hacim kullanılır.
  3. Plakaları gece boyunca 37 °C'de (12–16 saat) inkübe edin, böylece kollajen düzgün adsorbe olabilsin. Hücreleri tohumlamadan önce, fazla kaplama çözeltisi çıkarın ve plakaları steril 1x fosfatla tamponlanmış tuzlu (1x PBS, pH 7.4) ile 2 kez yıkayarak kalan asit ve bağlanmamış kollajen giderilebilir.

3. Beyin karma hücre kültürünün izolasyonu

NOT: Bu protokol, P5 farelerinin beyin korteksinden BMEC'leri izole etmeyi amaçlayan öncekiraporlar 9,17 üzerine inşa edilmiştir.

  1. İzofluran ile derin anestezi kullanarak beş P5 yavrusu feda edin; hipotermiyi sadece yan olarak kullanın, ardından servikal kafa kesilmesini takip edersiniz.
    NOT: Bu adımdan itibaren tüm prosedürler laminer akışlı biyolojik güvenlik kabininde yapılmalıdır.
  2. Beyinleri topla (Şekil 1A) ve tüm beyinler işlenene kadar 50 mL'lik konik bir tüpte steril soğuk PBS (1x) içine yerleştir.
  3. Meningeleri sterilize edilmiş nitroselüloz zarı üzerinde dikkatlice sararak ayırın. Beyinleri, soğuk PBS (1x) içeren 100 mm bir plakaya aktarın. Steril bir skarpel kullanarak beyin sapı, beyincik, talamus ve koku soğanını çıkarın (Şekil 1B,C).
  4. Ortaya çıkan meningssiz serebral korteksleri toplayın ve soğuk PBS (1x) içinde depolayın. Tüm beyin korteksini hemen 50 mL konik bir tüpte 50 mL PBS 1x içeren bir tüpe (Şekil 1D) aktarın.
  5. Dokuyu steril makasla mekanik olarak ayırın, ardından 1 mL pipet uygulanır, ta ki parça gözlemlenmeyecek kadar ve süspansiyon homojen hale gelene kadar (Şekil 1E).
    NOT: Pipet ucu, triturasyon sırasında mekanik gerilimi azaltmak için kesilebilir. Doku ayrışması kontrollü emme ve nazik pipetleme ile sağlanırken, daha geniş bir uç açıklığı kesme kuvvetlerini ve mekanik hücre lizisini en aza indirerek hücre canlılığını korur.
  6. Tüm dokuları topla ve 15 mL'lik tüplere yerleştir.
  7. Dokuyu sindirmek için, örneği 2 mL kollagenaz çözeltisi (DMEM'de 2 mg/mL) içeren steril 15 mL konik bir tüpe aktarın ve 180 rpm'de 37 °C'de 2 saat boyunca yörünge sallayıcısında inkübe yapın.
  8. Sindirimden sonra, süspansiyona %10 FBS takviyesi olan 5 mL DMEM ekleyin ve 3.000 × gr . seviyesinde 10 dakika boyunca santrifüj yapın (bkz. Şekil 1F). Üst yüzeyi at.
  9. Mielini çıkarmak için, pelleti 4 mL %20 BSA içinde PBS (w/v) içinde yeniden askıya alın ve 3.000 × g. ile 20 dakika boyunca santrifüj yapın (Şekil 1G). Santrifüjlemeden sonra, Pasteur pipeti ile üstteki miyelin içeren sütlü tabakayı dikkatlice çıkarın ve kalan süpernatantı atın (Şekil 1H).
  10. Pelleti %10 FBS içeren 2 mL DMEM'de yeniden süzülür, ardından tekrar 3.000 × gr. ile 10 dakika boyunca santrifüj yapın. Üst atıcıyı atın, ardından son peleti %10 FBS içeren 1 mL DMEM'de nazikçe tekrar askıya alın.
    NOT: Bu aşamada, son resüspansiyon, doku ayrışmasından kaynaklanan heterojen bir beyin kökeni hücre popülasyonunu içerir. Bu karışım, beyin mikrovasküler endotel hücreleri, astrositler, perisitler ve diğer sinir hücrelerini içerebilir. BMEC'leri seçici olarak zenginleştirmek için sonraki arındırma ve kültür adımları gereklidir.
  11. İzole hücreleri kaplamadan önce, hazırlanan kültür plakalarından kaplama çözeltisini çıkarın (bkz. Adım 2.3) ve her kuyuyu steril PBS (1x) ile iki kez durulayın.
  12. Yeniden askılanan hücreleri (adım 3.10) kaplamalı tabaklara tohumlayın (önerilen: 60 mm kaplar).
    NOT: Genellikle, bir izolasyondan elde edilen tüm hücre süspansiyonu, her biri 5 mL endotel büyüme ortamı içeren bir veya iki kaplı tabakaya dağıtılır.
  13. Kültürler, %5 CO₂ içeren nemlendirilmiş bir kuluçka makinesinde endotel hücre ortamında 37 °C sıcaklıkta tutulur. Ortamı her 2–3 günde bir değiştirin. Kültürler %90–100 birleşime ulaştığında, endotel hücreleri için zenginleştirmek amacıyla CD31 kaplı boncuklar kullanarak immünoselektirasyona devam edin.
    NOT: İzolasyon ve ilk kültür kurulmasının ardından, prosedür genellikle her preparat başına yaklaşık 5 × 10-6 hücre verir; bunlar kollajen kaplı plakalara yapışır ve endotel monotabakalarının karakteristik taş morfolojisini geliştirir.

4. CD31 manyetik boncukları kullanılarak beyin mikrovasküler endotel hücrelerinin (BMEC) izolasyonu

  1. Hücrelerin hazırlanması ve ayrılması
    1. Kültürler %90–100 birleşime ulaştığında, hücreleri 3 kez PBS (1x) ile yıkarak kalıntı ortamı çıkarın.
    2. Plakaya 1 mL tripsin (%0,5 1 kat) eklenin ve hücreleri ayırmak için 37 °C'de 3–5 dakika kuluçka yapın.
    3. Tripsini %10 FBS içeren 1 mL endotel kültür ortamı ekleyerek nötralize edin. Hücre süspansiyonunu (~2 mL) steril bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve 220 × g. sıcaklığında 4 °C'de 10 dakika boyunca santrifüj yapın. Üst yüzeyi at.
  2. CD31 manyetik boncuklarının hazırlanması
    1. 8 μL CD31 manyetik boncuklarını yeni bir 15 mL tüpe yerleştirin. Boncukları 1 mL %1 Hank çözeltisi ile yıkayıp tüpü hareket ettirerek nazikçe tekrar süsleyin.
    2. Boncukları çökeltmek için tüpü bir mıknatısın üzerine 2 dakika koyun. Boncukları rahatsız etmeden süpernatantı dikkatlice çıkarın. Yıkama adımını 3 kez tekrarlayın.
      NOT: Boncukları kaybetmemek için her zaman mıknatısa yakın çalışın ve bu adımı birincil hücre kültürünün kontaminasyonunu önlemek için steril koşullarda yapın.
  3. Boncuklarla hücrelerin kuluçka
    1. Hücre pelletini FBS içeren %1 Hank çözeltisi 1 mL içinde yeniden süspansiyona (spesifik olmayan bağlanmayı azaltmak için).
    2. Hücreleri, önceden yıkanmış boncukların bulunduğu tüplere 1.000 μL pipet kullanarak aktarın. Karışımı buz üzerinde nazikçe çalkalayarak 20 dakika inkübe edin.
  4. Endotel hücrelerinin manyetik ayrılması
    1. Tüpü bir mıknatısın üzerine 3 dakika koyarak boncukla bağlanmış endotel hücrelerini çökeltin.
    2. Süpernatantı dikkatlice çıkarın.
      NOT: Bu aşamada, iki izole hücre tipi saflaştırılabilir—bir endotel hücresi (bkz. adım 4.5) ve farklı beyin hücreleri türlerinin karışımı. Şu anda iki seçenek mevcut.
      1. Tüpü mıknatıs üzerinde tutarken süpernatantı (yani beyin hücrelerinin karışımını) çıkarıp atın. Boncuk bağlı hücreleri (yani CD31+ hücrelerini) 2 mL Hank çözeltisi ile yıkayın ve 3 kez tekrarlayın.
      2. Hücresel kalıntı içeren süpernatantı kullanarak seçilmemiş hücreler (örneğin fibroblastlar, astrositler, mikroglia, nöronlar, perisitler ve diğerleri) içeren yeni bir kültür oluşturulabilir.
  5. Arındırılmış BMEC'lerin yetiştirilmesi
    1. Boncukla bağlı endotel hücrelerini 7 mL tam endotel ortamında (%10 FBS) yeniden askıya alın.
    2. Hücreleri, gece boyunca daha önce kollajenle kaplanmış 60 mm bir plakaya tohumlayın (bkz. bölüm 2). Standart koşullar altında (37 °C, %5 CO₂) kuluçka yapın.
      NOT: Endotel fenotipi, tarif edilen kültür koşulları altında (p) 3 geçişine kadar korunur. Kan-beyin bariyeri ile ilgili özellikleri korumak için, erken geçişler (p0–p3) kullanılarak deneysel testler yapılması önerilir.

5. Hücre karakterizasyonu

  1. Boncukla yakalanan hücrelerin mikroskobik gözlemi
    NOT: Bu protokolde tanımlanan kültür koşullarında, birincil BMEC'ler genellikle karakteristik endotel morfolojisi ve fenotiplerini koruyarak üç geçişe kadar (p3) kadar korunabilir. Tohumlama yoğunluğu ve büyüme hızına bağlı olarak, kültürler genellikle in vitroyaklaşık 2–3 hafta boyunca sürdürülebilir, sonra önemli fenotipik değişiklikler meydana gelebilir.
    1. CD31 manyetik boncuklarla immünoseleksizasyondan sonra, bağlı hücreleri faz kontrast mikroskobu altında gözlemleyin (Şekil 2A).
      1. CD31-pozitif endotel hücrelerinin tipik bir taş taşı morfolojisi sergileyip 5–7 gün içinde homojen monotabakalar oluşturmasına dikkat edin.
        NOT: İmmünoselektivasyon sırasında, CD31 kaplı manyetik boncuklar endotel hücrelerine özel bağlanarak endotel popülasyonunu zenginleştirir. Seçim sürecinden sonra, boncuklar (yaklaşık 4,5 μm çapında) erken geçişlerde endotel hücreleriyle ilişkili veya içselleştirilmiş olabilir. Bunlar genellikle sonraki yıkamalar ve kültür bakımıyla azalır ve BMEC canlılığı veya hücre büyümesine müdahale etmez (Şekil 2B).
      2. Endotel popülasyonunun saflığını tahmin etmek için uniform morfolojisi ve uzamış veya astrosit benzeri hücrelerin yokluğunu kullanın.
  2. CD31 ve GLUT1 için immünofloresans
    1. Tohum 2 ×10-3 BMEC kolajen kaplamalı örtüklerde ve kültüre ile %80–90 birleşime ulaşın.
    2. Hücreleri oda sıcaklığında (22–25 °C) 10 dakika boyunca %4 paraformaldehit ile sabitleyin ve PBS ile yıkayın.
    3. %0,1 Triton X-100 ile 5 dakika permeabilize edin ve %5 BSA ile 30 dakika boyunca spesifik olmayan bağlanmayı engelleyin.
    4. CD31 ve GLUT1'e (beyin endotelyumu için özel glikoz taşıyıcısı) karşı primer antikorlarla 4 °C'de gece boyunca kuluçka yapın.
    5. PBS ile yıkayın ve uygun floresan ikincil antikorlarla 1 saat kuluçka yapın.
    6. Çekirdekleri 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) ile karşı boyama ile yerleştirin ve kapak kapaklarını antiifade montaj ortamıyla takın.
    7. Floresans veya konfokal mikroskop altında görselleştirin. CD31'i hücre sınırlarında lokalize olarak arayın (Şekil 3A), GLUT1 ise sitoplazmik ve membran dağılımını gösterir, endotel kimliği ve beyin endotelyum fenotipini doğrular (Şekil 3B).
      NOT: Bağımsız BMEC izolasyonlarından elde edilen temsil edici görüntüler, kültürlenmiş BMEC'lerin tipik morfolojisini ve belirteç ifadesini göstermektedir. Claudin-5 gibi sıkı birleşim proteinlerinin varlığı da beyin endotelini karakterize etmek için kullanılabilir. Endotel kültürlerinin saflığını daha fazla değerlendirmek için, diğer sinir hücre tipleri için negatif belirteçler kullanılarak ek immünoflüoresans boyama yapılabilir. Örneğin, Glial fibriller asidik protein (GFAP) astrositleri tespit etmek için kullanılabilir ve mikroglial hücreleri tanımlamak için İyonize kalsiyum bağlayıcı adaptör molekülü 1 (Iba1) kullanılabilir. Bu belirteçler için boyama olmaması, bu endotel hücre dışı popülasyonlardan kontaminasyon eksikliğini doğrulamaktadır (Şekil 3C,D).
  3. Tüp oluşumu testi
    NOT: Endotel hücreleri, Matrigeltestlerinde proanjiojenik kapasite gösterir ve endotel kimliği bu testle doğrulanabilir.
    1. 96 kuyruklu bir plakayı Matrigel ile önceden kaplamak ve 37 °C'de 30 dakika polimerleşmesine izin ver.
    2. Tohum 1 × 100 μL tam endotel ortamında (%10 FBS) her kuyuda 10-4 BMEC içerir. 37 °C'de kuluçka yapın ve faz kontrast mikroskobu kullanarak 4–8 saat boyunca tüp oluşumunu izleyin (Şekil 4A).
    3. ImageJ (Angiogenesis Analyzer eklentisi) ile toplam tüp uzunluğunu, bağlantı sayısını ve ağları nicelikle ölçün. (Şekil 4B).
      NOT: BMEC'lerin birbirine bağlı tübüler yapılar oluşturma yeteneği, anjiojenik potansiyellerini ve endotel fonksiyonelliğini doğrular.
  4. Transendotel elektriksel direncinin ölçümü (TEER)
    NOT: Beyin endotel hücreleri, BBB20'nin kritik bir bileşeni olduğundan, sıkı bir bariyer oluşturmalıdır. Elektrik bariyeri oluşturma endotel kapasitesinin doğrulanması gerekir.
    1. 20.000 BMEC, kollajen kaplı Transwell insertlerine (gözenek boyutu 0,4 μm) üst bölmede tohum ekin ve birleşme noktasına ulaşana kadar kültüre getirilin.
    2. TEER'i epitel voltohmmetre kullanarak tek katmanlı bütünlüğü değerlendirin. TEER değerlerini stabilize olana kadar günlük olarak kaydedin; dirençteki artış, fonksiyonel endotel bariyerlere özgü sıkı hücrelerarası bağlantıların oluşmasını gösterir (Şekil 4C).
      NOT: Seçilmemiş hücre karışımının kalıntıları, astrositler dahil, bir kokültür sistemi oluşturmak için kullanılabilir. Bu yapılandırma, üst (BMEC) ve alt (seçilmemiş hücre karışımı) bölmeleri arasındaki hücre oranının dikkatli optimize edilmesini gerektirir ve bu oranlar her laboratuvarda standartlaştırılmalıdır. Bu kokültür konfigürasyonu, daha önce tanımlanan BBBmodelleri 21'den uyarlanmıştır.
    3. Kültür plakasının alt kuyusuna seçilmemiş hücre karışımı (adım 4.4.2.2) ve Transwell insert zarının üst tarafına BMEC'ler tohumlanın.
      NOT: TEER ölçümleriyle bariyer sıkılığını değerlendirmek için monokültür ve kokültür koşullarını karşılaştıran temsilli bir deney dahil edilmiştir (Şekil 4C).

6. Temizlenmiş BMEC'lerin genişletilmesi ve bakımı

  1. Kültür koşulları
    1. Saflaştırılmış BMEC'leri tam endotel kültür ortamında (%10 FBS) 37 °C'de, nemlendirilmiş bir kuluçka makinesinde (%95 nem) %5 CO₂ ile tutun. Kültür ortamını her 2–3 günde bir değiştirerek taze besinler sağlanır ve hücre canlılığını korur.
  2. Hücre büyümesi ve morfolojisinin izlenmesi
    1. Kültürleri her gün faz kontrast mikroskobu altında gözlemleyerek hücre tutuşması, büyümesi ve morfolojisini izleyin. BMEC'lerin karakteristik taş morfolojisine bakın; bu morfolojiler 5–7 gün içinde birleşen bir tek tabaka oluşturur.
  3. Alt kültürleşme ve geçiş
    1. Kültürler %80–90 birleşime ulaştığında, hücreleri %0,05–0,1 tripsin ile 37 °C'de 3–5 dakika boyunca ayırın.
    2. Tripsini eşit hacimde tam ortamla nötralize edin, 220 × g. sıcaklıkta 4 °C'de 10 dakika boyunca santrifüj yapın ve pelleti taze endotel ortamında tekrar askıya alın.
    3. Hücreleri, istenen yoğunlukta kollajen kaplı plakalara tohumlayarak genişlemeye devam et.
      NOT: Endotel fenotipini ve fonksiyonel bütünlüğü korumak için BMEC geçişlerini 3–5 ile sınırlayın.
  4. Isteğe bağlı kriyokonserve
    1. Uzun süreli depolama için, BMEC'leri dondurucu ortamda (tam endotel ortamında %10 DMSO) yeniden süspansiyona alın. Kontrollü hızda dondurucuda kademeli olarak –80 °C'ye kadar dondurulur, ardından uzun süreli depolama için sıvı azota aktarılır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Burada açıklanan protokol, yeni doğumlu farelerden (P5) primer BMEC'lerin izole edilmesini ve kültürlenmesini sağlar. Bu hücreler, BBB'nin ana hücresel bileşenidir ve bu nedenle beyin vasküler fizyolojisi ve patofizyolojisi için değerli bir deneysel araçtır. Beyin mikrovasküler endotel hücrelerinin (BMEC) başarılı izolasyonu ve kültürü morfolojik, fenotipik ve fonksiyonel değerlendirmelerle gösterilmiştir.

İzolasyon iş akışı, kortikal olmayan bölgelerin çıkarı...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

BMEC'lerin izolasyonu, BBB'nin fizyolojisini düzenleyen mekanizmaları ve çeşitli merkezi sinir sistemi (CNS)patolojilerinde 4,9, inme dahil olmak üzere çalışmak için önemli bir araçtır. Ölümsüzleştirilmiş hücre hatlarının aksine, birincil BMEC kültürleri, beyin endotelinin temel fenotipik ve fonksiyonel özelliklerini, sıkı bağlı proteinlerin ekspresyonunu ve in vivo'nun anjiojenik kapasitesini temsil eden anjiojenik kapa...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların beyan edecek çıkar çatışmaları yoktur.

Bu makalenin bazı bölümleri, açıklık, dil ve tutarlılığı artırmak için OpenAI'nin ChatGPT (GPT-4, Temmuz 2025 versiyonu) ile yazılmıştır. Yazarlar, tüm yapay zeka destekli içerikleri eleştirel bir şekilde inceledi, düzenledi ve onayladı. Veri analizi, sonuç yorumu veya bilimsel sonuçlar üretmek için yapay zeka araçları kullanılmadı.

Teşekkürler

Yazarlar, GRIVAS Health ve NEUROVAS'a ait araştırmacılara değerli katkıları için teşekkür etmek ister. Bu çalışma Fondecyt Regular 1240295 tarafından finanse edilmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
60 mm kültür plakalarıCorning430166
96 Kuyu kültür plakalarıCorning41122107
Asetik asitSigma-AldrichA6283
Antibiyotik-Antimikotik (isteğe bağlı)Gibco15240062
Anti-CD31Santa Cruz sc-466941:100
Anti-GFAPThermo Fisher Scientific13-03001:500
Anti-GLUT1Abcamab1157301:200
Anti-Iba1Santa Cruzsc-327251:500
Anti-fare IgG Alexa Fluor (594 Boya)Thermo Fisher ScientificA-110051:500
Anti-tavşan IgG Alexa Fluor  (488 Boya)Thermo Fisher ScientificA-110081:500
Otomatik ve serolojik pipetler Oxford LP  OXL.OXL.OSP-5C
Taban ortamı (kolajen çözeltisi için)Gibco (DMEM)11965092
Sığır Serum Albumini (BSA)Sigma-AldrichA9647
Tip II KollajenazSigma-AldrichC6885
DAPIThermo Fisher Scientific622481 µg/mL
DMEM (yüksek glikoz)Thermo Fisher Scientific11965092
EndoGRO-MV Komple OrtamMerck MilliporeSCME004Endotel hücresi büyüme ortamı
Falcon tüpleri (15 & 50 mL)Corning®352096 / 352070
Fetal Bovin Serum (FBS)Gibco (Thermo Fisher)16000044
Floresan MikroskopMoticBA410
Eldivenler, maskeler, laboratuvar sarf malzemeleriÇeşitli tedarikçiler—
Heparin (100 U/mL)Sigma-AldrichH3393
Ters MikroskopOlympus CKX41
Manyetik ayırma mıknatısıEasySep  NC9284020
Orbital Çalkalayıcı (37 °C)Thermo Fisher ScientificSK-0180-S
ParafilmBemisPM996
PBS (1×)Thermo Fisher Scientific10010023
Soğutmalı SantrifüjHITACHICT5RE
Nesne bıçağıFine Science ToolsVarious
Makas ve ince forsepsFine Science ToolsVarious
Steril nitroselüloz membranBIO-RAD1620094
Tip I kolajenCorning 30394

Kaynaklar

  1. Kadry, H., Noorani, B., Cucullo, L. A blood-brain barrier overview on structure, function, impairment, and biomarkers of integrity. Fluids Barriers CNS. , (2020).
  2. Abbott, N. J., Rönnbäck, L., Hansson, E. Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier. Nat Rev Neurosci. , (2006).
  3. Saili, K. S., et al. Blood-brain barrier development: systems modeling and predictive toxicology. Birth Defects Res. , (2017).
  4. Persidsky, Y., Ramirez, S. H., Haorah, J., Kanmogne, G. D. Blood-brain barrier: structural components and function under physiologic and pathologic conditions. J Neuroimmune Pharmacol. , (2006).
  5. Tam, S. J., Watts, R. J. Connecting vascular and nervous system development: angiogenesis and the blood-brain barrier. Annu Rev Neurosci. , (2010).
  6. Crouch, E. E., et al. Ensembles of endothelial and mural cells promote angiogenesis in prenatal human brain. Cell. , (2022).
  7. Risau, W. Developing brain produces an angiogenesis factor. Proc Natl Acad Sci U S A. , (1986).
  8. Helms, H. C., et al. In vitro models of the blood-brain barrier: an overview of commonly used brain endothelial cell culture models and guidelines for their use. J Cereb Blood Flow Metab. , (2016).
  9. Assmann, J., et al. Isolation and cultivation of primary brain endothelial cells from adult mice. Bio Protoc. , (2017).
  10. Bernard-Patrzynski, F., et al. Isolation of endothelial cells, pericytes and astrocytes from mouse brain. PLoS One. , (2019).
  11. Czupalla, C., Yousef, H., Wyss-Coray, T., Butcher, E. Collagenase-based single cell isolation of primary murine brain endothelial cells using flow cytometry. Bio Protoc. , (2018).
  12. Nicolicht-Amorim, P., et al. Simple and efficient protocol to isolate and culture brain microvascular endothelial cells from newborn mice. Front Cell Neurosci. , (2022).
  13. Lee, K. H., Lee, D. W., Kang, B. C. The 3Rs principles in laboratory animal experiments. Lab Anim Res. , (2020).
  14. National Research Council. Guide for the care and use of laboratory animals. , 8th ed, National Academies Press. Washington (DC). (2011).
  15. American Veterinary Medical Association. AVMA guidelines for the euthanasia of animals: 2020 edition. , American Veterinary Medical Association. Schaumburg (IL). (2020).
  16. Ruck, T., et al. Isolation of primary murine brain microvascular endothelial cells. J Vis Exp. (93), e52204(2014).
  17. Sokol, L., et al. Protocols for endothelial cell isolation from mouse tissues: small intestine, colon, heart, and liver. STAR Protoc. , (2021).
  18. DeCicco-Skinner, K. L., et al. Endothelial cell tube formation assay for the in vitro study of angiogenesis. J Vis Exp. (91), e51312(2014).
  19. Carpentier, G., Berndt, S., Ferratge, S., Rasband, W., Cuendet, M., et al. Angiogenesis analyzer for ImageJ: a comparative morphometric analysis of "endothelial tube formation assay" and "fibrin bead assay". Sci Rep. , (2020).
  20. Dithmer, S., Blasig, I. E., Fraser, P. A., Qin, Z., Haseloff, R. F. The basic requirement of tight junction proteins in blood-brain barrier function and their role in pathologies. Int J Mol Sci. , (2024).
  21. Ramsauer, M., Krause, D., Dermietzel, R. Angiogenesis of the blood-brain barrier in vitro and the function of cerebral pericytes. FASEB J. , (2002).
  22. Liebner, S., Czupalla, C. J., Wolburg, H. Current concepts of blood-brain barrier development. Int J Dev Biol. , (2011).
  23. Abbott, N. J., Patabendige, A. A. K., Dolman, D. E. M., Yusof, S. R., Begley, D. J. Structure and function of the blood-brain barrier. Neurobiol Dis. , (2010).
  24. Weksler, B. B., et al. Blood-brain barrier-specific properties of a human adult brain endothelial cell line. FASEB J. , (2005).
  25. Rahman, N. A., Rasil, A. N. H. M., Meyding-Lamade, U., Craemer, E. M., Diah, S., et al. Immortalized endothelial cell lines for in vitro blood-brain barrier models: a systematic review. Brain Res. , (2016).
  26. Wu, W. Z., Bai, Y. P. Endothelial GLUTs and vascular biology. Biomed Pharmacother. , (2023).
  27. Vigh, J. P., et al. Transendothelial electrical resistance measurement across the blood-brain barrier: a critical review of methods. Micromachines (Basel). , (2021).
  28. Pusztaszeri, M. P., Seelentag, W., Bosman, F. T. Immunohistochemical expression of endothelial markers CD31, CD34, von Willebrand factor, and Fli-1 in normal human tissues. J Histochem Cytochem. , (2006).
  29. Escudero, C., et al. Brain vascular dysfunction in mothers and their children exposed to preeclampsia. Hypertension. , (2023).
  30. Sweeney, M. D., Zhao, Z., Montagne, A., Nelson, A. R., Zlokovic, B. V. Blood-brain barrier: from physiology to disease and back. Physiol Rev. , (2019).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

SinirbilimSayı 233Sayı 233Bu Ay JoVE'deSayıbeyin endotel hücreleriprimer kültürKan-Beyin Bariyeribeyin anjiyogenezi

Bu makale yayımlandı

Video yakında

Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.