Bu yöntem, yaşlı cilt fibroblastlarının sağlıklı fibroblastları nasıl etkilediğini inceler. Yaşlanma, UVB maruziyeti yoluyla indüklenir ve koşullu ortam normal fibroblastlara uygulanır. Cilt yaşlanmasında değişen hücre-hücre iletişimini hedefleyen biyoaktif bileşiklerin değerlendirilmesine yardımcı olur.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Yaşlı Hücrelerden Koşullu Ortamla In vitro Modelde Sağlıklı Hücreler Arası İletişimi Yeniden Sağlayacak Antioksidan Kombinasyonu
Bu makalede
Özet
Özet
Cilt yaşlanması, moleküler ve hücresel düzeyde yapılan değişikliklerle yönlendirilen çok faktörlü bir süreçtir; bu da yaşlanmanın alistik işaretleri olarak da bilinir. Bu değişikliklerden biri, hücre içi iletişimin değişmesinden oluşur ve bu da cilt dokusu işlev bozukluğuna ve yapısal hasara katkıda bulunur. Burada, yaşlı fibroblastlardan elde edilen koşullu ortamla sağlıklı fibroblastları inkubasyon yoluyla bu cilt yaşlanma özelliklerini taklit eden bir in vitro model sunulmaktadır. İlk olarak, UVB ışınlı fibroblastlar, fotoyaşlanmayla ilişkili gen ifadesindeki değişiklikler açısından analiz edilebilir. İkinci olarak, UVB kaynaklı yaşlanmış fibroblastlardan elde edilen koşullu ortam toplanıp sağlıklı fibroblastlara aktarılabilir; bu da hücre dışı matriks proteinlerinin aşağı regulasyonuna ve proinflamatuar sitokin gen ekspresyonunun yukarı regulasyonuna yol açar. Bu değişiklikler, antioksidanların yeni bir kombinasyonu (vitamin C + idebenon) kullanılarak dengelenir. Bu sonuçlar, in vitro modelin, yeni bileşiklerin dermal hücre yaşlanma özellikleri üzerindeki etkinliğini değerlendirmek ve böylece cilt yenileyici ve gençleştirme hücresel süreçlerini modüle edebilen bileşikleri seçmek için kullanılabileceğini göstermektedir.
Giriş
Cilt yaşlanması, cilt fonksiyonlarının ve özelliklerinin doğal olarak azalması, sertlik ve elastikiyet kaybı ile artan sarkma gibi süreçlerdir. Bu, hücrelere zarar veren ve molekülerseviye 1'de değişikliklere yol açan ultraviyole (UV) maruziyeti ve kirlilik gibi dış faktörlerle hızlanır. Bu değişiklikler son araştırmalarda iyi tanımlanmış ve genomik istikrarsızlık, telomer kaybı, epigenetik değişiklikler, proteostazis kaybı, kusurlu makrootofaji, deregülasyonsuz besin algılama, mitokondriyal işlev bozukluğu, hücresel yaşlanma, kök hücre tükenmesi, hücreler arası iletişimin değişmesi, kronik iltihap vedisbiosis gibi faktörler tarafından hızlandırılır. Bu özellikler, hücrealtı hasarın doku işlevsizliğine dönüşmesini ve böylece yaşlanma sürecini desteklemesini açıklar. İlginçtir ki, bu değişiklikler bağımsız olarak hareket etmez, aksine karşılıklı bir ağ imzası oluşturur. Genomik hasar veya epigenetik değişiklikler gibi birincil hasarlar birikir ve sonunda hücresel yaşlanmaya neden olur. Cilt durumunda, bu durum esas olarak UV hasarından kaynaklanır ve fotoyaşlanma, cilt yaşlanma özelliklerinin ana nedenidir3. Yaşlanan hücreler, proinflamatuar sitokinler, matriks metalloproteinazlar ve büyüme faktörlerinin üretiminde artış gösterir; bu durum yaşlanma ile ilişkili sekretör fenotip (SASP) olarak da bilinir ve IL6, IL8, MMP1, MMP3, TNFA veya IL1A gibiörnekleri içermektedir 4,5,6. Bu salgılanan faktörler, deri dışı matris gibi cildin yapısal özelliklerini etkilemekle kalmaz, aynı zamanda çevredeki hücrelerin işlevini de bozar. Bu, yaşa bağlı cilt hiperpigmentasyonunu (örneğin Kök Hücre Faktörü veya IL18) tetikleyen melanosit aktivasyonunu tetikleyen sitokinlerin veya çevresindeki sağlıklı fibroblastların işlevini değiştiren, fonksiyonlarını tehlikeye atan ve yaşlananfenotip 7,8,9,10,11'in artmasına katkıda bulunan diğer zararlı proteinlerin salınmasını içerir. Sonuç olarak, kronik iltihap ve değişen hücreler arası iletişim, bu moleküler değişiklikleri cilt yaşlanmasının görsel belirtilerine, örneğin kırışıklıklar, sarkma, yaşlanma lekeleri veya sertlik kaybına dönüşen zararlı durumun temel teşvik edicileridir.
SASP'nin zararlı etkilerine katkıda bulunan spesifik protein faktörleri, enzimle bağlantılı immünosor testi (ELISA), Luminex, nicel gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (qRT-PCR) veya Western Blot gibi bilinen tekniklerleincelenebilir 5,12. Ancak bu yaklaşım, bireysel bir bakış açısıyla belirli proteinleri tanımlamak ve belirli bir etki mekanizmasını karakterize etmek için faydalıdır, ancak tam SASP'nin komşu hücreler üzerindeki etkilerini dikkate almaz. Burada, UVB kaynaklı yaşlanma dermal fibroblastlar üzerindeki SASP'nin sağlıklı komşu fibroblastlar üzerindeki etkisini incelemek için in vitro bir protokol önerilmiştir; bu yöntem, yaşlanmanın hücreler arası iletişimin değişmiş özelliğini taklit eder. Daha önce belirtildiği gibi, UV deride hücre yaşlanmasının ana itici kaynağıdır. Bu nedenle, UV hasarı, replikatif veya onkogen kaynaklı yaşlanma üzerinde hasar kaynağı olarak seçilerek mevcutmodel 3'ü inşa etmektedir. Bunun için, yaşlanan fibroblastların (koşullu ortam) salgıladığı faktörleri içeren ortam kullanılır ve hücre fonksiyonunun belirteçleri bu ortamla kuluçka edilen sağlıklı fibroblastlarda nicelendirilir. Bu protokol kapsamında, koşullu ortam yaşlanmaktan sağlıklı hücrelere aktarıldığında, UVB kaynaklı yaşlanma fibroblastları moleküler özellikleri nicelendirmek için toplanır; örneğin proinflamatuar ve parakrin sinyal iletiminde rol alan genler. İkinci olarak, yaşlanan fibroblastlardan koşullu ortamla işlenmiş sağlıklı fibroblastlar, SASP'nin komşu hücrelere etkisini karakterize etmek için toplanır; ekstraslüler matris, büyüme faktörleri ve fibroblast aktivasyonunda rol alan genler nicelendirilir. Böylece, ilgi çekici bileşiklerin (COI) etkisi hem önce yaşlanan fibroblastlarda hem de koşullandırılmış ortamla tedavi edilen sağlıklı fibroblastlarda analiz edilir. Bu bileşiklerle ilgili olarak, önceki araştırmalar antioksidanların fotoyaşlanma kaynaklı cilt yaşlanmasının belirtilerini korumada ve düzeltmede etkili olduğunu göstermiştir. Sonuç olarak, iki antioksidanın (C vitamini ve idebenon) kombinasyonu, hem yaşlanan hücrelerde hem de yaşlı hücrelerden koşullandırılmış ortamla inkubasyon edilen sağlıklı hücrelerde UVB tarafından indüklenen bazı değişiklikleri geri almakiçin kullanılır 13,14,15
Genel olarak, bu protokol SASP'nin cilt hücreleri üzerindeki etkilerini incelemek ve değişmiş hücrelerarası iletişimi yeniden kazandıran yeni molekülleri/müdahaleleri belirlemek için tasarlanmıştır; böylece estetik tıp ve rejeneratif dermatolojide rejeneratif ve biyo-uyarıcı ürünler için uygundur.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Bu çalışmada kullanılan insan dermal fibroblastları, ticari bir hücre hattı sağlayıcısından alınmıştır. Birincil insan örnekleri, hasta verileri veya in vivo deneyler dahil edilmediğinden, bu çalışma için Kurumsal İnceleme Kurulu (IRB) onayı ve bilgilendirilmiş onayı gerekmemiştir.
1. UVB kullanılarak dermal fibroblastlarda yaşlanma indüksiyonu
- Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı (DMEM) ve %10 Fetal Sığır Serumu (FBS) ile takviye edilen 6 kuyu içinde 6 ×10-4 hücre yoğunluğunda plaka insan dermal fibroblastları.
- 24 saat sonra, hücre kültür ortamını çıkarın ve yerine her kuyu başına 1 mL fosfatlı tuzlu (PBS) koyun.
- Hücreleri UVB ışığı ile 25 mJ/cm 2 ışınla.
NOT: Bu enerji, bu protokolde kullanılan UVB ışınlama cihazı için optimize edilmiştir (bkz. Malzeme Tablosu), yaşlanmayı tetikleyecek kadar hasar verirken apoptoza yol açabilecek aşırı hasarı önler. Diğer cihazlar kullanılırken, ışın enerjisini buna göre ayarlayın.
DIKKAT: UVB radyasyonu tehlikelidir. Maruz kalmamak için uygun koruyucu ekipman ve koruma kullanın. - PBS'yi çıkarın ve her kuyu başına 2 mL taze hücre kültürü ortamı ekleyin.
- 72 saat sonra, hücre kültür ortamını çıkarın, her kuyuya 1 mL PBS ekleyin ve adım 1.3'te tarif edildiği gibi UVB ışınlamasını tekrarlayın.
- 72 saat sonra hücre kültür ortamını çıkarın ve her kuyu başına %0,05 tripsin-EDTA 0,5 mL ekleyin. 37 °C'de 1–2 dakika kuluçka yapın, ardından hücreleri 1,5 mL taze hücre kültür ortamı kullanarak hasat edin.
- Hücreler, hücre kültürü ortamı (%10 FBS ile takviye edilmiş DMEM) kullanılarak her kuyu başına 8 ×10-4 hücre yoğunluğunda 6 kuyu başına 10-4 hücre yoğunluğunda plaka alın. Bu adımdan sonra hücresel yaşlanma indüklenir.
2. Yaşlanan hücrelerin ilgi çekici bileşiklerle tedavisi
- 24 saat sonra, hücre kültür ortamı çıkarılır ve ilgilenilen bileşikler içeren 2 mL hücre kültürü ortamı eklenir.
- Ek 24 saat sonra, insan dermal fibroblastlarından ayrı bir parti (adım 1.1'de tarif edildiği gibi) 6 delikli plakalara yerleştirilin. Bu hücreler, koşullandırılmış ortamın transferi için sağlıklı dermal fibroblastlar olarak hizmet edecektir.
3. Yaşlanmış hücrelerden sağlıklı hücrelere koşullu ortam transferi
- Yaşlanan hücrelerin bileşik tedavisinden 48 saat sonra ve sağlıklı fibroblastların platlanmasından 24 saat sonra, yaşlanmış hücrelerden her kuyu başına 2 mL koşullu ortam alın ve sağlıklı fibroblastlara aktarılır.
NOT: Etkili transferi sağlamak için sağlıklı fibroblastlardan kültür ortamını hemen çıkarın. - Yaşlanan hücrelere 1 mL PBS ekleyin ve step 1.6'da tarif edildiği gibi tripsin ile alın. Bu hücreleri, yaşlanma veya iltihaplanma belirteçlerinin ELISA kiti veya qPCR kullanarak analiz etmek için kullanın.
NOT: Hücre pelletleri, aşağı akış testleri hemen yapılmazsa −80 °C'de depolanabilir. - Sağlıklı fibroblastları 37 °C'de %5 CO₂ ile 24 saat boyunca koşullandırılmış ortam alınarak kuluçka edin.
4. Sağlıklı hücreler, gen ekspresyonu analiziyle fibroblast aktivasyon analizi için hasat edilir
- Koşullu ortamda 24 saat kuluçkadan sonra, step 1.6'da tarif edildiği gibi tripsin kullanarak sağlıklı fibroblastlar alın. Hücredışı matris gen ifadesini qPCR ile analiz edin.
- QPCR analizi yapın.
- Üreticinin talimatlarına (RNA çıkarma kiti) göre hücre pelletlerinden RNA çıkarın.
- Üreticinin talimatlarına göre 200 ng RNA'nın ters transkripsiyonunu gerçekleştirin (Ters transkripsiyon kiti).
- Üreticinin talimatlarına göre cDNA'yı amplifikasyon (qPCR master mix) yapın. QPCR şu koşullarda yapılmalıdır: 30 saniye 95 °C, ardından 5 saniye için 95 °C ve 30 saniye boyunca 60 °C 40 döngü. Kullanılan primerler Tablo 1'de listelenmiştir.
| Gen | İleri dizisi | Ters dizisi |
| CDKN2A | 5'-GGCATTGTGAGCAACCACTG-3' | 5'-CCTGTAGGACCTTCGGTGAC-3' |
| CDKN1A | 5'-CTGGAGACTCTCAGGGTCGAA-3' | 5'-CCAGGACTGCAGGCTTCCT-3' |
| SCF | 5'-AATCCTCTCGTCAAAACTGAAGG-3' | 5'-CCATCTCGCTTATCCAACAATGA-3' |
| IL-18 | 5'-TGCAGTCTACACAGCTTCGG-3' | 5'-GTTTGTTGCGAGAGGAAGCG-3' |
| ELN | 5'-GCAGGAGTTAAGCCCAAGG-3' | 5'-TGTAGGGCAGTCCA-3' |
| FBN1 | 5'-GGTGAATGTACAAACAGTCAGCAGCAG-3' | 5'-ATAGGAACAGAGCAGCTTGTTGA-3' |
| IL-6 | 5'-AGCCCTGAGAAAGGAGACATGTA-3' | 5'-TCTGCCAGTGCCTCTTTTGC-3' |
| IL-8 | 5'-ATTTCTGCAGCTCTGTGTGAAGGT-3' | 5'-TTTTTTATGAATTCTCAGCCCT-3' |
| CTGF | 5'-GGAAATGCTGTGAGGAGTGGGT-3' | 5'-TGTCTTCCAGTCGGTAGGCAGCTA-3 |
| IGF1 | 5'-CAGAGCAGATAGAGCCTGCG-3' | 5'-CAGGTAACTCGTGCAGAGCA-3' |
Tablo 1: QPCR testleri için kullanılan primerlerin listesi. Her primer için bu modelde incelenen ve nicel edilen genlere karşılık gelen ileri ve geri diziler sağlanmıştır.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Mevcut protokol, in vitro yaşlanmanın değişen hücrelerarası iletişim özelliğini simüle etmek için bir yöntem tanımlamaktadır. Şekil 1, protokolün ana adımlarını gösteren grafiksel bir şematik sunmaktadır; bunlar arasında yaşlanma indüksiyonu, belirteç nicelleştirilmesi ve in vitro deri hücrelerinde değişen hücrelerarası iletişimin analizi yer almaktadır.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Moleküler düzeyde yaşlanma sürecini anlamak, yaşlanmayla ilgili özellikleri geciktiren ve hücrelerin ve dokuların ömrünü ve işlevselliğini uzatan yeni yaklaşımlar ve müdahaleler tasarlamanın anahtarıdır. Yaşlanmanın belirgin özelliklerinin tanımlanması ve tanımlanması, bu müdahalelerin geliştirilmesi için bilimsel bir çerçeve oluşturulmasındahayati öneme sahip olmuştur 2,16. Yaşlanmanın tanınan özellikleri arasında, hücreler aras...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Tüm yazarlar Mesoestetic Pharma Group, S.L. tarafından istihdam edilmiştir.
Teşekkürler
Yazarlar, bu projede yardımcı ve tavsiyeleri için iş birlikçilerine teşekkür etmek ister.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 6-well plates | Fisher Scientific | 10578911 | Assay (senescence induction ve bileşik tedavisi) sırasında kullanılacak hücre kültürü çok kuyu plakaları |
| Bio-LINK Crosslinker BLX-312/36 (UVB ışınlama cihazı) | Vilber Lourmat | VL-6111-1090-1 | UVB ışınlaması ile hasar üretmek ve sonuç olarak senesansı indüklemek için kullanılan cihaz |
| Dulbecco's Modifiye Edilmiş Kartal Ortamı (DMEM) | Merck Life science | D6046-500ML | Dermal fibroblastlar için standart hücre kültürü ortamı |
| Fetal boğa serumu (FBS) | Fisher Scientific | 17593595 | Hücre büyümesi için büyüme faktörleri, hormonlar, proteinler ve esansiyel mikro besinler kaynağı olarak kullanılan besin takviyesi |
| H3K27me3 ELISA kiti | Epigentek | P-3014T-096 | Biyolojik örneklerde H3K27me3'ün epigenetik modifikasyonunu tespit etmek için özel bir immünolojik test |
| İnsan dermis fibroblastları | Promocell | C-12302 | Dermis'teki ana cilt hücresi ve cildin fotoaging'i düzenleyici |
| Fosfat tamponlu salin (PBS) | Merck Life science | D8537-500ML | Fizyolojik ortamı taklit eden tampon çözeltisi. Hücreleri stres yaratmadan veya hücre canlılığını azaltmadan yıkamak için kullanılır |
| PrimeScript RT reaktifi kiti (ters transkripsiyon kiti) | Takara Bio | RR037A | Hücrelerden izole edilen RNA'dan cDNA elde etmek için kit. RNA saflaştırmasından sonra qPCR analizi için 2. adım. |
| TB Green Premix Ex Taq (qPCR master mix) | Takara Bio | RR420A | cDNA'dan gen ekspresyonu seviyelerini kantitize etmek için polimeraz zincir reaksiyonunu üretmek için kit. Ters transkripsiyondan sonra qPCR analizi için 3. adım. |
| Total RNA Saflaştırma Kiti (RNA ekstraksiyon kiti) | Norgen | 17200 | Hasat edilen hücrelerden RNA elde etmek için kit. Hücre hasatından sonra qPCR analizi için 1. adım. |
| Trypsin/EDTA 0.05% | Merck Life science | T2601-100ML | Hücre kültürü plakalarından hücrelerin ayrılması için hasat/pasaj adımlarında kullanılan enzim çözeltisi |
Kaynaklar
- Chaudhary, M., Khan, A., Gupta, M. Skin ageing: Pathophysiology and current market treatment approaches. Curr Aging Sci. 13 (1), 22-30 (2020).
- López-Otín, C., et al. Hallmarks of aging: An expanding universe. Cell. 186 (2), 243-278 (2023).
- Razzaghi, Z., Ahmadzadeh, A. Examination of the biological effects of sunlight on the skin: a review. J Lasers Med Sci. 16, e52 (2025).
- He, R., et al. Hallmarks of the aging skin microenvironment: components and mechanisms. J Cell Physiol. 240 (11), e70111 (2025).
- Karras, A., et al. Measuring the senescence-associated secretory phenotype. Biomedicines. 13 (9), 2451 (2025).
- Chin, T., et al. The role of cellular senescence in skin aging and age-related skin pathologies. Front Physiol. 14, 1297637 (2023).
- Yuan, X. H., Jin, Z. H. Paracrine regulation of melanogenesis. Br J Dermatol. 178 (3), 632-639 (2018).
- Fullard, N., et al. Cell senescence-independent changes of human skin fibroblasts with age. Cells. 13 (8), 662 (2024).
- Hachiya, A., et al. The paracrine role of stem cell factor/c-kit signaling in the activation of human melanocytes in ultraviolet-B-induced pigmentation. J Invest Dermatol. 116 (4), 578-586 (2001).
- Kovacs, D., et al. Role of fibroblast-derived growth factors in regulating hyperpigmentation of solar lentigo. Br J Dermatol. 163 (5), 1020-1027 (2010).
- Kim, M., et al. Ultraviolet-irradiated endothelial cells secrete stem cell factor and induce epidermal pigmentation. Sci Rep. 8 (1), 4235 (2018).
- Lee, Y. H., et al. Identification of senescence rejuvenation mechanism of Magnolia officinalis extract including honokiol as a core ingredient. Aging. 17 (2), 497-523 (2025).
- Pandel, R., Poljšak, B., Godic, A., Dahmane, R. Skin photoaging and the role of antioxidants in its prevention. ISRN Dermatol. 2013, 1-11 (2013).
- McDaniel, D. H., et al. Clinical efficacy assessment in photodamaged skin of 0.5% and 1.0% idebenone. J Cosmet Dermatol. 4 (3), 167-173 (2005).
- Farris, P. K. Topical vitamin C: a useful agent for treating photoaging and other dermatologic conditions. Dermatol Surg. 31 (7 Pt 2), 814-817 (2005).
- López-Otín, C., et al. The hallmarks of aging. Cell. 153 (6), 1194-1217 (2013).
- Sjerobabski-Masnec, I., Situm, M. Skin aging. Acta Clin Croat. 49 (4), 515-518 (2010).
- Ganguly, B., Hota, M., Pradhan, J. Skin aging: implications of UV radiation, reactive oxygen species and natural antioxidants. Skin Aging. , (2022).
- Ito, T., et al. Regulation of cellular senescence by polycomb chromatin modifiers through distinct DNA damage- and histone methylation-dependent pathways. Cell Rep. 22 (13), 3480-3492 (2018).
- Sen, P., Shah, P. P., Nativio, R., Berger, S. L. Epigenetic mechanisms of longevity and aging. Cell. 166 (4), 822-839 (2016).
- Cencioni, C., et al. Aging Triggers H3K27 Trimethylation Hoarding in the Chromatin of Nothobranchius furzeri Skeletal Muscle. Cells. 8 (10), 1269 (2019).
- Ma, Z., et al. Epigenetic drift of H3K27me3 in aging links glycolysis to healthy longevity in Drosophila. eLife. 7, e35368 (2018).
- Martinez-Gutierrez, A., et al. Hyaluronic and Succinic Acid: new biostimulating combination to counteract dermal and subcutaneous aging. Int J Mol Sci. 26 (15), 7548 (2025).
- Park, S., et al. Senotherapeutic potential of araliadiol in senescent human dermal fibroblasts: an in vitro study using three senescence models. Pharmaceutics. 17 (12), 1560 (2025).
- Waldera Lupa, D. M., et al. Characterization of skin aging–associated secreted proteins (SAASP) produced by dermal fibroblasts isolated from intrinsically aged human skin. J Invest Dermatol. 135 (8), 1954-1968 (2015).
- Boismal, F., et al. Proteomic and secretomic comparison of young and aged dermal fibroblasts highlights cytoskeleton as a key component during aging. Aging. 16 (16), 11776-11795 (2024).
- Abdul Ghani, N. I., et al. Effect of different collection times of dermal fibroblast conditioned medium (DFCM) on in vitro re-epithelialisation process. Biomedicines. 10 (12), 3203 (2022).
- Chowdhury, S. R., Aminuddin, B. S., Ruszymah, B. H. I. Effect of supplementation of dermal fibroblasts conditioned medium on expansion of keratinocytes through enhancing attachment. Indian J Exp Biol. 50 (5), 332-339 (2012).
- Ohgo, S., et al. Senescent dermal fibroblasts enhance stem cell migration through CCL2/CCR2 axis. Exp Dermatol. 24 (7), 552-554 (2015).
- Malaquin, N., et al. Senescent fibroblasts enhance early skin carcinogenic events via a paracrine MMP-PAR-1 axis. PLoS One. 8 (5), e63607 (2013).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
