Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Araştırma makalesi
Demir aşırı yükü pankreas dokusunda MEG3 ekspresyonunu azalttı. MEG3, demir kaynaklı adacık β-hücre apoptozuna karşı koruyucu bir rol oynayabilir; bu da NF-ĸB yolunun modülasyonunu içerebilir. Bu mekanizma, demir aşırı yükü olan β-TM hastalarında adacığığının işlevsizliğine katkıda bulunabilir.
Beta-talasemi majör (β-TM) hastaları genellikle anormal glikoz metabolizması ile karşılaşır ve demir aşırı yükü, kronik anemi, hormonal dengesizlikler, karaciğer fonksiyon bozukluğu ve iltihapla ilişkili insülin direnci gibi faktörler pankreas adacığı işlev bozukluğuna önemli katkı sağlayanlar olarak kabul edilir. Uzun kodlamayan ribonüklein asitler (lncRNA'lar), hücre apoptozu ve glikoz homeostazındaki düzenleyici rolleri nedeniyle giderek daha fazla tanınmaktadır. Bu çalışma, demir kaynaklı adacığak β hücre hasarında anne tarafından eksprese edilen gen 3 (MEG3) olan lncRNA'nın işlevini incelemektedir. Demir aşırı yüklenme fare modeli, intraperitoneal demir dekstran enjeksiyonu ile indüklenmiştir. Pankreastaki demir birikimi ve doku hasarı Prusya mavisi ve hematoksilin ile eozin boyama kullanılarak değerlendirildi ve MEG3 ekspresyonu ters transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonu (RT-PCR) ile nicelendirildi. In vitro, MIN6 hücreleri MEG3 küçük interferension RNA ile transfekte edilip apoptozu akış sitometrisiyle inceledi ve NF-kappa (ĸ)B sinyal yolu aktivitesi Western blotting ile değerlendirildi. Histolojik boyama, demir aşırı yüklenmiş farelerin pankreas dokusunda önemli demir birikimini ve yapısal hasarı doğrulamıştır. RT-PCR analizi, pankreastaki MEG3 ekspresyonunda belirgin bir azalma gösterdi (p<0.05). In vitro, MEG3 knockdown, MIN6 hücrelerinin apoptozunu kontrol seviyelerine kıyasla anlamlı şekilde artırdı. Western blot analizi, MEG3 susturulmuş hücrelerde NF-ĸB sinyal yolunun aktivasyonunu gösteren yüksek bir NF-ĸB seviyesi gösterdi. Bu bulgular, MEG3 aşağı regulasyonunun demir aşırı yük koşullarında NF-ĸB sinyalizasyonu yoluyla adacığın β-hücre apoptozunu artırabileceğini göstermektedir. MEG3 geni, demir kaynaklı adacığa β-hücre apoptozuna karşı koruyucu bir rol oynayabilir ve bu da NF-ĸB yolunun modülasyonunu içerebilir. Bu mekanizma, demir aşırı yükü olan β-TM hastalarında adacığığının işlevsizliğine katkıda bulunabilir.
Beta (β)-talasemi, kronik anemiye ve etkisiz eritropozis ile sonuçlanan β-globin zincir üretiminin azalması veya olmaması ile karakterize edilen kalıtsal hematolojikbozukluklar grubudur 1. Transfüzyona bağımlı β-talasemi major (β-TM) hastalarda, tekrarlanan kan naklimleri ve hemoliz sıklıkla sistemik demir aşırı yüküne yol açar; bu da birçok organa zarar verebilir ve anormal glukoz metabolizması dahil olmak üzere çeşitli endokrin komplikasyonlara katkıda bulunabilir2. Ayrıca, kronik anemi pankreas üzerindeki yükü artırır, glukoz düzenlemesini etkileyen hormonal dengesizlikler, karaciğer fonksiyon bozukluğu glikoz metabolizmasını bozur ve infümatuar süreçlerle indüklenen insülin direnci β-TM hastalarında hiperglisemiye katkıda bulunabilir. Bu nedenle, β-TM'deki glukoz metabolik bozulmaları doğası gereği çokfaktörlüdür 2,3. Yakın tarihli bir meta-analiz, β-TM hastalarında açlık glikozu bozulması, glukoz toleransı (IGT) ve diyabet (DM) oranlarının sırasıyla %17,21, %12,46 ve %6,54 olduğunu belirtmiştir; bu da bu popülasyonda glikoz metabolik bozukluklarının artan yükünügöstermektedir 3.
Artan klinik önemine rağmen, β-TM'de anormal glukoz metabolizmasının temel mekanizmaları hâlâ yeterince anlaşılmamaktadır. Önceki çalışmalar, özellikle tekrarlanan transfüzyonlar ve hemolizden kaynaklanan kronik demir aşırı yükünün, özellikle adacık β hücrelerinde pankreasın aşırı demir birikmesine yol açabileceğini göstermiştir. Bu birikim reaktif oksijen türlerinin oluşumunu teşvik eder ve oksidatif stresi artırarak mitokondriyal işlev bozukluğunu tetikler, insülin sentezi ve salgılanmasını bozur ve nihayetinde β hücre apoptozu ile insülin eksikliğineneden olur 4,6. Ayrıca, demir aşırı yükü, oksidatif stres aracılı iltihap ve insülin sinyal yollarındaki parazit yoluyla periferik insülin direncine katkıda bulunabilir. Ancak, demir aşırı yükünü β hücre hasarı ve sistemik glukoz düzensizliği ile ilişkilendiren moleküler yollar karmaşıktır ve henüz tam olarak açıklanmamıştır. Uzun kodlamayan ribonüklein asitler (lncRNA'lar) – 200 nükleotidden uzun ve proteinleri kodlamayan bir transkript sınıfı – glukoz homeostazı, insülin salgılanması ve oksidatif stresyanıtları 7,8,9 dahil olmak üzere çeşitli biyolojik süreçlerde önemli düzenleyiciler olarak ortaya çıkmıştır. Pankreas adacık β hücrelerinin 1.000'den fazla lncRNA eksprese ettikleri bilinir ve bu da endokrin fonksiyonu korumada potansiyel düzenleyicirollerini göstermektedir 10.
Ancak, özellikle β-TM'de, demir aşırı yükünden kaynaklanan adacık β hücre hasarı bağlamında lncRNA ifade profilleri ve fonksiyonel rolleri hakkında çok az şey bilinmektedir. Son gelişmeler, LncRNA MEG3'ün (MEG3) insülin salgılanmasını teşvik ettiğini ve pankreas β hücrelerininapoptozunu 11 inhibe ettiğini ortaya koydu. Ancak, demir aşırı yüklenme koşullarında pankreas β hücreleri üzerindeki etkisi hâlâ belirsizdir. Diğer patolojik bağlamlarda, lncRNA'ların NF-kappa (ĸ)B, JNK ve Nrf2 gibi temel sinyal yolları ile etkileşime girdiği gösterilmiştir; bu yollar oksidatif stres ve demir aşırı yüküne bağlı hücre hasarındada rol oynar 12,13,14. Özellikle, NF-ĸB oksidatif stres altında aktive edilen merkezi bir transkripsiyon faktörüdür ve demir aşırı yük koşullarında β hücre apoptozunda rol oynamıştır 15,16,17. Bu nedenle, bu çalışma MEG3 aşağı regülasyonunun demir aşırı yük koşullarında NF-ĸB sinyalizasyonu yoluyla adacık β hücre apoptozunu artırabileceğini araştırmaktadır. Bu çalışma, β-TM'de anormal glukoz metabolizmasının altında yatan moleküler mekanizmalar hakkında yeni bilgiler sağlayabilir.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Bu çalışmada kullanılan deneysel protokoller, Hainan Genel Hastanesi Etik Komitesi tarafından onaylandı (protokol no. 2021-239). ABD Ulusal Sağlık Enstitüleri'nin Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Rehberi ve Helsinki Bildirgesi, tüm deneysel işlemlerde sıkı sıkıya uygulandı. Bu çalışmada kullanılan reaktifler ve ekipmanlar Malzeme Tablosu'nda listelenmiştir.
1. Hayvan Modeli ve Deneysel Tasarım
Bu çalışmada 36 erkek C57BL/6J fare (4 haftalık, yaklaşık 20 g) kullanıldı. Tüm fareler standart laboratuvar koşullarında (20–25 °C, %50–%65 göreli nem, 12 saat ışık/karanlık döngü) ve yiyecek ile suya imkansız erişim sağlandı. 7 günlük bir aklimatlaşma döneminin ardından fareler rastgele iki gruba ayrıldı (grup başına n=18): demir aşırı yük grubu (Model grup), 4 hafta boyunca haftada iki kez intraperitoneal demir dekstran (0,2 g/kg) enjeksiyonu aldı; ve kontrol grubu, intraperitoneal enjeksiyon yoluyla eşdeğer miktarda normal salin alıyordu. 4 hafta sonra fareler ötenazi edildi ve pankreas dokuları sonraki analiz için alındı.
2. Serum Demir Ölçümü
Kan örnekleri, diestrus sırasında %1 pentobarbital anestezi altında retro-orbital sinüsten alındı. Oda sıcaklığında 1 saat bekletildikten sonra kan, 4 °C, 3.000 rpm'de 15 dakika santrifüjlendi. Serum ayrılarak -80 °C sıcaklıkta saklandı. Serum demir konsantrasyonları, üreticinin protokolüne uygun olarak demir kolorimetrik test kiti kullanılarak belirlendi.
3. Histolojik Analiz
Pankreas dokusu örnekleri fiksasyon için %4 paraformaldehit içine batırıldı, ardından bölüm hazırlığından önce parafin gömüldü. 4–5 μm kalınlığında seri doku kesitleri elde edilip standart deparafinizasyon ve rehidrasyon prosedürleriyle işlendi. Histomorfolojik muayene daha sonra hematoksilin ve eosin boyama kullanılarak yapıldı; pankreas dokularında demir birikimi ise geleneksel histolojik boyama protokollerine göre Prusya mavisi boyama ile değerlendirildi.
4. Hücre kültürü ve küçük interferensiyalı ribonüklein asit transfeksiyonu
MIN6 fare pankreas β-hücreleri, yüksek glikozlu Dulbecco'nun modifiye Eagle ortamında %15 fetal sığır serumu, 100 U/mL penisillin, 100 μg/mL streptomisin, 10 mM HEPES, 50 mM sodyum piruvat ve 50 μmol/L β-merkaptoetanol takviyesinde kültürlendi. Tüm deneyler %80 hücre birleşiminde gerçekleştirildi. Her hücre kültürü sırasında 6–8 ml kültür ortamı alınır. Hücreler, %5 CO₂ nemli atmosferde 37 °C'de tutuldu. Fonksiyonel çalışmalar için, logaritmik büyüme fazındaki MIN6 hücreleri, mikroarray sonuçlarına dayalı seçilmiş lncRNA'yı hedefleyen lncRNA-spesifik küçük interferension (si)RNA ile transfekte edildi; İnhibörü grubu) veya üreticinin talimatlarına göre Lipofectamine 2000 kullanılarak negatif kontrol siRNA (İnhibörü NC grubu) ile karşılaştırılabilir. 24 saat kültürden sonra, hücreler kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu (qRT-PCR) veya western blot ile analiz edilerek köndürme verimliliği belirlendi. Bu siRNA'nın hedef dizileri şu şekildeydi: siMEG3: GCGUCUUCCUGUGCCAUUUTTAAAUGGCACAGGAAGACGCTT; siNC: UUCUCCGAACGUGUCACUTTACGUGACACGUUGGAGAATT. Her deney üçlü olarak yapıldı ve üç kez tekrarlandı.
5. Ters Transkripsiyon Polimeraz Zincir Reaksiyonu Testi
Toplam RNA, üreticinin talimatlarına göre pankreas dokusu örneklerinden ve MIN6 hücrelerinden ticari olarak bulunan fenol bazlı RNA izolasyon reaktifi kullanılarak çıkarıldı. Tamamlayıcı DNA, toplam 20 μL reaksiyon hacminde ters transkripsiyon kiti kullanılarak sentezlendi. Ters transkripsiyonun ardından, örnek nicelendirme analizine göre çoğu örneğin cDNA konsantrasyonu yaklaşık 1 μg/μL idi. Daha sonra, 1 μL cDNA şablonu nicel gerçek zamanlı PCR amplifikasyonu için kullanıldı. qRT-PCR, aşağıdaki döngü koşullarında SYBR Yeşil tabanlı PCR tespit kiti kullanılarak gerçekleştirilmiştir: 30 saniye için 95 °C, 15 saniye için 90 °C, 34 saniye için 60 °C ve 30 saniye için 68 °C. Göreli gen ifade seviyeleri, karşılaştırmalı eşik döngüsü yöntemi (2-ΔCT yöntemi) kullanılarak belirlenmiştir. GAPDH, gerçek zamanlı PCR verilerinin normalizasyonu için dahili referans gen olarak kullanıldı. Tüm deneysel prosedürler ilgili üreticilerin protokollerine göre gerçekleştirildi ve her deney bağımsız olarak en az üç kez tekrarlandı. Bu çalışmada kullanılan primer dizileri, Ek Tablo 1 ve Tablo 2'de listelenmiştir.
6. Hücre Sayma Kiti 8 Testi
Hücre proliferasyon kapasitesi, üreticinin yönergelerine uygun olarak hücre sayma kiti 8 testiyle belirlendi. Kısaca, MIN6 hücreleri, si-MEG3 veya si-NC ile transfeksiyon sonrası her kuyu başına 5 x 103 hücre yoğunluğunda 96 kuyruklu kültür plakalarında örtülen ve 24 saat boyunca korunmuştur. Belirlenen zaman noktalarında, her kuyuya 10 μL hücre canlılık reaktifi yerleştirildi ve plakalar 37 °C'de 2 saat kuluçka edildi. Absorbans değerleri daha sonra mikroplaka okuyucu kullanılarak 450 nm olarak ölçüldü. Hücre canlılığı kontrol grubuna göre yüzde olarak hesaplandı.
7. Akış Sitometrisiyle Apoptoz Tespiti
MIN6 hücrelerindeki apoptotik değişiklikler, üreticinin talimatlarına göre Annexin V-FITC/PI apoptoz tespit kiti kullanılarak incelendi. 48 saatlik siRNA transfeksiyonunun ardından hücreler hasat edildi, soğuk fosfatla tamponlanmış tuzlu su ile iki kez yıkanmış ve bağlanma tamponunda yeniden süspansiye alınmıştır. Daha sonra, hücreler 5 μL Annexin V-FITC ve 5 μL propidium iyodid ile oda sıcaklığında, karanlık koşullarda 15 dakika kuluçka altına alındı. Boyamadan hemen sonra, örnekler akış sitometrisiyle analiz edildi. Erken ve geç apoptotik hücre popülasyonları, akış sitometrik analiz yazılımı kullanılarak nicelendirilmiştir. Apoptotik hücrelerin oranı daha sonra gruplar arası karşılaştırmalar için hesaplandı. Her deney bağımsız olarak üç kez gerçekleştirildi.
8. Western Blot Analizi
Western blot deneyleri, daha önce bildirilenprotokollere göre gerçekleştirildi 18. Hücreler önce tripsin ile sindirildi, toplandı ve radyoimmünoprecipitasyon testi liz tamponu kullanılarak buz üzerinde lizleştirildi. Protein konsantrasyonları nicelendirildi ve eşdeğer miktarda protein, poliviniliden florür membranlarına aktarılmadan önce %10 sodyum dodesil sülfat-poliakrilamid jel elektroforez jellerinde ayrılmaya tabi tutuldu. Membran bloklamasının ardından, gösterilen seyreltme oranlarında NF-κB (1:1000), Bcl-2 (1:1000), Bax (1:1000), kaspaz-3 (1:1000) ve gliseraldehit-3-fosfat dehidrojenaza (GAPDH) (1:2000) ile primer antikorlarla kuluçka yapıldı, ardından yaban turması peroksidaz bağlantılı ikincil antikorlarla kuluçka yapıldı. Protein sinyalleri kemilyünesans sistemi kullanılarak tespit edildi ve ImageJ yazılımıyla nicelendirildi. GAPDH iç yük kontrolü olarak kullanıldı ve protein ifade seviyeleri kontrol grubuna göre katlanma değişiklikleri olarak ifade edildi.
9. İstatistiksel analiz
Veriler, ortalama ± standart sapma (SD) olarak ifade edildi. Gruplar arasındaki karşılaştırmalar, istatistiksel analiz kullanılarak Mann–Whitney U testi19 kullanılarak gerçekleştirildi. <0.05 p-değeri istatistiksel olarak anlamlı olarak kabul edildi.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Demir aşırı yük fare modelinin değerlendirilmesi ve pankreas dokularında anne tarafından eksprese edilen gen 3 ekspresyonunun ölçümü
MEG3'ün in vivo'daki rolünü araştırmak için, intraperitoneal demir dekstran enjeksiyonu yoluyla farelerde demir aşırı yük modeli oluşturduk. Kontrol grubuna kıyasla, Model grubundaki serum demir seviyeleri anlamlı şekilde artmıştır (p<0,05) (Şekil 1A). Histolojik inceleme, hematoksilin-eosin boyama ve Prusya mavis...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Anormal glikoz metabolizması, β-TM hastalarında yaygın ve ciddi bir komplikasyondur ve genellikle IGT veya DM olarak kendini gösterir. Bu çalışmada, demir aşırı yükünün pankreas hasarına yol açtığını ve pankreas dokusunda lncRNA MEG3 ifadesini anlamlı şekilde azalttığını, ayrıca adacık β hücrelerinde artan apoptozla birlikte gerçekleştiğini bulduk. Ayrıca, MIN6 hücrelerinde MEG3'ün etkisi β hücre apoptozunu teşvik etmiş ve NF-ĸB aktivasyonu ile ilişkilendirilmiştir; bu da MEG3 ile demir ...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yazarlar çıkar çatışması belirtmemektedir.
Bu araştırma, Çin Hainan Eyalet Doğa Bilimleri Vakfı (822QN445) ve Hainan Eğitim Komitesi Vakfı (Hnky2024-30) tarafından finanse edilmiştir.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 1M Tris-HCL (pH=6.8) | Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd | T1020 | |
| 50bp DNA Ladder | TIANGEN | MD108 | |
| 50bp DNA Ladder | TIANGEN | MD108 | |
| 6×DNA Loading Buffer | TIANGEN | GH101-01 | |
| 6×DNA Loading Buffer | TRANS | GH101-01 | |
| -80ºC refrigerator | BIOBASE | BDF-86V348 | |
| ABI 7500 real-time PCR system | Applied Biosystems, USA | ||
| Annexin V-FITC/PI Apoptosis Kit | MULTI SCIENCES | AP101-100-kit | |
| BCA Protein Assay Kit | Elabscience Biotechnology Co.,Ltd. | E-BC-K318-M | |
| Biopulverizer | biospec | ||
| BSA | Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd | A8020 | |
| C57BL/6J male mice | Gempharmatech Co,Jiangsu,China | ||
| CCK-8 Cell Proliferation Assay Kit | KeyGEN BioTECH | KGA317 | |
| ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix | Vazyme | Q711-02 | |
| ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix | Vazyme | Q711-02 | |
| DMEM | KeyGEN BioTECH | ||
| Flow cytometry | ACEA Biosciences, USA | NovoCyte 2060R | |
| Fluorescence PCR instrument | Bio-Rad Laboratories, Shanghai | ||
| Glycine | Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd | G8200 | |
| High-capacity cDNA reverse transcription kit | Applied Biosystems, Carlsbad, CA, USA | ||
| HiScript II Q RT SuperMix for qPCR (+gDNA wiper) | Vazyme | R223-01 | |
| HiScript II Q RT SuperMix for qPCR (+gDNA wiper) | Vazyme | R223-01 | |
| HRP conjugated Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Servicebio | GB23301 | 1/2000 |
| HRP conjugated Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Servicebio | GB23303 | 1/2000 |
| Human LncRNA Array V5.0 | Arraystar,Rockville, Maryland, USA | ||
| Lipofectamine 3000 Transfection Reagent | Invitrogen | L3000015 | |
| Microarray scanner | Agilent Technologies,California, USA | ||
| MIN6 cell | procell | KGM12800N | |
| Mini-Bead-Beater-16 | biospec | ||
| Mouse Anti-GAPDH | TransGen Biotech | HC301 | 1/2000 |
| NanoDrop spectrophotometer | NanoDrop Products, Wilmington, DE, USA | ND-2000 | |
| PAGE Pre-Solution | Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd | A1010 | |
| Primers | Generay Biotech,Anhui, China | ||
| PrimeScript RT Reagent Kit with gDNA Eraser | CWBIO,Jiangsu, China | ||
| PVDF | Millipore | IPVH00010 | |
| Rabbit Anti Bax | proteintech | 50599-2-ig | 1/5000 |
| Rabbit Anti Bcl-2 | abcam | ab194583 | 1/1000 |
| Rabbit Anti Caspase3 | abcam | ab184787 | 1/2000 |
| Rabbit Anti P65 | abcam | ab32536 | 1/8000 |
| Rabbit Anti p-P65 | Affinity | af2006 | 1/1000 |
| TB Green Premix Ex Taq II | TaKaRa, Japan | ||
| TRIzol | Invitrogen life technologies, Carlsbad, CA, USA | ||
| TRIzol reagent | CWBIO,Jiangsu, China | ||
| Ultra-sensitive chemiluminescence imaging system instrument | Bio-Rad Laboratories, Shanghai | Chemi DocTM XRS+ | |
| Ultraviolet spectrophotometer | NanoPhotometer | NP80 |