Akonitin, JNK1/2 sinyal yolunun aktivasyonuyla ilişkili sıçanlarda miyokardiyal hasara neden olur

Özet

Bu çalışma, sıçanlarda Aconitine kaynaklı miyokard hasarında JNK1/2 sinyalizasyonunun potansiyel rolünü araştırmıştır. Artan JNK1/2 fosforilasyonu miyokard hasarıyla ilişkilendirilirken, JNK yolunun farmakolojik inhibisyonu miyokardiyal hasarı kısmen hafifletmiştir; bu da JNK sinyalinin Aconitine kaynaklı kardiyotoksisiteye katılabileceğini göstermektedir.

Özet

Akut Aconitine (Acon) zehirlenmesi aritmi ve miyokardiyal hasara neden olabilir; ancak temel mekanizmalar hâlâ belirsizdir. Bu çalışma, akut Acon zehirlenmesinden kaynaklanan miyokardiyal hasar mekanizmasını incelemiştir. Akut Acon zehirlenmesinin fare modeli (n = 51) intragastrik uygulamayla oluşturuldu. Kardiyografik izlemeler kardiyak ritmdeki değişiklikleri kaydetmek için kullanıldı. Miyokardiyal patolojik hasar ve kollajen birikimini değerlendirmek için hematoksilin ve eozin (HE) boyama ile Masson boyama yapıldı. Venöz kandaki kardiyak enzimlerin ve proteinlerin ifade seviyeleri, enzimle bağlantılı immünosorbent test (ELISA) kitleri kullanılarak tespit edildi. Acon ile JNK yolu arasındaki yapı-aktivite ilişkisi moleküler kenetlenme ile araştırıldı. Fosforile edilmiş c-Jun N-terminal kinaz 1/2 (JNK1/2) proteinlerinin ifade seviyeleri Western blotting ile tespit edildi. Bu çalışmada, Acon intragastrik uygulandıktan sonra sıçanlarda ventriküler aritmiler gözlemlendi. Miyokardiyal doku, miyokard lifleri ve hücrelerinin düzensiz bir düzeni ve anormal kollajen birikimiyle birlikte görüldü. Moleküler kenetlenme sonuçları, Acon ile JNK1/2 arasında potansiyel etkileşimleri gösterdi. Bu arada, kalp enzimleri ve proteinlerin ile fosforile JNK1/2'nin ifade seviyeleri önemli ölçüde arttı. Daha ileri çalışmalar, JNK inhibitörü ile tedavinin farelerde Acon kaynaklı miyokard hasarını kısmen tersine çevirdiğini SP600125 göstermiştir. Bu sonuçlar, JNK1/2 fosforilasyonunun akut Aconitine zehirlenmesinden kaynaklanan miyokard hasarının gelişiminde rol oynadığını göstermektedir. Bulgular, JNK1/2 sinyal yolunun aktivasyonunun Aconitine kaynaklı miyokard hasarına katkıda bulunduğunu ve JNK1/2 yolunun inhibisyonunun akut Aconitine toksikasyonu nedeniyle oluşan miyokardiyal hasarı hafifletebileceğini göstermektedir.

Giriş

Acon, Ranunculaceae familyasına ait Aconitum bitkisinden doğal bir diterpen alkaloid özüdür. Anti-inflamatuar ^1,2, analjezik, antitümör, antiromatik, bağışıklık metabolizması ve kan dolaşımı teşvik etkileri ^3,4,5 gibi etkiler içerir. Ancak, Acon içeren preparatların uygunsuz veya aşırı kullanımı ciddi zehirlenmelere yol açabilir. Aconitine zehirlenmesinin neden olduğu belirtiler arasında kalp^{semptomları 6}, nörolojik^{semptomlar 7} ve gastrointestinal semptomlar⁸ bulunur. Son yıllarda, dünya genelinde Aconite zehirlenmesi veya ölüm^{vakalarına dair sık} sık raporlar olmuştur. Akon zehirlenmesi esas olarak kardiyovasküler sistem, sinir sistemi ve sindirim sisteminde görülür. Bunlar arasında, zehirlenmeden ölümün başlıca nedeni kardiyotoksisitedir. Acon'un neden olduğu kalp hasarı çok ciddi; Özellikle, sendromun kısa süreli başlangıcı klinik tedaviyi zamanında gerçekleştirmeyi zorlaştırır. Genellikle, akut Acon zehirlenmesi birkaç saat içinde mide bulantı, ishal, baş dönmesi, göğüs ağrısı, nefes sefnesi ve diğer ilk belirtilere yol^{açar 8}. Şu anda, akut Acon zehirlenmesinin neden olduğu miyokardiyal hasarın ayrıntılı mekanizması hâlâ belirsizdir ve Acon zehirlenmesinden kaynaklanan miyokard hasarını etkili şekilde hafifledebilecek klinik olarak etkili bir ilaç^{yoktur 12,13}.

Akut Acon zehirlenmesinde miyokardiyal hasarın mekanizmasını araştırmaya olanak tanıyabilecek hasar, zamana bağlı bir araştırma için önemli bir yöntem sağlayabilir. Böyle bir model, akut Acon zehirlenmesi hastalarının gelecekte tedavi edilmesi potansiyeline sahip olabilir ve sendromun erken gelişimini erken önleyebilir. Çalışmalar, c-Jun n-terminal kinaz (JNK) sinyal yolunun zehirlere karşı bağışıklık yanıtındaki rolünü öne sürmüştür. JNK sinyal yolu, mitogen-aktive edilmiş protein kinaz (MAPK) sinyal yollarından biridir. JNK ailesi üç genden oluşur (JNK1/MAPK8, JNK2/MAPK9 ve JNK3/MAPK10). JNK1 ve JNK2, kalp dahil çoğu dokuda ifade edilebilirken, JNK3 esas olarak beyinde^{bulunur ve} esas olarak hücrelerin oksidatif stresi ve inflamatuar yanıtıyla ilişkilidir¹⁵. Çalışmalar, JNK aracılı sinyal yolunun beyin ve miyokard iskemisi/reperfüzyon yaralanmasında önemli bir rol oynadığını^{ortaya koymuştur 16,17}. C66 uygulaması, fare kalplerinde JNK aktivasyonunu engelleyerek yüksek yağlı diyet kaynaklı miyokard iltihabını^{hafifletmektedir 18}. Klorojenik asit, JNK sinyalini inhibe ederek TNF-α kaynaklı kardiyomiyosit hasarını^{hafifletmiştir 19}. Pinosebrin, p38/JNK MAPK sinyal yolunu inhibe ederek LPS kaynaklı miyokard hasarını ve inflamatuar yanıtı hafifleder ve kalp disfonksiyonu ile aritmini^{hafifleder 20}. Bu çalışmalar, JNK sinyal bildirimindeki değişikliklerin, özellikle JNK1/2'nin miyokardiyal hasarla yakından ilişkili olduğunu göstermektedir. Bu arada, JNK Acon'un bir dizi faaliyet için aşağı akıntı hedefi olarak da yer alıyor. Bir çalışma, yüksek dozlarda Acon maruziyetinin JNK enzim aktivasyon yolunu aracılık edebileceğini, zebrafish embriyolarında (gençlerde) kısaltılmış vücut uzunluğu, kavisli vücut şekli ve beyin gelişim kusurları gibi gelişimsel toksisiteye yol açtığını^{ortaya koymuştur 21}. Bu çalışma, Acon'un JNK sinyal yolunu aktive edebileceğini öne sürmektedir. Ancak, JNK sinyal yolunun akut Aconitine zehirlenmesinden kaynaklanan miyokardiyal hasardaki rolü belirsizdir.

Bu çalışma, farklı intragastrik dozlar ve zaman aralıkları belirleyerek miyokard hasarının akut Acon zehirlenmesinin bir fare modelini oluşturmuştur. Ayrıca, bu modelde Acon'un miyokarddaki JNK1/2 fosforilasyon seviyesi üzerindeki etkisini ve JNK sinyal yolunun aktivasyonunu inceledik. JNK1/2 fosforilasyonun, akut Acon zehirlenmesi nedeniyle indüklenen farelerde miyokardiyal hasarda rolünü incelemek, akut Acon zehirlenmesinden kaynaklanan miyokardiyal hasarın incelenmesi için teorik bir temel sağlar.

Protokol

Deneysel tasarım ve uygulama planı, 06/2022 tarihinde Kunming Tıp Üniversitesi Hayvan Deney Komitesi tarafından onay için onaylandı (onay numarası: Kmmu20220652). Tüm deneysel planlar, "Kunming Tıp Üniversitesi Hayvan Deneyleri Kılavuzları"na uygun olarak gerçekleştirildi. Bu çalışmada kullanılan tüm materyallerin listesi Materyaller Tablosu'nda listelenmiştir.

UYARI: Acon'un yüksek toksisitesi nedeniyle, tüm hazırlık ve uygulama prosedürleri kurumsal laboratuvar güvenlik düzenlemelerine uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Acon'u kullanan personel, eldiven, laboratuvar önlüğü ve maske dahil olmak üzere uygun kişisel koruyucu ekipman giydi ve Acon hazırlama prosedürleri, maruziyet riskini en aza indirmek için uygun önlemlerle gerçekleştirildi. Hayvanlar Acon uygulaması sırasında ve sonrasında ciddi toksisite ve sıkıntı belirtileri açısından yakından izlendi ve acıyı en aza indirmek için insancıl son noktalar uygulandı. Biyolojik atıklar ve Acon ile kirlenmiş malzemeler kurumsal biyogüvenlik düzenlemelerine uygun olarak bertaraf edilmiştir.

Hayvan tedavisi

Yetişkin erkek Sprague-Dawley (SD) fareleri (2 aylık, 230 g) Kunming Tıp Üniversitesi'nin SPF hayvan deney binasında, deneysel hayvan merkezinde yetiştirildi. Tüm SD sıçanların beslenme koşulları, SPF sıçanlarının beslenme gereksinimlerine göre işlendi. Deneyden önce 1 hafta adapte olarak büyütüldü ve 12 saat oruç tutuldu. Acon, 0,05 M asetat tamponunda (Acet) çözündü ve SD sıçanları rastgele kontrol prensibine göre 4 gruba ayrıldı: Grup 1 (Acon-1 mg) 1mg/kg Acon garajla verildi; Grup 2 (Acon-2 mg) intragastrik ile 2mg/kg Acon uygulandı; Grup 3 (Acet), intragastrik tarafından tamponlanmış 2 mL 0,05 M asetat uygulanır; ve Grup 4 (Kontrol, tedavi uygulanmadı). Örnekler, intragastrik uygulamadan 1, 3 ve 6 saat sonra alındı. Toplamda 36 fare incelendi; her grupta 1 saat, 3 saat ve 6 saat içinde 3 fare yapıldı. Her belirlenen zaman noktasında, EKG kayıtları ilk kez gerçekleştirilirdi. Daha sonra fareler anestezi edildi ve kan örnekleri serum biyokimyasal analizi için alındı. Kan alındıktan sonra fareler kurban edildi ve kalp dokusu hızla çıkarıldı. Miyokard dokusunun bazı bölümleri histolojik analiz için sabitlendi (HE ve Masson boyama), kalan dokular ise Western blotting ile protein ifade analizi için depolandı. JNK1/2 aktivatörleri ve inhibitörlerini test eden deneylerde, SD sıçanları rastgele kontrol prensibine göre 5 gruba ayrılacaktır: model gruba 2 mg/kg intragastrik Acon verilmiş, inhibitör grup ise başlangıçta 6 mg/kg SP600125²² mg intraperitoneal enjeksiyon almış, ardından 2 saat sonra 2 mg/kg Acon ve gavakaj uygulanmıştır. Agonist grubuna başlangıçta 0.1 mg/kg Anizomisin (Anis)^23,24 intraperitoneal enjeksiyon yapıldı^, ardından 2 saat sonra gavakaj ile 2 mg/kg Acon enjeksiyonu yapıldı. DMSO grubuna %0,8 DMSO kosolvent karışımı çözelti içeren 2 mL intraperitoneal enjeksiyon yapıldı. Kontrol grubu tedavi görmedi. Toplamda 15 fare incelendi. Tüm boyama sonuçları gözlemsel yanlılığı en aza indirmek için kör bir şekilde analiz edildi. Deney döneminde, sıçanlar Aconitine uygulamasından sonra sağlıklanma durumu ve şiddetli toksisite belirtileri açısından sürekli izlendi. Ölüm oranı her belirlenen gözlem zaman noktasında (1 saat, 3 saat ve 6 saat) kaydedildi. Ölüm, solunumun ve kalp atışının tamamen durması olarak tanımlanıyordu. Kalıcı nefes nefesi, düzeltici refleks kaybı, hareket edemeyme veya ölü durum gibi şiddetli sıkıntı gösteren hayvanlar, insancıl son noktaya ulaşmış sayıldı ve acıyı en aza indirmek için derin anestezi altında hemen ötenazi edildi. Her fare grubu için ölüm sayısı (Tablo 1–4).

Fare elektrokardiyogramı (EKG) izleme

Her gruptaki fareler EKG izlerine tabi tutuldu. Spesifik yöntem şöyleydi: anestezi sonrası sodyum pentobarbital intraperitoneal enjeksiyonla 30 mg/kg dozda. Fareler hayvan deney konsolunda sırtüstü pozisyonda sabitlenmişti. Bilgisayar, BL-420N biyolojik sinyal toplama ve analiz sistemine bağlandı ve EKG kablosu fişi BL-420N sisteminin 3 kanallı giriş portuna takıldı. Iğneler, farelerin sağ ön uzağının iç tarafına, sağ arka uzuvuna ve sol arka ayağına deri altı olarak yerleştirildi. Ameliyattan önce iğneler %75 alkolle islatıldı ve sterilize edildi, iğnelerin kaslara yerleştirilmemesi dikkat edildi. EKG kurşun tel elektrot klipsleri her bir uzvun pinlerine bağlandı. BL-420N biyolojik sinyal alım ve analiz sisteminin güç anahtarı ve sistem yazılımı açıldı. Sinyal alımı için kanal 3 seçildi ve sinyal türü fare EKG olarak belirlendi. Parametreler şu şekilde ayarlandı: örnekleme hızı, 1 kHz; menzil, 2.0 mV; zaman sabiti (yüksek geçirem filtreleme), 200 ms (0,80 Hz); alçak geçirim filtreleme, 100 Hz; tarama hızı, 200.0 ms/div; ve 50 Hz çentik filtresi kapatıldı. Lead II EKG kaydedildi ve EKG değişiklikleri gözlemlendi. EKG stabil hale geldikten sonra, 3 dakika boyunca izleme ve kayıt yapıldı ve veriler gruplar halinde sonraki analizler için kaydedildi. EKG kaydından sonra elektrot klipleri ve pinler çıkarıldı ve fareler kafeslerine geri getirildi. Fareler sıcak tutuldu ve boğulma kaynaklı ölümleri önlemek için anesteziden tam iyileşmeye kadar solunumları izlendi. Başlangıç EKG kayıtları herhangi bir tedaviden önce 1. günde yapıldı. 2. günde, farelere intragastrik gaaj ile Acon verildi ve aynı prosedürle uygulandıktan sonra 1 saat, 3 saat ve 6 saat içinde EKG kayıtları yapıldı.

Hematoksilin ve Eozin (HE) boyama ile Masson boyama

Kalpler yatay kısa eksen düzleminde kesildi ve SD sıçanların kalp apeksinden kalp dokusu toplanıp 24 saat boyunca oda sıcaklığında %4 poliformaldehit ile sabitlendi. Sabitlenmiş dokular kurutulmuş, ksilen ile temizlenmiş ve parafin mumuna gömülmüştür. Daha sonra, standart prosedüre uygun olarak 4 μm kalınlığında kesitler HE ve Masson boyama ile boyandı. HE boyamasında hematoksilin boyama işlemi 2 dakika yapıldı, ardından örnekler 1 dakika sıcak suda bekletildi ve ardından eozin boyama işlemi 30 saniye yapıldı. Masson boyamasında Weigert demir hematoksilin çözeltisi ile 5 dakika boyanın, ardından Masson mavi çözeltisi ile 3–5 dakika ve son olarak anilin mavisi çözeltisi ile 1–2 dakika boyanın. Slaytlar sıradan bir optik mikroskop altında gözlemlendi. Her bölüm için, aynı büyütmede üste bakışmayan beş mikroskobik alan rastgele seçildi, büyük kaplar ve belirgin artefaktlar kaçındı. Kolajen hacim fraksiyonu (CVF), Denklem (1)'e göre ImageJ kullanılarak hesaplandı:

(1)

Enzimle bağlantılı immünosorbent testi (ELISA)

EKG kaydedildikten sonra fareler sodyum pentobarbital ile anestezi edildi ve ardından venöz kan toplamak için orta hat laparotomisi yapıldı. Kan örnekleri, alt vena kava delikle, tek kullanımlık venöz kan toplama iğnesi kullanılarak alındı. Kan gece boyunca 4 °C'de kuluçka edildi ve süpernatant, 1000 × g seviyesinde 20 dakika boyunca santrifüjlendikten sonra toplandı. CK-MB, AST, LDH, cTn-1 ve h-FABP konsantrasyonları ELISA test kiti kullanılarak belirlendi. ELISA, üreticinin talimatlarına göre gerçekleştirildi. Her kuyunun optik yoğunluk (OD) değerleri, mikroplaka okuyucu kullanılarak 450 nm olarak belirlendi.

Western blotting analizi

Toplam protein, kalp dokularından protein ekstraksiyon kiti kullanılarak çıkarıldı. Protein konsantrasyonunu belirlemek için bir BCA Protein Analiz Kiti kullanıldı. Toplam protein (Test edilecek proteinin örnek hacmi 10 μL idi) %10 sodyum dodesil sülfat-poliakrilamid jel elektroforezi ile ayrıldı ve PVDF membranına aktarıldı; %5 yağsız sütte 30 dakika bloke edildi. Daha sonra, zar gece boyunca JNK1/2(1:500), p-JNK1/2 (1:1000) ve GAPDH (1:4000) birincil antikor ile inkübe edildi. Ertesi gün, tüm zarlar üç kez PBST ile yıkanmış ve ardından uygun ikincil antikor (1:5000) ile 1 saat kuluçka edilmiştir. Son olarak, sinyal tespiti için geliştirilmiş kemilyünüminesans reaktifleri kullanıldı; gelişen çözelti denge olarak PVDF membran şeritlerine damla olarak uygulandı ve 10 saniye kuluçkaya bırakıldı, ardından maruz kalma, geliştirme ve görüntüleme yapıldı. Western blot bandı yoğunlukları ImageJ yazılımı kullanılarak ölçüldü.

Moleküler kenetlenme doğrulaması

Aconitine'in SDF 3D moleküler yapısı PubChem veritabanından indirildi ve SDF yapısı OpenBabel yazılımı kullanılarak mol2 yapısına dönüştürüldü. JNK1 ve JNK2'nin en yüksek çözünürlüklü ve en uzun PDB protein yapıları Uniprot ve Protein Data Bank veritabanlarından indirildi. Makromoleküler proteinlerde hidrojenleme, ligand çıkarılması ve tam hidrojen eklemesi yapılırken, küçük molekül bileşiklerde tam hidrojen eklemesi ve elektron yüklemesi yapıldı ve torsiyon bağları belirlendi. Moleküler kenetlenme deneyleri, AutoDock Vina ile gerçekleştirildi ve burada -7.0 kcal/mol ≤ bağlanma afiniteleri güçlü ligand-protein etkileşimlerinin göstergesi olarak tanımlandı. PyMol, kenetlenme kompleksinin 3D yapısını görselleştirmek için kullanıldı, Discovery Studio ise kenetlenme kompleksinin 2D yapısını görselleştirmek için kullanıldı.

İstatistiksel analiz

Tüm deneyler bağımsız olarak üç kez tekrarlandı. Tüm verileri istatistiksel olarak analiz etmek ve grafiklemek için GraphPad Prism 8 kullanıldı. Verilerin tamamı ortalama ± standart sapma (SD) olarak gösterildi. Öğrencinin t-testi iki grup arasındaki karşılaştırmalar için kullanıldı. Aynı zaman noktasındaki birden fazla grup arasındaki karşılaştırmalar veya aynı grup içindeki zaman akışı analizleri için tek yönlü ANOVA kullanılmıştır. p < 0.05 istatistiksel olarak anlamlı²⁵ olduğunu göstermektedir.

Sonuçlar

Acon gavajı sonrası farelerin EKG sonuçları

Önceki çalışmalar, Aconitine'in toksik etkilerinin genellikle uygulamadan sonraki saatler içinde erken aşamada^{ortaya çıktığını göstermiştir 26,27}. Bu nedenle, bu zaman aralığında akut kardiyotoksisitenin erken oluşmasını ve ilerlemesini yakalamak için, deneyler için üç zaman noktası seçtik: 1 saat, 3 saat ve 6 saat. Elektrokardiyogram sonuçları, 1 saat, 3 saat ve 6 saat Acon etkisi sonrası kontrol grubunda ve Acet grubunda aritmi olmadığını, EKG değişikliklerinin belirgin olmadığını gösterdi. Acon-1mg grubundaki farelerde erken ventriküler kasılmalar ve erken ventriküler bigemi vardı; bunlar sırasıyla erken ventriküler üçlü, kısa patlamalı ventriküler taşikardi, monomorfik ventriküler taşikardi, çift yönlü ventriküler taşikardi ve bir veya daha fazla ventriküler aritmi. Acon-2 mg grubundaki farelerde erken ventriküler kasılmalar, erken ventriküler bigemini, kısa patlama ventriküler taşikardi ve iki yönlü ventriküler taşikardi gibi bir veya daha fazla ventriküler aritmi, gelişmiş (Şekil 1, Ek Şekiller 1–2). Acon, miyokardiyal patolojik hasarı artırır ve sıçan miyokardiyal dokusunda kolajen boyalanmasını artırır.

Miyokard dokusu HE boyama ile değerlendirildi. Sonuçlar, kontrol grubu ve Acet grubuna kıyasla, 1 saat, 3 saat ve 6 saat Acon tedavisinden sonra, Acon-1 mg grubundaki SD sıçanların miyokard dokusunda miyokard kas liflerinin kısmi yırtığı, miyokard hücrelerinin düzensizliği, miyokard interstisiyumunun genişlediği, miyokard interstisiyumunda ödem görüldüğünü gösterdi. Miyokard hücrelerinin çoğu şişmiş, çekirdekler derin lekelenmiş ve yoğunlaşmış, çok sayıda miyokard hücresi dejenerasyon geçirir ve miyokard lifi sitoplazmasında yuvarlak vakuollar oluşur (oklarla belirtilir). Acon-2 mg grubundaki SD sıçanların miyokard dokusundaki kas lifi çizgileri belirsizdi veya kayboldu; Kas demetlerinin düzeni gevşek ve düzensizdi, kas arası boşluklar genişlemiş, çok sayıda hücre çekirdeği derin lekelenmiş durumda, nükleer piknoz, hücre arası ödem ve miyokard hücreleri şişmiş ve dejenere olmuştu. Miyokard liflerinin sitoplazmasında yuvarlak vakuollar (oklarla gösterilmiştir) görülmüştür (Şekil 2A, Ek Şekil 3A, Ek Şekil 4A).

Miyokardiyal dokuda kollajen birikimini değerlendirmek için masson boyama yapıldı. Kontrol ve Acet gruplarında, kardiyomiyositler normal morfoloji sergilemiş, miyokard interstitiyumunda minimal kolajen birikimi gözlemlenmiştir. Acon-1 mg grubunda, bazı ara bölgelerde mavi boyalı kolajen miktarında hafif artışlar gözlemlenmiştir. Acon-2 mg grubunda, daha geniş mavi boyalı bölgeler miyokard dokusu boyunca dağınık şekilde yayılmış, düzensiz miyofilament düzeni ve normal miyokard yapısının bozulması ile birlikte gerçekleşmiştir. Acon-2 mg grubundaki kolajen boyama kapsamı, Acon-1 mg grubundan daha fazlaydı. Kantitatif analiz, hem Acon-1 mg hem de Acon-2 mg gruplarında kolajen hacim fraksiyonunun (CVF) Kontrol ve Acet gruplarına kıyasla anlamlı şekilde arttığını gösterdi (n = 3 fare, tek yönlü ANOVA, p < 0.05). Özellikle, CVF değeri Acon-2 mg grubunda intragastrik uygulamadan 6 saat sonra en yüksek seviyesine ulaşmıştır (Şekil 2B, Ek Şekil 3B, Ek Şekil 4B). Kısa gözlem süresi (1–6 saat) göz önüne alındığında, bu bulgular daha çok akut interstisyel değişiklikleri, örneğin ödem veya kollajen boyama desenlerindeki değişiklikleri yansıtma olasılığı daha yüksektir; yerleşik miyokard fibrozisi değil. Ayrıca, Acon-1 mg veya Acon-2 mg tedavisinden sonra 1 saat, 3 saat ve 6 saat içinde gruplar arasında kalp ağırlığında anlamlı bir fark yoktu (Tablo 5).

Acon, farelerin venöz kanındaki kalp enzimlerini ve kardiyak protein seviyelerini artırır

Acon'a bağlı miyokard hasarını değerlendirmek için, CK-MB, AST, LDH, cTn-I ve h-FABP dahil olmak üzere serum kardiyak hasar belirteçleri seviyelerini ölçtük. Kontrol ve Acet gruplarıyla karşılaştırıldığında, Acon-1 mg ve Acon-2 mg grupları 1 saat, 3 saat ve 6 saatte (n = 3 fare her grup, tek yönlü ANOVA, p < 0.05) CK-MB, AST, LDH, cTn-I ve h-FABP seviyelerinde anlamlı artış gösterdi. Ayrıca, aynı zaman noktalarında bu belirteçlerdeki artışlar Acon-2 mg grubunda, Acon-1 mg grubuna göre daha belirgindir (p < 0.05) (Şekil 3).

Moleküler kenetlenme sonuçları

Acon'un farelerde miyokard hasarının sinyal yolu üzerindeki etkisini daha ayrıntılı incelemek için, Acon ile ilişkili yol proteinlerini belirlemek için moleküler kenetlenme kullandık. Kenetlenme sonuçları, Acon'un JNK1 ve JNK2'nin aktif ceplerine birden fazla kovalent olmayan etkileşimle istikrarlı şekilde bağlanabildiğini gösterdi. JNK1'de, Aconitine, ALA267 ve SER299 ile sırasıyla 2.0 şve 2.1 şbağ mesafelerine sahip iki geleneksel hidrojen bağı oluşturdu; bu da ligand sabitlenmesine katkıda bulunan güçlü yönlü etkileşimleri gösterir. Ayrıca, Aconitine ile çevresindeki kalıntılar arasında kapsamlı van der Waals etkileşimleri gözlemlenmiş, bu da bağlanma cepinde yakın mekânsal tamamlayıcılığı sağlamıştır. ILE304 ile Alkil/π-Alkil etkileşimleri dahil olmak üzere hidrofobik etkileşimler, ligandı hidrofobik mikroçevre içinde daha da stabilize etmiştir. Karbon-hidrojen bağları da tanımlanmış, ligand bağlanmasını destekleyen işbirlikçi bir etkileşim ağı oluşturmuş (Şekil 4A–C). JNK2'de, Aconitine, LEU302 (2.1 Å) ile bir geleneksel hidrojen bağı oluşturdu ve bu da ana bir ankraj etkileşimi olarak hizmet verdi. JNK1'e benzer şekilde, van der Waals etkileşimleri, hidrofobik etkileşimler ve karbon-hidrojen bağları birlikte ligand-protein kompleksinin stabilizasyonuna katkıda bulundu (Şekil 4D–F). Test edilen bileşiklerin kenetlenme sonuçları bağlanma skorları (kcal/mol) olarak bildirilir ve Tablo 6'da sunulur. Genel olarak, hidrojen bağları özgüllük ve sabitleme sağladı, hidrofobik etkileşimler ligand gömülüşünü ve bağlanma afinitesini artırdı ve van der Waals etkileşimleri genel karmaşık stabiliteye katkıda bulundu. Bu bulgular, Aconitine'in hem JNK1 hem de JNK2 ile stabil kompleksler oluşturabildiğini ve hedefleme ajanı olarak potansiyelini desteklediğini göstermektedir.

Acon, JNK fosforilasyon seviyesini yükseltiyor

Acon'un miyokard dokusunda JNK sinyal yolu üzerindeki etkisini daha fazla incelemek için, JNK1/2 fosforilasyonunun ekspresyonu Western blotting ile değerlendirildi. Kontrol ve Acet gruplarına kıyasla, Acon-1 mg ve Acon-2 mg gruplarında p-JNK1/2 seviyeleri anlamlı artış gösterdi (n = 3 fare grup başında, tek yönlü ANOVA, p < 0.05). Ayrıca, JNK1/2'nin fosforilasyon seviyesi, Acon-2 mg grubunda Acon-1 mg grubuna göre anlamlı derecede yüksekti (p < 0.05) (Şekil 5A). Acon-2 mg grubu içinde, farklı zaman noktaları arasındaki karşılaştırmalar p-JNK1/2 seviyelerinin 1 saat, 3 saat ve 6 saat içinde anlamlı şekilde arttığını, en yüksek seviyenin ise 6 saatte gözlemlendiğini gösterdi (n = 3 fare grup başında, tek yönlü ANOVA, p < 0.05) (Şekil 5B). Bu sonuçlara dayanarak, sonraki deneyler için 6 saat içinde Acon-2 mg grubu seçildi.

JNK inhibitörü, sıçan miyokardil dokusunda miyokard patolojik hasarını ve kollajen boyalanmasını hafifleter

JNK sinyal yolunun düzenleyici rolünü daha fazla değerlendirmek için, miyokard dokusunda p-JNK1 ve p-JNK2'nin ifade seviyeleri Western blotting ile değerlendirildi. Kontrol ve DMSO gruplarına kıyasla Acon grubunda p-JNK1 ve p-JNK2 ifade seviyelerinde anlamlı artış gösterdi (n = 3 fare grup başında, tek yönlü ANOVA, p < 0.05). Acon grubuyla karşılaştırıldığında, Acon+SP600125 grubunda p-JNK1 ve p-JNK2 seviyelerinde anlamlı azalma görüldü (n = 3 fare grup başında, tek yönlü ANOVA, p < 0.05). Buna karşılık, Acon+SP600125 grubuna kıyasla Acon + Anis grubunda p-JNK1 ve p-JNK2 ifade seviyeleri anlamlı artış gösterdi (n = 3 fare her grup, tek yönlü ANOVA, p < 0.05) (Şekil 6).

Anis ve SP600125'in miyokard hasarı üzerindeki etkileri daha fazla araştırıldı. HE boyama sonuçları, Acon grubuna kıyasla Acon+SP600125 grubundaki miyokard dokusunun interstisyel ödeminin azaldığını, bazı kardiyomiyositlerin şişmesinin kaybolduğunu ve hücre sitoplazmasının uniform olduğunu gösterdi. Kas boşluğu doludur, kaslar arası boşluk incelir, bazı miyokardiyal lifler sıkı ve düzenli düzenlenir, az sayıda hücre çekirdeği derin lekeyle boyanmıştır ve miyokard liflerinin sitoplazmasında küçük yuvarlak vakuoller bulunur ve miyokard patolojik hasarı hafiflemiştir. Acon+SP600125 grubuyla karşılaştırıldığında, Acon + Anis grubunda miyokard lifleri kırılmış, kas boşlukları genişlemiş, miyokard lifleri gevşek ve düzensiz düzenli, miyokard hücreleri şişmiş ve dejenere olmuş, nükleer kromatin derin lekelenmiş ve hücrelerarası ödem oluşmuştur (Şekil 7A).

Miyokardiyal dokuda kollajen boyama değerlendirmek için masson boyama yapıldı. Acon+SP600125 grubunda, miyokard interstisiyumunda orta derecede mavi lekeli alanlar gözlemlenmiştir. Acon grubuyla karşılaştırıldığında, Acon+SP600125 grubundaki kolajen hacim fraksiyonu (CVF) anlamlı şekilde azalmıştı; bu da Aconitine kaynaklı interstisyel değişikliklerin azaldığını gösteriyor. Buna karşılık, Acon + Anis grubunda, miyokard interstitiyumunda Acon+SP600125 grubuna kıyasla daha geniş mavi boyalı kolajen alanları gözlemlendi ve CVF'de anlamlı bir artış (n = 3 fare, tek yönlü ANOVA, p < 0.05) (Şekil 7B) görüldü. Ayrıca, gruplar arasında kalp ağırlığında anlamlı bir fark yoktu (Tablo 5). Kısa gözlem süresi (1–6 saat) göz önüne alındığında, bu değişikliklerin yerleşik miyokard fibrozisi yerine ödem veya kollajen boyama desenlerindeki değişiklikler gibi akut interstisyel değişiklikleri yansıtma olasılığı daha yüksektir. Bu bulgular, SP600125 Aconitine kaynaklı miyokardiyal hasarı hafiflettiğini, Anizomycin ise bu deneysel koşullarda miyokard hasarını daha da kötüleştirdiğini göstermektedir.

JNK inhibitörü, fare serumunda kalp enzimleri ve kardiyak proteinlerin ekspresyonunu hafifleter

ELISA sonuçları, Acon grubuna kıyasla Acon + SP600125 grubunda CK-MB, AST ve LDH ifadelerinin anlamlı şekilde azaldığını, Anis etkisinden sonra ise CK-MB, AST ve LDH ifadelerinin arttığını gösterdi (n = grup başına 3 fare sayısı, tek yönlü ANOVA, p < 0.05). Ayrıca, Acon grubuna kıyasla cTn-I ve h-FABP ifadesi Acon + SP600125 grubunda anlamlı şekilde azaldı (n = 3 fare her grup, tek yönlü ANOVA, p < 0,05). Acon + SP600125 grubuyla karşılaştırıldığında, cTn-I ve h-FABP ekspresyonu Acon + Anis grubunda anlamlı şekilde artmıştır (n = 3 fare, tek yönlü ANOVA, p < 0,05) (Şekil 8A–8B).

VERİ ERIŞILEBILIRLIĞI:

Bu çalışmada kullanılan tüm ham veriler, el yazmasına ekli ek dosyalarda mevcuttur.

Şekil 1: Sıçanlarda aritmin elektrokardiyogram örneği (6 saat Acon etkisi sonrası). Yukarıdan aşağıya Kontrol grubu, Acet grubu, Acon-1 mg grubu ve Acon-2 mg grubu. Acon-1mg-A-gavaj ve Acon-2 mg-A-gavajda aritmi türleri (aritmi oluşum sırasına göre yukarıdan aşağıya): Acon-1mg-A-gavaj: erken ventriküler kasılmalar; erken ventriküler bigemini; çift yönlü ventriküler taşikardi. Acon-2 mg-A-gavaj: erken ventriküler kasılmalar; erken ventriküler bigemini; Kısa süreli ventriküler taşikard patlaması. Kısaltmalar; B-gavage = Acon gavage'den önce; A-gavage = Acon gavage'den sonra. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: HE ve Masson boyama ile belirtilen sıçan miyokard dokusunda miyokard hasarı ve kolajen boyama. (A) Fare miyokardiyal dokusundaki patolojik değişiklikler HE boyama ile tespit edildi (sarı ok, hasar görmüş kardiyomiyositlerin oluşturduğu yuvarlak vakuolleri gösterir); ölçek çubuğu = 100 μm. (B) Fare miyokard dokusunda kolajen boyama Masson boyama ile tespit edildi; ölçek = 50 μm. Ortalama ± SD, n = 3. Tüm P-değerleri bağımsız tek yönlü varyans analiziyle hesaplandı. *p < 0.05, **p < 0.01. 40x ve 400x. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Fare serumundaki CK-MB, AST, LDH, cTn-I ve h-FABP seviyeleri miyokard hasarını göstermiştir. (A–F). CK-MB, AST, LDH, cTn-I ve h-FABP seviyeleri ELISA kitleri kullanılarak ölçüldü. Ortalama±SD, n = 3. Tüm p-değerleri bağımsız tek yönlü varyans analiziyle hesaplandı. *p < 0.05, **p < 0.01. Kısaltmalar; CK-MB = Kreatin Kinaz-MB; AST = Aspartat aminotransferaz; LDH = Laktat dehidrojenaz; cTn-I = Kardiyak Troponin I; h-FABP = kalp tipi yağ asidi bağlayan protein. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: Acon'un JNK yolu ile moleküler kenetlenme sonuçları. (A–B) ve (D–E) Acon'un JNK1/2 proteini ile 2D etkileşim diyagramları. (C) ve (F) Acon'un JNK1/2 proteini ile 3D etkileşim diyagramları. Kısaltmalar; JNK = c-Jun N-terminal Kinaz. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 5: Acon, JNK fosforilasyon seviyesini yükseltir. (A–B) Fare miyokardiyal dokularındaki p-JNK1/2 ve JNK1/2 ifade seviyeleri Western blotlama ile tespit edildi. Ortalama ± SD, n = 3. Tüm p-değerleri bağımsız tek yönlü varyans analiziyle hesaplandı. *p < 0.05, *p < 0.01. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 6: JNK inhibitörü, Acon kaynaklı JNK fosforilasyonunu inhibe eder. Fare miyokardiyal dokularındaki p-JNK1/2 ve JNK1/2 ifade seviyeleri Western blotlama ile tespit edildi. Ortalama ± SD, n = 3. Tüm p-değerleri bağımsız tek yönlü varyans analiziyle hesaplandı. *p < 0.05, **p < 0.01. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 7: JNK inhibitörü, farelerde miyokard patolojik hasarını ve kollajen boyamasını hafifletmektedir. (A) Fare miyokard dokularındaki patolojik değişiklikler HE boyama ile tespit edilmiştir (sarı ok, hasar görmüş kardiyomiyositlerin oluşturduğu yuvarlak vakuolleri gösterir); ölçek = 100 μm. (B) Fare miyokard dokusunda kolajen boyama Masson boyama ile tespit edildi; ölçek = 50 μm. Ortalama±SD, n = 3. Tüm p-değerleri bağımsız tek yönlü varyans analiziyle hesaplandı. *p < 0.05, **p < 0.01. 40 ve 400x. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 8: JNK inhibitörü, fare serumunda CK-MB, AST, LDH, cTn-I ve h-FABP seviyelerini aşağı düşürür. (A–B) CK-MB, AST, LDH, cTn-I ve h-FABP ekspresyon seviyeleri ELISA test setleriyle tespit edildi. Tüm p-değerleri bağımsız tek yönlü varyans analiziyle hesaplandı. Ortalama±SD, n = 3. *p < 0.05, **p < 0.01. Kısaltmalar; CK-MB = kreatin kinaz-MB; AST = aspartat aminotransferaz; LDH = laktat dehidrojenaz; cTn-I = kardiyak troponin I; h-FABP = kalp tipi yağ asidi bağlayan protein. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

	Kontrol	Aset	Acon-1 mg	Acon-2 mg
Fareler	9	9	9	9
Fare ölümleri sayısı	0	0	0	0

Tablo 1: Acon etkisinin 1 saatinden sonra fare ölümleri. Acon uygulamasından 1 saat sonra, kontrol grubu, Acet grubu, Acon-1 mg grubu ve Acon-2 mg grubunda fare ölmedi. (Analize nihayet dahil edilen hayvan sayısı her grup başına 3 idi ve ölü fareler yerine getirilmedi).

	Kontrol	Aset	Acon-1 mg	Acon-2 mg
Fareler	9	9	9	9
Fare ölümleri sayısı	0	0	0	0

Tablo 2: Acon etkisinin 3 saatinden sonra fare ölümlerinin sayısı. Acon uygulamasından 3 saat sonra, Kontrol grubu, Acet grubu, Acon-1 mg grubu ve Acon-2 mg grubunda fare ölmedi. (Analize nihayet dahil edilen hayvan sayısı her grup başına 3 idi ve ölü fareler yerine getirilmedi).

	Kontrol	Aset	Acon-1 mg	Acon-2 mg
Fareler	9	9	9	9
Fare ölümleri sayısı	0	0	4	4

Tablo 3: Acon etkisinin 6 saatinden sonra fare ölümlerinin sayısı. Acon uygulamasından 6 saat sonra, 9 fareden 4'ü Acon-1 mg grubunda, 9 fareden 4'ü ise Acon-2 mg grubunda öldü. (Analize nihayet dahil edilen hayvan sayısı her grup başına 3 idi ve ölü fareler yerine getirilmedi).

	Kontrol	DMSO	Acon	Acon + SP600125	Acon + Anis
Fareler	9	9	9	9	9
Fare ölümleri sayısı	0	0	3	1	3

Tablo 4: Anis ve eylem sonrası fare ölümleri SP600125 sayısı. Fare ölüm sayısı farklı tedavi grupları arasında değişiyordu: Acon-2 mg grubunda 9 fareden 3'ü öldü; Acon+SP600125 grubunda ise 9 fareden 1'i öldü; Acon + Anis grubunda ise 9 fareden 3'ü öldü. (Analize nihayet dahil edilen hayvan sayısı her grup başına 3 idi ve ölü fareler yerine getirilmedi).

Grup	Kalp ağırlığı (g)
Kontrol	0.71 ± 0.03
Aset	0.73 ± 0.02
Acon-1mg (1 saat)	0.73 ± 0.06
Acon-2mg (1 saat)	0.75 ± 0.02
Acon-1mg (3 saat)	0.71 ± 0.04
Acon-2mg (3 saat)	0.77 ± 0.03
Acon-1mg (6 saat)	0.72 ± 0.03
Acon-2mg (6 saat)	0.77 ± 0.02
DMSO	0.70 ± 0.03
Acon + SP600125	0.74 ± 0.03
Acon + Anis	0.75 ± 0.04

Tablo 5: Farelerin kalp ağırlığı. Gruplar arasında kalp ağırlığında anlamlı bir fark yoktu.

Ligand	JNK1	JNK2
Acon	-7.8 Kcal/mol	-8.41 Kcal/mol

Tablo 6: Moleküler kenetlenme çalışmalarının sonuçları. Acon ile JNK1 arasındaki kenetlenme puanları -7.8 Kcal/mol, Acon ile JNK2 arasındaki kenetlenme skorları ise -8.41 Kcal/mol'dur.

Ek Şekil 1: Sıçanlarda aritmin elektrokardiyogram illüstrasyonu (1 saat Acon etkisi sonrası). Yukarıdan aşağıya Kontrol grubu, Acet grubu, Acon-1 mg grubu ve Acon-2 mg grubu. Acon-1mg-A-gavaj ve Acon-2 mg-A-gavaj aritmi türleri (aritmi oluşum sırasına göre yukarıdan aşağıya): erken ventriküler kasılmalar; erken ventriküler bigemini; erken ventriküler üçl; kısa patlama ventriküler taşikardi; monomorfik ventriküler kalp atışı Taşikardi; çift yönlü ventriküler taşikardi. Acon-2 mg-A-gavaj: İki yönlü ventriküler taşikard. Kısaltmalar; B-gavage = Acon gavage'den önce; A-gavage = Acon gavage'den sonra. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 2: Farelerde aritmin elektrokardiyogram örneği (3 saat Acon etkisi sonrası). Yukarıdan aşağıya Kontrol grubu, Acet grubu, Acon-1 mg grubu ve Acon-2 mg grubu. Acon-1mg-A-gavaj ve Acon-2 mg-A-gavajda aritmi türleri (aritmi oluşum sırasına göre yukarıdan aşağıya): Erken ventriküler kasılmalar; kısa dönem ventriküler taşikard patlamaları; çift yönlü ventriküler taşikardi. Acon-2 mg-A-gavaj: Erken ventriküler kasılmalar; çift yönlü ventriküler taşikardi. Kısaltmalar; B-gavage = Acon gavage'den önce; A-gavage = Acon gavage'den sonra. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 3: Acon, 1 saat Acon etkisi sonrası miyokard hasarını ve kolajen boyamasını teşvik eder. (A) Fare miyokardiyal dokularındaki patolojik değişiklikler HE boyama ile tespit edildi (Not: sarı ok, hasar görmüş kardiyomiyositlerin oluşturduğu yuvarlak vakuolları gösterir); ölçek = 100 μm. (B) Fare miyokard dokusunda fibroz, Masson boyama ile tespit edildi; ölçek = 50 μm. Ortalama ± SD, n = 3. Tüm p-değerleri bağımsız tek yönlü varyans analiziyle hesaplandı. *p < 0.05, **p < 0.01, 40x ve 400x. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 4: Acon, 3 saat Acon etkisi sonrası miyokardiyal hasarı ve kollajen boyalanmasını teşvik eder. (A) Fare miyokardiyal dokularındaki patolojik değişiklikler HE boyama ile tespit edilmiştir (sarı ok, hasar görmüş kardiyomiyositlerin oluşturduğu yuvarlak vakuolları gösterir); ölçek = 100 μm. (B) Fare miyokard dokusunda kolajen boyama Masson boyama ile tespit edildi; ölçek = 50 μm. Ortalama ± SD, n = 3. Tüm p-değerleri bağımsız tek yönlü varyans analiziyle hesaplandı. *p < 0.05, **p < 0.01. 40x ve 400x. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

Acon, aritmiler ve miyokard hasarına neden olabilir; ancak Acon kaynaklı miyokard hasarının altında yatan mekanizmalar belirsizdir. Bu çalışmada, miyokardiyal hasarla akut Acon zehirlenmesinin fare modeli başarıyla oluşturulmuştur. Bu sonuçlar, JNK sinyal yolunun aktivasyonunun, akut Acon zehirlenmesinden kaynaklanan miyokard hasarında önemli bir aşağı akış mekanizması olabileceğini gösterdi. Özellikle, JNK1/2 fosforilasyon seviyeleri, Acon kaynaklı aritmiler ve miyokard hasarı olan farelerde anlamlı şekilde yükselmiştir. Ayrıca, JNK yolunun inhibisyonu, akut Acon zehirlenmesinden kaynaklanan miyokard hasarını kısmen tersine çevirmiştir. Bu bulgular, JNK yolunun aktivasyonunun Aconitine kaynaklı miyokardiyal hasarın patogenezinde önemli bir rol oynadığını göstermektedir.

Akut Acon zehirlenmesinden ölümün başlıca nedeni kardiyotoksisitedir. Önceki çalışmalar, Acon tedavisinden sonra farelerdeki miyokard liflerinin dejenere ve düzensizleştiğini, nükleer boyamanın derinleştiğini, nötrofil infiltrasyonunun gerçekleştiğini ve yuvarlak vakuollerin ortaya çıktığını^{göstermiştir 28}. Bu, araştırma sonuçlarıyla tutarlıdır. HE boyama, Acon tedavisi gören gruptaki miyokard dokusunda kas demetlerinin düzensizliği, kas boşluklarının genişlemesi ve kas liflerinin kopması gibi patolojik değişiklikler gösterdiğini ortaya koydu. Ayrıca, normal koşullarda, kalp enzimleri CK-MB, AST, LDH ve kalp proteinleri cTn-I ile h-FABP^{serumda çok az miktarda bulunur 29}. Miyokardiyal hücreler zarar gördüğünde, bu işaretleyiciler büyük miktarlarda kana^salınır 30,31,32,33.

Bu çalışmanın sonuçları, Acon gavaj grubundaki sıçanların venöz serumunda CK-MB, AST, LDH, cTn-I ve h-FABP seviyelerinin her gözlem zaman noktasında farklı derecelerde arttığını göstermektedir. İfade seviyesi, intragastrik uygulamada 6 saat sonra en yüksek seviyede görülür. Bu bulgu, önceki çalışmalarla^{tutarlıdır 34}. Acon'un sıçan H9C2 kardiyomiyositlerine zarar verdiğini ve AST seviyelerini yükselttiğini tespit ettiler. Bu arada, önceki çalışmalar Acon'u sıçanlarda miyokard hasarı oluşturmak için kullanmış, böylece panzehirlerin miyokard hasarı üzerindeki^{etkilerini incelemiştir 35}. Miyokardiyal hasarı olan sıçanların serumundaki LDH ve CK-MB seviyelerinin yüksek olduğunu buldular. Kısacası, miyokard hasarı belirteçlerinin ortak tespitinin deneysel sonuçları, akut Acon zehirlenmesiyle indüklenen miyokard hasarının fare modelinin 1–2 mg/kg Acon intragastrik uygulamasından 1, 3 ve 6 saat sonra başarıyla belirlenebileceğini göstermektedir. 6 saat intragastrik uygulamadan sonra 2 mg/kg Acon'un modelleme etkisi en iyisidir ve sonraki deneylerin gereksinimlerini karşılar.

Çalışmalar, Acon'un Na⁺ ve Ca²⁺ iyon kanalları üzerindeki etkisinin hücre içi kalsiyum iyon konsantrasyonunda artışa yol açtığını, bunun da P38-MAPK sinyal yolunu daha da aktive ettiğini ve ardından JNK kaskad^{reaksiyonu 36,37,38'i} tetiklediğini ortaya koymuştur. JNK aktivasyonu miyokardial^{hasarı 39,40} artıracaktır. Bu, bu deneyin sonuçlarıyla tutarlıdır. Bu çalışmada Acon'un kardiyomiyositlerde JNK1/2 fosforilasyonunu teşvik ettiğini ve JNK sinyal yolunu aktive ettiğini gördük. Bu, JNK aktivasyonunun Aconitine kaynaklı miyokard hasarına katkıda bulunan bir sinyal yanıtı olabileceğini gösterir. Ancak, Acon'un JNK1/2 fosforilasyonunu uyarmasının altında yatan moleküler ve farmakokinetik mekanizmalar daha fazla araştırma gerektirir.

Çalışmalar, JNK1/2'nin büyük miktarda fosforile edildiğinde JNK sinyal yolunun aktive olduğunu, bunun da kardiyomiyositlerin çekirdeğindeki genlerin kontrolsüz ifadesini aracılık ettiğini ve hücre döngüsünü bozduğunu göstermiştir. JNK sinyal yolunun inhibisyonu miyokardiyal hasarı^{hafifletebilir 41,42}. HE sonuçlarında, JNK yol inhibitörü SP600125 Acon tarafından indüklenen miyokard dokusunda patolojik değişiklikleri önemli ölçüde azaltabilir. Bu arada, önceki çalışmalar, koroner arter ligasyonuyla indüklenen akut miyokard enfarktüsü fare modelinde, mavi boyalı kolajen liflerinin ve miyokard dokusunda kolajen birikiminin belirgin şekilde arttığını, JNK sinyal yolunun aktivasyonuyla birlikte gerçekleştiğini göstermiştir. Geleneksel Çin tıp granülleriyle tedavi, JNK sinyal yolunun inhibisyonu yoluyla miyokard kollajen birikmesini^{azaltmıştır 43,44}.

Diyabetik miyokard hasarı olan farelerde kolajen lif içeriği (mavi boyalanma) ve kolajen hacim fraksiyonu (CVF) anlamlı şekilde artmıştır. Aynı zamanda, JNK sinyal yolu etkinleştirildi. Düşük dozlu etanol, JNK yolu aktivasyonunu inhibe ettiği bildirilmiştir; böylece sıçan miyokardi dokusunda kolajen lifi birikiminin ve CVF artışını^{azaltmıştır 45}. Mevcut çalışmada, moleküler kenetlenme analizi, Aconitine'in JNK1 ve JNK2 ile birden fazla kovalent olmayan etkileşim yoluyla etkileşebileceğini göstermiştir; ancak bu sonuçlar destekleyici kanıt olarak kabul edilmeli ve fizyolojik bağlılığın doğrudan kanıtı teşkil edilmemelidir. Ayrıca, in vivo deneyler, Acon'un bir strestör olarak JNK1/2 fosforilasyonunu artırdığını ve böylece JNK sinyal yolunu aktive ettiğini göstermiştir. Bu aktivasyon, sıçan miyokardiyal dokusunda artan kollajen birikimiyle (mavi boyalanma) ve yüksek CVF ile ilişkilendirilmiş, bu da nihayetinde miyokard hasarına yol açmıştır. Ancak, JNK inhibitörü eklenmesi Acon'un toksik etkilerini önemli ölçüde inhibe SP600125 ve miyokard dokusunun CVF değerindeki artışı azaltmıştır. Miyokard hasarı, normal kardiyak miyosit zar bütünlüğünü ve hücre içi içeriğin hücre dışı boşluğa kaybını bozur; bu da kandaki miyokard enzimlerinin artması olarak^{görülür 46,47}. Bu sonuçlar, sıçan kanındaki miyokard enzim seviyelerindeki artışın Acon'un miyokard hasarına neden olduğunu da gösterdiğini göstermiştir. Aynı zamanda, JNK inhibitörleri miyokard enzimlerinin salgılanmasını inhibe eder; bu da JNK inhibitörlerinin Acon tarafından neden olduğu miyokard hasarını kısmen hafifletebileceğini öne sürmektedir.

Bu çalışmanın birkaç sınırlaması kabul edilmelidir. İlk olarak, her zaman noktasında örneklem büyüklüğü nispeten küçüktü (n = 3 grup başında), bu da analizlerin istatistiksel gücünü sınırlayabilir ve örneklem büyüklüğü belirlenmeden önce resmi bir güç analizi yapılmamıştır. Ayrıca, yalnızca tek bir Aconitine doz aralığı ve nispeten kısa gözlem süreleri (1–6 saat) değerlendirildi; bu da uzun vadeli patolojik değişiklikler ve doz yanıt ilişkilerinin değerlendirilmesini sınırladı. İkincisi, artan JNK1/2 fosforilasyonu ve farmakolojik müdahale, JNK sinyal yolunun Aconitine kaynaklı miyokard hasarına dahil olduğunu gösterse de, Aconitine maruziyeti ile JNK aktivasyonunu bağlayan üst akış mekanizmaları tam olarak araştırılmamıştır. Akonitin, öncelikle gerilim kapılı Na⁺ kanallarını ve hücre içi Ca²⁺ homeostazını etkilediği bilinir ve bunlar aşağı akış JNK aktivasyonuna katkıda bulunabilir. Ancak, oksidatif stres ve kalsiyum aşırı yüklenme yolları gibi ilgili sinyal olayları bu çalışmada doğrudan incelenmemiştir. Üçüncü olarak, moleküler kenetlenme analizi yalnızca Aconitine ile JNK1/2 arasındaki potansiyel etkileşimlere dair destekleyici kanıtlar sağlamış ve doğrudan fizyolojik bağlanmayı temsil etmiyordu. Yüzey plazmon rezonansı veya pull-down testleri gibi ek deneysel doğrulama yapılmadı. Ayrıca, sadece JNK1/2 araştırılmış, JNK3'ün Aconitine kaynaklı kardiyotoksisitedeki potansiyel rolü ise belirsizdir. Son olarak, SP600125 veya anisin müdahalesinden sonra elektrokardiyografik değerlendirme yapılmadı. Bu nedenle, JNK yol düzenlemesinin Aconitine kaynaklı ventriküler aritmileri doğrudan etkileyip etkilemediği daha fazla araştırma gerektirir.

Özetle, Acon JNK sinyal yolunu aktive eder; JNK1/2'nin artan fosforilasyonu ile kanıtlanmıştır; bu, fare miyokardial dokusunda artan kolajen birikimi ve yüksek kalp enzim salınımıyla gösterildiği gibi, miyokard hasarına katkıda bulunabilir. Aconitine kaynaklı kardiyotoksisite, Na⁺ kanalı aktivasyonu, Ca²⁺ aşırı yükü ve oksidatif stres gibi birden fazla yukarı akış olayı içerdiği göz önüne alındığında, JNK yolunun aktivasyonu, miyokard hasarına katkıda bulunan önemli bir aşağı sinyal olayını temsil edebilir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
%4 Paraformaldehit	Wuhan Servis-biyoloju Şirketi, Ltd.	HJ203501	Doku fiksasyonu
Aconitine (Acon)	Chengdu DeSiTe Biyolojik Teknoloji A., Ltd.	DRK-0335-960330	Gavaj modeli için toksik bileşik
Anilin Mavisi Çözeltisi	Pekin Solarbio Co., Ltd.	G1350	Masson boyama
Anizomisin (Anis)	MedChemExpress Co., Ltd.	153154	JNK yol aktivatörü/kontrolü
AST ELISA Kiti	Wuhan Huamei Biyoteknoloji Şirketi, Ltd.	CSB-E13023r	Kardiyak enzim tespiti
AutoDock Vina	Açık kaynak	Yok	Moleküler kenetleme
BCA Protein Test Kiti	Sangon Biotech (Şanghay, Çin)	Belirtilmedi	Protein niceliklendirmesi
Santrifüj	Dongguan cnzcn Co., Ltd.	TD5M-WS	1000 & Times; g santrifüjasyonu
Chem3D Yazılımı	PerkinElmer	Yok	Ligand enerjisi minimizasyonu
CK-MB ELISA Kit	Wuhan Huamei Biyoteknoloji Şirketi, Ltd.	CSB-E14403r	Kardiyak enzim tespiti
cTn-I ELISA Kiti	Wuhan Huamei Biyoteknoloji Şirketi, Ltd.	CSB-E08594r	Kardiyak protein tespiti
Tek Kullanımlık Venöz Kan Toplama İğnesi	KINDLY Co., Ltd.	https://www.kdlchina.cn/specimen-collection/220.html	Kan toplama
Geliştirilmiş Kemimilüminesans (ECL) Reaktifi	Millipore Co., Ltd.	21302A4	Western Blot görselleştirmesi
Eosin	Pekin Solarbio Co., Ltd.	20200905	H& E boyama
GraphPad Prizması 8	GraphPad Yazılımı, Inc.	Yok	İstatistiksel analiz
Hematoksilin	Wuhan Servis-biyoloju Şirketi, Ltd.	CR2203066	H& E boyama
h-FABP ELISA Kiti	Wuhan Huamei Biyoteknoloji Şirketi, Ltd.	CSB-E16184r	Kardiyak protein tespiti
ImageJ Yazılımı	Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH)	Yok	Western Blot nicelik
JNK1/2 Birincil Antikor	HuaAn Biyoteknolojisi (Hangzhou, Çin)	ET1609-42	Western blot antikoru
LDH ELISA Kiti	Şanghay Enzim Bağlantılı Biyoteknoloji	ml003416	Kardiyak enzim tespiti
Masson Blue Çözümü	Pekin Solarbio Co., Ltd.	20220303	Masson boyama
Microplate Reader	Thermo Fisher Scientific	ME001000C	ELISA OD ölçümü (450 nm)
Optik Mikroskop (Olympus C33)	Olympus (Tokyo, Japonya)	C33	Histoloji görüntüleme
Parafin Mumu	Leica  Co., Ltd.	2110068	Doku gömülmesi
PBST Tamponu	Meilunbio Co., Ltd.	MA0015-Apr-27G2	Yıkama tamponu
p-JNK1/2 Birincil Antikor	HuaAn Biyoteknolojisi (Hangzhou, Çin)	ET1601-28	Fosforile JNK antikoru
Protein Veri Bankası (PDB)	RCSB	https://www.rcsb.org/	Protein yapı kaynağı
Protein Çıkarma Kiti	Sangon Biotech (Şanghay, Çin)	C510003-0050	Doku protein ekstraksiyonu
PubChem Veritabanı	NIH	https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov	Ligand yapısı kaynağı
PVDF Zarı	Millipore Co., Ltd.	R1PB81493	Batı leke transfer zarı
PyMOL	Schrö dinger, Inc.	https://pymol.org/	Kenetlenme görselleştirmesi
SDS-PAGE Jeli (%10)	Pekin Solarbio Co., Ltd.	817X031	Protein elektroforezi
Yağsız Süt Tozu	Pekin Solarbio Co., Ltd.	http://www.solarbio-hd.com/solarbiohd-Products-23261665/	Bloke edici reaktif (%5)
Sodyum Pentobarbital	Thermo Fisher Scientific Inc.	57-33-0	Hayvan işlemleri için anestezik
SP600125 (JNK inhibitörü)	MedChemExpress Co., Ltd.	112518	JNK yol inhibitörü
SPF Hayvan Barınma Tesisi	Kunming Tıp Üniversitesi	Yok	Hayvan barınma koşulları
Sprague-Dawley Fareleri (erkek, 2 aylık, ~230 g)	Pekin Huafukang Biyolojik Teknoloji Şirketi, Ltd.	http://www.hfkbio.com/	Deneysel hayvanlar (n = 51)
Weigert Demir Hematoksilin	Guangzhou Wexis Co., Ltd.	18092001	Masson boyama
Ksilen	Tianjin Tjhxsj Şirketi, Ltd.	20220208	Doku temizleme