Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Araştırma makalesi

Propentofilin, Spinal Astrosit ve Mikroglialarda ERK1/2 Fosforilasyonunu Düzenleyerek İnsizyonel Hiperaljeziyi Giderir

32 görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/70927

⸱

14 Ağustos 2026

 ,  ,  , 
1Department of Anesthesiology, Zhang Ye People's Hospital Affiliated To Hexi University, 2Department of Stomatology, Zhangye Hospital of Traditional Chinese Medicine, 3Department of Anesthesiology, The Second Hospital & Clinical Medical School, Lanzhou University

Bu makalede

Özet

Bu çalışma, intratekal olarak uygulanan propentofylline'in insizyonel hiperaljeziyi hafifletme üzerindeki etkisini ve bu etkinin sıçanlardaki spinal glial belirteçlerdeki değişimler ile ekstrasellüler sinyal düzenleyici kinaz 1 ve 2'nin fosforilasyonu ile ilişkili olup olmadığını araştırmaktadır.

Özet

Omurilik astrositleri, mikroglia ve ekstrasellüler sinyal düzenleyici kinaz 1 ve 2 (ERK1/2)'nin ağrı işlemede rol oynadığı bilinmektedir. Bu çalışma, preoperatif intratekal propentofylline (PPF) uygulamasının sıçanlarda akut insizyonel hiperaljeziyi azaltıp azaltmadığını ve bu etkinin spinal glial markerlar ile ERK1/2 fosforilasyonu ile ilişkili olup olmadığını araştırmıştır. Altmış altı erkek Sprague–Dawley sıçanı; boş, insizyonel ağrı, normal salin, dimetil sülfoksit, PPF ve U0126 gruplarına rastgele atanmıştır. Mekanik ve termal hiperaljezi, başlangıçta ve insizyondan sonraki 2, 4, 8, 24 ve 72. saatlerde değerlendirilmiştir. Spinal nöronal ve glial markerlar, p-ERK1/2 ve inflamatuar mediyatörler, Western blotting ve immünofloresan yöntemiyle analiz edilmiştir. Ayrıca, ERK1/2'ye bağımlı inflamatuar mediyatör salınımını incelemek için primer spinal astrosit deneyleri kullanılmıştır. Preoperatif intratekal PPF, 72 saatlik gözlem süresi boyunca mekanik ve termal hiperalgeziyi azaltırken, U0126 hiperalgeziyi temel olarak insizyon sonrası erken dönemde azaltmıştır. İnsizyondan 4 saat sonra, her iki tedavinin de spinal GFAP, Iba-1 ve p-ERK1/2 ekspresyonunda azalma ile TNF-α ve COX-2 immünoreaktivitesinde azalma ile ilişkili olduğu görülmüştür. Kültürlenmiş astrositlerde PPF, LPS ile indüklenen inflamatuar mediyatör salınımını azaltmış, ancak konstitütif olarak aktif ERK1/2 bu etkiyi hafifletmiştir. Bu bulgular, PPF'nin antihiperaljezik etkisi ile insizyon sonrası spinal glial, ERK1/2 ile ilişkili ve inflamatuar yanıtların modülasyonu arasındaki bağlantıyı desteklemektedir.

Giriş

Cerrahi prosedürleri takiben gelişen yaygın bir akut ağrı türü olan insizyonel ağrı, genellikle 7 günden daha uzun sürmez; ancak inflamatuar ve nöropatik ağrılardan farklı, karmaşık patolojik mekanizmalara sahiptir1,2. Eğer insizyonel ağrı gelişme sürecinde yetersiz kontrol edilirse, kronik ağrı sendromuna doğru ilerleyebilir ve doğası akut doku yaralanması ağrısından nöropatik veya karma ağrıya dönüşebilir3. Genel olarak, opioidler ve steroid olmayan anti-inflamatuar ilaçlar gibi analjeziklerin uygulanması, insizyon sonrası en yaygın analjezi yöntemidir. Bununla birlikte, bu ilaçların sürekli veya yüksek dozda kullanımı birçok yan etkiye yol açabilmektedir; bu durum, daha güvenli ve etkili analjezik stratejilere duyulan ihtiyacı vurgulamaktadır.

Güvenilir kanıtlar, propentofylline'in (PPF) farklı ağrı süreçlerinde hiperaljeziyi giderdiğini göstermektedir4,5. Ayrıca, PPF'nin analjezik etkisi, p38 ve c-Jun N-terminal kinazlar (JNKs) gibi mitojenle aktive olan protein kinazların (MAPKs) spinal ekspresyonunun inhibe edilmesiyle kısmen sağlanabilmektedir6. PPF'nin p38 ve JNK yolakları üzerindeki etkileri belirlenmiş olsa da, ağrı sinyalizasyonunda rol oynayan bir diğer kritik MAPK alt ailesi olan hücre dışı sinyal düzenleyici kinaz 1 ve 2 (ERK1/2) yolağını modüle etme potansiyeli, akut insizyonel ağrıda henüz araştırılmamıştır. ERK1/2 aktivasyonunun p38 ve JNK'ye kıyasla belirgin zamansal ve hücresel paternler sergilediği göz önüne alındığında, bu bilgi boşluğu potansiyel olarak benzersiz terapötik fırsatlar sunması nedeniyle özellikle önemlidir.

Astrositler, mikroglialar ve oligodendrositler dahil olmak üzere glial hücrelerin, başlangıçta sinir dokusunun bağlayıcı ve destekleyici yapısı olduğu düşünülüyordu. Ancak son çalışmalar, astrositlerin ve mikrogliaların sinaptik plastisiteyi düzenlemede ve ağrı bilgisini iletmede önemli bir rol oynadığını göstermiştir7. Beyin ve omuriliğin yerleşik makrofajları olan mikroglialar, ağrı sürecinin çok erken aşamasında çeşitli hücre dışı uyarıcı sinyallerle aktive olabilir ve ardından proliferasyon göstererek yüksek miktarlarda inflamatuar sitokin salgılayabilirler; bu durum, ağrı sinyallerinin omurilikten beyne iletimini artırır8,9. Eş zamanlı olarak, aktive olmuş astrositler eksitatör nörotransmitter glutamat salınımını yukarı yönlü düzenleyebilir ve hücreler arası iletişimi güçlendirerek bilgiyi doğrudan duyusal nöronlara gönderebilir10.

Çalışmalar, insizyon kaynaklı ağrının erken aşamasında (ilk 24 saat içinde) astrosit aktivasyonunun gerçekleştiğini, mikroglial aktivasyonun ise çok daha geç ortaya çıktığını göstermiştir11,12. Ayrıca, bir çalışma, aktive olmuş mikrogliaların insizyon kaynaklı ağrıda mekanik hiperaljezi üzerinde sınırlı bir etkiye sahip olduğunu belirtmiştir13. Bu bulgular, akut ağrıda astrositlerin ve mikrogliaların farklı rolleri hakkındaki süregelen soruları vurgulamaktadır. Glial modüle edici bir ajan olan propentofylline'in, kronik sinir sıkıştırma yaralanması, akut sinir yaralanması ve akut doku yaralanması sonrası astrosit ve mikroglial aktivasyonunu düzenleyerek hiperalgeziyi hafiflettiği bildirilmiştir4,5. Ancak, mevcut bilgiler dahilinde, hiçbir çalışma PPF'nin akut insizyon kaynaklı ağrıda astrosit veya mikroglial aktivasyon üzerindeki etkilerini incelememiştir.

Mitogenle aktive olan protein kinaz 1 ve 2'nin (MEK1/2) aşağı akışında aktive olan temel bir MAPK alt ailesi olan hücre dışı sinyal düzenleyici kinaz 1 ve 2'nin, nosiseptif süreçlerde ve nöronal plastisitede yaygın olarak rol oynadığı bildirilmiştir14,15. Önceki çalışmalar, fosfo-ERK1/2'nin (p-ERK1/2) spinal nöronlarda nosiseptif stimülasyonla indüklenebileceğini ve ayrıca enflamatuar veya nöropatik ağrı durumlarında astrositler ile mikroglialarda saptanabileceğini göstermiştir16,17,18,19. Ek olarak, MEK1/2–ERK1/2 sinyal yolunun farmakolojik inhibisyonunun çeşitli ağrı modellerinde mekanik ve termal hiperaljeziyi azalttığı rapor edilmiştir20,21,22,23,24,25.

Buna rağmen, akut bir insizyon tarafından aktive edilen spinal ERK1/2'nin, özellikle astrosit ve mikroglialardaki hücresel dağılımı ve insizyon kaynaklı ağrıdaki rolü yetersizle tanımlanmış durumdadır. Araştırma grubunun önceki çalışmaları, PPF'nin spinal JNK ve p38 sinyalini azaltarak sıçanlarda akut insizyonel hiperaljeziyi hafiflettiğini göstermektedir; ancak PPF'nin insizyon kaynaklı ağrı sırasında spinal glial hücrelerde ERK1/2 ile ilişkili sinyalleri de modüle edip etmediği belirsizliğini korumaktadır. Bu nedenle, mevcut çalışma tamamen bağımsız bir mekanistik paradigmadan ziyade, ağrı araştırmalarındaki mevcut glial ve MAPK çerçevelerinin bir uzantısı olarak değerlendirilmelidir. Bu çalışmanın önceki çalışmalardan temel farkı; spesifik olarak akut insizyonel ağrıya odaklanması, ilgilenilen MAPK bileşeni olarak p38/JNK yerine ERK1/2'yi incelemesi ve PPF tedavisi ile ilişkili olarak p-ERK1/2'nin erken spinal hücresel dağılımını değerlendirmesidir.

Bu çalışma, ameliyat öncesi intratekal olarak uygulanan PPF'nin, sıçan plantar insizyon modelinde insizyonel hiperaljeziyi hafifletip hafifletmediğini ve bu etkinin ERK1/2 fosforilasyonuyla veya spinal nöronal ve glial belirteçlerin ile inflamatuar mediyatörler olan tümör nekroz faktör-α (TNF-α) ve siklooksijenaz-2 (COX-2) ekspresyonundaki değişikliklerle ilişkili olup olmadığını araştırmak için tasarlanmıştır. Daha spesifik olarak bu çalışma, davranışsal değerlendirmeyi zamansal Western blot analiziyle birleştirmesi; MEK1/2 inhibitörü U0126 ile yaptığı farmakolojik karşılaştırma ve akut insizyonel ağrı modelinde p-ERK1/2'nin spinal nöronlar, astrositler ve mikroglialarda kalitatif immünofloresan lokalizasyonunu belirlemesiyle önceki raporlardan ayrılmaktadır. Mekanistik çerçevesi, glial modülasyon ve MAPK sinyallemesini ağrı ile ilişkilendiren önceki literatür üzerine kurulmuş olsa da, mevcut çalışma, insizyonel hiperaljezinin erken evresinde spinal ERK1/2 ile ilişkili glial yanıtların olası katılımına dair ek kanıtlar sağlamayı amaçlamaktadır.

Konvansiyonel postoperatif analjeziklerle karşılaştırıldığında, yol hedefli yaklaşımlar tanımlanmış bir sinyalizasyon bileşenini test edebilir ancak yalnızca sınırlı süreli fayda sağlayabilir ve invaziv uygulama gerektirebilir; MEK1/2–ERK1/2 inhibisyonu, çeşitli deneysel ağrı modellerinde antihiperaljezik etkiler göstermiştir20,21,22,23,24,25. PPF, glial yanıtları modüle etmesi ve birden fazla MAPK ile ilişkili süreçle bağlantılı olması nedeniyle tek yollu bir inhibitörden farklıdır4,5,6. Pratik translasyon; preklinik tasarım, preoperatif intratekal uygulama, yalnızca erkek sıçanların kullanılması ve daha büyük cerrahi modellerde doz aralığı ve güvenlik çalışmalarının eksikliği nedeniyle sınırlı kalmaktadır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Yürütülen deneyler, Çin, Gansu Eyaleti'ndeki Lanzhou Üniversitesi İkinci Bağlı Hastanesi Etik Kurulu tarafından onaylanmıştır (etik onay no. 2017-070). Tüm prosedürler, Uluslararası Ağ Çalışmaları Derneği kılavuzlarına uygun olarak gerçekleştirilmiştir26. Akredite bir laboratuvar hayvan merkezi'nden temin edilen ve 200–250 g ağırlığında olan toplam 66 yetişkin erkek Sprague–Dawley sıçanı kullanılmıştır. Cinsiyete bağlı hormonal etkilerle ilgili potansiyel değişkenliği azaltmak amacıyla çalışmaya yalnızca erkek sıçanlar dahil edilmiştir. Tüm protokoller, Uluslararası Ağ Çalışmaları Derneği kılavuzlarına26 uygun olarak yürütülmüş ve acıyı en aza indirmek için gerekli önlemler alınmıştır. Bu çalışmada kullanılan reaktifler, sarf malzemeleri, cihazlar ve yazılımlar hakkında ayrıntılı bilgiler Materyaller Tablosu'nda sunulmuştur.

Hayvanlar

Sıçanlar operasyon öncesinde çiftler halinde, insizyon sonrası ise yiyecek ve suya ad libitum erişim sağlanarak bireysel olarak barındırılmıştır. Oda, 12 saat ışık–12 saat karanlık döngüsünde ve 24 °C ± 2 °C sıcaklık kontrolünde tutulmuştur.

İntratekal enjeksiyon ve insizyonel ağrı modeli

Çözeltilerin intratekal uygulaması için sıçanlar %1,5–3 sevoflurane (burun konisi aracılığıyla verildi) ile anestezi altına alınmış ve vertebral kolon fleksiyona getirilerek pron pozisyona yerleştirilmiştir. Lomber bölgedeki tüyler tıraşlanmış ve L5–L6 intervertebral boşluk üzerindeki deri dezenfekte edilmiştir. L5–L6 intervertebral boşluktan perkütan olarak bir mikrosiringe yerleştirilmiştir. Subaraknoid boşluğa başarılı giriş, iğne ilerlemesi sırasında meydana gelen ani bir kuyruk sıçraması veya kuyruk hareketi ile belirtilmiş ve hafif aspirasyonla beyin omurilik sıvısının görülmesiyle ayrıca doğrulanmıştır. Bu belirtiler gözlemlenmediğinde, enjeksiyondan önce iğne pozisyonu ayarlanmıştır. Enjeksiyon, ancak her iki doğrulama kriteri de karşılandıktan sonra gerçekleştirilmiş ve enjeksiyon sonrası anormal nörolojik belirtiler gösteren hayvanlar çalışma dışı bırakılmıştır. Ardından ilgili çözelti yavaşça enjekte edilmiş ve enjeksiyondan sonra deri tekrar temizlenmiştir. Cerrahi işlem yaklaşık 3 dk sürmüş ve sıçanlar genellikle 5–10 dk içinde anesteziden çıkmıştır.

İnsizyonel ağrının sıçan modeli, daha önce tarif edildiği şekilde kurulmuştur27. Anestezinin ardından, arka patinin plantar yüzeyi %10 povidon-iyot ile dezenfekte edildi. Plantar deride, topuktan yaklaşık 0,5 cm mesafeden başlayıp ayak parmaklarına doğru uzanan 1 cm'lik boylamsı bir insizyon yapıldı. İnsizyon, deri ve fasyayı geçti. Plantar kas, oftalmik pens ile nazikçe kaldırıldı ve genel doku sürekliliği korunarak boylamsı olarak kesildi. Ardından kas tekrar konumlandırıldı, hemostaz sağlamak için hafif baskı uygulandı ve yara, 3-0 naylon kullanılarak iki matris sütür ile kapatıldı. Yara kapatıldıktan sonra insizyon bölgesi tekrar dezenfekte edildi. Cerrahi işlem sonrası sıçanlar tek tek barındırıldı ve güçlü ışıktan korunmuş, sessiz ve sıcak bir ortamda, yiyecek ve suya serbest erişimi olacak şekilde iyileşmeye bırakıldı. Hayvanlar ameliyat sonrası izlendi ve önceden tanımlanmış kriterleri karşılamayanlar derhal çıkarıldı. Yara enfeksiyonu; yara çevresinde kızarıklık, şişlik ve yerel sıcaklık artışı, kötü kokulu anormal sarı-yeşil pürülan eksuda, kalıcı yara açıklığı ile gecikmiş yara iyileşmesi, nekroz ve büyüme ile birlikte vücut sıcaklığının yükselmesi, letarji ve beslenme reddi gibi sistemik belirtilere göre belirlendi. Ek dışlama kriterleri arasında 30 dakika içinde anesteziden uyanamama, intraoperatif kas transversiyonu veya nörovasküler yaralanma, postoperatif self-mutilasyon, modelin başarısız kurulması ve arka ekstremite paralizisi veya insizyonel ağrı ile ilgisi olmayan ağırlık taşıyamama gibi nörolojik defisitler yer aldı. Yara enfeksiyonu veya dehissansı olan sıçanlar çalışmadan çıkarıldı.

Davranışsal ölçüm

Pati çekme mekanik eşiği (PWMT) ve pati çekme termal gecikmesi (PWTL), grup tahsisinden habersiz bir araştırmacı tarafından ölçülmüştür. Testler, en az 10 dakikalık aklimatizasyon sonrası, günün sabit bir saatinde sessiz bir odada gerçekleştirilmiştir; bölme, tel veya cam zemin, ortam ışığı ve ısı kaynağı yoğunluğu gruplar arasında sabit tutulmuştur. PWMT testi için, kalibre edilmiş von Frey filamentleri (0.4 g, 0.6 g, 1.0 g, 1.4 g, 2.0 g, 4.0 g, 6.0 g, 8.0 g, 10.0 g ve 15.0 g), filament yaklaşık 1–2 mm bükülene kadar yaranın bitişiğindeki plantar yüzeye dik olarak uygulanmıştır. Ardışık stimülasyonlar 2 dakika arayla yapılmış ve %50 PWMT, yukarı-aşağı yöntemi kullanılarak belirlenmiştir28. PWTL testi için sıçanlar, cam zemin üzerindeki bireysel şeffaf bölmelere yerleştirilmiş ve radyant ısı kaynağı yaranın yanındaki plantar yüzeyle hizalanmıştır. Doku hasarını önlemek için 30 saniyelik bir kesme süresi (cut-off) uygulanmış, ardışık maruziyetler 2 dakika arayla yapılmış ve üç ölçümün ortalaması kaydedilmiştir29. Patinin kaldırılması, sallanması veya yalanması pozitif bir çekilme yanıtı olarak kabul edilmiştir; kişisel bakım, lokomosyon veya ısı kaynağı hizalamasının kaybından etkilenen denemeler, yeniden aklimatizasyon sonrası tekrarlanmıştır.

Western blot analizi

Önceden belirlenen zamanlarda, sıçanlar servikal dislokasyon ile sakrifiye edildi ve L4–L6 lomber spinal kord, 100:1 oranında proteaz inhibitörü eklenmiş radyoimmünopresipitasyon analiz lizis tamponuna hızla alındı. Doku homojenize edildi, 20 dk boyunca buz üzerinde bekletildi ve 4 °C'de 20 dk boyunca 15,000 × g hızında santrifüj edildi. Süpernatant 3:1 oranında 4× yükleme tamponu ile karıştırıldı, kaynayan suda 5 dk ısıtıldı ve −80 °C'de saklandı. Protein örnekleri (her şerit için 30 µg), %10 sodyum dodesil sülfat–poliakrilamid jellerinde ayrıldı ve 0,45 veya 0,22 µm poliviniliden florür membranlara aktarıldı. Başarılı aktarım, önceden boyanmış moleküler ağırlık markerının beklenen göçünün doğrulanması ve belirgin düzensiz veya kesintili aktarım bölgelerinin olmamasıyla kontrol edildi. Membranlar, oda sıcaklığında 2 saat boyunca %5 yağsız süt ve %3 sığır serum albümini ile bloke edildi ve NeuN (1:8.000), GFAP (1:4.000), Iba-1 (1:3.000), p-ERK1/2 (1:1.000), t-ERK1/2 (1:3.000) veya GAPDH (1:2.000) karşıtı primer antikorlarla 4 °C'de gece boyunca inkübe edildi. %0,05 Tween 20 (pH 7,4) içeren Tris-tamponlu salin ile yıkandıktan sonra, membranlar karşılık gelen yaban turba horseradish peroksidaz-konjuge ikincil antikor (1:5.000) ile oda sıcaklığında 1 saat boyunca inkübe edildi. Sinyaller geliştirilmiş kemilüminesans ile geliştirildi ve her hedef için aynı pozlama aralığı kullanılarak filme kaydedildi. Grup tahsisine kör olan bir araştırmacı, bant yoğunluğunu görüntü analiz yazılımı ile analiz etti. Görüntüler 8-bit gri tonlamaya dönüştürüldü, her banda özdeş bir dikdörtgen ilgi alanı uygulandı, komşu boş bir bölgeden yerel arka plan çıkarıldı ve entegre yoğunluk kaydedildi. Bir blot üzerindeki tüm şeritler için aynı bölge boyutu ve arka plan prosedürü kullanıldı. NeuN, GFAP, Iba-1 ve t-ERK1/2 GAPDH'ye göre normalize edildi; p-ERK1/2 t-ERK1/2'ye göre normalize edildi ve değerler daha sonra boş gruba göre göreceli olarak ifade edildi.

İmmünofloresan

Belirlenen zamanlarda, sıçanlara %3 pentobarbital sodyum (1,5 mL/kg) ile anestezi uygulanmış ve kalp yoluyla 300 mL önceden soğutulmuş 0,01 mol/L fosfat tamponlu salin (PBS; pH 7,4), ardından 250 mL önceden soğutulmuş %4 paraformaldehit ile perfüzyon yapılmıştır. L4–L6 omurilik bölgesi %4 paraformaldehit ile 6 saat boyunca post-fikse edilmiş, 4 °C'de %20–30 sakkaroz-PBS içinde gece boyunca kriyokoruklanmış ve −22 °C'de 10 µm kalınlığında kesitlere ayrılmıştır. Kesitler 0,01 mol/L PBS ile yıkanmış, oda sıcaklığında 1 saat boyunca %10 keçi serumu ile bloke edilmiş ve NeuN (1:100), GFAP (1:1.000), Iba-1 (1:100), p-ERK1/2 (1:100), TNF-α (1:200) veya COX-2 (1:50) karşıtı primer antikorlar ile 4 °C'de gece boyunca inkübe edilmiştir. Üç kez PBS ile yıkandıktan sonra, kesitler oda sıcaklığında 1 saat boyunca ilgili yeşil veya kırmızı florofor konjuge ikincil antikor (1:400) ile inkübe edilmiş, üç kez daha PBS ile yıkanmış ve antifade ortamı ile lam kapatılmıştır. Her boyama grubuna, primer antikor olmadan hazırlanan negatif kontrol kesitleri dahil edilmiştir. Görüntüler, körleme yöntemi kullanan bir araştırmacı tarafından floresan mikroskobu ile elde edilmiştir. Düşük büyütmeli genel görüntüler 10× objektif kullanılarak, hücresel immünoreaktivite ve ko-lokalizasyon görüntüleri ise ilgili şekil paneline göre 20× veya 40× objektifler kullanılarak alınmıştır. Aynı şekil ve boyama grubu içindeki karşılaştırmalar için objektif büyütmesi, aydınlatma şiddeti, pozlama süresi, detektör kazancı, kamera ayarları ve görüntü işleme parametreleri, doygunluk altı optimizasyondan sonra sabitlenmiştir. Kanal örtüşmesini minimize etmek için ayrı floresan kanalları ardışık olarak alınmıştır. Her hayvan için ipsilateral dorsal horn bölgesinden üç adet örtüşmeyen alan görüntülenmiştir. Floresan yoğunluğu, 8-bit dönüşümü, hücre içermeyen bir bölge kullanılarak arka plan çıkarımı ve her boyama grubu içinde özdeş bir ilgi alanı (ROI) ve eşik değerinin uygulanmasının ardından görüntü analiz yazılımı ile kantifiye edilmiş; hayvan başına tek bir değer elde etmek için alan değerlerinin ortalaması alınmıştır. Aşırı pozlama, doku katlanması, yırtılma, yetersiz odaklama veya düzensiz arka plan içeren alanlar hariç tutulmuş ve aynı doygunluk karşıtı ayarlarda yeniden görüntülenmiştir. Doku mimarisinin sağlam olduğu, hedef sinyalin primer antikorsuz kontrolden daha yüksek olduğu ve analizi etkileyen majör katlanma, yırtılma veya doygun bölge bulunmadığı durumlarda boyama kabul edilmiştir.

In vitro primer spinal astrosit deneyleri

Primer sıçan spinal astrositleri, nemlendirilmiş %5 CO2 inkübatöründe, 37 °C'de, komple kültür ortamında standart steril koşullar altında kültüre edilmiştir. Hücreler yaklaşık %70–80 konfluansa ulaştıklarında kullanılmış ve kontrol, LPS-stimüle, LPS + PPF, LPS + U0126 ve ERK1/2 rescue gruplarına atanmıştır. PPF ve U0126, 10 µM konsantrasyonunda eklenmiştir. LPS stimülasyonu, ilaç tedavisi ve toplama koşulları, her deneydeki paralel kuyucuklar arasında aynı tutulmuştur. Yolak seçiciliği analizi için hücre lizatları; p-ERK1/2, t-ERK1/2, p-p38, total p38, p-JNK, total JNK ve ilgili yükleme kontrolünün Western blotting analizleri için toplanmıştır. Paralel kuyucuklardan alınan kültür süpernatantları toplanmış, santrifüj ile berraklaştırılmış ve üretici talimatlarına uygun olarak enzyme-linked immunosorbent assay kullanılarak TNF-α, PGE2 ve IL-6 açısından analiz edilmiştir. Western blot densitometrisi, yukarıda açıklanan görüntü analiz prensipleri ile gerçekleştirilmiştir. Rescue deneyleri için endojen ERK1/2, siRNA transfeksiyonu ile baskılanmış ve tedaviden önce konstitütif aktif bir ERK1/2 (CA-ERK1/2) ekspresyon konstrüktü hücrelere aktarılmıştır. Sitokin verileri yorumlanmadan önce, knockdown ve overexpression verimliliği Western blotting ile doğrulanmıştır. Aktif siRNA veya konstrükt olmaksızın transfeksiyon reaktifine maruz kalan hücreler, uygun olduğunda prosedürel kontroller olarak kullanılmıştır.

Deneysel tasarım

Deney hayvanlarının alt gruplara ayrılması

Sıçanlar, rastgele sayı tablosu yöntemi kullanılarak altı gruba ayrılmış ve grup atamaları davranışsal testler ile doku toplama işleminden önce tamamlanmıştır. Altı grup; boş grup (n = 6), insizyonel ağrı (IP) grubu (n = 18), normal salin (NS) grubu (0,9% NS, 10 µL; n = 9), PPF grubu (10 µL içinde 10 µg; n = 12), dimetil sülfoksit (DMSO) grubu (10% DMSO, 10 µL; n = 9) ve U0126 grubu (10 µL içinde 10 µg; n = 12) şeklinde oluşturulmuştur. Boş gruptaki sıçanlara plantar insizyon veya intratekal enjeksiyon uygulanmamış ve bu grup tedavi edilmemiş kontroller olarak kullanılmıştır. IP grubundaki sıçanlara, intratekal enjeksiyonla ön tedavi uygulanmadan plantar insizyon yapılmıştır. NS, PPF, DMSO ve U0126 gruplarındaki sıçanlara, plantar insizyondan 30 dk önce ilgili ajanların intratekal uygulaması yapılmıştır. NS grubu PPF için taşıyıcı kontrol, DMSO grubu ise U0126 için taşıyıcı kontrol olarak kullanılmıştır.

Propentofyllin ve U0126 dozları

Propentofylline bir glial modülatördür ve araştırma grubunun önceki çalışmalarında akut hiperaljeziyi giderdiği için 10 µg'lık bir doz seçilmiştir. U0126, ERK1/2 fosforilasyonunu engellemek için kullanılan, adenozin trifosfatla rekabet etmeyen bir MEK1/2 inhibitörüdür. Ağrı modellerinde 1–10 µg arasındaki intratekal dozların etkili olduğu bildirilmiştir30,31,32; mevcut çalışmada 10 µg'lık doz kullanılmıştır. U0126 %10 dimetil sülfoksitte, PPF ise %0,9 normal salinde çözülmüştür. Final konsantrasyonlar 1 µg/µL olarak belirlenmiştir. İlaçlar ve taşıyıcılar cerrahi işlemden önce hazırlanmış, 4 °C'de muhafaza edilmiş ve 12 saat içinde kullanılmıştır.

Propentofylline veya U0126'nın preoperatif intratekal uygulamasının hiperaljezi üzerindeki etkisi

Davranışsal ölçüm için her gruptan altı sıçan, operasyondan 24 saat önce rastgele seçildi ve elde edilen PWMT ve PWTL değerleri bazal değerler olarak belirlendi. İntratekal enjeksiyonlar operasyondan 30 dakika önce uygulandı. PPF ve U0126'nın ameliyat öncesi intratekal uygulamasının mekanik ve termal hiperaljezi üzerindeki etkilerini değerlendirmek için, insizyondan sonra 2 sa, 4 sa, 8 sa, 24 sa ve 72 sa'da PWMT ve PWTL değerlendirmeleri yapıldı.

İnsizyon sonrası spinal nöronal ve glial marker ekspresyonu üzerine preoperatif intratekal propentofylline veya U0126 etkilerini değerlendirmek için deneysel tasarım

Tedavi etkisinin değerlendirilmesi için uygun insizyon sonrası zaman noktasını belirlemek amacıyla, öncelikle IP grubunda ön bir zaman seyri analizi gerçekleştirilmiştir. Spesifik olarak, IP grubundaki sıçanlar insizyondan 2 sa, 4 sa, 24 sa ve 72 sa sonra ötanize edilmiş ve omurilikteki NeuN, GFAP ve Iba-1 hücre belirteçlerinin ekspresyon seviyeleri Western blot ile ölçülmüştür (n = her zaman noktası için 3). Bu ön analize dayanarak, NeuN ekspresyonunun 4. saatte en yüksek seviyeye ulaşması ve erken moleküler değişikliklerin insizyonel hiperaljezinin başlangıç gelişimiyle en ilgili olduğu düşünülmesinden dolayı, insizyondan sonraki ilk 4 sa erken bir insizyon sonrası gözlem penceresi olarak seçilmiştir. Bununla birlikte, 4 saatlik zaman noktasının insizyon sonrası tüm zamansal moleküler değişiklikleri temsil etmesi amaçlanmamıştır.

Seçilen bu zaman noktasında, intratekal enjeksiyon yapılan sıçanlar, farklı hücre belirteçlerinin Western blot analizi (n = 3 grup başına) ve farklı hücre tiplerinin morfolojisinin immünofloresan değerlendirmesi (n = 3 grup başına) için ötanize edildi. Boş gruptaki sıçanlar, omurilikteki farklı hücre belirteçlerinin (NeuN, GFAP ve Iba-1) temel ekspresyon seviyelerini Western blot ile belirlemek (n = 3) ve farklı hücrelerin (nöronlar, astrositler ve mikroglia) morfolojisini immünofloresan ile değerlendirmek (n = 3) için rastgele sonlandırıldı. Böylece boş grup, insizyon yapılmamış ve tedavi uygulanmamış bazal kontrol grubu olarak hizmet etti.

Tedavi etkilerinin spinal p-ERK1/2 ve enflamatuar mediyatörler üzerindeki etkileri

p-ERK1/2 ekspresyonu ve inflamatuar sitokin seviyeleri üzerindeki tedavi etkilerini değerlendirmek için uygun insizyon sonrası zaman noktasını belirlemek amacıyla, öncelikle IP grubunda öncül bir zaman seyri analizi gerçekleştirilmiştir. Spesifik olarak, IP grubundaki sıçanlar insizyondan 2 sa, 4 sa, 24 sa ve 72 sa sonra ötanize edilmiş ve spinal p-ERK1/2 ekspresyonu Western blot ile ölçülmüştür (n = her zaman noktası için 3). Bu zaman seyri deneyine ve insizyon sonrası NeuN ekspresyonunun en yüksek olduğu zaman noktasına dayanarak, preoperatif intratekal olarak uygulanan PPF veya U0126'nın spinal p-ERK1/2 ekspresyonu ve inflamatuar sitokinler üzerindeki etkilerinin sonraki değerlendirmeleri için insizyondan 4 sa sonrası sabit zaman noktası olarak seçilmiştir. Bu zaman noktası, insizyon sonrası tüm zamansal değişimlerin kapsamlı bir temsili olarak değil, erken mekanistik bir gözlem penceresi olarak seçilmiştir.

Seçilen bu zaman noktasında, intratekal enjeksiyon uygulanan sıçanlar, p-ERK1/2 ekspresyonunun Western blot analizi (n = grup başına 3) ve inflamatuar sitokinlerin immünofloresan değerlendirmesi (n = grup başına 3) için sakrifiye edildi. Boş gruptaki sıçanlar, spinal korddaki p-ERK1/2 temel ekspresyon seviyelerinin Western blot ile (n = 3) ve inflamatuar sitokinlerin (TNF-α ve COX-2) immünofloresan ile (n = 3) belirlenmesi için rastgele sonlandırıldı. Böylece boş grup, insizyon yapılmamış ve tedavi uygulanmamış bazal kontrol grubu olarak kullanıldı.

Nöronlarda, astrositlerde ve mikroglialarda spinal p-ERK1/2'nin hücresel lokalizasyonu

İnsizyon sonrası spinal p-ERK1/2'nin hücresel dağılımını daha ayrıntılı değerlendirmek için, insizyondan 4 saat sonra Blank ve IP gruplarında immunofloresan boyama gerçekleştirilmiştir (n = 3).

İstatistiksel analiz

Veriler ortalama ± standart sapma olarak ifade edilmiştir. Örneklem büyüklüğü, araştırma grubunun önceki çalışmalarına ve ön deneylere referans alınarak belirlenmiştir. Davranışsal veriler; grup denekler arası faktör, zaman ise denek içi faktör olmak üzere iki yönlü tekrarlı ölçümler varyans analizi (ANOVA) ile analiz edilmiştir. Zaman seyirli Western blot verileri, tek yönlü ANOVA ve ardından Bonferroni düzeltmeli ikili karşılaştırmalar ile değerlendirilmiştir. Sabit zamanlı Western blot ve immünofloresan verileri, Bonferroni düzeltmeli planlanmış karşılaştırmalarla tek yönlü ANOVA ile değerlendirilmiş; iki grup karşılaştırmaları ise Student t-testi ile analiz edilmiştir. Normallik ve varyans homojenliği sırasıyla Shapiro–Wilk ve Levene testleri ile değerlendirilmiştir. İki yönlü p-değeri < 0.05 anlamlı kabul edilmiştir. İstatistiksel analizler, Materyal Tablosu'nda listelenen istatistiksel analiz yazılımı kullanılarak gerçekleştirilmiştir. in vitro astrosit deneyleri için bağımsız kültür deneyleri analiz birimi olarak kabul edilmiştir; Western blot densitometrisi ve sitokin konsantrasyonları, uygunluğa göre tek yönlü ANOVA ve ardından Bonferroni düzeltmeli planlanmış karşılaştırmalarla veya önceden belirlenmiş iki grup karşılaştırmaları için Student t-testi kullanılarak karşılaştırılmıştır.

VERİ KULLANİLABİLİRLİĞİ:

Bu çalışmanın bulgularını destekleyen veriler Ek Dosya 1'de sunulmuştur.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

İnsizyonun ve preoperatif intratekal propentofylline veya U0126 uygulamasının insizyon sonrası hiperaljezi üzerindeki etkileri

Mekanik hiperaljezi

Operasyondan 24 saat önce altı grup arasında PWMT'ler açısından anlamlı bir fark saptanmamıştır (p > 0.05; Şekil 1A,B). IP grubunda PWMT, insizyondan sonra azalmış ve insizyondan sonraki 2. saat ile 72. saat arasında bazal değerden anlaml...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Çoğu hasta ameliyat sonrası sadece fiziksel olarak değil, bazen zihinsel olarak da akut ağrı çekmektedir33, ancak akut postoperatif ağrının ayrıntılı mekanizmaları hakkında hala pek çok şey bilinmemektedir. Analjezik ilaçların güçlü etkilerinin yanı sıra kaçınılmaz yan etkileri de bulunmaktadır; bu durum, daha güvenli ve etkili analjeziklerin araştırılmasını kritik derecede önemli hale getirmektedir. Bu çalışma, akut postoperatif ağrıyı simüle etmek için daha önce doğrulanmış, hazırlanması kolay v...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar; kişisel, finansal, ticari veya akademik herhangi bir çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.

Teşekkürler

Yazarlar, teknik destekleri için Haijiao Zhou ve Ming Wang'a teşekkür ederler.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
0,01 M PBS tamponuSolarbioP1020
1,0 M Tris-HCl tamponu (pH 6,8)SolarbioT1020
1,5 M Tris-HCl tamponu (pH 8,8)SolarbioT1010
%10 sodyum dodecil sülfat (SDS)SolarbioS1010
10× TBST stok çözeltisiSolarbioT1081
%30 akrilamidSolarbioA1010
4× protein yükleme tamponuSolarbioP1041
Adobe PhotoshopAdobe—
Amonyum persülfatSolarbioA1030
Otomatik pul buz makinesiChangshu XuekeIMS-40
Sığır serum albümini (BSA)SolarbioA8020
Kriyostat CM150LeicaCM150
Dijital pH metre—PHS-3C
Dimetil sülfoksit (DMSO)SolarbioD8371
Elektronik analitik teraziCany—
Geliştirilmiş kemilüminesans (ECL) reaktifiSolarbioPE0010
FilmKodak—
Floresan mikroskobu DP71OlympusDP71
Dondurulmuş kesit gömme ortamıSakura4583
Gel elektroforez düzeneğiBIO-RAD—
GliserolSolarbioIG0910
GlisinSolarbioG8200
Keçi anti-fare Alexa Fluor 594 sekonder antikoruProteintechSA00013-3
Keçi anti-fare yaban turburperoksidaz konjuge sekonder antikorZSGB-BIOZB2305
Keçi anti-tavşan Alexa Fluor 488 sekonder antikoruProteintechSA00013-2
Keçi anti-tavşan yaban turburperoksidaz konjuge sekonder antikorZSGB-BIOZB2301
Keçi serumuSolarbioSL038
GraphPad PrismGraphPad Software5
Yüksek hızlı soğutmalı santrifüj 3K15Sigma3K15
Yatay orbital çalkalayıcı TS-1000Haimen QilinbeierTS-1000
ImageJNational Institutes of Health1.51j8
MetanolTianjin Guangfu—
Fare anti-sıçan GAPDH primer antikoruProteintech60004-1-Ig
Fare anti-sıçan p-ERK1/2 primer antikoruCST9101S
Na2HPO3Tianjin Beichen Fangzheng—
NaH2PO3Tianjin Damao—
ParaformaldehitBiosharpBL539A
Patoloji sınıfı mikroskop lamlarıShitai—
Fenilmetilsülfonil florür (PMSF)BeyotimeST506
Plantar Test 37370UGO BASILE37370
Poliviniliden florür membranSolarbio—
Propentofilin (PPF)TaosuT19812
Tavşan anti-sıçan COX-2 primer antikoruAbcamAb179800
Tavşan anti-sıçan GFAP primer antikoruProteintech16825-1-AP
Tavşan anti-sıçan Iba-1 primer antikoruProteintech10904-1-AP
Tavşan anti-sıçan NeuN primer antikoruAbcamAb279297
Tavşan anti-sıçan t-ERK1/2 primer antikoruProteintech11257-1-AP
Tavşan anti-sıçan TNF-α primer antikoruProteintech29652-1-AP
RIPA liz tamponuSolarbioR0010
SDSSolarbioS8010
Yağsız süt tozuSolarbioD8340
SPSSIBM22
Tetrametiletilendiamin (TEMED)SolarbioT8090
TrisSolarbioT8060
Triton X-100SolarbioT8200
U0126-EtOHSelleckS1102
Ultra düşük sıcaklık dondurucuHaier—
Ultra düşük sıcaklık dondurucuSanyo—
Ultrapure su saflaştırma sistemiHeal Force—
von Frey filamentleriNorth Coast Medical—

Kaynaklar

  1. Bateman C. Pain management—the global sound of silence. S Afr Med J. 2015;105:621-3.
  2. Pogatzki-Zahn EM, Segelcke D, Schug SA. Postoperative pain—from mechanisms to treatment. Pain Rep. 2017;2:e588.
  3. Kaiser U, Kopkow C, Deckert S, Neustadt K, Jacobi L, Cameron P, et al. Validation and application of a core set of patient-relevant outcome domains to assess the effectiveness of multimodal pain therapy (VAPAIN): a study protocol. BMJ Open. 2015;5:e008146.
  4. Tawfik VL, Nutile-McMenemy N, Lacroix-Fralish ML, DeLeo JA. Efficacy of propentofylline, a glial modulating agent, on existing mechanical allodynia following peripheral nerve injury. Brain Behav Immun. 2007;21:238-46.
  5. Wu F, Li H, Sun J, Li X, Jiang W, Huang Y, et al. Inhibition of GAP-43 by propentofylline in a rat model of neuropathic pain. Int J Clin Exp Pathol. 2013;6:1516-22.
  6. Norsted Gregory E, Codeluppi S, Gregory JA, Steinauer J, Svensson CI. Pentoxifylline and propentofylline prevent proliferation and activation of the mammalian target of rapamycin and mitogen-activated protein kinase in cultured spinal astrocytes. J Neurosci Res. 2013;91:300-12.
  7. Ji RR, Chamessian A, Zhang YQ. Pain regulation by non-neuronal cells and inflammation. Science. 2016;354:572-7.
  8. Grace PM, Hutchinson MR, Maier SF, Watkins LR. Pathological pain and the neuroimmune interface. Nat Rev Immunol. 2014;14:217-31.
  9. Ji RR, Berta T, Nedergaard M. Glia and pain: is chronic pain a gliopathy? Pain. 2013;154 Suppl 1:S10-28.
  10. Chen G, Park CK, Xie RG, Ji RR. Connexin-43 induces chemokine release from spinal cord astrocytes to maintain late-phase neuropathic pain in mice. Brain. 2014;137:2193-209.
  11. Liu Y, Hou B, Zhang W, Wang D, Wang H, Yu G, et al. The activation of spinal astrocytes contributes to preoperative anxiety-induced persistent postoperative pain in a rat model of incisional pain. Eur J Pain. 2015;19(5):733-40.
  12. Obata H, Eisenach JC, Hussain H, Bynum T, Vincler M. Spinal glial activation contributes to postoperative mechanical hypersensitivity in the rat. J Pain. 2006;7:816-22.
  13. Masaki E, Mizuta K, Ohtani N, Kido K. Early postoperative nociceptive threshold and production of brain-derived neurotrophic factor induced by plantar incision are not influenced by minocycline in a rat: role of spinal microglia. Neurosignals. 2016;24:15-24.
  14. Cargnello M, Roux PP. Activation and function of the MAPKs and their substrates, the MAPK-activated protein kinases. Microbiol Mol Biol Rev. 2011;75:50-83.
  15. Roskoski R Jr. ERK1/2 MAP kinases: structure, function, and regulation. Pharmacol Res. 2012;66:105-43.
  16. Berta T, Liu YC, Xu ZZ, Ji RR. Tissue plasminogen activator contributes to morphine tolerance and induces mechanical allodynia via astrocytic IL-1β and ERK signaling in the spinal cord of mice. Neuroscience. 2013;247:376-85.
  17. Bi RY, Meng Z, Zhang P, Wang XD, Ding YQ, Gan YH, et al. Involvement of trigeminal ganglionic Nav1.7 in hyperalgesia of inflamed temporomandibular joint is dependent on ERK1/2 phosphorylation of glial cells in rats. Eur J Pain. 2013;17(7):983-94.
  18. Mikuzuki L, Saito H, Katagiri A, Okada S, Kubo A, Suzuki T, et al. Phenotypic change in trigeminal ganglion neurons associated with satellite cell activation via extracellular signal-regulated kinase phosphorylation is involved in lingual neuropathic pain. Eur J Neurosci. 2017;46:2190-202.
  19. Song Z, Xie W, Chen S, Strong JA, Print MS, Wang JI, et al. STAT1 as a downstream mediator of ERK signaling contributes to bone cancer pain by regulating MHC II expression in spinal microglia. Brain Behav Immun. 2017;60:161-73.
  20. Duncia JV, Santella JB III, Higley CA, Pitts WJ, Wityak J, Frietze WE, et al. MEK inhibitors: the chemistry and biological activity of U0126, its analogs, and cyclization products. Bioorg Med Chem Lett. 1998;8:2839-44.
  21. Ji RR, Gereau RW IV, Malcangio M, Strichartz GR. MAP kinase and pain. Brain Res Rev. 2009;60:135-48.
  22. Li F, Zhang H, Ma X, Zhang X, Wang Y, Zhang J, et al. Annexin A10 contributes to chronic constrictive injury-induced pain through activating ERK1/2 signalling in rats. Int J Neurosci. 2018;128(2):125-32.
  23. Qiu Q, Chai S, Jiang Z, Zhang Y, Liu X, Li M, et al. Propofol produces preventive analgesia via GluN2B-containing NMDA receptor ERK1/2 signaling pathway in a rat model of inflammatory pain. Mol Pain. 2017;13:1744806917737462.
  24. van den Heuvel I, Reichl S, Segelcke D, Zahn PK, Pogatzki-Zahn EM. Selective prevention of mechanical hyperalgesia after incision by spinal ERK1/2 inhibition. Eur J Pain. 2015;19(2):225-35.
  25. Zhang YB, Guo Y, Li H, Wang LN. Gabapentin effects on PKC-ERK1/2 signaling in the spinal cord of rats with formalin-induced visceral inflammatory pain. PLoS One. 2015;10:e0141142.
  26. Zimmermann M. Ethical guidelines for investigations of experimental pain in conscious animals. Pain. 1983;16:109-10.
  27. Brennan TJ, Vandermeulen EP, Gebhart GF. Characterization of a rat model of incisional pain. Pain. 1996;64:493-9.
  28. Dixon WJ. Efficient analysis of experimental observations. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 1980;20:441-62.
  29. Hargreaves K, Dubner R, Brown F, Flores C, Joris J. A new and sensitive method for measuring thermal nociception in cutaneous hyperalgesia. Pain. 1988;32:77-88.
  30. Hao J, Chen H, Madigan MC, Coote JH, Zhang Y, Xu XJ, et al. Roles of peripheral mitogen-activated protein kinases in melittin-induced nociception and hyperalgesia. Neuroscience. 2008;152:1067-75.
  31. Wang LN, Yao M, Yang JP, Peng J, Peng Y, Li CF, et al. Cancer-induced bone pain sequentially activates the ERK/MAPK pathway in different cell types in the rat spinal cord. Mol Pain. 2011;7:48.
  32. Yang F, Sun W, Yang Y, Wang Y, Li CL, Fu H, et al. SDF1-CXCR4 signaling contributes to persistent pain and hypersensitivity via regulating excitability of primary nociceptive neurons: involvement of ERK-dependent Nav1.8 up-regulation. J Neuroinflammation. 2015;12:219.
  33. Apfelbaum JL, Chen C, Mehta SS, Gan TJ. Postoperative pain experience: results from a national survey suggest postoperative pain continues to be undertreated. Anesth Analg. 2003;97:534-40.
  34. Latremoliere A, Woolf CJ. Central sensitization: a generator of pain hypersensitivity by central neural plasticity. J Pain. 2009;10:895-926.
  35. Zhuang ZY, Gerner P, Woolf CJ, Ji RR. ERK is sequentially activated in neurons, microglia, and astrocytes by spinal nerve ligation and contributes to mechanical allodynia in this neuropathic pain model. Pain. 2005;114:149-59.
  36. Marchand F, Perretti M, McMahon SB. Role of the immune system in chronic pain. Nat Rev Neurosci. 2005;6:521-32.
  37. Bath PM, Bath-Hextall FJ. Pentoxifylline, propentofylline and pentifylline for acute ischemic stroke. Cochrane Database Syst Rev. 2004;3:CD000162.
  38. Cui XY, Chen Y, Chen J, Ma ZL, Zhao YL, Li YQ, et al. Differential activation of p38 and extracellular signal-regulated kinase in spinal cord in a model of bee venom-induced inflammation and hyperalgesia. Mol Pain. 2008;4:17.
  39. Ji RR. ERK MAP kinase activation in superficial spinal cord neurons induces prodynorphin and NK-1 upregulation and contributes to persistent inflammatory pain hypersensitivity. J Neurosci. 2002;22:478-85.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Spinal MikrogliaPropentofyllin TedavisiMekanik HiperaljeziTermal HiperaljeziWestern Blottingmm nofloresan Analiznflamatuar Mediyat rler
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.