Propentofilin, Spinal Astrosit ve Mikroglialarda ERK1/2 Fosforilasyonunu Düzenleyerek İnsizyonel Hiperaljeziyi Giderir

Özet

Bu çalışma, intratekal olarak uygulanan propentofylline'in insizyonel hiperaljeziyi hafifletme üzerindeki etkisini ve bu etkinin sıçanlardaki spinal glial belirteçlerdeki değişimler ile ekstrasellüler sinyal düzenleyici kinaz 1 ve 2'nin fosforilasyonu ile ilişkili olup olmadığını araştırmaktadır.

Özet

Omurilik astrositleri, mikroglia ve ekstrasellüler sinyal düzenleyici kinaz 1 ve 2 (ERK1/2)'nin ağrı işlemede rol oynadığı bilinmektedir. Bu çalışma, preoperatif intratekal propentofylline (PPF) uygulamasının sıçanlarda akut insizyonel hiperaljeziyi azaltıp azaltmadığını ve bu etkinin spinal glial markerlar ile ERK1/2 fosforilasyonu ile ilişkili olup olmadığını araştırmıştır. Altmış altı erkek Sprague–Dawley sıçanı; boş, insizyonel ağrı, normal salin, dimetil sülfoksit, PPF ve U0126 gruplarına rastgele atanmıştır. Mekanik ve termal hiperaljezi, başlangıçta ve insizyondan sonraki 2, 4, 8, 24 ve 72. saatlerde değerlendirilmiştir. Spinal nöronal ve glial markerlar, p-ERK1/2 ve inflamatuar mediyatörler, Western blotting ve immünofloresan yöntemiyle analiz edilmiştir. Ayrıca, ERK1/2'ye bağımlı inflamatuar mediyatör salınımını incelemek için primer spinal astrosit deneyleri kullanılmıştır. Preoperatif intratekal PPF, 72 saatlik gözlem süresi boyunca mekanik ve termal hiperalgeziyi azaltırken, U0126 hiperalgeziyi temel olarak insizyon sonrası erken dönemde azaltmıştır. İnsizyondan 4 saat sonra, her iki tedavinin de spinal GFAP, Iba-1 ve p-ERK1/2 ekspresyonunda azalma ile TNF-α ve COX-2 immünoreaktivitesinde azalma ile ilişkili olduğu görülmüştür. Kültürlenmiş astrositlerde PPF, LPS ile indüklenen inflamatuar mediyatör salınımını azaltmış, ancak konstitütif olarak aktif ERK1/2 bu etkiyi hafifletmiştir. Bu bulgular, PPF'nin antihiperaljezik etkisi ile insizyon sonrası spinal glial, ERK1/2 ile ilişkili ve inflamatuar yanıtların modülasyonu arasındaki bağlantıyı desteklemektedir.

Giriş

Cerrahi prosedürleri takiben gelişen yaygın bir akut ağrı türü olan insizyonel ağrı, genellikle 7 günden daha uzun sürmez; ancak inflamatuar ve nöropatik ağrılardan farklı, karmaşık patolojik mekanizmalara sahiptir^1,2. Eğer insizyonel ağrı gelişme sürecinde yetersiz kontrol edilirse, kronik ağrı sendromuna doğru ilerleyebilir ve doğası akut doku yaralanması ağrısından nöropatik veya karma ağrıya dönüşebilir³. Genel olarak, opioidler ve steroid olmayan anti-inflamatuar ilaçlar gibi analjeziklerin uygulanması, insizyon sonrası en yaygın analjezi yöntemidir. Bununla birlikte, bu ilaçların sürekli veya yüksek dozda kullanımı birçok yan etkiye yol açabilmektedir; bu durum, daha güvenli ve etkili analjezik stratejilere duyulan ihtiyacı vurgulamaktadır.

Güvenilir kanıtlar, propentofylline'in (PPF) farklı ağrı süreçlerinde hiperaljeziyi giderdiğini göstermektedir^4,5. Ayrıca, PPF'nin analjezik etkisi, p38 ve c-Jun N-terminal kinazlar (JNKs) gibi mitojenle aktive olan protein kinazların (MAPKs) spinal ekspresyonunun inhibe edilmesiyle kısmen sağlanabilmektedir⁶. PPF'nin p38 ve JNK yolakları üzerindeki etkileri belirlenmiş olsa da, ağrı sinyalizasyonunda rol oynayan bir diğer kritik MAPK alt ailesi olan hücre dışı sinyal düzenleyici kinaz 1 ve 2 (ERK1/2) yolağını modüle etme potansiyeli, akut insizyonel ağrıda henüz araştırılmamıştır. ERK1/2 aktivasyonunun p38 ve JNK'ye kıyasla belirgin zamansal ve hücresel paternler sergilediği göz önüne alındığında, bu bilgi boşluğu potansiyel olarak benzersiz terapötik fırsatlar sunması nedeniyle özellikle önemlidir.

Astrositler, mikroglialar ve oligodendrositler dahil olmak üzere glial hücrelerin, başlangıçta sinir dokusunun bağlayıcı ve destekleyici yapısı olduğu düşünülüyordu. Ancak son çalışmalar, astrositlerin ve mikrogliaların sinaptik plastisiteyi düzenlemede ve ağrı bilgisini iletmede önemli bir rol oynadığını göstermiştir⁷. Beyin ve omuriliğin yerleşik makrofajları olan mikroglialar, ağrı sürecinin çok erken aşamasında çeşitli hücre dışı uyarıcı sinyallerle aktive olabilir ve ardından proliferasyon göstererek yüksek miktarlarda inflamatuar sitokin salgılayabilirler; bu durum, ağrı sinyallerinin omurilikten beyne iletimini artırır^8,9. Eş zamanlı olarak, aktive olmuş astrositler eksitatör nörotransmitter glutamat salınımını yukarı yönlü düzenleyebilir ve hücreler arası iletişimi güçlendirerek bilgiyi doğrudan duyusal nöronlara gönderebilir¹⁰.

Çalışmalar, insizyon kaynaklı ağrının erken aşamasında (ilk 24 saat içinde) astrosit aktivasyonunun gerçekleştiğini, mikroglial aktivasyonun ise çok daha geç ortaya çıktığını göstermiştir^11,12. Ayrıca, bir çalışma, aktive olmuş mikrogliaların insizyon kaynaklı ağrıda mekanik hiperaljezi üzerinde sınırlı bir etkiye sahip olduğunu belirtmiştir¹³. Bu bulgular, akut ağrıda astrositlerin ve mikrogliaların farklı rolleri hakkındaki süregelen soruları vurgulamaktadır. Glial modüle edici bir ajan olan propentofylline'in, kronik sinir sıkıştırma yaralanması, akut sinir yaralanması ve akut doku yaralanması sonrası astrosit ve mikroglial aktivasyonunu düzenleyerek hiperalgeziyi hafiflettiği bildirilmiştir^4,5. Ancak, mevcut bilgiler dahilinde, hiçbir çalışma PPF'nin akut insizyon kaynaklı ağrıda astrosit veya mikroglial aktivasyon üzerindeki etkilerini incelememiştir.

Mitogenle aktive olan protein kinaz 1 ve 2'nin (MEK1/2) aşağı akışında aktive olan temel bir MAPK alt ailesi olan hücre dışı sinyal düzenleyici kinaz 1 ve 2'nin, nosiseptif süreçlerde ve nöronal plastisitede yaygın olarak rol oynadığı bildirilmiştir^14,15. Önceki çalışmalar, fosfo-ERK1/2'nin (p-ERK1/2) spinal nöronlarda nosiseptif stimülasyonla indüklenebileceğini ve ayrıca enflamatuar veya nöropatik ağrı durumlarında astrositler ile mikroglialarda saptanabileceğini göstermiştir^16,17,18,19. Ek olarak, MEK1/2–ERK1/2 sinyal yolunun farmakolojik inhibisyonunun çeşitli ağrı modellerinde mekanik ve termal hiperaljeziyi azalttığı rapor edilmiştir^{20,21,22,23,24,25}.

Buna rağmen, akut bir insizyon tarafından aktive edilen spinal ERK1/2'nin, özellikle astrosit ve mikroglialardaki hücresel dağılımı ve insizyon kaynaklı ağrıdaki rolü yetersizle tanımlanmış durumdadır. Araştırma grubunun önceki çalışmaları, PPF'nin spinal JNK ve p38 sinyalini azaltarak sıçanlarda akut insizyonel hiperaljeziyi hafiflettiğini göstermektedir; ancak PPF'nin insizyon kaynaklı ağrı sırasında spinal glial hücrelerde ERK1/2 ile ilişkili sinyalleri de modüle edip etmediği belirsizliğini korumaktadır. Bu nedenle, mevcut çalışma tamamen bağımsız bir mekanistik paradigmadan ziyade, ağrı araştırmalarındaki mevcut glial ve MAPK çerçevelerinin bir uzantısı olarak değerlendirilmelidir. Bu çalışmanın önceki çalışmalardan temel farkı; spesifik olarak akut insizyonel ağrıya odaklanması, ilgilenilen MAPK bileşeni olarak p38/JNK yerine ERK1/2'yi incelemesi ve PPF tedavisi ile ilişkili olarak p-ERK1/2'nin erken spinal hücresel dağılımını değerlendirmesidir.

Bu çalışma, ameliyat öncesi intratekal olarak uygulanan PPF'nin, sıçan plantar insizyon modelinde insizyonel hiperaljeziyi hafifletip hafifletmediğini ve bu etkinin ERK1/2 fosforilasyonuyla veya spinal nöronal ve glial belirteçlerin ile inflamatuar mediyatörler olan tümör nekroz faktör-α (TNF-α) ve siklooksijenaz-2 (COX-2) ekspresyonundaki değişikliklerle ilişkili olup olmadığını araştırmak için tasarlanmıştır. Daha spesifik olarak bu çalışma, davranışsal değerlendirmeyi zamansal Western blot analiziyle birleştirmesi; MEK1/2 inhibitörü U0126 ile yaptığı farmakolojik karşılaştırma ve akut insizyonel ağrı modelinde p-ERK1/2'nin spinal nöronlar, astrositler ve mikroglialarda kalitatif immünofloresan lokalizasyonunu belirlemesiyle önceki raporlardan ayrılmaktadır. Mekanistik çerçevesi, glial modülasyon ve MAPK sinyallemesini ağrı ile ilişkilendiren önceki literatür üzerine kurulmuş olsa da, mevcut çalışma, insizyonel hiperaljezinin erken evresinde spinal ERK1/2 ile ilişkili glial yanıtların olası katılımına dair ek kanıtlar sağlamayı amaçlamaktadır.

Konvansiyonel postoperatif analjeziklerle karşılaştırıldığında, yol hedefli yaklaşımlar tanımlanmış bir sinyalizasyon bileşenini test edebilir ancak yalnızca sınırlı süreli fayda sağlayabilir ve invaziv uygulama gerektirebilir; MEK1/2–ERK1/2 inhibisyonu, çeşitli deneysel ağrı modellerinde antihiperaljezik etkiler göstermiştir^{20,21,22,23,24,25}. PPF, glial yanıtları modüle etmesi ve birden fazla MAPK ile ilişkili süreçle bağlantılı olması nedeniyle tek yollu bir inhibitörden farklıdır^4,5,6. Pratik translasyon; preklinik tasarım, preoperatif intratekal uygulama, yalnızca erkek sıçanların kullanılması ve daha büyük cerrahi modellerde doz aralığı ve güvenlik çalışmalarının eksikliği nedeniyle sınırlı kalmaktadır.

Protokol

Yürütülen deneyler, Çin, Gansu Eyaleti'ndeki Lanzhou Üniversitesi İkinci Bağlı Hastanesi Etik Kurulu tarafından onaylanmıştır (etik onay no. 2017-070). Tüm prosedürler, Uluslararası Ağ Çalışmaları Derneği kılavuzlarına uygun olarak gerçekleştirilmiştir²⁶. Akredite bir laboratuvar hayvan merkezi'nden temin edilen ve 200–250 g ağırlığında olan toplam 66 yetişkin erkek Sprague–Dawley sıçanı kullanılmıştır. Cinsiyete bağlı hormonal etkilerle ilgili potansiyel değişkenliği azaltmak amacıyla çalışmaya yalnızca erkek sıçanlar dahil edilmiştir. Tüm protokoller, Uluslararası Ağ Çalışmaları Derneği kılavuzlarına²⁶ uygun olarak yürütülmüş ve acıyı en aza indirmek için gerekli önlemler alınmıştır. Bu çalışmada kullanılan reaktifler, sarf malzemeleri, cihazlar ve yazılımlar hakkında ayrıntılı bilgiler Materyaller Tablosu'nda sunulmuştur.

Hayvanlar

Sıçanlar operasyon öncesinde çiftler halinde, insizyon sonrası ise yiyecek ve suya ad libitum erişim sağlanarak bireysel olarak barındırılmıştır. Oda, 12 saat ışık–12 saat karanlık döngüsünde ve 24 °C ± 2 °C sıcaklık kontrolünde tutulmuştur.

İntratekal enjeksiyon ve insizyonel ağrı modeli

Çözeltilerin intratekal uygulaması için sıçanlar %1,5–3 sevoflurane (burun konisi aracılığıyla verildi) ile anestezi altına alınmış ve vertebral kolon fleksiyona getirilerek pron pozisyona yerleştirilmiştir. Lomber bölgedeki tüyler tıraşlanmış ve L5–L6 intervertebral boşluk üzerindeki deri dezenfekte edilmiştir. L5–L6 intervertebral boşluktan perkütan olarak bir mikrosiringe yerleştirilmiştir. Subaraknoid boşluğa başarılı giriş, iğne ilerlemesi sırasında meydana gelen ani bir kuyruk sıçraması veya kuyruk hareketi ile belirtilmiş ve hafif aspirasyonla beyin omurilik sıvısının görülmesiyle ayrıca doğrulanmıştır. Bu belirtiler gözlemlenmediğinde, enjeksiyondan önce iğne pozisyonu ayarlanmıştır. Enjeksiyon, ancak her iki doğrulama kriteri de karşılandıktan sonra gerçekleştirilmiş ve enjeksiyon sonrası anormal nörolojik belirtiler gösteren hayvanlar çalışma dışı bırakılmıştır. Ardından ilgili çözelti yavaşça enjekte edilmiş ve enjeksiyondan sonra deri tekrar temizlenmiştir. Cerrahi işlem yaklaşık 3 dk sürmüş ve sıçanlar genellikle 5–10 dk içinde anesteziden çıkmıştır.

İnsizyonel ağrının sıçan modeli, daha önce tarif edildiği şekilde kurulmuştur²⁷. Anestezinin ardından, arka patinin plantar yüzeyi %10 povidon-iyot ile dezenfekte edildi. Plantar deride, topuktan yaklaşık 0,5 cm mesafeden başlayıp ayak parmaklarına doğru uzanan 1 cm'lik boylamsı bir insizyon yapıldı. İnsizyon, deri ve fasyayı geçti. Plantar kas, oftalmik pens ile nazikçe kaldırıldı ve genel doku sürekliliği korunarak boylamsı olarak kesildi. Ardından kas tekrar konumlandırıldı, hemostaz sağlamak için hafif baskı uygulandı ve yara, 3-0 naylon kullanılarak iki matris sütür ile kapatıldı. Yara kapatıldıktan sonra insizyon bölgesi tekrar dezenfekte edildi. Cerrahi işlem sonrası sıçanlar tek tek barındırıldı ve güçlü ışıktan korunmuş, sessiz ve sıcak bir ortamda, yiyecek ve suya serbest erişimi olacak şekilde iyileşmeye bırakıldı. Hayvanlar ameliyat sonrası izlendi ve önceden tanımlanmış kriterleri karşılamayanlar derhal çıkarıldı. Yara enfeksiyonu; yara çevresinde kızarıklık, şişlik ve yerel sıcaklık artışı, kötü kokulu anormal sarı-yeşil pürülan eksuda, kalıcı yara açıklığı ile gecikmiş yara iyileşmesi, nekroz ve büyüme ile birlikte vücut sıcaklığının yükselmesi, letarji ve beslenme reddi gibi sistemik belirtilere göre belirlendi. Ek dışlama kriterleri arasında 30 dakika içinde anesteziden uyanamama, intraoperatif kas transversiyonu veya nörovasküler yaralanma, postoperatif self-mutilasyon, modelin başarısız kurulması ve arka ekstremite paralizisi veya insizyonel ağrı ile ilgisi olmayan ağırlık taşıyamama gibi nörolojik defisitler yer aldı. Yara enfeksiyonu veya dehissansı olan sıçanlar çalışmadan çıkarıldı.

Davranışsal ölçüm

Pati çekme mekanik eşiği (PWMT) ve pati çekme termal gecikmesi (PWTL), grup tahsisinden habersiz bir araştırmacı tarafından ölçülmüştür. Testler, en az 10 dakikalık aklimatizasyon sonrası, günün sabit bir saatinde sessiz bir odada gerçekleştirilmiştir; bölme, tel veya cam zemin, ortam ışığı ve ısı kaynağı yoğunluğu gruplar arasında sabit tutulmuştur. PWMT testi için, kalibre edilmiş von Frey filamentleri (0.4 g, 0.6 g, 1.0 g, 1.4 g, 2.0 g, 4.0 g, 6.0 g, 8.0 g, 10.0 g ve 15.0 g), filament yaklaşık 1–2 mm bükülene kadar yaranın bitişiğindeki plantar yüzeye dik olarak uygulanmıştır. Ardışık stimülasyonlar 2 dakika arayla yapılmış ve %50 PWMT, yukarı-aşağı yöntemi kullanılarak belirlenmiştir²⁸. PWTL testi için sıçanlar, cam zemin üzerindeki bireysel şeffaf bölmelere yerleştirilmiş ve radyant ısı kaynağı yaranın yanındaki plantar yüzeyle hizalanmıştır. Doku hasarını önlemek için 30 saniyelik bir kesme süresi (cut-off) uygulanmış, ardışık maruziyetler 2 dakika arayla yapılmış ve üç ölçümün ortalaması kaydedilmiştir²⁹. Patinin kaldırılması, sallanması veya yalanması pozitif bir çekilme yanıtı olarak kabul edilmiştir; kişisel bakım, lokomosyon veya ısı kaynağı hizalamasının kaybından etkilenen denemeler, yeniden aklimatizasyon sonrası tekrarlanmıştır.

Western blot analizi

Önceden belirlenen zamanlarda, sıçanlar servikal dislokasyon ile sakrifiye edildi ve L4–L6 lomber spinal kord, 100:1 oranında proteaz inhibitörü eklenmiş radyoimmünopresipitasyon analiz lizis tamponuna hızla alındı. Doku homojenize edildi, 20 dk boyunca buz üzerinde bekletildi ve 4 °C'de 20 dk boyunca 15,000 × g hızında santrifüj edildi. Süpernatant 3:1 oranında 4× yükleme tamponu ile karıştırıldı, kaynayan suda 5 dk ısıtıldı ve −80 °C'de saklandı. Protein örnekleri (her şerit için 30 µg), %10 sodyum dodesil sülfat–poliakrilamid jellerinde ayrıldı ve 0,45 veya 0,22 µm poliviniliden florür membranlara aktarıldı. Başarılı aktarım, önceden boyanmış moleküler ağırlık markerının beklenen göçünün doğrulanması ve belirgin düzensiz veya kesintili aktarım bölgelerinin olmamasıyla kontrol edildi. Membranlar, oda sıcaklığında 2 saat boyunca %5 yağsız süt ve %3 sığır serum albümini ile bloke edildi ve NeuN (1:8.000), GFAP (1:4.000), Iba-1 (1:3.000), p-ERK1/2 (1:1.000), t-ERK1/2 (1:3.000) veya GAPDH (1:2.000) karşıtı primer antikorlarla 4 °C'de gece boyunca inkübe edildi. %0,05 Tween 20 (pH 7,4) içeren Tris-tamponlu salin ile yıkandıktan sonra, membranlar karşılık gelen yaban turba horseradish peroksidaz-konjuge ikincil antikor (1:5.000) ile oda sıcaklığında 1 saat boyunca inkübe edildi. Sinyaller geliştirilmiş kemilüminesans ile geliştirildi ve her hedef için aynı pozlama aralığı kullanılarak filme kaydedildi. Grup tahsisine kör olan bir araştırmacı, bant yoğunluğunu görüntü analiz yazılımı ile analiz etti. Görüntüler 8-bit gri tonlamaya dönüştürüldü, her banda özdeş bir dikdörtgen ilgi alanı uygulandı, komşu boş bir bölgeden yerel arka plan çıkarıldı ve entegre yoğunluk kaydedildi. Bir blot üzerindeki tüm şeritler için aynı bölge boyutu ve arka plan prosedürü kullanıldı. NeuN, GFAP, Iba-1 ve t-ERK1/2 GAPDH'ye göre normalize edildi; p-ERK1/2 t-ERK1/2'ye göre normalize edildi ve değerler daha sonra boş gruba göre göreceli olarak ifade edildi.

İmmünofloresan

Belirlenen zamanlarda, sıçanlara %3 pentobarbital sodyum (1,5 mL/kg) ile anestezi uygulanmış ve kalp yoluyla 300 mL önceden soğutulmuş 0,01 mol/L fosfat tamponlu salin (PBS; pH 7,4), ardından 250 mL önceden soğutulmuş %4 paraformaldehit ile perfüzyon yapılmıştır. L4–L6 omurilik bölgesi %4 paraformaldehit ile 6 saat boyunca post-fikse edilmiş, 4 °C'de %20–30 sakkaroz-PBS içinde gece boyunca kriyokoruklanmış ve −22 °C'de 10 µm kalınlığında kesitlere ayrılmıştır. Kesitler 0,01 mol/L PBS ile yıkanmış, oda sıcaklığında 1 saat boyunca %10 keçi serumu ile bloke edilmiş ve NeuN (1:100), GFAP (1:1.000), Iba-1 (1:100), p-ERK1/2 (1:100), TNF-α (1:200) veya COX-2 (1:50) karşıtı primer antikorlar ile 4 °C'de gece boyunca inkübe edilmiştir. Üç kez PBS ile yıkandıktan sonra, kesitler oda sıcaklığında 1 saat boyunca ilgili yeşil veya kırmızı florofor konjuge ikincil antikor (1:400) ile inkübe edilmiş, üç kez daha PBS ile yıkanmış ve antifade ortamı ile lam kapatılmıştır. Her boyama grubuna, primer antikor olmadan hazırlanan negatif kontrol kesitleri dahil edilmiştir. Görüntüler, körleme yöntemi kullanan bir araştırmacı tarafından floresan mikroskobu ile elde edilmiştir. Düşük büyütmeli genel görüntüler 10× objektif kullanılarak, hücresel immünoreaktivite ve ko-lokalizasyon görüntüleri ise ilgili şekil paneline göre 20× veya 40× objektifler kullanılarak alınmıştır. Aynı şekil ve boyama grubu içindeki karşılaştırmalar için objektif büyütmesi, aydınlatma şiddeti, pozlama süresi, detektör kazancı, kamera ayarları ve görüntü işleme parametreleri, doygunluk altı optimizasyondan sonra sabitlenmiştir. Kanal örtüşmesini minimize etmek için ayrı floresan kanalları ardışık olarak alınmıştır. Her hayvan için ipsilateral dorsal horn bölgesinden üç adet örtüşmeyen alan görüntülenmiştir. Floresan yoğunluğu, 8-bit dönüşümü, hücre içermeyen bir bölge kullanılarak arka plan çıkarımı ve her boyama grubu içinde özdeş bir ilgi alanı (ROI) ve eşik değerinin uygulanmasının ardından görüntü analiz yazılımı ile kantifiye edilmiş; hayvan başına tek bir değer elde etmek için alan değerlerinin ortalaması alınmıştır. Aşırı pozlama, doku katlanması, yırtılma, yetersiz odaklama veya düzensiz arka plan içeren alanlar hariç tutulmuş ve aynı doygunluk karşıtı ayarlarda yeniden görüntülenmiştir. Doku mimarisinin sağlam olduğu, hedef sinyalin primer antikorsuz kontrolden daha yüksek olduğu ve analizi etkileyen majör katlanma, yırtılma veya doygun bölge bulunmadığı durumlarda boyama kabul edilmiştir.

In vitro primer spinal astrosit deneyleri

Primer sıçan spinal astrositleri, nemlendirilmiş %5 CO₂ inkübatöründe, 37 °C'de, komple kültür ortamında standart steril koşullar altında kültüre edilmiştir. Hücreler yaklaşık %70–80 konfluansa ulaştıklarında kullanılmış ve kontrol, LPS-stimüle, LPS + PPF, LPS + U0126 ve ERK1/2 rescue gruplarına atanmıştır. PPF ve U0126, 10 µM konsantrasyonunda eklenmiştir. LPS stimülasyonu, ilaç tedavisi ve toplama koşulları, her deneydeki paralel kuyucuklar arasında aynı tutulmuştur. Yolak seçiciliği analizi için hücre lizatları; p-ERK1/2, t-ERK1/2, p-p38, total p38, p-JNK, total JNK ve ilgili yükleme kontrolünün Western blotting analizleri için toplanmıştır. Paralel kuyucuklardan alınan kültür süpernatantları toplanmış, santrifüj ile berraklaştırılmış ve üretici talimatlarına uygun olarak enzyme-linked immunosorbent assay kullanılarak TNF-α, PGE2 ve IL-6 açısından analiz edilmiştir. Western blot densitometrisi, yukarıda açıklanan görüntü analiz prensipleri ile gerçekleştirilmiştir. Rescue deneyleri için endojen ERK1/2, siRNA transfeksiyonu ile baskılanmış ve tedaviden önce konstitütif aktif bir ERK1/2 (CA-ERK1/2) ekspresyon konstrüktü hücrelere aktarılmıştır. Sitokin verileri yorumlanmadan önce, knockdown ve overexpression verimliliği Western blotting ile doğrulanmıştır. Aktif siRNA veya konstrükt olmaksızın transfeksiyon reaktifine maruz kalan hücreler, uygun olduğunda prosedürel kontroller olarak kullanılmıştır.

Deneysel tasarım

Deney hayvanlarının alt gruplara ayrılması

Sıçanlar, rastgele sayı tablosu yöntemi kullanılarak altı gruba ayrılmış ve grup atamaları davranışsal testler ile doku toplama işleminden önce tamamlanmıştır. Altı grup; boş grup (n = 6), insizyonel ağrı (IP) grubu (n = 18), normal salin (NS) grubu (0,9% NS, 10 µL; n = 9), PPF grubu (10 µL içinde 10 µg; n = 12), dimetil sülfoksit (DMSO) grubu (10% DMSO, 10 µL; n = 9) ve U0126 grubu (10 µL içinde 10 µg; n = 12) şeklinde oluşturulmuştur. Boş gruptaki sıçanlara plantar insizyon veya intratekal enjeksiyon uygulanmamış ve bu grup tedavi edilmemiş kontroller olarak kullanılmıştır. IP grubundaki sıçanlara, intratekal enjeksiyonla ön tedavi uygulanmadan plantar insizyon yapılmıştır. NS, PPF, DMSO ve U0126 gruplarındaki sıçanlara, plantar insizyondan 30 dk önce ilgili ajanların intratekal uygulaması yapılmıştır. NS grubu PPF için taşıyıcı kontrol, DMSO grubu ise U0126 için taşıyıcı kontrol olarak kullanılmıştır.

Propentofyllin ve U0126 dozları

Propentofylline bir glial modülatördür ve araştırma grubunun önceki çalışmalarında akut hiperaljeziyi giderdiği için 10 µg'lık bir doz seçilmiştir. U0126, ERK1/2 fosforilasyonunu engellemek için kullanılan, adenozin trifosfatla rekabet etmeyen bir MEK1/2 inhibitörüdür. Ağrı modellerinde 1–10 µg arasındaki intratekal dozların etkili olduğu bildirilmiştir^30,31,32; mevcut çalışmada 10 µg'lık doz kullanılmıştır. U0126 %10 dimetil sülfoksitte, PPF ise %0,9 normal salinde çözülmüştür. Final konsantrasyonlar 1 µg/µL olarak belirlenmiştir. İlaçlar ve taşıyıcılar cerrahi işlemden önce hazırlanmış, 4 °C'de muhafaza edilmiş ve 12 saat içinde kullanılmıştır.

Propentofylline veya U0126'nın preoperatif intratekal uygulamasının hiperaljezi üzerindeki etkisi

Davranışsal ölçüm için her gruptan altı sıçan, operasyondan 24 saat önce rastgele seçildi ve elde edilen PWMT ve PWTL değerleri bazal değerler olarak belirlendi. İntratekal enjeksiyonlar operasyondan 30 dakika önce uygulandı. PPF ve U0126'nın ameliyat öncesi intratekal uygulamasının mekanik ve termal hiperaljezi üzerindeki etkilerini değerlendirmek için, insizyondan sonra 2 sa, 4 sa, 8 sa, 24 sa ve 72 sa'da PWMT ve PWTL değerlendirmeleri yapıldı.

İnsizyon sonrası spinal nöronal ve glial marker ekspresyonu üzerine preoperatif intratekal propentofylline veya U0126 etkilerini değerlendirmek için deneysel tasarım

Tedavi etkisinin değerlendirilmesi için uygun insizyon sonrası zaman noktasını belirlemek amacıyla, öncelikle IP grubunda ön bir zaman seyri analizi gerçekleştirilmiştir. Spesifik olarak, IP grubundaki sıçanlar insizyondan 2 sa, 4 sa, 24 sa ve 72 sa sonra ötanize edilmiş ve omurilikteki NeuN, GFAP ve Iba-1 hücre belirteçlerinin ekspresyon seviyeleri Western blot ile ölçülmüştür (n = her zaman noktası için 3). Bu ön analize dayanarak, NeuN ekspresyonunun 4. saatte en yüksek seviyeye ulaşması ve erken moleküler değişikliklerin insizyonel hiperaljezinin başlangıç gelişimiyle en ilgili olduğu düşünülmesinden dolayı, insizyondan sonraki ilk 4 sa erken bir insizyon sonrası gözlem penceresi olarak seçilmiştir. Bununla birlikte, 4 saatlik zaman noktasının insizyon sonrası tüm zamansal moleküler değişiklikleri temsil etmesi amaçlanmamıştır.

Seçilen bu zaman noktasında, intratekal enjeksiyon yapılan sıçanlar, farklı hücre belirteçlerinin Western blot analizi (n = 3 grup başına) ve farklı hücre tiplerinin morfolojisinin immünofloresan değerlendirmesi (n = 3 grup başına) için ötanize edildi. Boş gruptaki sıçanlar, omurilikteki farklı hücre belirteçlerinin (NeuN, GFAP ve Iba-1) temel ekspresyon seviyelerini Western blot ile belirlemek (n = 3) ve farklı hücrelerin (nöronlar, astrositler ve mikroglia) morfolojisini immünofloresan ile değerlendirmek (n = 3) için rastgele sonlandırıldı. Böylece boş grup, insizyon yapılmamış ve tedavi uygulanmamış bazal kontrol grubu olarak hizmet etti.

Tedavi etkilerinin spinal p-ERK1/2 ve enflamatuar mediyatörler üzerindeki etkileri

p-ERK1/2 ekspresyonu ve inflamatuar sitokin seviyeleri üzerindeki tedavi etkilerini değerlendirmek için uygun insizyon sonrası zaman noktasını belirlemek amacıyla, öncelikle IP grubunda öncül bir zaman seyri analizi gerçekleştirilmiştir. Spesifik olarak, IP grubundaki sıçanlar insizyondan 2 sa, 4 sa, 24 sa ve 72 sa sonra ötanize edilmiş ve spinal p-ERK1/2 ekspresyonu Western blot ile ölçülmüştür (n = her zaman noktası için 3). Bu zaman seyri deneyine ve insizyon sonrası NeuN ekspresyonunun en yüksek olduğu zaman noktasına dayanarak, preoperatif intratekal olarak uygulanan PPF veya U0126'nın spinal p-ERK1/2 ekspresyonu ve inflamatuar sitokinler üzerindeki etkilerinin sonraki değerlendirmeleri için insizyondan 4 sa sonrası sabit zaman noktası olarak seçilmiştir. Bu zaman noktası, insizyon sonrası tüm zamansal değişimlerin kapsamlı bir temsili olarak değil, erken mekanistik bir gözlem penceresi olarak seçilmiştir.

Seçilen bu zaman noktasında, intratekal enjeksiyon uygulanan sıçanlar, p-ERK1/2 ekspresyonunun Western blot analizi (n = grup başına 3) ve inflamatuar sitokinlerin immünofloresan değerlendirmesi (n = grup başına 3) için sakrifiye edildi. Boş gruptaki sıçanlar, spinal korddaki p-ERK1/2 temel ekspresyon seviyelerinin Western blot ile (n = 3) ve inflamatuar sitokinlerin (TNF-α ve COX-2) immünofloresan ile (n = 3) belirlenmesi için rastgele sonlandırıldı. Böylece boş grup, insizyon yapılmamış ve tedavi uygulanmamış bazal kontrol grubu olarak kullanıldı.

Nöronlarda, astrositlerde ve mikroglialarda spinal p-ERK1/2'nin hücresel lokalizasyonu

İnsizyon sonrası spinal p-ERK1/2'nin hücresel dağılımını daha ayrıntılı değerlendirmek için, insizyondan 4 saat sonra Blank ve IP gruplarında immunofloresan boyama gerçekleştirilmiştir (n = 3).

İstatistiksel analiz

Veriler ortalama ± standart sapma olarak ifade edilmiştir. Örneklem büyüklüğü, araştırma grubunun önceki çalışmalarına ve ön deneylere referans alınarak belirlenmiştir. Davranışsal veriler; grup denekler arası faktör, zaman ise denek içi faktör olmak üzere iki yönlü tekrarlı ölçümler varyans analizi (ANOVA) ile analiz edilmiştir. Zaman seyirli Western blot verileri, tek yönlü ANOVA ve ardından Bonferroni düzeltmeli ikili karşılaştırmalar ile değerlendirilmiştir. Sabit zamanlı Western blot ve immünofloresan verileri, Bonferroni düzeltmeli planlanmış karşılaştırmalarla tek yönlü ANOVA ile değerlendirilmiş; iki grup karşılaştırmaları ise Student t-testi ile analiz edilmiştir. Normallik ve varyans homojenliği sırasıyla Shapiro–Wilk ve Levene testleri ile değerlendirilmiştir. İki yönlü p-değeri < 0.05 anlamlı kabul edilmiştir. İstatistiksel analizler, Materyal Tablosu'nda listelenen istatistiksel analiz yazılımı kullanılarak gerçekleştirilmiştir. in vitro astrosit deneyleri için bağımsız kültür deneyleri analiz birimi olarak kabul edilmiştir; Western blot densitometrisi ve sitokin konsantrasyonları, uygunluğa göre tek yönlü ANOVA ve ardından Bonferroni düzeltmeli planlanmış karşılaştırmalarla veya önceden belirlenmiş iki grup karşılaştırmaları için Student t-testi kullanılarak karşılaştırılmıştır.

VERİ KULLANİLABİLİRLİĞİ:

Bu çalışmanın bulgularını destekleyen veriler Ek Dosya 1'de sunulmuştur.

Sonuçlar

İnsizyonun ve preoperatif intratekal propentofylline veya U0126 uygulamasının insizyon sonrası hiperaljezi üzerindeki etkileri

Mekanik hiperaljezi

Ameliyattan 24 saat önce altı grup arasında PWMT'ler açısından anlamlı bir fark saptanmamıştır (p > 0,05; Şekil 1A,B). IP grubunda, PWMT insizyondan sonra azalmış ve insizyondan sonraki 2. saatten 72. saate kadar başlangıç değerinden anlamlı derecede düşük kalmıştır (p < 0,05 başlangıca karşı; Şekil 1A). NS ve DMSO gruplarında, insizyon sonrası zaman noktaları arasında PWMT'ler açısından anlamlı bir fark gözlenmemiştir (p > 0,05 IP grubuna karşı; Şekil 1B). PPF grubunda PWMT, insizyondan sonraki 2. saatten 72. saate kadar IP grubundakinden anlamlı derecede yüksekken (p < 0,05 IP grubuna karşı; Şekil 1A), insizyon sonrası 72. saatte artık başlangıç değerinden anlamlı bir fark göstermemiştir (p > 0,05 başlangıca karşı; Şekil 1A). U0126 grubunda PWMT'ler, insizyondan sonraki ilk 24 saat boyunca IP grubundakilerden anlamlı derecede yüksekken (p < 0,05 IP grubuna karşı; Şekil 1A), bu etki insizyon sonrası 72. saatte devam etmemiş; bu noktada PWMT başlangıç değerinden anlamlı derecede düşük kalmış ve artık IP grubundakinden anlamlı bir fark göstermemiştir (p < 0,05 başlangıca karşı; p > 0,05 IP grubuna karşı; Şekil 1A).

Termal hiperaljezi

Ameliyattan 24 saat önce altı grup arasında PWTL değerlerinde anlamlı bir fark görülmemiştir (p > 0.05; Şekil 1C,D). IP grubunda, PWTL ameliyat öncesindeki 24,85 s ± 1,06 s değerinden, insizyondan 4 saat sonra 4,38 s ± 1,02 s değerine düşmüş ve ardından insizyondan 72 saat sonra kısmen artarak 18,37 s ± 1,38 s değerine ulaşmıştır; ancak gözlem süresi boyunca başlangıç değerinden anlamlı derecede düşük kalmıştır (p < 0.05 başlangıca kıyasla; Şekil 1C). NS ve DMSO gruplarında, insizyon sonrası zaman noktaları arasında PWTL değerlerinde anlamlı bir fark saptanmamıştır (p > 0.05 IP grubuna kıyasla; Şekil 1D). PPF grubunda PWTL, 72 saatlik gözlem süresi boyunca IP grubundakinden anlamlı derecede daha yüksek seyretmiş (p < 0.05 IP grubuna kıyasla; Şekil 1C) ve insizyondan 72 saat sonra, başlangıç değerinden anlamlı derecede farklı olmayan bir seviyeye geri dönmüştür (p > 0.05 başlangıca kıyasla; Şekil 1C). U0126 grubunda PWTL, insizyondan sonraki ilk 24 saat boyunca IP grubundakinden anlamlı derecede daha yüksekti (p < 0.05 IP grubuna kıyasla; Şekil 1C); bu etki insizyondan 72 saat sonra sürdürülememiş, PWTL başlangıç değerinden anlamlı derecede düşük kalmış ve artık IP grubuyla arasında anlamlı bir fark görülmemiştir (p < 0.05 başlangıca kıyasla; p > 0.05 IP grubuna kıyasla; Şekil 1C).

İnsizyon sonrası spinal hücre belirteci ekspresyonundaki zamansal değişikliklerin ve hücre dışı sinyal düzenleyici kinaz 1 ve 2 fosforilasyonunun Western blot analizi

PVDF membranlar üzerinde spesifik bir antikor ile NeuN (48 ve 50 kD), GFAP (50 kD), Iba-1 (17 kD), p-ERK1/2 (p-ERK1 = 44 kD; p-ERK2 = 42 kD), t-ERK1/2 (t-ERK1 = 44 kD; t-ERK2 = 42 kD) ve GAPDH (36 kD) dahil olmak üzere tam moleküler ağırlıklarda birkaç bant tanımlanmıştır. GAPDH bandı; NeuN, GFAP, Iba-1 ve t-ERK1/2 için kontrol olarak, t-ERK1/2 bandı ise p-ERK1/2 için kontrol olarak kullanılmıştır.

IP grubundaki spinal kordlardan elde edilen Western blotting verileri, insizyon sonrası farklı derecelerde artışlar göstermiştir (Şekil 2A). Nöron spesifik nükleer protein ekspresyonu, insizyondan 4 saat sonra en yüksek değerine ulaşmış (p < 0.001 başlangıca kıyasla; Şekil 2A) ve insizyondan 72 saat sonra da anlamlı derecede yüksek kalmaya devam etmiştir (p < 0.001 başlangıca kıyasla; Şekil 2A). Glial fibrilary asit protein seviyeleri, 72 saatlik gözlem süresince kademeli olarak artmış (p < 0.001 başlangıca kıyasla; Şekil 2A) ve ölçülen zaman noktaları arasında en yüksek seviye 72. saatte gözlemlenmiştir. Benzer şekilde, Iba-1 seviyeleri de insizyondan 4 saat sonra anlamlı derecede artış göstermiş (p < 0.001 başlangıca kıyasla; Şekil 2A) ve küçük bir aralıkta dalgalanmıştır. Özellikle, IP grubundaki spinal kordlardan elde edilen Western blotting verileri, ERK1/2 aktivasyonunun yalnızca insizyondan sonraki ilk 24 saat içinde arttığını (p < 0.05 başlangıca kıyasla; Şekil 2B), ancak insizyondan 72 saat sonra azaldığını (p < 0.05 başlangıca kıyasla; Şekil 2B) göstermiş; buna karşın t-ERK/2 ekspresyonu hiçbir zaman noktasında anlamlı bir değişiklik göstermemiştir.

Propentofylline veya U0126'nın ameliyat öncesi intratekal uygulamalarının omurilikteki hücre belirteçleri ile fosfo-ekstraselüler sinyal düzenleyici kinaz 1 ve 2 ekspresyonu üzerindeki etkilerinin Western blot analizi

Western blotting verileri, NeuN ekspresyonunun, davranışsal ölçümün en düşük eşikte olduğu kesiden 4 saat sonra en yüksek seviyeye ulaştığını göstermiştir. Bu nedenle, operasyondan 30 dk önce intratekal olarak uygulanan PPF ve U0126'nın hücre belirteç ekspresyonu ve ERK1/2 fosforilasyonu üzerindeki etkileri, kesiden 4 saat sonra değerlendirilmiştir.

Western blotting verileri, boş gruba kıyasla, insizyondan 4 saat sonra IP grubunda tüm hücre belirteçlerinin spinal ekspresyonunun anlamlı derecede arttığını göstermiştir (p < baz hattına göre 0,05; Şekil 3). IP grubuyla karşılaştırıldığında, preoperatif intratekal PPF uygulaması NeuN'ün spinal ekspresyonunu azaltmıştır (p < 0.05 karşı IP grubu; Şekil 3A), GFAP (p < 0.05 karşılaştırmalı olarak IP grubu; Şekil 3B), ve Iba-1 (p < 0.01 karşı IP grubu; Şekil 3C). IP grubuyla karşılaştırıldığında, ameliyat öncesi intratekal U0126 uygulaması ayrıca NeuN'nin spinal ekspresyonunu da azaltmıştır (p < 0.01 karşı IP grubu; Şekil 3D), GFAP (p < 0.05 vs IP grubu; Şekil 3E), ve Iba-1 (p < 0.01 karşısında IP grubu; Şekil 3F). Bununla birlikte, boş grup ile karşılaştırıldığında, PPF grubundaki NeuN ekspresyonu başlangıç değerinden anlamlı derecede daha yüksek kalmıştır (p < 0.01 karşı başlangıç düzeyi; Şekil 3A), buna karşın U0126 grubundaki NeuN ekspresyonu, boş kontrol grubundakinden anlamlı derecede daha düşüktü (p < 0.01 veya bazal değer; Şekil 3D). GFAP ve Iba-1 için metin, şu şekilde gösterildiği üzere artık IP grubuyla olan karşırmaya vurgu yapmaktadır: Şekil 3NS ve DMSO'nun preoperatif intratekal uygulaması, herhangi bir hücre belirtecinin ekspresyonu üzerinde anlamlı bir etki yaratmamıştır.

Western blotting verileri, insizyondan 4 saat sonra Blank, IP, NS ve PPF grupları arasında spinal t-ERK1/2 ekspresyonunun anlamlı düzeyde farklılık göstermediğini ortaya koymuştur (Şekil 4A). Buna karşılık, blank grubu ile karşılaştırıldığında, insizyondan 4 saat sonra IP ve NS gruplarında p-ERK1/2 ekspresyonu anlamlı şekilde artmıştır (p < 0,001 blank grubuna kıyasla; Şekil 4B). IP grubu ile karşılaştırıldığında, preoperatif intratekal PPF uygulaması, insizyondan 4 saat sonra p-ERK1/2 ekspresyonunu anlamlı düzeyde azaltmıştır (p < 0,001 IP grubuna kıyasla; Şekil 4B). NS grubu ile karşılaştırıldığında, PPF grubundaki p-ERK1/2 ekspresyonu da anlamlı derecede daha düşüktür (p < 0,01 NS grubuna kıyasla; Şekil 4B). Bununla birlikte, blank grubu ile karşılaştırıldığında, PPF grubundaki p-ERK1/2 ekspresyonu insizyondan 4 saat sonra anlamlı şekilde yüksek kalmaya devam etmiştir. Benzer şekilde, insizyondan 4 saat sonra Blank, IP, DMSO ve U0126 grupları arasında spinal t-ERK1/2 ekspresyonu anlamlı düzeyde farklılık göstermemiştir (Şekil 4C). Blank grubu ile karşılaştırıldığında, insizyondan 4 saat sonra IP ve DMSO gruplarında p-ERK1/2 ekspresyonu anlamlı şekilde artmıştır (p < 0,001 blank grubuna kıyasla; Şekil 4D). IP grubu ile karşılaştırıldığında, preoperatif intratekal U0126 uygulaması p-ERK1/2 ekspresyonunu anlamlı düzeyde azaltmıştır (p < 0,001 IP grubuna kıyasla; Şekil 4D). DMSO grubu ile karşılaştırıldığında, U0126 grubundaki p-ERK1/2 ekspresyonu da anlamlı derecede daha düşüktür (p < 0,001 DMSO grubuna kıyasla; Şekil 4D). Özellikle, blank grubu ile karşılaştırıldığında, U0126 grubundaki p-ERK1/2 ekspresyonu insizyondan 4 saat sonra blank grubundakinden anlamlı düzeyde farklı değildir. NS veya DMSO ile ön işlem yapılması, IP grubu ile karşılaştırıldığında p-ERK1/2 ekspresyonu üzerinde anlamlı bir etki yaratmamıştır.

Omurilik hücre belirteçlerinin ve inflamatuar mediyatörlerin immünofloresan gözlemleri

İmmünofloresan sonuçları, insizyondan 4 saat sonra ipsilateral dorsal boynuzda, kontralateral tarafa kıyasla niteliksel olarak daha güçlü NeuN immünoreaktivitesi olduğunu göstermiştir (Şekil 5). Boş grupta, temsilci görüntüler ipsilateral spinal kord dorsal boynuzundaki bazal NeuN, GFAP ve Iba-1 immünoreaktivitesini göstermiştir (Şekil 6A–C). IP grubunda NeuN immünoreaktivitesi, boş gruba göre niteliksel olarak daha güçlüydü (Şekil 6D vs Şekil 6A), GFAP immünoreaktivitesi de daha güçlüydü (Şekil 6E vs Şekil 6B) ve Iba-1 immünoreaktivitesi aynı şekilde artıştı (Şekil 6F vs Şekil 6C). Eş zamanlı olarak, IP grubundaki astrositler ve mikroglia, genişlemiş hücre gövdeleri ve daha kalın, daha yüksek derecede dallanmış uzantılarla birlikte hipertrofik görünümdeydi (Şekil 6E,F).

PPF grubunda, temsili görüntüler IP grubuna kıyasla daha zayıf NeuN immünoreaktivitesi (Şekil 6G vs Şekil 6D), daha zayıf GFAP immünoreaktivitesi (Şekil 6H vs Şekil 6E) ve daha zayıf Iba-1 immünoreaktivitesi (Şekil 6I vs Şekil 6F) olduğunu göstermiştir. U0126 grubunda, temsili görüntüler benzer şekilde IP grubuna göre daha zayıf NeuN immünoreaktivitesi (Şekil 6J vs Şekil 6D), daha zayıf GFAP immünoreaktivitesi (Şekil 6K vs Şekil 6E) ve daha zayıf Iba-1 immünoreaktivitesi (Şekil 6L vs Şekil 6F) olduğunu göstermiştir. Hem PPF hem de U0126 gruplarında, astrositler ve mikroglialar, daha küçük hücre gövdeleri ve daha az sayıdaki daha ince uzantılarıyla daha az hipertrofik görünmüştür (Şekil 6H,I,K,L). NeuN, GFAP ve Iba-1'in ilgili floresan yoğunluk analizleri, temsili immünofloresan gözlemleriyle tutarlı çıkmıştır (Şekil 6M–O, sırasıyla).

İnsizyondan 4 saat sonra, IP grubunun ipsilateral dorsal boynuzunda TNF-α ve COX-2 immünoreaktivitesi ile relatif floresan yoğunluğu boş gruba kıyasla artış göstermiştir. Her iki ölçüm de preoperatif intratekal PPF veya U0126 tedavisi sonrası daha düşük seyretmiştir (Şekil 7A–C).

İmmünofloresan yöntemiyle spinal p-ERK1/2'nin hücresel lokalizasyonu

İmmünofloresan sonuçları, boş grupta p-ERK1/2 immünoreaktivitesinin omurilikte zayıf olduğunu ve yalnızca NeuN-pozitif nöronlarda gözlemlendiğini göstermiştir (Şekil 8A–C). Buna karşın, insizyondan 4 saat sonra, p-ERK1/2 immünoreaktivitesi ipsilateral omurilik dorsal boynuzunda belirgin şekilde artmış olup yalnızca nöronlarla değil, aynı zamanda GFAP-pozitif astrositler ve Iba-1-pozitif mikroglialarla da ko-lokalizasyon göstermiştir (Şekil 8D–I). Bu bulgu, insizyonun p-ERK1/2'nin hücresel dağılımını genişleterek, bazal koşullarda sadece nöronlarda görülürken, yaralanma sonrası nöronlar, astrositler ve mikroglialarda görülmesine yol açtığını göstermektedir.

In vitro spinal astrositlerde ERK1/2'ye bağımlı mekanizmanın doğrulanması

PPF'nin hücresel düzeyde ERK1/2 ile ilişkili sinyalizasyon yoluyla inflamatuar mediyatör salınımını baskılayıp baskılamadığını daha ayrıntılı değerlendirmek için, primer sıçan spinal astrositleri LPS ile stimüle edildi ve PPF veya U0126 (10 µM) ilele tedavi edildi. Western blot analizi, PPF'nin LPS kaynaklı p-ERK1/2 ekspresyonunu azalttığını, buna karşılık p-p38 ve p-JNK fosforilasyonunun belirgin bir şekilde değişmediğini göstermiştir (Şekil 9A); bu durum, söz konusu koşullar altında göreceli ERK1/2 yolu seçiciliğini desteklemektedir. Paralel olarak PPF, Stim grubuyla karşılaştırıldığında kültür süpernatantındaki TNF-α, PGE2 (COX-2 aktivitesinin bir alt ürünü) ve IL-6 seviyelerini düşürmüştür; U0126 benzer inhibitör etkiler meydana getirmiştir (Şekil 9B).

Sürekli ERK1/2 aktivasyonunun PPF'nin anti-inflamatuar etkisini zayıflatıp zayıflatmadığını test etmek için kurtarma deneyleri gerçekleştirilmiştir. Endojen ERK1/2, siRNA kullanılarak susturulmuş ve ardından konstitütif olarak aktif bir ERK1/2 (CA-ERK1/2) konstrüktü tanıtılmıştır (Şekil 9C). CA-ERK1/2 eksprese eden astrositlerde, PPF artık TNF-α, PGE2 veya IL-6 seviyelerini aynı ölçüde düşürmemiştir (Şekil 9D); bu durum, ERK1/2 fosforilasyonunun baskılanmasının, bu in vitro astrosit sisteminde PPF'nin anti-inflamatuar etkisine katkıda bulunduğunu göstermektedir.

Kolektif olarak bu in vitro bulgular, PPF'nin spinal astrositlerde ERK1/2'ye bağımlı bir mekanizma aracılığıyla inflamatuar medyatör salınımını azalttığına dair hücresel düzeyde mekanistik destek sağlayarak in vivo gözlem verilerini tamamlamaktadır.

Şekil 1: Preoperatif intratekal PPF veya U0126'nın insizyon kaynaklı mekanik ve termal hiperaljezi üzerindeki etkileri. (A) Boş, IP, PPF ve U0126 gruplarında PWMT. (B) IP ve vehicle-kontrol gruplarında PWMT. (C) Boş, IP, PPF ve U0126 gruplarında PWTL. (D) IP ve vehicle-kontrol gruplarında PWTL. Veriler ortalama ± SD (grup başına n = 6 sıçan) olarak sunulmuştur ve iki yönlü tekrarlanan ölçümler ANOVA ile analiz edilmiştir. ***p < 0.001 bazal değere göre; #p < 0.05, ##p < 0.01 ve ###p < 0.001 IP grubuna göre. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: İnsizyon sonrası spinal hücre belirteç ekspresyonu ve ERK1/2 fosforilasyonunun zaman seyri. (A) IP grubunda bazal seviyeden insizyon sonrası 72 saate kadar olan NeuN, GFAP ve Iba-1'in kantifikasyonu ve temsilci Western blotları. (B) Aynı dönem boyunca t-ERK1/2 ve p-ERK1/2'nin kantifikasyonu ve temsilci Western blotları. Değerler boş kontrol grubuna (100%) göre normalize edilmiş olup ortalama ± SD (her zaman noktası için n = 3 sıçan) olarak gösterilmiştir. Genel farklar, belirtilen ikili karşılaştırmalarla birlikte tek yönlü ANOVA ile analiz edilmiştir. Bazale göre *p < 0.05, **p < 0.01 ve ***p < 0.001. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: İnsizyondan 4 sa sonra spinal nöronal ve glial belirteçler üzerinde preoperatif intratekal PPF veya U0126'nın etkileri. (A–C) Boş, IP, normal salin ve PPF gruplarında NeuN, GFAP ve Iba-1. (D–F) Boş, IP, dimetil sülfoksit ve U0126 gruplarında NeuN, GFAP ve Iba-1. Temsili Western blot görüntüleri sağda gösterilmiştir. Değerler boş gruba (100%) göre normalize edilmiş olup ortalama ± SD (grup başına n = 3 sıçan) olarak sunulmuştur. *p < 0.05, **p < 0.01 ve ***p < 0.001 boş gruba göre; #p < 0.05 ve ##p < 0.01 IP'ye göre; Δp < 0.05, ΔΔp < 0.01 ve ΔΔΔp < 0.001 ilgili taşıyıcı gruba göre. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: Preoperatif intratekal PPF veya U0126'nın insizyondan 4 sa sonra spinal ERK1/2 fosforilasyonu üzerindeki etkileri. (A,B) Boş, IP, normal salin ve PPF gruplarında t-ERK1/2 ve p-ERK1/2. (C,D) Boş, IP, dimetil sülfoksit ve U0126 gruplarında t-ERK1/2 ve p-ERK1/2. Temsili Western blot görüntüleri sağda gösterilmiştir. Değerler boş gruba göre normalize edilmiştir (%100) ve ortalama ± SD olarak gösterilmiştir (grup başına n = 3 sıçan). **p < 0.01 ve ***p < 0.001 boş gruba göre; ###p < 0.001 IP grubuna göre; ΔΔp < 0.01 ve ΔΔΔp < 0.001 ilgili taşıyıcı (vehicle) grubuna göre. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 5: İnsizyon sonrası ipsilateral ve kontralateral spinal NeuN immünoreaktivitesi. İnsizyondan 4 sa sonra IP grubundan alınan temsili bir transvers lomber spinal kord kesiti, kontralateral ve ipsilateral dorsal boynuzlarda NeuN boyanmasını göstermektedir. Görüntü n = 3 sıçanı temsil etmektedir ve kalitatif anatomik karşılaştırma amacıyla sunulmuştur. Ölçek çubuğu = 500 µm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 6: İnsizyondan 4 saat sonra spinal nöronal ve glial immünoreaktivite üzerindeki PPF ve U0126 etkileri. (A–C) Boş grupta NeuN, GFAP ve Iba-1. (D–F) IP grubundaki karşılık gelen boyamalar. (G–I) PPF tedavisi sonrası karşılık gelen boyamalar. (J–L) U0126 tedavisi sonrası karşılık gelen boyamalar. (M–O) Sırasıyla NeuN, GFAP ve Iba-1'in bağıl floresan yoğunlukları. Çubuklar ortalama ± SD'yi göstermektedir (grup başına n = 3 sıçan); belirtilen karşılaştırmalar için *p < 0.05, **p < 0.01 ve ***p < 0.001. Ölçek çubukları = 200 µm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 7: İnsizyon ve tedavi sonrası spinal TNF-α ve COX-2 immünoreaktivitesi. (A) İnsizyondan 4 saat sonra boş, IP, PPF ve U0126 gruplarına ait temsilci TNF-α ve COX-2 görüntüleri. (B) Rölatif TNF-α floresans yoğunluğu. (C) Rölatif COX-2 floresans yoğunluğu. Çubuklar ortalama ± SD'yi göstermektedir (grup başına n = 3 sıçan); belirtilen karşılaştırmalar için ***p < 0.001. Ölçek çubukları = 200 µm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 8: İnsizyondan 4 saat sonra spinal p-ERK1/2'nin hücresel lokalizasyonu. (A–C) Kontrol grubunda sırasıyla p-ERK1/2'nin NeuN, GFAP ve Iba-1 ile ko-boyaması. (D–F) IP grubundaki karşılık gelen ko-boyama; oklar temsili ko-lokalize hücreleri belirtmektedir. Kırmızı p-ERK1/2'yi, yeşil hücre belirtecini ve sarı ko-lokalizasyonu göstermektedir. (G–I) Sırasıyla NeuN-, GFAP- ve Iba-1-pozitif bölgelerle ilişkili göreceli floresan yoğunlukları. Çubuklar ortalama ± SD'yi göstermektedir (grup başına n = 3 sıçan); belirtilen karşılaştırmalar için **p < 0.01 ve ***p < 0.001. Ölçek çubukları = 100 µm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 9: Primer sıçan spinal astrositlerinde PPF'nin ERK1/2'ye bağımlı anti-inflamatuar etkileri. (A) PPF'nin, p-p38 veya p-JNK üzerinde belirgin bir etki olmadan LPS ile indüklenen p-ERK1/2 seviyelerini azalttığını gösteren temsili Western blotlar. (B) LPS, PPF veya U0126 uygulaması sonrası kültür süpernatantlarındaki TNF-α, PGE2 ve IL-6 konsantrasyonları. (C) siRNA aracılı ERK1/2 nakavtunu ve konstitütif olarak aktif ERK1/2 (CA-ERK1/2) ekspresyonunu doğrulayan Western blotlar. (D) PPF varlığında veya yokluğunda CA-ERK1/2 ekspresyonu sonrası TNF-α, PGE2 ve IL-6 konsantrasyonları. Çubuklar, bağımsız in vitro deneylerden elde edilen ortalama ± SD değerlerini göstermektedir; belirtilen karşılaştırmalar için ***p < 0.001; ns, anlamlı değil. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Dosya 1: Bu çalışmanın bulgularını destekleyen veriler.Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

Çoğu hasta ameliyat sonrası sadece fiziksel olarak değil, bazen zihinsel olarak da akut ağrı çekmektedir³³, ancak akut postoperatif ağrının ayrıntılı mekanizmaları hakkında hala pek çok şey bilinmemektedir. Analjezik ilaçların güçlü etkilerinin yanı sıra kaçınılmaz yan etkileri de bulunmaktadır; bu durum, daha güvenli ve etkili analjeziklerin araştırılmasını kritik derecede önemli hale getirmektedir. Bu çalışma, akut postoperatif ağrıyı simüle etmek için daha önce doğrulanmış, hazırlanması kolay ve uygulanabilir olan bir insizyonel sıçan modeli üzerine kurulmuştur²⁷. Mevcut çalışma, insizyon sonrası spinal nöronal ve glial belirteçlerdeki, ERK1/2 fosforilasyonundaki ve inflamatuar medyatörlerdeki değişiklikleri değerlendirmiş ve preoperatif intratekal PPF uygulamasının antihiperaljezik etkisinin, spinal ERK1/2 fosforilasyonu ve inflamatuar sitokin ekspresyonundaki paralel değişikliklerle ilişkili olup olmadığını incelemiştir.

İnsizyon sonrası IP grubundaki sıçanlarda güçlü mekanik ve termal hiperaljezi gelişirken, araç ön işlemi davranışsal veya moleküler sonuçların hiçbirinde saptanabilir bir etki yaratmamıştır. Bu bulgular modelin stabilitesini desteklemekte ve PPF ile U0126 gruplarında gözlemlenen etkilerin enjeksiyon prosedürüne veya aracın kendisine bağlanmasının düşük ihtimal olduğunu göstermektedir. Ayrıca, insizyon sonrası NeuN ekspresyonu artmış olsa da, bu değişim nöronal aktivasyonun doğrudan bir kanıtından ziyade nöronal marker ekspresyonundaki bir değişim olarak dikkatle yorumlanmalıdır. Birlikte değerlendirildiğinde bu gözlemler, insizyonel ağrının erken gelişimindeki glial ve ERK1/2 ilişkili yanıtların incelenmesi için temel oluşturmaktadır.

Glial hücrelerin sinaptik oluşumda, sinaptik bilgi iletimi ve entegrasyonunda ve sinaptik plastisite düzenlemesinde önemli bir rol oynadığı gösterilmiştir. Glial hücrelerin ağrı işlemedeki immünolojik ve proinflamatuar fonksiyonları, özellikle de aktive olmuş spinal astrositler ve mikroglialar, hiperaljeziyi ve postoperatif davranışsal değişiklikleri aracılık eden santral sensitizasyonu artırabilir^7,34. Spinal korddaki maladaptif nörolojik değişiklikler, noksi veya non-noksi uyarılara karşı artmış bir tepkiselliğe yol açabilir. Çok sayıda kanıt; spinal astrositlerin ve mikrogliaların aktivasyonunun, spinal sinir yaralanması³⁵, doku plazminojen aktivatörü kaynaklı ağrı¹⁶, insizyonel ağrı^11,12 ve kemik kanseri ağrısı^19,31 modellerinde hiperaljezinin gelişimi ve sürdürülmesinde rol oynadığını göstermektedir. Bu nedenle, spinal glial aktivasyonun birçok ağrı durumunun ortak bir özelliği olduğu görülmektedir ve insizyonel ağrıdaki rolünün daha fazla araştırılması, postoperatif ağrı mekanizmalarına dair mevcut anlayışı genişletebilir.

Mevcut bulgular, spinal astrositlerin ve mikrogliaların insizyon sonrası erken nöroinflamatuar yanıta katıldığı görüşünü desteklemektedir¹². GFAP, Iba-1 ve p-ERK1/2, özdeş zamansal modeller göstermek yerine kısmen farklı zaman seyirleri sergilemiş olup, bu durum farklı glia ilişkili süreçlerin postoperatif ağrı gelişiminin farklı aşamalarına katkıda bulunabileceğini düşündürmektedir^31,35. İmmünofloresan bulgular, insizyon sonrası astrositlerde ve mikroglialarda hipertrofik morfolojik değişiklikler göstererek bu yorumu daha da desteklemiştir. TNF-α ve COX-2 immünoreaktivitesindeki artışlarla birlikte bu gözlemler, glia ilişkili inflamatuar sinyalin akut insizyonel hiperaljeziye katkıda bulunduğu kavramıyla uyumludur^7,36.

Bir metilksantin türevi olan Propentofylline, antiplatelet aktivitesi ve uzun süreli hafızanın korunmasını desteklemesi nedeniyle başlangıçta serebrovasküler aktif bir ilaç olarak çalışılmıştır³⁷. Bununla birlikte, PPF'nin glial hücreler üzerindeki düzenleyici etkisi, onu aynı zamanda potansiyel olarak değerli bir analjezik ilaç haline getirmektedir. Çalışmalar, PPF'nin hücre içi siklik adenozin monofosfatın yıkımını inhibe ederek ve hücre dışı adenozinin geri alımını azaltarak mikrogliaların aktivasyonunu engelleyebileceğini göstermektedir^4,5. Bir in vitro çalışmada PPF, TNF-α ile indüklenen memeli rapamisin hedefi (mTOR) yolunu engelleyerek astrositlerin proliferasyonunu inhibe etmiştir⁶. Dolayısıyla, ağrı süreçlerinin modülasyonuna katılımını mümkün kılan unsur, PPF'nin glial hücreler üzerindeki düzenleyici etkisidir.

Mevcut çalışmada PPF'nin sürdürülen antihiperaljezik etkisi, GFAP ve Iba-1 ekspresyonundaki azalmalarla birlikte, glial modülasyonun bu modeldeki PPF'nin analjezik etkisinin önemli bir bileşeni olduğu yorumunu desteklemektedir. Önceki çalışmalar da PPF'nin ağrı durumlarında glial ilişkili enflamatuar sinyallemeyi baskılayabileceğini öne sürmüştür^5,31. Ayrıca, TNF-α ve COX-2'deki paralel azalma, PPF'nin insizyonel ağrıyı kısmen glial ilişkili enflamatuar yanıtları sönümleyerek hafifletebileceğini göstermektedir. Bununla birlikte, mevcut veriler mekanistikten ziyade ilişkisel olduğu için, bu bulgular doğrudan bir nedensel yolun kanıtı olarak değil, glial katılımın destekleyicisi olarak yorumlanmalıdır.

Önemli bir hücre içi sinyal düzenleyici kinaz çifti olan ERK1/2'nin, farklı ağrı süreçlerinin gelişiminde ve sürdürülmesinde (beyin ve omurilikte nöronal uyarılabilirliği ve sinaptik plastisiteyi aracılık ederek) rol oynadığı kanıtlanmıştır²¹. Örneğin, bir çalışma, kapsaisin veya formalin enjeksiyonunun omurilikte p-ERK1/2'de kısa ve hızlı bir artışa neden olduğunu, ancak tam Freund adjuvanı veya arı zehri enjeksiyonunu (kısa bir gecikme süresinden sonra) takiben spinal ERK1/2 aktivasyonunun çok daha uzun sürdüğünü göstermiştir^38,39. Buna karşılık, başka bir çalışmada sinir hasarının tetiklediği spinal ERK1/2 aktivasyonu oldukça erken zirveye ulaşmış ve bir süre boyunca devam etmiş, hiperaljezi ise p-ERK1/2 zirvesinden sonra gelişmiştir³⁵. Bu nedenle, ERK1/2 fosforilasyonu farklı ağrı süreçlerinin farklı aşamalarında meydana gelebilir ve omurilikte artan p-ERK1/2, hem anlık indüksiyon hem de uzun süreli gen yanıtı için önemli olabilir.

Mevcut çalışmada, insizyonla tetiklenen ERK1/2 fosforilasyonu, kontrol grubuyla karşılaştırıldığında insizyondan sonraki ilk 24 saatte anlamlı şekilde artmış ve p-ERK1/2 ekspresyonu insizyondan 4 saat sonra zirveye ulaşmıştır (daha önce açıklandığı üzere)²⁴; bu durum NeuN ekspresyonunun en yüksek olduğu zaman noktasıyla örtüşmektedir. Eş zamanlı olarak, immunofloresans sonuçlarının ortaya koyduğu üzere, insizyonla tetiklenen ERK1/2 fosforilasyonu ipsilateral spinal kord dorsal boynuzundaki nöronlarda, astrositlerde ve mikroglialarda aynı anda dağılım göstermiştir; bu durum ERK1/2 ile ilişkili sinyalizasyonun, insizyonel hiperaljezinin erken evresi için özellikle ilgili olduğu görüşünü desteklemektedir. Ayrıca, preoperatif intratekal U0126 uygulaması insizyondan 4 saat sonra spinal glial belirteçlerin, NeuN ve p-ERK1/2 ekspresyonunu azaltmış; insizyon sonrası erken dönemde hem mekanik hem de termal hiperaljeziyi hafifletmiştir; bu durum spinal p-ERK1/2'nin insizyon sonrası akut hiperaljezinin erken aşamasında rol oynayabileceğini göstermektedir. Bununla birlikte, GFAP, Iba-1, p-ERK1/2 ve davranışsal sonuçlar farklı zamansal profiller gösterdiği için, mevcut mekanistik yorum tüm postoperatif döneme genelleyilmemeli, aksine 4. saat zaman noktasıyla temsil edilen erken insizyon sonrası aşamayla sınırlı tutulmalıdır.

Ayrıca, mevcut çalışmada, preoperatif intratekal PPF uygulaması insizyondan 4 saat sonra ERK1/2 fosforilasyonunu da azaltmıştır; bu durum, spinal NeuN, GFAP ve Iba-1 ekspresyonunda gözlenen değişikliklerin en azından kısmen ERK1/2 ile ilişkili sinyalizasyonla bağlantılı olabileceğini düşündürmektedir. Preoperatif intratekal U0126 uygulaması da TNF-α ve COX-2 immünoreaktivitesini azaltarak, insizyon sonrası ERK1/2 fosforilasyonu ile inflamatuar mediyatör ekspresyonu arasındaki olası bir ilişkiyi desteklemiştir. Şekil 9'da gösterilen ek in vitro astrosit deneyleri, hücresel düzeyde ERK1/2'ye bağımlı bir anti-inflamatuar bileşene destek sağlamıştır; çünkü kalıcı ERK1/2 aktivasyonu, PPF'nin TNF-α, PGE2 ve IL-6 salınımını azaltma yeteneğini zayıflatmıştır. Ancak, bu kurtarma deneyleri sağlam spinal kord yerine kültüre edilmiş astrositlerde gerçekleştirildiği ve in vivo kurtarma veya hücre tipi seçici manipülasyon yapılmadığı için, in vivo sonuçlar yine de nedensel bir ERK1/2 bağımlı mekanizmanın kesin kanıtı olarak değil, destekleyici olarak yorumlanmalıdır.

Glial hücre aktivasyonu, p-ERK1/2 ekspresyonu ve inflamatuar sitokin salınımı arasındaki olası ilişkileri daha ayrıntılı tartışmak için, immunofloresans ile gözlemlenen mekansal lokalizasyon paternleri değerlendirilmiştir. İnsizyon sonrası 4. saatte, spinal dorsal horn bölgesinde p-ERK1/2'nin GFAP-pozitif astrositler ve Iba-1-pozitif mikroglialar ile birlikte eksprese edildiği görülmüştür. Hem PPF'nin hem de U0126'nın p-ERK1/2, TNF-α ve COX-2 ekspresyonunun azalmasıyla ilişkili olduğunu gösteren Western blot ve immunofloresans bulgularıyla birleştirildiğinde, bu veriler spinal glial hücrelerdeki ERK1/2 fosforilasyonunun insizyon sonrası inflamatuar yanıtta rol oynayabileceğini düşündürmektedir. Primer astrositlerdeki in vitro veriler, PPF tedavisi, ERK1/2 baskılanması ve inflamatuar medyatör salınımı arasındaki doğrudan hücresel bağı daha fazla desteklemektedir. Bununla birlikte, in vivo kanıtlar ilişkiyi ve tedaviyle ilgili paralel değişimleri ortaya koyarken, hücresel deneyler in vivo hücre tipi spesifik nedensel doğrulamayı tamamlamakta ancak onun yerini tutmamaktadır. Immunofloresans analizinin sınırlı sayıda hayvan ve sahaya dayalı olması nedeniyle, bu gözlemler dikkatle ve Western blot ve in vitro bulgularla birlikte yorumlanmalıdır.

Çeşitli prosedürel adımların tekrarlanabilirlik üzerinde orantısız bir etkisi vardır. İntratekal enjeksiyon, hem karakteristik bir kuyruk yanıtı hem de beyin omurilik sıvısı onayı gerektirir; enjeksiyon sırasında dirençle karşılaşılması, onayın alınamaması veya yeni bir nörolojik defisit oluşması, aynı bölgeye yeniden enjeksiyon yapmak yerine deneğin dışlanmasını gerektirmelidir. Davranışsal testler; aklimatizasyona, kafes koşullarına, stimülüs yerleşimine ve araştırmacı beklentisine duyarlıdır; bu nedenle körleme, sabit aralıklar ve tutarlı çevresel koşullar esastır. Doku toplama zamanı, tekdüze protein transferi, antikor inkübasyonu ve her boyama serisindeki özdeş mikroskopi ayarları da aynı derecede önemlidir. Yaygın sorunlar arasında yetersiz aklimatizasyondan kaynaklanan değişken çekilme eşikleri, eksik transfer veya aşırı pozlama nedeniyle oluşan zayıf veya düzensiz Western blot bantları ve yetersiz yıkama, aşırı antikor konsantrasyonu veya doygun görüntüleme ayarlarından kaynaklanan yüksek floresan arka plan yer alır.

Protokol, bilimsel soruya göre modifiye edilebilir. Geç glial yanıtlar ilgi çekici olduğunda daha geniş bir zaman seyri kullanılabilir ve translasyonel fizibilite önceliklendirildiğinde doz aralığı çalışmaları veya alternatif uygulama yolları eklenebilir. İnflamatuar veya nöropatik ağrı modelleriyle karşılaştırıldığında, plantar insizyon modeli nispeten hızlı ve pratiktir ve tanımlanmış bir postoperatif yaralanmayı yeniden üretir²⁷. Davranışsal testlerin, Western blotting ve hücre ilişkili immünofloresansın kombinasyonu; birbirini tamamlayan fonksiyonel, moleküler ve mekansal bilgiler sağlar; ancak, tek uç noktalı bir analizden daha fazla kaynak gerektirir ve tek başına hücreye özgü nedenselliği kanıtlamaz. U0126 ile yapılan farmakolojik karşılaştırma, yolak yorumlamasını güçlendirir ancak genetik veya hücre tipi seçici manipülasyondan daha az spesifik kalır^{20,21,22,23,24,25}.

Gelecekteki uygulamalar arasında her iki cinsiyetin test edilmesi, daha büyük cerrahi yaralanmalar, klinik olarak uygulanabilir dozajlama yolları, ek ameliyat sonrası zaman noktaları ve belirli glial popülasyonları hedefleyen müdahaleler yer almaktadır. İnsizyon modeli kısa sürdüğü, davranışsal sonlanım noktaları tekrarlanabilir olduğu ve moleküler analizlerde standart laboratuvar yöntemleri kullanıldığı için bu iş akışı, aday analjezik veya glial-modüle edici tedavilerin taranması açısından pratiktir. Buna rağmen tekrarlanabilirlik; önceden belirlenmiş dışlama kriterlerine, körleme yöntemiyle yapılan sonuç değerlendirmesine, tutarlı görüntüleme süreçlerine ve ham veriler ile analiz ayarlarının eksiksiz raporlanmasına bağlıdır.

Kısıtlamalar

Bu çalışmanın birkaç kısıtlılığı bulunmaktadır. İlk olarak, plantar paw insizyon modeli nispeten küçük bir cerrahi yaralanmayı temsil etmekte olup torakotomi veya laparotomi gibi daha büyük cerrahi işlemleri tam olarak yansıtmayabilir. Bu nedenle, mevcut bulguların diğer postoperatif ağrı türlerine genelletilmesinde dikkatli olunmalıdır. Ek olarak, çalışmaya yalnızca erkek Sprague–Dawley sıçanlar dahil edilmiş olup bu durum bulguların cinsiyetler arası genellenebilirliğini kısıtlamaktadır. Ağrı yanıtlarındaki, analjezik etkilerdeki ve glial aktivasyon modellerindeki bilinen cinsiyete dayalı farklılıklar göz önüne alındığında, dişi hayvanları da içeren ileri çalışmalara ihtiyaç vardır.

Temel moleküler ve histolojik gözlemler, insizyon sonrası 4. saat zaman noktasına odaklanmıştır. GFAP, Iba-1, p-ERK1/2 ve davranışsal sonuçlar dahil olmak üzere farklı son noktaların insizyon sonrası farklı zamansal profiller göstermesi nedeniyle, mevcut bulguların mekanistik yorumlaması temel olarak erken insizyon sonrası aşama ile sınırlandırılmalıdır. Ayrıca, buradaki moleküler deneyler nispeten sınırlı bir örneklem boyutuyla gerçekleştirilmiştir ve bu durum söz konusu gözlemlerin istatistiksel sağlamlığını potansiyel olarak azaltmaktadır.

Hücre dışı sinyal düzenleyici kinaz 1 ve 2, p-ERK1/2 olarak birlikte değerlendirilmiş; bireysel katkıları ayrı ayrı incelenmemiştir. Bu nedenle, ERK1 ve ERK2'nin insizyon kaynaklı ağrı işlemedeki ilgili rolleri mevcut çalışmada belirlenememiştir. Ayrıca, floresan yoğunluk nicelendirmesi sınırlı sayıda hayvan ve alana dayalıdır; stereolojik hücre sayımları veya resmi ko-lokalizasyon katsayılarını içermemektedir. Bu gözlemler, bu nedenle Western blot bulgularıyla birlikte dikkatle yorumlanmalıdır.

Son olarak, in vitro astrosit kurtarma deneyleri ERK1/2-bağımlı inflamatuar medyatör düzenlemesi için mekanistik destek sağlamış olsa da, insizyon sonrası yukarı akış düzenleyici olaylar ve sağlam spinal dokudaki aşağı akış olayları derinlemesine incelenmemiştir. in vitro kültür sistemi ayrıca spinal dorsal boynuzdaki nöronlar, astrositler, mikroglia ve sızan bağışıklık hücreleri arasındaki etkileşimleri tam olarak yeniden üretemez. Buna göre, mevcut çalışma ERK1/2 ile ilgili bir mekanizmayı desteklemekte ancak tam bir in vivo hücreye özgü nedensellik kurmamaktadır.

Sonuç

Mevcut çalışma, insizyonla tetiklenen spinal NeuN, GFAP ve Iba-1 ekspresyonundaki artışların, preoperatif intratekal PPF uygulaması ile hafifletildiğini göstermektedir. Bu etkiye, akut mekanik ve termal hiperaljezinin giderilmesinin yanı sıra, insizyon sonrası ERK1/2 fosforilasyonu ile TNF-α ve COX-2 ekspresyonundaki azalmalar eşlik etmiştir. Bununla birlikte, bu bulgular, PPF'nin antihiperaljezik etkisi ile spinal glial hücrelerdeki azalmış ERK1/2 fosforilasyonu (azalmış inflamatuar mediyatör ekspresyonu ile birlikte) arasındaki ilişkiyi desteklemektedir (kesin mekanistik kanıt sağlamaktan ziyade). PPF'nin antihiperaljezik etkisi insizyon sonrası gözlem süresi boyunca devam ederken, MEK1/2 inhibitörü U0126'nın etkisi temel olarak erken post-insizyonel dönemle sınırlı kalmıştır. Bu bulgular, ERK1/2 sinyallemesinin özellikle insizyonel ağrının erken gelişimi sırasında ilgili olabileceğini düşündürmektedir. PPF'nin daha uzun süreli etkisi, etki mekanizmasının yalnızca ERK1/2 inhibisyonunun ötesinde ek yolakları da içerebileceğine işaret etmektedir. Bu nedenle PPF, akut postoperatif ağrı yönetimini iyileştirmek için biyolojik bir hedeften ziyade potansiyel bir terapötik müdahale teşkil edebilir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
0,01 M PBS tamponu	Solarbio	P1020
1,0 M Tris-HCl tamponu (pH 6,8)	Solarbio	T1020
1,5 M Tris-HCl tamponu (pH 8,8)	Solarbio	T1010
%10 sodyum dodecil sülfat (SDS)	Solarbio	S1010
10× TBST stok çözeltisi	Solarbio	T1081
%30 akrilamid	Solarbio	A1010
4× protein yükleme tamponu	Solarbio	P1041
Adobe Photoshop	Adobe	—
Amonyum persülfat	Solarbio	A1030
Otomatik pul buz makinesi	Changshu Xueke	IMS-40
Sığır serum albümini (BSA)	Solarbio	A8020
Kriyostat CM150	Leica	CM150
Dijital pH metre	—	PHS-3C
Dimetil sülfoksit (DMSO)	Solarbio	D8371
Elektronik analitik terazi	Cany	—
Geliştirilmiş kemilüminesans (ECL) reaktifi	Solarbio	PE0010
Film	Kodak	—
Floresan mikroskobu DP71	Olympus	DP71
Dondurulmuş kesit gömme ortamı	Sakura	4583
Gel elektroforez düzeneği	BIO-RAD	—
Gliserol	Solarbio	IG0910
Glisin	Solarbio	G8200
Keçi anti-fare Alexa Fluor 594 sekonder antikoru	Proteintech	SA00013-3
Keçi anti-fare yaban turburperoksidaz konjuge sekonder antikor	ZSGB-BIO	ZB2305
Keçi anti-tavşan Alexa Fluor 488 sekonder antikoru	Proteintech	SA00013-2
Keçi anti-tavşan yaban turburperoksidaz konjuge sekonder antikor	ZSGB-BIO	ZB2301
Keçi serumu	Solarbio	SL038
GraphPad Prism	GraphPad Software	5
Yüksek hızlı soğutmalı santrifüj 3K15	Sigma	3K15
Yatay orbital çalkalayıcı TS-1000	Haimen Qilinbeier	TS-1000
ImageJ	National Institutes of Health	1.51j8
Metanol	Tianjin Guangfu	—
Fare anti-sıçan GAPDH primer antikoru	Proteintech	60004-1-Ig
Fare anti-sıçan p-ERK1/2 primer antikoru	CST	9101S
Na2HPO3	Tianjin Beichen Fangzheng	—
NaH2PO3	Tianjin Damao	—
Paraformaldehit	Biosharp	BL539A
Patoloji sınıfı mikroskop lamları	Shitai	—
Fenilmetilsülfonil florür (PMSF)	Beyotime	ST506
Plantar Test 37370	UGO BASILE	37370
Poliviniliden florür membran	Solarbio	—
Propentofilin (PPF)	Taosu	T19812
Tavşan anti-sıçan COX-2 primer antikoru	Abcam	Ab179800
Tavşan anti-sıçan GFAP primer antikoru	Proteintech	16825-1-AP
Tavşan anti-sıçan Iba-1 primer antikoru	Proteintech	10904-1-AP
Tavşan anti-sıçan NeuN primer antikoru	Abcam	Ab279297
Tavşan anti-sıçan t-ERK1/2 primer antikoru	Proteintech	11257-1-AP
Tavşan anti-sıçan TNF-α primer antikoru	Proteintech	29652-1-AP
RIPA liz tamponu	Solarbio	R0010
SDS	Solarbio	S8010
Yağsız süt tozu	Solarbio	D8340
SPSS	IBM	22
Tetrametiletilendiamin (TEMED)	Solarbio	T8090
Tris	Solarbio	T8060
Triton X-100	Solarbio	T8200
U0126-EtOH	Selleck	S1102
Ultra düşük sıcaklık dondurucu	Haier	—
Ultra düşük sıcaklık dondurucu	Sanyo	—
Ultrapure su saflaştırma sistemi	Heal Force	—
von Frey filamentleri	North Coast Medical	—