Yöntem makalesi

Yetişkin Kök Hücrelerden İnsan Koklu Epitelyal Organoidlerin Üretimi ve Farklılaşması

DOI:

10.3791/70917

⸱

3 Nisan 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1The Department of Otolaryngology, People's Hospital of Tibet Autonomous Region, 2The Department of Otolaryngology-Head & Neck Surgery, West China Hospital, Sichuan University, 3The Department of Medicine and Engineering Interdisciplinary Research Laboratory of Nursing & Materials, West China Hospital, Sichuan University, 4The Department of Otolaryngology, People's Hospital of Shannan City in Tibet Autonomous Region, 5The Upper Airways Research Laboratory, Department of Otolaryngology, Ghent University

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, yetişkin insan üst türbinat dokusundan koku progenitor hücrelerinin izole edilmesi ve koku epitelyal organoidlerin oluşturulması için yerleşik bir yaklaşımı ortaya koymaktadır. Ayrıca, bu organoidlerin olgun, koku duyusal nöronlara ayırılmasını sağlamak için kimyasal bir indüksiyon stratejisini detaylandırıyor ve böylece insan koku nörogenezisinin modellenmesini mümkün kılıyor.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İnsan koklu epitel, bazal kök hücrelerden oluşan yerleşik popülasyon tarafından sürdürülen dikkat çekici nörojenik kapasiteye sahiptir; Ancak, bu rejeneratif süreci sadakatle özetleyen dinamik bir in vitro model oluşturmak zor olmuştur. Burada, yetişkin insan üst türbinat dokusundan izole edilen progenitor hücrelerden koklu organoidlerin üretilmesi için yerleşik bir protokol sunuyoruz. Bu organoidler, SOX2 ekspresyonu ile kanıtlandığı gibi köklülüğünü korur ve olgunlaşmamış nöronal belirteç GAP43'ün uniform ekspresyonuyla ve olgun koku duyusal nöron belirteci OMP'nin periferik lokalizasyonuyla karakterize edilen mekansal olarak düzenlenmiş bir farklılaşma deseni gösterir. Sonraki hedefli farklılaşma Notch inhibitörü LY411575, Wnt aktivatörü CHIR-99021 ve retinoik asit ile OMP ile nöronal belirteç belirtisi Tuj1 (sınıf III β-tubulin) birlikte eksprese edilen belirteç-pozitif koku duyusal nöron benzeri hücreler üretti. Bu insan kaynaklı model, fare sistemlerinin sınırlamalarını aşar ve koklu nörogenezi, COVID-19 ile ilişkili anosmi ve diğer koku alanına bağlı nörodejeneratif bozuklukları incelemek için sağlam bir in vitro platform sağlar.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İnsan koku sistemi, öncelikle koku epitelindeki bazal kök hücreler (HBC) ve globoz bazal hücreler (GBC) tarafından yönlendirilen sürekli nörogenezi destekler. 2,3 GBC, koku duyusal nöronlara (OSN) ayrılırken, HBC'ler yaralanma ile aktive olana kadar hareketsiz kalır. 4,5 Koku algısı, koku veren moleküllerin OSN'lerin kirpiklerindeki reseptörlere bağlanmasıyla başlar; bu da koku bulbağı ve kortekse bilgi ileten bir sinyal iletim zincirini tetikler. 6 Bu duyusal fonksiyonun gelişimi ve korunması, koku epitelyumu tarafından yönetilir.

Fiziksel, kimyasal veya biyolojik hakaretlerden kaynaklanan koku disfonksiyonu genellikle kendiliğinden düzelir. 7 Buna rağmen, küresel nüfusun %1,5 ila %25'ini etkiler8 ve travma, 9 enfeksiyonlar, 10 ve Alzheimer ile Parkinson hastalığı gibi nörodejeneratif bozukluklar gibi çeşitli etiyolojilerden kaynaklanabilir; Bu durumlarda, kendiliğinden iyileşme genellikle eksik veya eksik olur. Koklama eğitimi ve kortikosteroid uygulaması gibi mevcut tedavi yöntemleri sınırlı etkinlik göstermektedir. 12,13 Bu terapötik boşluk, yaralanma sonrası koku nöroepitelyumunun hayatta kalma ve yenilenmesini yöneten mekanizmaların eksik anlaşılmasından kaynaklanır; bu bilgi eksikliği, insan koku biyolojisini incelemek için mevcut in vitro modellerin yetersizliğiyle daha da kötüleşmiştir.

Son yıllarda, çeşitli insan organoid modellerinin geliştirilmesi, insan hastalıklarını incelemek için yeni teknolojik platformlar yaratmıştır. 14 Yetişkin kök hücrelerinden (AdSC) türetilen organoidler, aynı zamanda doku yerleşik kök hücreleri olarak da adlandırılır, mide, karaciğer, pankreas, akciğerler ve mesane gibi endoderm kaynaklı dokular için başarıyla üretilmiştir. 15,16,17,18,19 Buna karşılık, ektodermden türetilen koku plakasından insan koku epitelyal organoidlerini oluşturmak teknik olarak zordur. Büyük pratik zorluklardan biri, insan üst turbinatından sürekli olarak canlı koklu epitel dokusu elde etmenin zorluğudur. Koku alanının konumu ve kapsamı bireyler arasında oldukça değişkenlik gösterir ve yaşa bağlı belirgin dejenerasyon geçirir. Koklu epitelden ziyade istemeden solunum epitelinin toplanması, kültür sonuçlarını tehlikeye atar. Bunu ele almak için, insan koku mukozasından hücre kümelerini başarıyla kültürleyen Ren ve arkadaşları,20 tarafından geliştirilen ve güvenilir bir şekilde insan koklu epitel organoidleri üreten Ren ve arkadaşlarının protokolünü geliştirdik. Yaklaşımımız, insan koku epitelyal organoidlerini üç boyutlu, hiyerarşik olarak organize edilmiş bir mimariye sahip üretir ve bunların koku duyusal nöronlara ayrılmasını destekler. Bu model, koklu epitel kök hücrelerinin kaderini belirleyen mekanizmaların araştırılması ve koklu hastalıklar için potansiyel terapötik ajanların taraması için değerli bir deneysel platform sağlar.

Özetlemek gerekirse, bu yöntemin temel amacı, insan koklu epitel organoidlerini yetişkin progenitor hücrelerden ayırt etmek ve ayırt etmek için standartlaştırılmış bir iş akışı oluşturmaktır. Bu yaklaşımın gerekçesi, insan koku sisteminin fizyolojik olarak ilgili in vitro modellerinin eksikliğinden kaynaklanan kritik boşluğu ele almaktır. Geleneksel iki boyutlu (2D) tek katmanlı kültürler veya fare modelleriyle karşılaştırıldığında, bu üç boyutlu (3D) insan kaynaklı sistem, karmaşık mekansal organizasyonu ve insana özgü genetik bağlamı sadık bir şekilde tekrarlama avantajı sunar. Araştırmacıların bu protokolü değerlendirmesi için, insan üst turbinatından canlı koku epitelinin hassas izolasyonunun, solunum epiteliyle kontaminasyondan kaçınmanın son derece zor ve hasta yaşı ile bireysel anatomik varyasyondan büyük ölçüde etkilendiğini kabul etmek önemlidir. Sonuç olarak, bu protokol özellikle insan klinik örneklerine tutarlı erişimi olan ve insan koklama nörogenezi, virüs kaynaklı anosmi veya nörodejeneratif bozukluklarla ilişkili koku eksikliğini modellemek isteyen araştırmacılar için oldukça uygundur.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, Sichuan Üniversitesi Batı Çin Hastanesi Kurumsal İnceleme Kurulu'nun (IRB) onayıyla (Onay No. 2024 (31)) tarafından yapılmıştır. Tüm katılımcı hastalardan doku toplama ve veri yayımından önce yazılı bilgilendirilmiş onay alındı. Endoskopik kafatası temeli ameliyatı veya beyin omurilik sıvısı rinoresi için etmoid sinüs ameliyatı yapılan hastalardan superior türbinat dokusu örnekleri alındı.

1. Doku örneklerinin işlenmesi ve taşınması

  1. Toplandıktan hemen sonra, doku örnekleri DMEM/F12/HEPES bazal ortamından oluşan, %10 fetal sığır serumu ve %5 penisilin–streptomisin çözeltisi ile takviye edilmiş önceden soğutulmuş, steril bir taşıma ortamına yerleştirilir ve 4 °C sıcaklıkta laboratuvara taşınır.
    NOT: Serum hücre canlılığını korumaya yardımcı olurken, antibiyotik karışımı taşınma sırasında potansiyel mikrobiyal kontaminasyonu önler. Hücre canlılığını korumak için taşıma süresini 2 saatin altında tutun.

2. Doku ön işleme (buz üzerinde yapılır)

  1. Örneği önceden soğutmuş, steril bir kültür kabına aktarın, taşıma ortamını çıkarın ve dokuyu %5 penisilin – streptomisin çözeltisi içeren modifiye bir PBS tamponu ile yıkayın. Yıkamayı şu şekilde yapın: kaba 5 mL önceden soğutulmuş yıkama çözeltisi ekleyin, dokunun 5–7 katına nazikçe dokunun, ardından sıvıyı tamamen aspire edin. Bu yıkama döngüsünü 3 kez tekrarlayarak kan hücrelerini ve doku kalıntılarını çıkarabilirsiniz.
  2. Steril mikromakas kullanarak, doku yaklaşık 1–2 mm3 boyutlarında parçalara indirin.
    NOT: Bu adımda, doku hidratını koruyun, küt uçlu forsepsle sabitleyin ve hücre canlılığını korumak için kesme süresini en aza indirin.

3. Enzimatik sindirim

  1. Mekanik olarak ayrılmış dokuyu 15 mL'lik santrifüj tüpüne aktarın ve 3 mL önceden ısıtılmış (37 °C) bileşik sindirim tamponu (%0,125 tripsin ve 10 U/mL DNaz I içerir) ekleyin; böylece enzim-doku hacmi oranı 3:1 korunur. Tüpü 37 °C su banyosunda hafif bir çalkalama ile 20 dakika kuluçka yapın. Sindirim ilerlemesini izlemek ve doku topaklanmasını önlemek için her 5 dakikada bir numuneyi inceleyin.
  2. Sindirimi durdurun, %10 fetal sığır serumu ile takviye edilmiş DMEM/F12/HEPES bazal ortamı ekleyerek eşit hacimde sonlandırma çözeltisi ekleyin. Karışımı nazikçe yukarı ve aşağı 10 kez pipetleyin, böylece enzimler ile inhibitör bileşenler arasında tam karıştırma ve etkili temas sağlanır.
    NOT: Serumda bulunan α1-antitripsin, tripsin aktivitesini etkili bir şekilde nötralize eder.

4. Tek hücreli süspansiyonun hazırlanması

  1. 40 μm hücre süzgecini 50 mL'lik bir santrifüj tüpünün üzerine yerleştirin. Kesilmiş 1 mL pipet ucu kullanarak, sindirilen doku ve sıvıyı 15 mL'lik tüpten süzgecine aktarın. Filtredeki malzemeyi pipet ucuyla nazikçe döndürerek geçişi kolaylaştırın, ardından süzgeçi ek olarak 1–2 mL sonlandırma çözeltisi ile durulayın. Tüm sıvı süzgeçten geçtikten sonra, filtratı 50 mL'lik tüpten yeni bir 15 mL santrifüj tüpüne aktarın.
  2. Süspansiyonu 300 × g'de 4 °C'de 5 dakika boyunca santrifüj yapın. Tüpün altındaki belirgin hücre pelletini gözlemleyin ve süpernatantı dikkatlice aspire edin, hücre pelletinin bozulmaması veya kaybedilmesi için yaklaşık 100 μL bırakın.

5. Üç boyutlu kültür sisteminin kurulması

  1. Hücre pelletini kültür ortamında yeniden süzülmeden, önceden soğutulmuş, düşük bağlayıcı pipet ucu kullanarak doğrudan Matrigel ile birleştirerek 10.000 hücre/μL hassasiyet yoğunluğu elde edin. Bu hücre-Matrigel karışımından 40 μL 24 kuyruklu bir plakanın her kuyusuna ve 20 μL cam tabanlı konfokal kaba her kuyuya dağıtın. Plakaları 37 °C'de 30 dakika boyunca kuluçka yapın, böylece Matrigel polimerize olup üç boyutlu bir iskelet oluşturabilir.
  2. Matrigel katılaşmasından sonra, jelin bozulmamasını önlemek için kuyu duvarı boyunca nazikçe 500 μL serumsuz koku alanlı sinir kök hücre kültürü ortamı ekleyin. Kültürleri nemlendirilmiş bir kuluçka makinesinde, %5 CO₂ ile 37 °C'de tutun, ortamı her 3 günde bir taze önceden ısıtılmış ortamla değiştirin.
    NOT: Koku sinirsel kök hücre kültürü ortamı, aşağıdaki bileşenlerle desteklenen DMEM/F12/HEPES'ten oluşur: R-spondin 1 (200 ng/mL), Noggin (100 ng/mL), Wnt3a (50 ng/mL), EGF (50 ng/mL), Y-27632 (10 μM), birincil antimikrobiyal ajan (100 μg/mL), N2 takviyesi (1%), B27 takviyesi (%2) ve L-glutamin (%1).

6. Pas ve farklılaşma

  1. Organoid geri kazanma çözeltisini kullanmadan önce 10 dakika buzda önceden soğutun; Kuyulardan kültür ortamını aspire edin, ardından her kuyuya 1 mL buz soğuğu geri kazanım çözeltisi ekleyin. Plakayı 45° açıya çevirin ve nazikçe üfleyin ve çözeltiyi 5–7 kez nazikçe aspire edip dağıtarak bazal membran matriksinden organoidleri yerinden çıkarın ve ortaya çıkan süspansiyonu 15 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın. Tüpü buz üzerinde 3–5 dakika kuluçka edin, ardından 300 × g sıcaklıkta 4 °C'de 5 dakika santrifüj yapın ve süpernatantı dikkatlice çıkarın, böylece pelletin kaybını önlemek için yaklaşık 100 μL sıvı bırakın.
  2. Hücre pelletine doğrudan 1 mL organoid dissosiyasyon reaktifi ekleyin ve tüpü 37 °C'de 220 rpm'de hafif sallayarak 5 dakika kuluçka yapın. Sindirimi hemen sona erdirin, eşit hacimde Stop Solution ekleyin ve karışımı nazikçe yukarı aşağı 5 kez pipetleyin, böylece homojenlik sağlanır. Dissosiyasyon hücrelerini toplamak için 300 × g boyunca 4 °C'de 5 dakika boyunca santrifüj yapın.
  3. Hücre pelletini Matrigel'de 24 kuyu plakaları için 40 μL hacmde, cam tabanlı konfokal kültür kapları için ise 20 μL hacmde yeniden askıya alın; Önceden soğutulmuş, düşük bağlayıcı pipet ucu ile iyice karıştırarak eşit bir askı alın. Uygun tabaklara veya tabaklara tohumlandıktan sonra, yapıları 37 °C'de 30 dakika kuluçka altına alın, böylece Matrigel polimerizasyonu ve üç boyutlu iskelet oluşumu sağlanır. Daha sonra, jelin zarar vermemesi için iyi duvarlara koku siniri kök hücreleri için 500 μL uzmanlaşmış serumsuz sferoid kültür ortamı nazikçe ekleyin. Kültürleri 37 °C'de, %5 CO₂ ve %95 göreli nem ile bir kuluçka makinesinde tutun.
  4. Yaklaşık 7 gün sonra, yeni nesil koku epitelyal organoidler kürelere dönüştükten sonra, cam tabanlı konfokal kaplardan genleşme ortamı çekilir ve yerine farklılaştırma ortamı getirilir. Farklılaştırma ortamını her 3 günde bir taze, önceden ısıtılmış ortamla değiştirin. Morfolojik olarak farklı koklu nöronlar genellikle mikroskopi altında yaklaşık 7 günlük farklılaşmadan sonra ortaya çıkar.
    NOT: Farklılaştırma ortamı, R-Spondin 1 (200 ng/mL), Noggin (100 ng/mL), Wnt3a (50 ng/mL), EGF (50 ng/mL), Y-27632 (10 μM), LY411575 (5 μM), CHIR99021 (3 μM), retinoik asit (RA, 1 μM), birincil antimikrobiyal ajan (100 μg/mL), N2 takviyesi (1%), B27 takviyesi (%2) ve L-glutamin (%1) ile takviye edilmiştir.

7. İmmünofluoresans

  1. Kültür ortamını aspire edin ve örnekleri bir kez 500 μL PBS ile nazikçe yıkayın. PBS'yi çıkarın, ardından %4 paraformaldehit 500 μL ekleyin ve örnekleri oda sıcaklığında 15 dakika sabitleyin. Fiksasyonu aspire edin ve atın; sonra sabit örnekleri PBS (3 x 500 μL) ile yıkayıp 4 °C'de 48 saate kadar saklayın.
  2. PBS'yi aspire edin ve 500 μL permeabilizasyon çözeltisi (%0,2 Triton X-100 PBS içinde) ekleyin, oda sıcaklığında 15 dakika kuluçka yapın, ardından soru çekip çözeltiyi atın. Örnekleri %0,02 PBST (%0,02 Triton X-100 PBS; 3 x 500 μL) ile yıkayın.
  3. 500 μL bloklayıcı çözelti (PBS'de %3 BSA) ekleyin ve oda sıcaklığında 1 saat kuluçka yapın.
  4. Bloklayıcı çözeltiyi aspire edin ve uygun birincil antikorun (örneğin, anti-GAP43 1:160, anti-OMP 1:50 veya anti-SOX2 1:50) seyreltilmesiyle hazırlanan 500 μL primer antikor çözeltisi ile yerine bloklayıcı çözeltide inkübe yapın ve gece boyunca 4 °C'de kuluçka yapın. Ertesi gün, birincil antikor çözeltisi aspire edilip örnekleri %0,02 PBST (3 x 500 μL) ile yıkanın.
  5. 500 μL ikincil antikor çözeltisi ekleyin; bu çözelti, bloklayıcı çözeltide 1:500 seyreltilmiş Alexa Fluor 488– veya Alexa Fluor 555–konjuge ikincil antikor içeren bir antikor parçası ekleyin ve oda sıcaklığında karanlıkta 1 saat kuluçka yapın. İkincil antikor çözeltisi aspire edilip %0,02 PBST (3 x 500 μL) ile ek yıkamalar yapın.
  6. 500 μL DAPI çalışma çözeltisi (DAPI PBS ile seyreltilmiş olarak) ekleyin ve çekirdekleri boyamak için karanlıkta 10 dakika kuluçka yapın. DAPI çözeltisini aspire edin ve örnekleri %0,02 PBST (3 x 500 μL) ile yıkayın. Boyalı örnekleri görüntülemeden önce 4 °C'de 48 saate kadar sakla.

8. Konfokal mikroskopi görüntüleme

  1. ≤100 μm çapındaki organoidler için 1 μm, 100 μm'den büyük organoidler için 0,5 μm Z ekseni boyutu kullanılarak konfokal mikroskopi yapılmaktadır. Görüntüleri çok kanallı ardışık modda alın, tarama sırası şu sırayla yapılır: DAPI, FITC, TRITC ve Cy5. Alınan Z-yığını görüntü dizisi dosyalarını 3D render yazılımına (örneğin Imaris) aktarın. 3D hacim render fonksiyonunu kullanarak organoidin tam üç boyutlu modelini oluşturun. Bu yeniden oluşturulmuş modeli gözlemleyerek belirli hücresel belirteçlerin (örneğin SOX2, GAP43 ve OMP) mekansal dağılımını görselleştirin ve koku epitelyal organoidlerin hiyerarşik mimarisi ile nöronal farklılaşma durumunu nihai son nokta olarak niteliksel olarak doğrulayabilirsiniz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Koklu epitel dokusunun izolasyonu ve birincil koku epitel organoidlerinin kültürü
Koku epitelyal organoidler için bir kültür sistemi oluşturmak amacıyla, insan üst türbinat dokusundan koku epitelini izole ettik ve onu üç boyutlu bir Matrigel matrisine yerleştirdik (Şekil 1). Ren ve ark. tarafından bildirilen tanımlanmış kültür koşullarına dayanarak, temel büyüme faktörleri olan EGF, Noggin, Wnt3a ve R-pondin 1 konsantrasyonlarını, ROCK in...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Organoidler, kendi kendini organize eden, üç boyutlu mimarilerinin yerli insan dokularının mimarisini yakından yansıtması ve bazı durumlarda gerçek organlardan histolojik olarak ayırt edilemez olması nedeniyle benzersiz bir in vitro modeli temsil eder. 14 Bu nedenle, insan organoid modellerinin oluşturulması, insan hastalıklarını incelemek için kritik öneme sahiptir. Burada, birincil insan koklu epitel hücrelerinden organoid kültür sistemi oluşturmak için...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların beyan edecek çıkar çatışmaları yoktur.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, cömertçe üst türbinat dokusu örnekleri bağışlayan tüm hastalara içtenlikle teşekkür eder; bu çalışma onların katkıları olmadan mümkün olmazdı. Bu makalenin araştırması, yazarlığı ve/veya yayımlanması için maddi destek alındı. Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (Ba L: 82160209 ve 82460217), Sichuan Üniversitesi–Zigong Belediye Hükümeti Bilim ve Teknoloji İşbirliği Özel Fonu (Yang H: 2023CDZG-18) ve Tibet Özerk Bölgesi Doğa Bilimleri Vakfı (Cong TC: XZ2023ZR-ZY10(Z)) tarafından desteklendi.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
ALEXA FLUOR 488 DONKEYThermoA110551:500
ALEXA FLUOR 555 DONKEYThermoA315721:500
Anti-GAP43 antikoruAbcamab75810 1:160
Anti-OMP antikoruSANTA CRUZsc-3658181:50
Anti-Sox-2 antikoruSANTA CRUZsc-3658231:50
B-27 TakviyesiGibco175040442%
CHIR99021NovoproteinHY-101823 μM
DMEM/F12/HEPESProcellPM150310/
Glutamax (L-glutamin takviyesi)Gibco350500611%
LY411575NovoproteinHY-507525 μM
Matrigel (bazal membran matrisi)Corning3562314% (Vol/Vol)
N-2 TakviyesiGibco175020481%
Organoid Dağılma ReaktifiPrecedoPRS-ODR/
Organoid Kurtarma ÇözeltisiThewellbioMS04-100/
Primocin (birincil antimikrobiyal ajan)Invivogenant-pm-05100 μg/mL
Rekombinant İnsan EGFNovoproteinC02950 ng/mL
Rekombinant İnsan NogginNovoproteinCB89100 ng/mL
Rekombinant İnsan RSPO1NovoproteinCX83200 ng/mL
Rekombinant İnsan Wnt3aNovoproteinC18K50 ng/mL
Retinoik asitMCEHY-146491 μM
Y27632MCEHY-1007110 μM

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hummel, T., et al. Olfactory dysfunction: etiology, diagnosis, and treatment. Dtsch Arztebl Int. 120 (9), 146-154 (2023).
  2. Firestein, S. How the olfactory system makes sense of scents. Nature. 413 (6852), 211-218 (2001).
  3. Peterson, J., et al. Activating a reserve neural stem cell population in vitro enables engraftment and multipotency after transplantation. Stem Cell Rep. 12 (4), 680-695 (2019).
  4. Schnittke, N., et al. Transcription factor p63 controls the reserve status but not the stemness of horizontal basal cells in the olfactory epithelium. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (36), E5068-E5077 (2015).
  5. Schwob, J. E., et al. Stem and progenitor cells of the mammalian olfactory epithelium: taking poietic license. J Comp Neurol. 525 (4), 1034-1054 (2017).
  6. Takeuchi, H. Olfactory cilia, regulation and control of olfaction. Physiol Rep. 12 (19), e70057 (2024).
  7. Lin, B., et al. Injury induces endogenous reprogramming and dedifferentiation of neuronal progenitors to multipotency. Cell Stem Cell. 21 (6), 761-774.e5 (2017).
  8. Huang, T., Wei, Y., Wu, D. Effects of olfactory training on posttraumatic olfactory dysfunction: a systematic review and meta-analysis. Int Forum Allergy Rhinol. 11 (7), 1102-1112 (2021).
  9. Hura, N., et al. Treatment of post-viral olfactory dysfunction: an evidence-based review with recommendations. Int Forum Allergy Rhinol. 10 (9), 1065-1086 (2020).
  10. Doty, R. L. Olfactory dysfunction in neurodegenerative diseases: is there a common pathological substrate?. Lancet Neurol. 16 (6), 478-488 (2017).
  11. Patel, Z. M., et al. International consensus statement on allergy and rhinology: olfaction. Int Forum Allergy Rhinol. 12 (4), 327-680 (2022).
  12. Liu, J., et al. A novel surgical treatment for long lasting unilateral peripheral parosmia: olfactory cleft blocking technique. Auris Nasus Larynx. 48 (6), 1209-1213 (2021).
  13. Seo, B. S., et al. Treatment of postviral olfactory loss with glucocorticoids, ginkgo biloba, and mometasone nasal spray. Arch Otolaryngol Head Neck Surg. 135 (10), 1000 (2009).
  14. Kim, J., Koo, B. K., Knoblich, J. A. Human organoids: model systems for human biology and medicine. Nat Rev Mol Cell Biol. 21 (10), 571-584 (2020).
  15. Lee, S. H., et al. Tumor evolution and drug response in patient-derived organoid models of bladder cancer. Cell. 173 (2), 515-528.e17 (2018).
  16. Loomans, C. J. M., et al. Expansion of adult human pancreatic tissue yields organoids harboring progenitor cells with endocrine differentiation potential. Stem Cell Rep. 10 (3), 712-724 (2018).
  17. Huch, M., et al. Long-term culture of genome-stable bipotent stem cells from adult human liver. Cell. 160 (1-2), 299-312 (2015).
  18. Schlaermann, P., et al. A novel human gastric primary cell culture system for modelling Helicobacter pylori infection in vitro. Gut. 65 (2), 202-213 (2016).
  19. Bartfeld, S., et al. In vitro expansion of human gastric epithelial stem cells and their responses to bacterial infection. Gastroenterology. 148 (1), 126-136.e6 (2015).
  20. Ren, W., et al. Expansion of murine and human olfactory epithelium/mucosa colonies and generation of mature olfactory sensory neurons under chemically defined conditions. Theranostics. 11 (2), 684-699 (2021).
  21. Li, X., et al. Age-dependent activation and neuronal differentiation of Lgr5+ basal cells in injured olfactory epithelium via notch signaling pathway. Front Aging Neurosci. 12, 602688 (2020).
  22. Dai, Q., et al. Notch signaling regulates Lgr5+ olfactory epithelium progenitor/stem cell turnover and mediates recovery of lesioned olfactory epithelium in mouse model. Stem Cells. 36 (8), 1259-1272 (2018).
  23. Wang, L., et al. Chitinase-like protein Ym2 (Chil4) regulates regeneration of the olfactory epithelium via interaction with inflammation. J Neurosci. 41 (26), 5620-5637 (2021).
  24. Ma, Z., et al. TMEM59 ablation leads to loss of olfactory sensory neurons and impairs olfactory functions via interaction with inflammation. Brain Behav Immun. 111, 151-168 (2023).
  25. Li, W., et al. A single-cell transcriptomic census of mammalian olfactory epithelium aging. Dev Cell. 59 (22), 3043-3058.e8 (2024).
  26. Chen, Z. H., et al. Matrix metalloprotease-mediated cleavage of neural glial-related cell adhesion molecules activates quiescent olfactory stem cells via EGFR. Mol Cell Neurosci. 108, 103552 (2020).
  27. Shechtman, L. A., et al. Generation and culture of lingual organoids derived from adult mouse taste stem cells. J Vis Exp. (170), e62300 (2021).
  28. Liu, M., et al. Multimodal spatiotemporal monitoring of basal stem cell-derived organoids reveals progression of olfactory dysfunction in Alzheimer’s disease. Biosens Bioelectron. 246, 115832 (2024).
  29. Abranches, E., et al. Neural differentiation of embryonic stem cells in vitro: a road map to neurogenesis in the embryo. PLoS One. 4 (7), e6286 (2009).
  30. McLean, W. J., et al. Clonal expansion of Lgr5-positive cells from mammalian cochlea and high-purity generation of sensory hair cells. Cell Rep. 18 (8), 1917-1929 (2017).
  31. Freemantle, S. J., et al. Developmentally-related candidate retinoic acid target genes regulated early during neuronal differentiation of human embryonal carcinoma. Oncogene. 21 (18), 2880-2889 (2002).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Koku Organoidlerinsan K k H creleriKoku EpiteliOrganoid DiferansiyasyonuBazal K k H crelerProjenit r H cre zolasyonuSOX2 EkspresyonuKoku Duyusal N ronlarNotch nhibit r DiferansiyasyonuN rogenez Modeli

İlgili makaleler