Yöntem makalesi

Değiştirilmiş histonların, peptit dizileri ve doğal nükleozom pulldown ile insan spindlin aile üyesi 4'ün (SPIN4) bağlanma substratları olarak tanımlanması

DOI:

10.3791/70934

⸱

27 Mart 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Cellular and Molecular Pathogenesis, Department of Pathology, Virginia Commonwealth University School of Medicine, 2Center for Precision Medicine and Genomics Research, Children's National Research Institute, 3Department of Endocrinology, Children's National Hospital, 4Department of Pediatrics, George Washington University School of Medicine and Health Sciences, 5Massey Comprehensive Cancer Center, Virginia Commonwealth University School of Medicine

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İnsan Spindlin Aile Üyesi 4'te (SPIN4) genetik varyantlar, yeni bir gelişimsel bozukluk olan kemik aşırı büyümesi olan hastalarda yakın zamanda tespit edilmiştir. Nükleozomlar bağlamında modifiye histonların SPIN4 bağlanma substratları olarak biyokimyasal tanımlanmasını tanımlayan bir protokol ve yeni sonuçlar sunulmaktadır.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İnsan Spindlin Aile Üyesi 4 (SPIN4), kemik büyümesinin yeni bir düzenleyicisi olarak ortaya çıktı. SPIN4'teki fonksiyon kaybı varyantları, doğum öncesi ve sonrası aşırı büyüme sendromu gösteren hastalarda tespit edildi; bu sendrom X-bağlantılı dominant bir şekilde kalıtılır. SPIN4, her biri ayrı aromatik kafes oluşturan üç tandem Tudor alanı tekrarını içerir. Bu Tudor domainleri, dizili homolojiye dayalı olarak histonların metilen arginin ve lizin kalıntıları için epigenetik okuyucu alanları olarak kabul edilir. Ancak, SPIN4'ün tam bağlanma substratları hâlâ belirsizdir. İnsan SPIN4, hem vahşi tipi hem de hastalık yaratan mutant formlarıyla, böcek hücresi ifade sistemi aracılığıyla başarıyla üretilmiştir. Bir histon modifikasyonu peptid dizisi ile, vahşi tip ve mutant SPIN4 arasındaki farklı bağlanma eğilimleri belirlendi. Fonksiyonel doğrulamalar, SPIN4'ün histon H3 Lizin 4 metilasyonunun (H3K4me) gerçek bir okuyucusu olduğunu ve bunun yerel mononükleozomların biyokimyasal çekilmesiyle kanıtlandığını gösterdi. Bu entegre yaklaşım, epigenetik okuyucu proteinlerinin hızlı bağlanma hedefi tanımlanmasını kolaylaştırır.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Spindlin Aile Üyesi 4 (SPIN4), epigenetik okuyucudur ve yakın zamanda aşırı büyüme sendromuna karıştırılmıştır; doğum öncesi ve sonrası aşırı büyüme takımyıldızı ile uzunboylu 1,2 ile ortaya çıkmıştır. Spin4 nakavt (KO) fareleri, insan fenotipini tam olarak tekrarlayarak nedenselliği destekledi. Bugüne kadar, kemik büyümesini olumsuz düzenleyen tek tanımlanmış özel epigenetik okuyucu SPIN4 olmaktadır. Ancak, büyüme için kritik epigenetik okuyucu olan SPIN4'ün biyokimyasal özellikleri tanımlanmamış olup, bu yeni gelişimsel bozukluktaki temel hastalık yaratan mekanizmaların anlaşılmasında kritik bir bilgi boşluğu bırakmıştır. SPIN4, genellikle metilen arginin veya lizin histon okuyucu protein domainleri olarak kabul edilen üç Tudor domeni tandemtekrarını içerir 3. Yakın zamanda prenatal ve postnatal kemik aşırı büyüme sendromlu bir hastada SPIN4D82H missens varyantı tespit edilmiştir. Bu mutasyon, SPIN4'ün ilk Tudor alanını etkiler; ancak bu Tudor domainlerinin ilgili bağlanma substratları belirsizdir ve bu da kemik gelişimi sırasında kromatin ve gen ifadesinin SPIN4'e bağlı düzenlemesinin fonksiyonel diseksiyonunu sınırlamaktadır.

Okuyucu protein domainlerinin yeni histon bağlayıcı substratlarının tanımlanması tek bir standartlaştırılmış yaklaşıma dayanmaz. Histonun translasyon sonrası modifikasyonları (PTM) çoğunlukla çekirdek nükleozom parçacıklarından dışa doğru çıkan histon kuyruklarında görülür. Okuyucu protein domainleri tarafından histon kuyruğundaki PTM'lerin tanınması oldukça değişkendir ve okuyucu-hedef etkileşimini topluca stabilize etmek için genellikle nükleozomal DNA, linker DNA ve/veya diğer histon domainlerini içeren çok valent, elektrostatik etkileşimler gerektirir4. Şu anda, histon kuyruk peptitlerinin PTM'leri mikrodiziler şeklinde üretilmiş ve birkaç satıcı tarafındanticarileştirilmiştir 5. Okuyucu protein domainlerinin bağlanma hedefleri için histon kuyruk peptit tabanlı PTM taraması yüksek verimliliğe sahip olsa da, nükleozomlar yokken genellikle yanlış pozitif sonuçlar verir. Ayrıca, bu tür ekranların deneysel koşulları oldukça ampiriktir ve proteinden proteine değişiklik göstererek teknik olarak ele almayı zorlaştırır. Sentetik nükleozom tabanlı PTM taraması veya pulldown çok daha sağlam bir okuma sağlar, ancak değişken PTM kombinasyonlarını taşıyan nükleozomların yeniden oluşturulması doğası gereği zordur ve çok daha maliyetli ve düşük verimliliktir.

Bu protokol, nükleozomlarda histon PTM'lerin SPIN4'ün bağlanma hedefleri olarak tanımlanması için hızlı bir yaklaşım tanımlar. Rekombinant SPIN4, yeniden oluşturuldu ve potansiyel bağlanma hedeflerini belirlemek için ticari bir histon PTM peptid dizisi ile karşılaştırıldığında tarandı. Daha sonra canlı hücrelerden çeşitli endojen histon PTM'ler içeren doğal mono-nükleozomlar üretildi. Mono-nükleozomların SPIN4 pulldown'u, ilk taramadan sonra histon PTM'lerin antikor tabanlı hedefli validasyonunu mümkün kıldı. Bu entegre biyokimyasal strateji, zaman ve maliyet etkin hedef keşfi için prensip kanıtı yaklaşımını gösterir ve diğer kötü karakterize edilmiş epigenetik okuyucu proteinlerinin bağlanma substratlarını tanımlamak için kolayca uygulanabilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

HEK293FT hücreleri içeren tüm deneysel prosedürler, Virginia Commonwealth Üniversitesi'nin Kurumsal Biyogüvenlik Komitesi (IBC) yönergelerine uygun olarak gerçekleştirilmiştir.

1. Rekombinant insan SPIN4'ün arındırılması

  1. Tam boy yabani tip SPIN4 veya SPIN4D82H'yi N-terminal 1× FLAG epitop etiketiyle baculoviral vektör 6,7'ye klonlayın.
  2. Baculovirus hazırlayın; Sf9 hücrelerini baculoviral vektörlerle transfekte ederek, hücreler patladığında virüsleri toplayın, aliquot ve virüsü −80 °C 6,7 sıcaklıkta depolayın.
  3. 500 mL Erlenmeyer şişesine 100 mL büyüme ortamı, 1.5 × 108 Sf9 hücresi ve 1 mL P1 bakulovirüs ekleyin.
  4. Kültürü 27,5 °C'de, 125 rpm'ye ayarlanmış bir yörüngesel shaker kuluçka makinesinde, karanlıkta 72 saat boyunca inkubasyon yapın.
  5. FLAG-SPIN4'ü BC150 lizaz inhibitörleri içeren liz tamponu içinde FLAG afinite jeliyle saflaştırın ve proteini 0,1 mg/mL'de 1× FLAG peptidi ile elüasyonla elüasyonla elde edin.
  6. 1× FLAG peptidini tamamen çıkarmak için, FLAG-SPIN4'ü 4 °C'de BC150 Protein Depolama tamponuna karşı aşağıdaki sırayla diyaliz edilmiştir:
    1. İlk diyaliz: 1 l, 1 saat.
    2. İkinci diyaliz: 2 litre, gece boyunca.
    3. Üçüncü diyaliz: 1 l, 1 saat.
  7. Diyalizlenen proteini istenen hacme (SPIN4 için, 600 μL'den 150 μL'ye kadar) konsantre edin.
  8. Protein konsantrasyonunu Bicinchoninic Acid (BCA) testiyle belirleyin ve molar konsantrasyonu buna göre hesaplayın.
  9. Her saflaştırma aşamasında geri kazanılan ham protein miktarı ve buna karşılık gelen tahmini verimler, Ek Tablo 1'de özetlenmiştir. Arıtma, 250 mL Sf9 kültüründen 400 μL anti-FLAG affinite jel bulamaç kullanılarak gerçekleştirildi.
  10. SPIN4'ü BC150 Protein Depolama Tamponunda 10× seyreltir (Ek Tablo 2). 1, 2, 5, 10 ve 20 μL miktarlarını %15 SDS–PAGE jeline yükleyin ve Coomassie mavi boyama ile görselleştirin (Şekil 1A).
  11. Eşit hacimli hatlar arasında göreli sinyal yoğunluğunu belirlemek için bir görüntü analiz yazılımı kullanarak bant yoğunluğunu nicelikle ölçemek.
  12. Molar oranı elde etmek için yoğunluk oranını her proteinin moleküler ağırlığına böl.
  13. Bu azı dişleri oranı kullanarak Adım 1.8'de tahmin edilen molyar konsantrasyonu düzeltin.
  14. Aliquot arıtılmış protein, sıvı azotta snap-dondurur ve −80 °C'de depolar. Kısa süreli kullanım için, bir sonraki deneye geçmeden önce gece boyunca 4 °C'de saklanın.

2. Histon peptit dizisi

  1. 5 g Bovine Serum Albumini (BSA) BC150 Protein Depolama Tamponunda 100 mL nihai hacme çözünerek peptid dizisi bloklama tamponu hazırlanır.
  2. Isteğe göre, reaktif tüketimini en aza indirmek için hidrofobik marker kalemi kullanarak peptid dizisindeki reaksiyon alanını belirtebilirsiniz.
  3. Birkaç sayfa filtre kağıdını 15 cm'lik bir petri kabına yerleştirin ve suyla nemlendirin.
  4. Peptit dizilerini nemli filtre kağıtlarının üzerine yerleştirin.
  5. Her dizi alanını tamamen kapsayacak şekilde dikkatlice 300 μL bloklama tamponu ekleyin.
  6. Petri kabını kapatın ve oda sıcaklığında 1–3 saat kuluçka yapın.
  7. FLAG-SPIN4'ü bloklama tamponunda 1 μM nihai konsantrasyona hazırlayın.
  8. Bloklama tamponu içinde 1× FLAG peptidini 1 μM nihai konsantrasyona kadar hazırlayın.
  9. Sinyal-gürültü oranını artırmak ve istenmeyen arka planı azaltmak için soğuk odada aşağıdaki adımları gerçekleştirin. Bloklanmış dizileri (petri kabı ile) protein eklemeden önce soğuk odaya taşıyın.
  10. Dizilerden fazla engelleme tamponu kaldırın.
  11. İstediğiniz FLAG-SPIN4 proteinini veya FLAG peptitini kontrol olarak her bloka dikkatlice ekleyin.
  12. Petri kabını kapatın ve soğuk odada gece boyunca kuluçka yapın.
  13. Yaklaşık 50 mL peptid dizisi yıkama tamponu Western blot yıkama kutusuna ekleyin ve soğuk odaya götürün.
  14. Protein çözeltisini atın ve dizileri hemen yıkama tamponuna aktarın, reaksiyon yüzü yukarı olsun.
  15. Dizileri şu şekilde beş kez yıkayın: ilk iki yıkama 1 dakika boyunca, kalan üç yıkama ise 5 dakika sürer.
  16. Dizileri kalan deterjan çıkarmak için peptit diziyi bloklama tamponu ile durulayın, ardından onları Petri kabına geri döndürün.
  17. Anti-FLAG antikor çözeltisi 1:2000 seyreltmede hazırlayın ve blok başına 300 μL ekleyin.
  18. Oda sıcaklığında 1 saat kuluçka yapın.
  19. Dizileri yıkamak için 2.14'ten 2.16'ya kadar olan adımları tekrarlayın.
  20. HRP ile konjuge edilmiş keçi anti-fare IgG (ikincil antikor) çözeltisi 1:6000 seyreltme ile hazırlayın ve blok başına 300 μL ekleyin.
  21. Oda sıcaklığında 1 saat kuluçka yapın.
  22. Dizileri yıkamak için 2.14'ten 2.16'ya kadar olan adımları tekrarlayın.
  23. Dizileri şeffaf bir örtü koruyucuya yerleştirin.
  24. Yaklaşık 1 mL Geliştirilmiş Kemimilüminesans (ECL) substratı ekleyin, böylece reaksiyon yüzeyinin eşit kaplanması sağlanır.
  25. Hava kabarcıklarını çıkarın ve uygun bir görüntüleme sistemi (örneğin, dijital görüntüleyiciler veya otoradyografik filmler) kullanarak kemimilüminesans ve parlak alan görüntüleri yakalayın (Şekil 1B).
  26. Peptit dizisi yazılımı ve ilgili çevrimiçi araçlara göre sinyal yoğunluğunu analiz edin (Şekil 2A–C).

3. FLAG-SPIN4'ün pulldown testi için büyük ölçekli ifadesi

  1. 500 mL'lik bir Erlenmeyer şişesine 125 mL ESF921 ortamı, 1.8 × 108 Sf9 hücresi ve 1.2 mL P1 baculovirus ekleyerek FLAG-SPIN4 veya FLAG-SPIN4D82H ekleyin.
  2. 27,5 °C'de yörüngesel sarstırıcı kuluçka makinesinde (125 rpm) 72 saat kuluçka yapın.
  3. Kültürü şu şekilde anlatabilirsiniz:
    1. 4 mL kültürü 15 mL'lik bir tüpe titrasyon için yerleştirir.
    2. 30 mL kültürü dört 50 mL'lik tüpe dönüştürür.
  4. Tüpleri 600 × g ile 15 dakika boyunca santrifüj edin ve süpernatantı atın.
  5. Pelletleri sıvı azotta dondurun ve −80 °C'de kullanana kadar saklayın.

4. FLAG-SPIN4 ve FLAG-SPIN4D82H için boncuk-lizat oranının titrasyonu

  1. Bölüm 3, Adım 3.1'de tanımlanan 5 mL Sf9 kültüründen her bir Sf9 peletine 1 mL BC150 lizis tamponu ekleyin.
  2. Lizatları sonikle tam bozulma sağlamak için: %30 genlik, 5 s açık/5 saniye kapalı, toplam sonikasyon süresi 15 saniye.
  3. 20.000 × g, 4 °C'de 10 dakika boyunca santrifüj yapın ve süpernatantı yeni 1,5 mL tüplere aktarın.
  4. Her pulldown reaksiyonu için 20 μL anti-FLAG affinite jel çamuru hazırlayın (3 titrasyon için 60 μL)
  5. Boncukları BC150 liz tamponu ile yıkayın:
    1. 1 mL BC150 lizin tamponu ekleyin ve kısa bir süreliğine girdap ekleyin.
    2. Santrifüj 3.000 × g'de 1 dakika koyun.
    3. Süpernatantı aspire edin ve atın.
  6. Her 1 pulldown reaksiyonu için boncukları 40 μL BC150 lizis tamponunda yeniden askıya alın (3 titrasyon için 120 μL).
  7. Lizat, BC150 lizis tamponu ve boncuk süspansiyonu içeren 1.5 mL tüplerde birleştirin (Ek Tablo 3)
  8. Tüpleri, 4 °C'de 15 rpm'ye ayarlanmış bir tüp döner cihazında 1,5 saat kuluçka yapın.
  9. 3.000 × g 1 dakika boyunca santrifüj yapın ve süpernatantı aspire edin.
  10. Boncukları aşağıdaki gibi üç kez yıkayın:
    1. 500 μL BC150 liz tamponu ve girdabında boncukları kısa süreliğine yeniden askıya alın.
    2. Santrifüj 3.000 × g 1 dakika boyunca kullanın.
    3. Üst natantı aspire edin.
  11. Boncukları 20 μL 1× Laemmli tamponunda yeniden askıya alın ve 95 °C'de 5 dakika kuluçka yapın.
  12. Santrifüj 3.000 × g 1 dakika boyunca koyun.
  13. Süpernatantı %15 SDS–PAGE jeli üzerinde çalıştırın ve protein verimini tahmin etmek için Coomassie mavisiyle boyanın.
  14. Verilere dayanarak, boncuklardaki antikor bağlanma noktalarını doyuran lizat-boncuk oranı seçilir. Deneylerde, 20 μL boncuk başına ≥300 μL lizat, tam bağlanma kapasitesine ulaşmak için yeterliydi.
    NOT: "Antikor bağlanma noktalarının doygunluğu", lizat hacminin artırılmasının hedef proteinin daha iyi geri dönüşünü sağlamadığı nokta olarak tanımlanır.
    NOT: Aynı molisitede, SPIN4D82H , FLAG afinite jeline vahşi tip karşılıka göre daha düşük bağlanma afinitesi gösterir.
    NOT: Bu deneysel ortamda, 6 milyon Sf9 hücresinden 1 mL lizat türetildi (1,5 × 106 hücre/mL × 4 mL olarak hesaplandı), bu da ~6 milyon Sf9 hücresinden eksprese edilen SPIN4'ün 20 μL anti-FLAG afinite jel bulaşı doygunlaştırmaya yeterli olduğunu gösterir.

5. Anti-FLAG affinite jel ile bağlı FLAG-SPIN4'ün yem olarak büyük ölçekli hazırlanması

  1. Test edilecek her protein için, 30 mL kültürlerden iki pelet toplayın. Her peleti 6 mL BC150 liz tamponuna yeniden askıya alın, 15 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın ve BC150 liz tamponu ile toplam hacmi 13 mL'ye ayarlayın.
  2. Her örneği buz üzerinde %100 genlikte, 15 saniye açık/30 saniye kapalı olarak sonikle sonikle yapın, toplam sonikasyon süresi 2 dakikadır.
  3. Lizatları önceden soğutulan yüksek hızlı santrifüj tüplerine aktarın ve 20.000 × g, 4 °C'de 15 dakika boyunca santrifüj yapın.
  4. 1.5 mL'lik santrifüj tüpüne 200 × (örnek sayısı + 1) × 1.1 μL anti-FLAG affinite jel çamur ekleyin.
  5. Boncukları >5 sütun hacmi (CV) BC150 liz tamponuyla bir kez yıkayın.
  6. Boncukları 400 × (örnek sayısı + 1) × 1.1 μL BC150 lizis tamponu ile yeniden askıya alın.
  7. 4. Adımda elde edilen süpernatantları 15 mL santrifüj tüplerine aktarın.
  8. Her tüpten 500 μL Step 5.7 boncuk süspansiyonu ekleyin.
  9. Bir tüpte, negatif kontrol olarak 3 mL BC150 lizis tamponu ve 60 μL 1× FLAG peptidi (100 mM) ekleyin.
  10. Örnekleri 120 rpm'ye ayarlanmış bir tüp rotatöründe 4 °C'de 1,5 saat kuluçka edin.
  11. 2.000 × g sıcaklıkta 5 dakika santrifüj yapın ve süpernatantı atın.
  12. Boncukları uygun miktarda süpernatantla tekrar askıda bırakın ve 1,5 mL'lik tüplere aktarın.
  13. 3.000 × g seviyesinde 1 dakika boyunca santrifüj yapın ve süpernatantı aspire edin.
  14. Boncukları BC150 liz tamponu ile beş kez aşağıdaki gibi yıkayın:
    1. Boncukları 1 mL BC150 liz tamponu içinde yeniden askıya alın.
    2. 4. ve 5. yıkamalarda, örnekleri 4 °C'de 20 rpm'ye ayarlanmış bir tüp rotatoruna 10 dakika boyunca yerleştirin.
    3. 3.000 × g seviyesinde 1 dakika boyunca santrifüj yapın ve süpernatantı aspire edin.
  15. Boncukları 200 μL BC150 liz tamponunda yeniden askıya alın.
  16. 9 μL boncuk/tampon süspansiyonu alın ve protein içeriğini %15 SDS–PAGE ile analiz edin, ardından Coomassie mavisi boyama uygulanır.
  17. Protein girdisi boncuk bağlanma kapasitesini aştığı için, boncuk hacmi başına bağlanan protein miktarı örnekler arasında benzer olmalıdır. Dijital görüntü analiziyle bant yoğunluğunu yarı nicelikle ölçmek ve sonraki reaksiyonlar için boncuk miktarlarını ayarlamak.

6. HEK293FT hücrelerden mono-nükleozomların hazırlanması

  1. 15 cm doku kültürü tabaklarında HEK293FT%10 fetal sığır serumu (FBS) kullanılarak, %5CO2 nemlendirilmiş bir kuluçka içinde, %10 fetal sığır serumu (FBS) kullanılarak yaklaşık %90 birleşime ulaşarak yetiştirin.
  2. Erken geçiş HEK293FT hücreleri ticari olarak elde edilir ve STR profilleme ile doğrulanır.
    NOT: Bir 15 cm'lik çanak ~27 milyon hücre sağlar, bu da 1–2 pulldown reaksiyonu için yeterlidir. Altı reaksiyon için (negatif kontroller dahil) en az üç adet 15 cm yemek hazırlayın. Hedef histon translasyon sonrası modifikasyon (PTM) nadir veya kararsızsa, hücre sayısını 2–10× buna göre artırın.
  3. (İsteğe bağlı) İlgilendiğiniz histon modifikasyonuna bağlı olarak, kültür ortamına uygun PTM inhibitörleri (Ek Tablo 2) ekleyin ve 24 saat kuluçka yapın.
    NOT: Bol miktarda histon PTM'ler varsa bu adım atlanabilir.
  4. Hücreler %100 birleşmeye yaklaştığında, aşağıdaki şekilde toplayın:
    1. Kültür ortamını aspire edin.
    2. Hücreleri 10 mL buz gibi soğuk PBS ile nazikçe durulayın, ardından aspirineri.
    3. 5 mL buz gibi soğuk PBS ekleyin.
    4. Hücreleri buz üzerinde kazıyıp 50 mL'lik bir tüpe aktarın (tüm çanaklar birleştirilebilir).
    5. 13.000 × g, 4 °C'de 10 dakika boyunca santrifüj yapın.
    6. Üst yüzeyi at.
  5. (İsteğe bağlı) Ya hemen hareket edin ya da hücre pelletini daha sonra kullanmak üzere dondurun:
    1. Pellet hacmini tahmin edin.
    2. Buffer G'nin 9× pellet hacminde yeniden süzülerek %20 nihai gliserol konsantrasyonuna ulaşın.
    3. Sıvı azotta ani dondurma ve −80 °C'de sakla.
  6. Donmuş peletle devam ediyorsanız, pelleti buzda eritin, 1.300 × g, 4 °C'de 5 dakika boyunca santrifüj yapın ve üst yüzeyi atın.
  7. (Taze veya çözülmüş) pelleti, proteaz inhibitörleri içeren TMSD tamponu (40 mM Tris-HCl, pH 7.5, 5 mM MgCl2, 250 mM sukroz, 1 mM DTT) içeren 10× pellet hacminde serolojik pipet kullanılarak yeniden askıya alın.
  8. TMSD tamponunda %10 NP-40 taze hazırlanır ve toplam reaksiyon hacmi 0,11× eklenerek nihai NP-40 konsantrasyonu ~1% elde edilir.
  9. Süspansiyonu, 4 °C'de 120 rpm'ye ayarlanmış bir tüp rotatöründe 5 dakika boyunca kuluçka edin.
  10. 10 μL süspansiyon ile 10 μL tripan mavisi karıştırın ve nükleer boyama izi için mikroskop altında gözlemleyin. Çekirdeklerin sitosolden tamamen izole olduğundan emin olun (Şekil 3A).
  11. Çekirdeklerin yaklaşık %95'i trypan mavi-pozitif olduğunda, bir sonraki adıma geçin. HEK293FT hücreler için genellikle %1 NP-40 kuluçkası 5 dakika boyunca yeterlidir. Diğer hücre tipleri için inkubasyon süresini doğrulayın ve ayarlayın.
  12. 1.300 × g, 4 °C'de 5 dakika boyunca santrifüj yapın ve süpernatantı atın.
  13. Pelleti 10× TMSD tamponlu pellet hacminde yeniden süzül.
  14. 6.12'den 6.13'e kadar olan adımları beş kez tekrarlayarak kalıntı NP-40'ı tamamen çıkarabilirsiniz.
  15. Pelleti 5× Buffer B hacminde tekrar askıya alın.
  16. Her 10.000 çekirdekte 1 Birim mikrokokkal nükleaz (MNase) ekleyin ve 37 °C su banyosunda kuluçka yapın. Tüpü zaman zaman kuluçka sırasında tahrik ederek çekirdeklerin dengeli şekilde yeniden askıda kalmasını sağlar
  17. Belirtilen zaman noktalarında (0,5, 1 ve 2,5 saat), reaksiyonun 50 μL'sini 1,5 mL tüplere çekin, hemen 1 μL 0,5 M EDTA-Na (pH 8,0) ekleyin ve girdab.
  18. Her zaman noktasından aşağıdaki prosedürü takip ederek DNA çıkarın:
    1. 80 μL H₂O, 30 μL %10 SDS ve 20 μL 5 M NaCl ekleyin; vortex.
    2. 200 μL fenol/kloroform ekleyin; Vortex'i iyice yok.
    3. Santrifüj 20.000 × g, RT, 3 dakika.
    4. Süpernatantı dikkatlice yeni bir 1.5 mL tüpe aktarın.
    5. 1 mL %100 etanol ve 20 μL 3 M sodyum asetat (pH 5.2) ekleyin; vortex.
    6. Santrifüj 20.000 × g, RT, 5 dakika.
    7. Üst örtü maddesini çıkarın, 1 mL %70 etanol ekleyin.
    8. Santrifüj 20.000 × g, RT, 1 dakika.
    9. Üst yüzeyi çıkarın ve kapağı açık şekilde 55 °C'de 10 dakika boyunca kurutun.
    10. Pelleti 50 μL TE tamponunda yeniden askıya alın.
  19. Mono-nükleozom DNA boyutunu (147 bp) doğrulamak için %1 TBE agaroz jeli üzerinde örnekler çalıştırın (Şekil 3B).
  20. (İsteğe bağlı) Mikrokok Nükleaz (MNaz) sindirim verimleri hücre tiplerine göre değişir; gerekirse polinükleozomları tamamen ortadan kaldırmak için reaksiyon sırasında ek MNaz eklenebilir. Örneğin, 1 saat ve 2 saat örnekleri benzer görünüyorsa, 3 saat içinde daha fazla MNaz ekleyin.
  21. Baskın ~147 bp bandı gözlemlendiğinde veya ek MNase/genişletilmiş kuluçka artık parça boyutunu değiştirmediğinde, son konsantrasyon 2 mM'e 0,5 M EDTA-Na (pH8,0) eklenerek reaksiyonu durdurun.
  22. 1.300 × g, 4 °C sıcaklıkta 5 dakika boyunca santrifüj yapın. Süpernatantı (S1) topla.
  23. Pelleti 10× TE tampon + proteaz inhibitörleriyle dolu pellet hacminde yeniden askıya alın ve örneği 4 °C'de 20 rpm'ye ayarlanmış bir tüp rotatöründe en az 30 dakika kuluçka yapın.
    NOT: Mono-nükleozom ekstraksiyon verimliliği hücre tiplerine göre değişir. 0-300 mM NaCl, nükleozomları verimli bir şekilde çıkarmak için kullanılabilir.
  24. 1.300 × g, 4 °C sıcaklıkta 5 dakika boyunca santrifüj yapın. Süpernatantı (S2) topla.
  25. S1 ve S2'nin her biri 50 μL ayrı 1.5 mL tüplere aktarın.
  26. Tüm fraksiyonları agaroz jel elektroforezi ile analiz edin (Adımlar 6.17'den 6.18'e kadar) ve DNA boyut dağılımı ve ekstraksiyon verimliliğini değerlendirin. Çoğu mono-nükleozom S2 fraksiyonunda bulunur (Şekil 3C).
  27. S2'yi yüksek hızlı santrifüj tüplerine aktarın ve çözünmeyen malzemeyi çıkarmak için 20.000 × g, 4 °C sıcaklıkta 10 dakika boyunca spin yapın.
  28. Süpernatantı topla ve BC150 liz tamponu (inhibitörler olmadan) karşı diyaliz yapın:
    1. İlk diyaliz: 1 l, 1 saat.
    2. İkinci diyaliz: 2 litre, gece boyunca.
  29. Diyalizden sonra, 20.000 × g, 4 °C sıcaklıkta tekrar santrifüj yapın ve kalan çözünmeyen kalıntıları temizlemek için 10 dakika boyunca kullanılsın.
  30. Son süpernatı topla.
  31. 5 μL süpernatantı 35 μL BC150 lizis tamponu ve 10 μL 5× Laemmli tamponu ile karıştırın, 95 °C'de 5 dakika ısıtın ve 1, 2, 5, 10 ve 20 μL %15 SDS–PAGE jeliyle yükleyin.
  32. Verim tahmini için referans olarak Laemmli tamponunda 0.1 mg/mL BSA yükü 1, 2 ve 5 μL.
  33. Coomassie mavisiyle boyanın ve bir görüntü analiz yazılımı kullanarak nükleozom verimini yarı nicel olarak tahmin edin (Şekil 3D).

7. Modifiye nükleozom çekilmesi

  1. BC150 liz tamponunda 1 g BSA'yı son 10 mL hacme kadar çözerek 2× boncuk engelleme tamponunu hazırlayın, ardından tamamen çözünene kadar girdabı yapın.
  2. Eşdeğer molyar miktarda protein içeren FLAG-SPIN4-WT ve FLAG-SPIN4D82H boncuklarını (Bölüm 5, 5.16'dan 5.17'ye kadar) ayrı 1.5 mL tüplere aktarın.
  3. FLAG-SPIN4-WT örneğine eşit miktarda negatif kontrol boncukları (Bölüm 5, Adım 10'dan) ekleyin.
  4. Tüm boncuk örneklerinin toplam hacmini BC150 liz tamponu kullanarak aynı şekilde ayarlayın.
  5. Her boru ve BC150 liz tamponu içeren her tüpte eşit hacimde 2× boncuk engelleme tamponu ekleyin.
  6. Örnekleri gece boyunca 4 °C'de 20 rpm'ye ayarlanmış bir tüp rotatöründe kuluçka edin.
  7. Buz üzerinde HEK293FT hücreden çıkarılan uygun miktarda 1× nükleozomu eritin. Gerekli hacm, istenen nükleozom-SPIN4 molar oranına bağlıdır. İlk optimizasyon için, nükleozomun SPIN4'e karşı 1:1 molar oranı kullanın.
  8. 1× nükleozomu 2× boncuk engelleme tamponu ile iyice karıştırın.
  9. Adım 7.8'deki karışımı önceden bloklanmış boncuklarla 15 mL'lik bir tüpte birleştirin.
  10. Karışımı, 4 °C'de 20 rpm'ye ayarlanmış bir tüp rotatöründe 4 saat veya gece boyunca kübe edin.
  11. 3.000 × g, 4 °C'de 3 dakika boyunca santrifüj yapın.
  12. Süpernatantı dikkatlice at.
  13. Boncukları 1 mL BC150 liz tamponuna yeniden süsleyip 1.5 mL tüplere aktarın.
  14. Boncukları aşağıdaki gibi üç kez yıkayın:
    1. 3.000 × g, 1 dakika boyunca santrifüj yapın ve süpernatantı aspire edin.
    2. Boncukları 1 mL BC150 liz tamponu içinde yeniden askıya alın.
    3. Yıkama sırasında boncukların denge olarak yeniden asılmış kalması için tüpü ara sıra karıştırın.
  15. Boncukları aşağıdaki gibi iki kez daha yıkayın:
    1. 3.000 × g 1 dakika santrifüj yapın ve süpernatantı aspire edin.
    2. 1 mL BC150 lizis tamponu içinde yeniden askıya alınmış boncuklar.
    3. 20 rpm, 4 °C sıcaklıkta 10 dakika boyunca dön.
  16. Yıkamadan sonra, boncukları BC150 lizis tamponu olan 9 sütunlu ciltte (CV) yeniden askıya alın.
  17. Her örnekten 160 μL alın, 40 μL 5× Laemmli tamponu ile karıştırın ve 95 °C'de 5 dakika ısıtın.
    NOT: Protein-nükleozom kompleksinin flag peptit elülasyonu önerilir; bu da daha temiz sonuçlar ve daha az arka plan sağlar.
  18. Santrifüj 3.000 × g, oda sıcaklığında 5 dakika boyunca.
  19. Üst yüzeyin 5 μL'sini %15 SDS–PAGE jel üzerine yükleyin ve gümüş boyama işlemi yapın (Şekil 4A).
  20. Üst yüzeyden 5 μL daha %15 SDS–PAGE jel üzerine yüklenin, PVDF membranına aktarın ve hedef histon PTM'lere özgü uygun birincil ve ikincil antikorlarla prob yapın (Şekil 4B).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İnsan SPIN4'ün bağlanma substratlarını incelemek için, vahşi tip SPIN4 ve aşırı büyüme sendromuyla ilişkili hasta kaynaklı mutant Sf9 böcek hücresi ekspresyon sistemi kullanılarak yeniden oluşturuldu. Özellikle, bu aspartik asit (D)'den histidin (H) ile rekıntı 82 (D82H) arasındaki yanlış anlam mutasyonudur ve SPIN4'ün ilk Tudor alanında yer alır; bu da SPIN4'ün substrat bağlanmasını düzenlemedeki rolünü ima eder. Sf9 hücrelerinde protein ekspresyonu için tek bir FLAG etiketli SPIN4 kodl...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Belirli histon PTM'lerin kötü karakterize edilmiş bir proteinin hedefleri olarak biyokimyasal olarak tespit edilmesi ve hastalıkla ilişkili mutasyonun hedefin bağlanma eğilimini nasıl etkilediğini değerlendirmek için zaman ve maliyet açısından etkili bir yöntem sunuldu. Bu yöntemin avantajı, sentetik nükleozomların pahalı veya zaman alıcı yeniden yapılandırılmasını gerektirmemesidir. Bu yaklaşım, ticarileştirilmiş histon PTM peptid dizilerinin kolaylığından yararlanırken, SPIN4'ün fizyol...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar çıkar çatışması belirtmemektedir.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, teknik destekleri için Yu and Jee Lab'ın tüm eski ve mevcut üyelerine teşekkür etmektedir. J.-R.Y., NIH NIGMS Maksimizasyon Araştırmacılar Araştırma Ödülü (MIRA) tarafından desteklendi R35GM160046. YH. J, Çocuk Ulusal Hastanesi ve Çocuk Araştırma Enstitüsü tarafından desteklendi.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
1.5 mL Mikrosantrifüj TüpleriSarstedt72.690.001Genel deneyler
15 cm doku kültürü kabıSarstedt83.3903.300Genel deneyler
15 mL Konik Santrifüj TüpleriSarstedt62.554.101Genel deneyler
50 mL Konik Santrifüj TüpleriSarstedt62.548.004Genel deneyler
500 mL Erlenmeyer MatarasıStellar ScientificCT229809Sf9 hücre kültürü
Amersham ImageQuant 800 CCD GörüntüleyiciCytivaIMQ800CCD görüntüleme sistemi
Anti-FLAG M2 Affinity JeliSigma-AldrichA2220Biyokimyasal pulldown
Anti-FLAG M2 antikoruSigma-AldrichF1804Western Blot
AprotininMedChemExpressHY-P0017Proteaz inhibitörü
Array Analyze SofrwareAktif Motifhttps://www.activemotif.com/documents/Array_Analyze_Software_v16.1.zipMODified peptid dizi veri analizi
ASI Agarose LEAlkali ScientificA7700DNA jeli
Bac-to-Bac Baculovirus İfade SistemiTermo Bilimsel10359016Baculoviral ekspresyon
Benzamidin hidroklorürMedChemExpressHY-W018781Proteaz inhibitörü
Sığır Serum Albümini (BSA)Sigma-AldrichA9647Protein nicelik standardı
Bromofenol MavisiTermo BilimselA18469.08Lammeli tamponu
Coomassie Parlak Mavi R-250Termo Bilimsel20278Protien jel boyama
Ditiothreitol (DTT)Sigma-Aldrich D5545Liz tamponu
EDTARPI araştırma ürünleriE58100Liz tamponu
Geliştirilmiş Kemimilüminesans (ECL) altlığıCytivaRPN2232Western Blot
ESF 921 Böcek Hücresi Kültür Ortamıİfade Sistemleri96-001Sf9 hücre kültürü
Etanol (200 proof)Spectrum ChemicalET107DNA çökeltmesi
EVOS M5000 Görüntüleme SistemiInvitrogenM5000Genel görüntüleme
FLAG peptidiMedChemExpressHY-P7006Pulldown elyusiyonu
GliserolSigma-Aldrich G77893Depolama tamponu
H3K4me1 antikor Aktif Motif39300Western Blot
H3K4me2 antikor Hücre Sinyalizasyonu9725TWestern Blot
H3K4me3 antikor Hücre Sinyalizasyonu9751TWestern Blot
HEK293FT hücreleriTermo BilimselR70007İnsan embriyonik böbrek fibroblasthücre hattı
HEPESSigma-Aldrich H3375Liz tamponu
ImageJUlusal Sağlık Enstitülerihttps://imagej.net/ij/download.html  Java tabanlı görüntü işleme programı
Leupeptin hemisülfatMedChemExpressHY-18234AProteaz inhibitörü
Mikrokokkal Nükleaz (MNaz)NEB M0247SKromatin sindirimi için endonükleaz
Model 120 Sonic DismembratorFisher ScientificFB120110Sonikasyon
MODified Histon Peptit DizisiAktif Motif13005Protein bağlanma testi
Pepstatin AMedChemExpressHY-P0018Proteaz inhibitörü
Peroksidaz IgG Fraksiyonu Monoklonal Keçi Anti-Fare IgG, hafif zincire özgüJackson ImmunoResearch115-035-174Western Blot
pFastBac1-Bayrak-SPIN4Termo Bilimsel10360014Baculoviral ekspresyon vektörü
pFastBac1-Bayrak-SPIN4-D82HTermo Bilimsel10360014Baculoviral ekspresyon vektörü
Fenol:Kloroform:İzoamil Alkol (25:24:1)Sigma-AldrichP2069DNA arıtma
Pierce Rapid Gold BCA Protein Test KitiTermo BilimselPIA53226Protein niceliklendirmesi
Pierce Gümüş Leke KitiTermo Bilimsel24612Protein tespiti
PMSF Proteaz İnhibitörüTermo Bilimsel36978Proteaz inhibitörü
Poliakrilamid JelKendi yapımYokProtein jeli
Sf9 böcek hücreleriATCCCRL-1711Bakülovirüs ifadesi için böcek hücre hattı
Slide-A-Lyzer MINI Diyaliz Cihazı, 10K MWCOTermo Bilimsel69572Protein diyalizi
Sodyum asetatSigma-AldrichS8750DNA çökeltmesi
Sodyum Klorür Fischer BP358-1Genel tamponlar
Sodyum Dodesil Sülfat (SDS)Sigma-Aldrich L3771Genel tamponlar
Trypan Blue Çözeltisi (%0,4)Termo Bilimsel15250061Çekirdek boyama

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lui, J. C., et al. Loss-of-function variant in SPIN4 causes an X-linked overgrowth syndrome. JCI Insight. 8 (9), e167074(2023).
  2. Chawla, N., Rajput, M., Shriyan, R., Bachani, S., Gupta, A. Clinical observation of a rare Binder phenotype with fetal overgrowth due to a SPIN4 mutation. Matern Fetal Med. 7 (1), e0030(2025).
  3. Lu, R., Wang, G. G. Tudor: a versatile family of histone methylation readers. Trends Biochem Sci. 38 (11), 546-555 (2013).
  4. Ruthenburg, A. J., Li, H., Patel, D. J., Allis, C. D. Multivalent engagement of chromatin modifications by linked binding modules. Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (12), 983-994 (2007).
  5. Mauser, R., Jeltsch, A. Application of modified histone peptide arrays in chromatin research. Arch. Biochem Biophys. 661, 31-38 (2019).
  6. Hsu, C. I., et al. Paraspeckle protein NONO regulates active chromatin by allosterically stimulating NSD1. Cell Rep. 44 (1), 116247(2025).
  7. Hsu, C. I., Yeh, E., Chen, C. C. L., Sahn, M., Yu, J. R. Protocol for reconstituting enzymatic activities for ultra-large histone methyltransferases NSD1 and SETD2 using a baculovirus expression system. STAR Protoc. 6 (1), 103963(2025).
  8. Plazas-Mayorca, M. D., et al. One-pot shotgun quantitative mass spectrometry characterization of histones. J Proteome Res. 8 (11), 5367-5374 (2009).
  9. Fuhrmann, J., Thompson, P. R. Protein arginine methylation and citrullination in epigenetic regulation. ACS Chem Biol. 11, 654(2015).
  10. Zhao, F., et al. Molecular basis for histone H3 “K4me3-K9me3/2” methylation pattern readout by Spindlin1. J Biol Chem. 295 (49), 16877(2021).
  11. Padeken, J., Methot, S. P., Gasser, S. M. Establishment of H3K9-methylated heterochromatin and its functions in tissue differentiation and maintenance. Nat Rev Mol Cell Biol. 23 (9), 623-640 (2022).
  12. Greschik, H., et al. The histone code reader Spin1 controls skeletal muscle development. Cell Death Dis. 8 (11), e3173(2017).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

SPIN4 ProteinHistone ModificationPeptide ArrayNative Nucleosome PulldownTudor DomainHistone ReaderH3K4 MethylationWestern BlotBone Growth RegulationPost Translational Modification

İlgili makaleler