Tek Hücreli ve İmmünoflüoresans Analizi İçin Dişi Fare Üretral Epitelini İzole Etmek İçin Optimize Edilmiş Bir Yöntem

Özet

Bu protokol, akım sitometrisi, immünboyama ve organoid kültür dahil olmak üzere aşağı akış analizleri için yetişkin dişi fare üretrasının epitel tabakasının izole edilmesi için optimize edilmiş bir yöntem sunar. Yöntemler, akış sitometrisi analizi, tam montaj görüntüleme ve verimli organoid oluşumu ile zenginleştirilmiş ve canlı üretral epitel hücreleri elde etmiştir.

Özet

Epitel hücreleriyle kaplanmış üretra, vücuttan idrarın çıkışı için bir kanal görevi görür. Üretra epitelyal tabakası, antimikrobiyal ve bağışıklık savunmasında rolleri gösteren gen imzalarına sahip farklı hücre tiplerinden oluşur. Üretral epitel tabakasına gömülü yerleşik makrofajlar, immün gözetimi ve antijen sunumunda rolleri olduğu iddia edilen transkripsiyon açısından farklı bir alt tipi temsil eder. İdrar patojenleri üretra boyunca yukarı çıkarak mesane ulaşır. Üretral epitel tabakası ve ilgili bağışıklık hücrelerinin incelenmesi, alt idrar yollarındaki konak savunma mekanizmalarını aydınlatacaktır. Bu protokolün temel hedeflerinden biri, dişi fare üretrasının disseksiye edilmesi ve epitel astarının izole edilmesi için optimize edilmiş yöntemler sağlamaktır. Protokol, dişi fare üretrasından epitel dokusunun nazik enzimatik ve mekanik ayrılma yoluyla izole edilmesi için optimize edilmiş bir yöntemi tanımlar. Epitel izolasyonundan sonra, izole üretral epitelin ve ilişkili bağışıklık hücrelerinin nazik enzimatik sindirimi için yüksek canlılıklı tek hücreli süspansiyonlar elde edilmesi yöntemleri tanımlanmıştır. Protokol ayrıca izole fare üretral epitel hücreleri ve epitel ilişkili bağışıklık hücrelerinin akış sitometrisi analizi yöntemlerini detaylandırmaktadır. Ayrıca, izole epitel hücrelerden tabakalı 3D üretral epitel organoidleri üretme yöntemleri burada sunulmaktadır. Protokol ayrıca, fare üretral epitelinin morfolojisi ve moleküler yapılarını gözlemlemek için kullanılabilecek üretral epitel tabakalarının tam montajlı immünboyama yöntemini de detaylandırır. Genel olarak, burada açıklanan fare üretral epitel hücrelerinin izolasyonu ve tek hücreli sindirimi yöntemleri, immünboyama, akış sitometrisi, organoid üretimi ve tek hücreli RNA dizileme gibi aşağı akış analizlerini mümkün kılar.

Giriş

Fare alt idrar yolu (LUT) iki bölümden oluşur: mesane ve üretra. Embriyonik evrelerde, LUT'un yapıları, kaudal arka bağırsakta bulunan geçici endoderm kaynaklı bir kloakadan gelişir. Kloaka'nın ventral kısmı olan urogenital sinüs, ön tarafta mesaneyi ve arka tarafta üretra^oluşturur. Mesane astarı iyi incelenmiştir. Uroplakin proteinlerinden oluşan apikal kristalin^{plaklar aracılığıyla idrar bileşenlerine karşı sıkı} bir bariyer oluşturur ^2,3,4. Mesane iç tabakası geçiş epitelyumu olsa da, üretra epitel mimarisinde, mesane boyundan distal üretral açıklığa kadar farklılıklar gösterir. Ayrıca, üretrada epitel yapılarında ve hücresel yapıda cinsel dimorfizm görülür. Erkek fare üretrası, mesane boynundaki geçiş epitelinden oluşur, ardından sütunlu ve tabakalı epitelden oluşur. Dişi fare üretrası, mesane boynundaki geçiş epiteliyle ve distal uçta sekretör bezlerle biten çok katmanlı tabakalı sayımsız^{epiteliyle kaplıdır 5}.

Dişiler, çoğunlukla bağırsaktan üretra yoluyla mesaneye enfekte eden üropatojen bakteriler tarafından oluşan idrar yolu enfeksiyonlarına (İY) daha yatkın^{olur 6}. Üretra, LUT'da yükselen idrar patojenlerle temas eden ilk yüzeydir. Üretral epitel hücrelerinin işlevi, özellikle aktif bir immünolojik bariyer olarak rolü, yeterince incelenmemiştir. Aynı grubun son çalışmaları, yetişkin dişi fare üretrasının tek hücre çözünürlüklü mekânsal^{haritasını sağlamıştır 5}. Bazal, ara ve apikal hücrelerden oluşan üç katmanlı üretral kaplama tespit edildi. Epitel kaplamasında nadir nöroendokrin hücreler^{bulunur 5,7}. İdranın ortasına doğru, ana gövdeden küçük kanallar ayrılır ve üretranın stromal bölmesine gömülü sekretör bezler kümeleriyle sona erer. Transkriptomik veriler, üretradaki epitel hücrelerinin, konak savunmasını şekillendirebilecek immünomodülatör ve antimikrobiyal genleri ifade^{ettiğini ortaya koymuştur 5}. Üretral epitel hücrelerinin savunma potansiyeli ve immünomodülasyon fonksiyonlarıyla ilişkili özellikleri ve özellikleri incelenmek, İYE'lerle mücadele için yeni stratejiler sunabilir.

Fare ile üretral epitelin incelenmesi, zamansal çalışmalar ve cinsel dimorfizmin araştırılmasına olanak tanır. Farenin insan ile mesane ve üretra 1 hücresel yapısı açısından benzerlikleri göz önüne^{alındığında}, fare alt idrar yolunun embriyonik^{gelişimini incelemek için kapsamlı şekilde kullanılmıştır 1,8,9}. Fareler ayrıca transüretral instillasyon modellerinde idrar patojenleri tarafından neden olan^{İT'yi incelemek için kullanılmıştır} 10,11,12. Hastalarda alt idrar yolu dokusuna ulaşmak zordur, ancak kanser veya diğer hastalıklar için rezeksiyon geçirilmedikçe. Tutarlı, sağlıklı insan dokusu kaynağına ulaşmak zordur ve fare, alt idrar yollarındaki dokuları doku homeostazı, onarımı ve inflamatuar hakaretlere yanıt çalışmaları için faydalı bir model sunar. Dişi fare ve insan üretral astarı mesane boynundaki geçiş epitelinden ve distal uca doğru tabakalı, skuamoz olmayan, keratinizesiz epitelden oluşur. Skuamöz epitel, insan dişi üretrasının distal ucunda gözlemlenirken, ^5,13 yaş yaşlarında insan kadın üretral kaplamasında değişkenlik gözlemlenir. İnsan ve fare üretrası arasında transkriptom seviyesinde üretral iç tabakanın karşılaştırmaları yapılmamış olsa da, fare, epitel desenlerini, epitelyal-bağışıklık etkileşimlerini ve üretradaki enfeksiyonlara yanıtı yakalamak için faydalı bir model sunmaktadır.

Bu çalışmada yazarlar, tam boy dişi fare üretrasının diseksiyonu, üretral epitelin izolasyonu ve tek hücreli süspansiyonların hazırlanması için nazik enzimatik sindirim yöntemlerini açıklamaktadır. Bu, dişi fare üretral epitel dokusunun izolasyonu ve sindirimi için ilk ayrıntılı protokoldür. Optimize edilmiş protokol, çeşitli aşağı akış analizlerinde kullanılabilecek zenginleştirilmiş tek hücreli epitel hücre popülasyonu sağlar. Çalışmada sunulduğu gibi, yazarlar üretral epitel hücre izolelerinin tek hücreli süspansiyonu üzerinde akış sitometrisi yapmışlardır; bu da ağırlıklı olarak epitel niteliğinde canlı tek hücrelerin varlığını göstermektedir. Ayrıca, bu epitel hücreleri 3D kültürde tabakalanmış fare üretral astarına benzeyen organoidler üretebiliyor. Yazarlar ayrıca, epitelyal ilişkili bağışıklık hücrelerinin, özellikle makrofajların üretral epitel hücreleriyle ilişkisini incelemek için üretral epitel tabakalarının tam montajlı boyama yapılmasını göstermektedir. Bu makalede açıklanan yöntemler, üretra kaplaması ve bağışıklık savunmasındaki rolü üzerine araştırmalara yardımcı olacaktır.

Protokol

Fare üzerindeki tüm çalışmalar, BRIC-Kök Hücre Bilimi ve Rejeneratif Tıp Enstitüsü'nde Kurumsal Hayvan Etik Komitesi (INS-IAE 2022/01(R 1 M2)) ve Kurumsal Biyogüvenlik Komitesi'nin (inStem/G-141(3)-22/DBJ) onayı ile yapıldı. Bu çalışma için 6-12 haftalık dişi CD-1 veya C57BL6/J fareleri, Bangalore Yaşam Bilimleri Kümesi (BLiSC) Ulusal Biyolojik Bilimler Merkezi'ndeki (NCBS) Hayvan Bakım ve Kaynak Merkezi'nde (ACRC) tutulmuştur. Fareler, belirli patojensiz koşullarda, 12 saatlik ışık-karanlık döngüsünde, improvizet yiyecek ve su ile beslendi.

Kullanılan tüm malzemeler Malzeme Tablosu'nda listelenmiştir.

1. Yetişkin dişi fare üretrasının diseksiyonu ve toplanması

1. Fareyi CO₂ ile fare nefes almayı durdurana kadar ötenazi yapın. İkincil ötenazi yöntemi olarak servikal dislokasyon uygulanır.
2. Faresi sırtüstü pozisyona getirin ve karın tüylerini ıslatmak için %70 etanol püskürtürün (Şekil 1A).
3. Karın derisini bir çift forseps ile kaldırın ve alt vücuda dikey bir kesi yapın, bu kesik dış üretral açıklıkta bitiyor (Şekil 1B ve 1C).
4. Mesanesi tespit edin ve pensle nazikçe kaldırın. Bazı durumlarda, idrarla dolu olabilir. Mesanesi pensler arasına nazikçe sıkıştırarak boşaltın.
   NOT: Mesane şişkin bir yapı olarak görünecektir.
5. Mesane etrafındaki yağ ve bağ dokusunu küçük yaylı makas kullanarak kesin, iki pubik kemiğin kasık simfizinde birleştiği kelebek şeklindeki yapıyı ortaya çıkarın (Şekil 1D). İuretra kasık simfizinin altından geçer.
6. Pubik simfizi pensle kaldırıp küçük yaylı makasla keserek kesin (Şekil 1E). Kasık kemiği parçalarını çıkarın, böylece üretra mesaneden aşağıya doğru aktığını görebilir (Şekil 1F).
   NOT: Üretra, vajinal duvarın ventral yüzeyinde bulunan ince kırmızı bir tüp şeklinde görünecektir (Şekil 1G).
7. İnce forseps kullanarak mesaneyi vücut boşluğundan nazikçe yukarı çekin ve idrar ile üreme yollarını ayırmak için üretra ile vajinal duvar arasında küçük yaylı makas geçirin.
8. Üretra arkasını vajinal duvardan ayırmak için keserken mesanede hafif gerginlik kalın. Tam boy fare üretrasını elde etmek için distal üretra açıklığına kadar kesin (1,2–1,5 cm uzunluğunda) (Şekil 1K ve 1L).
9. İrayolu mesaneden kese boynunda tek bir kesik yaparak ayırın.

2. Üretral epitel dokusunun izolasyonu

NOT: Üretradan epitel tabakalarını izole etme protokolü, endometriyal^{epitel 14'ü} izole eden bir protokolle değiştirildi ve optimize edildi. Şekil 2, çevresindeki stromal bölmeden üretral epitel tabakalarının izole edilmesi için adımları göstermektedir (Şekil 2A).

1. Disseksiye edilen üretraları, taze 1x Hanks Dengeli Tuz Çözeltisi içeren steril bir petri kabına aktarın (HBSS, Ca ve Mg içerme, detaylar Ek Tablo 1'de verilmiştir).
   NOT: Bu aşamada epitel ayrılması ve tek hücreli sindirim için 4–5 üretra toplamak önerilir.
2. Bir disseksiya mikroskobu altında, üretra çevresindeki yağ ve bağ dokusunu ince uçlu forseps ve küçük yaylı makasla kesin (Şekil 2B).
3. Her üretrayı çapraz iki eşit boyutta parçaya kesin ve üstüne 100 mikronluk naylon bir örgü süzgeci yerleştirin (Şekil 2C–G).
4. Mendilleri 1 mL 1x HBSS (Ca ve Mg içermemiş) geçirerek dokuların üzerinden yıkayın.
5. Doku parçalarını, 1 mL %1 Tripsin (%1 Tripsin, w/v ile 1x sHBSSa'ya kadar, detaylar Ek Tablo 2'de verilmiştir) içeren 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne (Şekil 2H) aktarın.
6. Dokuyu 4 °C'de örnek rotator (30 rpm) üzerinde 15–30 dakika kuluçka yoluyla sindirin.
7. İnkubasyondan sonra tüpleri 4 °C'den çıkarın. MgCl₂ (1 M MgCl₂, 1x HBSS'de hazırlanmış stok) 10 mM nihai konsantrasyona ve DNase I (10 mg/mL DNase I, stok 1x PBS'de hazırlanmış) doku parçalarıyla aynı tüpte 10 μg/mL nihai konsantrasyona eklenin.
8. Tüpü örnek rotatör üzerinde 37 °C hibritizasyon fırınına aktararak 15–30 dakika kuluçka yapın.
   NOT: Tripsin için 4 °C ve 37 °C sıcaklıklardaki kuluçka süreleri, sonraki uygulamaya göre ayarlanabilir. Tüm montaj boyama için 15 dakikalık kuluçka süresi, tek hücreli sindirim için ise 30 dakikalık kuluçka süresi tercih edilir.
9. Dokuları, tripsin aktivitesini azaltmak için %10 koyun serumu içeren 1,5 mL MCT'ye aktarın (1x HBSS (Ca ve Mg içermeden).
10. Üretral dokuları, buz gibi 1x HBSS (Ca ve Mg içermeden) içeren yeni bir tüpe aktarın. Sonra 1x HBSS buz gibi soğuk bir petri kabına aktarın.
11. İki ince uçlu forseps kullanarak, üretradan epitelin çıkmasını sağlayın. Üretra parçasının bir ucunu bir çift forseps ile tutun.
12. Diğer elinizle, üretral parçayı forsepsin uçları arasına sıkıştırın, parçanın tüm uzunluğu boyunca epitelin dışarı çıkmasını sağlar. Epitelin izole edilmesi için kabdaki kalan üretra parçaları için bunu tekrarlayın (Şekil 2I–J).
    NOT: Mekanik ayrılma işleminde, üretra lümeninden ince bir şeffaf epitel dokusu tabakası dışarı çıkarılır. Üretral epitel, stromal dokudan daha açık renkte (şeffaf) görünen ince, tabaka şeklinde doku parçaları olarak tanımlanabilir. Epitel izolatları, doğramak için petri kabına aktarılabilen ince, şeffaf doku parçaları olmalıdır. Doku izolatları tamamen parçalanmamalıdır. Doku parçaları tamamen parçalanırsa, tripsin kuluçka süresi kısalabilir.

3. Tek hücreli süspansiyona sindirim

1. İzole epitel parçalarını küçük plastik transfer pipeti veya 200 μL pipet ucu kullanarak steril bir petri kabına aktarın. Epitelyumu küçük yaylı makas ile küçük parçalara indirerek 1x HBSS damlasında parçalara indirin (Şekil 2K).
   NOT: Epitel ayrılmasından sonra kalan stromal doku parçaları, izole epitelli yöntemle aynı yöntemle sindirilebilir.
2. Kıyma parçaları pipet ile 1,5 mL önceden ısıtılmış (37 °C) Accutase sindirim çözeltisi içeren 2 mL MCT'ye aktarın. Accutase sindirim çözeltisi şunları içerir: Accutase, 10 μM Rocki Y-27632 ve 100 μg/mL DNaz I.
3. Doku ve sindirim çözeltisi içeren tüpü, 37 °C hibridizasyon fırınında örnek rotatora aktarın. 1 saat kuluçka yapın.
   NOT: Tüpün içeriği başarılı sindirim açısından kontrol edilebilir. Başarılı sindirim: Kıyılmış doku, kuluçkadan sonra sadece birkaç görünür parça kalarak Accutase çözeltisinde iyi dağılır. Başarısız sindirim: Accutase çözeltisinde kuluçkadan sonra da büyük doku parçaları hâlâ mevcuttur. Başarılı sindirim için dokular mümkün olduğunca ince kıymırtılmalıdır.
4. 1 saat sonra, 2 mL MCT'nin tüm içeriğini 5 mL'lik santrifüj tüpüne aktarın ve 2 mL yıkama tamponu ekleyin (1x PBS, Ca ve Mg içermeden, %1 sığır serum albümini ile).
5. Süspansiyonu 600 x g ile 5 dakika boyunca 4 °C'lik bir santrifüjde sallanan kovalı rotorla döndürün.
6. Süpernatantı nazik vakum ile aspire edin ve pelleti 1 mL yıkama tamponu içinde 1 mL pipetle ve filtre ucu ile yeniden askıya alın.
7. Pipet ucunu kullanarak, topaklar küçülene kadar pipetle topu yukarı aşağı indirerek parçalayın. Süspansiyonu, 1 mL'lik bir şırıngaya bağlı 23 1/2 gauge iğneden 4 vuruş ile geçirin, ardından 1 mL'lik bir enşırıngaya bağlı 26 1/2 gauge iğneyle 4–6 vuruş yapılır.
   NOT: Küçük bir iğneden geçmek, tek-hücreli bir süspansiyon elde etmek ve hücre topaklanmasını önlemek için gereklidir. Bu adım kesme stresi ve hücre ölümüne neden olabilirken, yazarlar iğne ve şırıngayla yapılan inme sayısını optimize ederek aşırı hücre ölümü olmadan tek bir süspansiyon sağlamışlardır. Bu adımı atlamak, büyük bir grup kümelenmiş hücre ortaya çıkar ve bu da tek hücreli RNA dizileme ve akış sitometrisi gibi aşağı akış analizlerini karıştırır.
8. 5 mL'lik bir tüp üzerine yerleştirilen 30 mikronluk ön ayırma filtresinin yüzeyini ıslatmak için 1 mL yıkama tamponu ekleyin. 26 1/2 gauge iğneye bağlı şırıngayı kullanarak 1 mL hücre çözeltisi süzgeçten geçirin.
9. Hücreleri içeren tüpe 1 mL ek yıkama tamponu ekleyin, ardından bu çözeltiyi şırıngayla alıp filtreden geçirin. Pellet hücreleri 600 x g sıcaklığında 5 dakika boyunca 4 °C'de sallanan kovalı rotor kullanılarak santrifüjle yapılabilir.
10. Süpernatantı aspire edin ve pelleti 100 μL yıkama tamponu ile yeniden süzülür ve 100 μL 1x kırmızı kan hücresi (RBC) liziz tamponu ekleyin. Süspansiyonu oda sıcaklığında tam 3 dakika inkübe edin, ardından 4 mL yıkama tamponu ekleyin ve peleti tekrar süspansiyona alın.
    NOT: Üretral epitel hücre süspansiyonundan kan hücrelerini çıkarmak için RBC lizisi önerilir. Bu adım epitel hücre canlılığı üzerinde küçük bir etki yaratabilir, ancak protokol hücre kaybını en aza indirmek ve hücre canlılığını korumak için 0,5x seyreltilmiş RBC lizis tamponu ve 3 dakikalık kuluçka kullandı.
11. Hücreleri 600 x g sıcaklığında 5 dakika boyunca 4 °C'de salınan bir kovalı rotor kullanarak santrifüjle hasat edin.
12. Süpernatantı aspire edin ve pellet boyutuna göre 50–200 μL yıkama tamponunda tekrar süzülür.
    NOT: 4–5 fare üretral epitel toplamasından elde edilen dokulardan elde edilen pellet boyutu küçük olacak ancak yine de gözle görülecektir. Hücreleri, salınan bir kovalı rotor kullanarak santrifüj yapmak şarttır; böylece pellet tüpün alt kısmında toplanır ve yan tarafa yayılmaz. Araştırmacılar, fare üretral epitelimi başına 28.000–34.000 canlı hücre verimi kaydetmiştir.
13. 5 μL aliquot hücre 0,5 mL MCT'ye aktarın ve 5 μL tripan mavisi ekleyin. Veri ve hücre canlılığını kontrol etmek için hemositometreyi karıştırıp yükleyin.

4. Üretral epitelyal tek hücreli izolaların akış sitometrisi analizi

1. Aliquot, üretral epitel veya stromal bölmeden gelen tek hücrelerin floresan immünboyaması için 5 mL'lik santrifüj tüpünde toplam 100.000 hücreyi akış sitometrisi için gerçekleştirir. Tüpteki hacmi 1x PBS ile 4 mL'ye çıkar.
   NOT: Akış sitometrisiyle güvenilir sonuçlar elde etmek için her örnek için en az 50.000 hücre önerilir.
2. Hücre süspansiyonunu 500 x g ile 5 dakika boyunca 4 °C'de sallanan bir kovalı rotorla döndürün.
3. Süpernatantı atın ve pelleti 50 μL 1x PBS ile yeniden askıya alın.
4. Hücre süspansiyonuna 50 μL 2x Ghost boyası Violet 450 (500 μL 1x PBS'de 1 μL Ghost boya) eklenerek 100 μL 1x Ghost boya çözeltisi elde edilir.
   NOT: Ghost Dye V450, akış sitometrisi uygulamalarında canlı ve yaşanabilir olmayan hücreleri ayırt etmek için kullanılabilen amin reaktif bir canlılık boyasıdır.
5. Her 100 μL hücre süspansiyonu için 5 μL Fc reseptör bloklama çözeltisi (fare karşıtı CD16/32) eklenin ve oda sıcaklığında 5 dakika kuluçka yapın.
   NOT: Bu adım, immünoglobulinin Fc reseptörlerine bağlanmasını engellemek için gereklidir.
6. Hücre süspansiyonunu buzda ek 25 dakika kuluçka yapın.
7. Hücre süspansiyonunu hücre boyama tamponu ile 5 mL'ye seyreldin (1x PBS, %0,02 (w/v) Sodyum azid ve %1 (w/v) BSA, bkz. Ek Tablo 3). 500 x g sıcaklıkta, 4 °C'de 5 dakika boyunca sallanan kovalı rotorla aşağı döndürün. Süpernatantı atın ve hücre pelletini 100 μL hücre boyama tamponunda yeniden süzülür.
   NOT: Sodyum azid son derece toksiktir. Cilt, göz ve kıyafetlerle temas etmekten kaçının. Taşıma sırasında uygun kişisel koruyucu ekipman (PPE) kullanın.
8. 100 μL hücre süspansiyonuna, 1:20 seyreltme ile 5 μL konjuge primer antikor eklenir: anti-CD326/EPCAM (epitel hücrelerini etiketler), anti-F4/80 (mare makrofajlarını etiketler) ve anti-CD45 (pan-immün belirteç) 1:20 seyreltmede eklenir. Hücre süspansiyonunu 30 dakika boyunca buzda kuluçka edin.
9. Hücre süspansiyonunu hücre boyama tamponu ile 5 mL'ye kadar seyreltin, ardından 500 x g sıcaklığında 4 °C'de sallanan kovalı rotorla 5 dakika boyunca aşağı döndürün. Süpernatantı aspire edin ve hücre pelletini 500 μL hücre boyama tamponunda yeniden süzülür.
10. Hücre süspansiyonunu, filtre kapağı ayırma tüplerinde 35 mikronluk naylon örgü süzgeçten geçirin. Tüpleri daha fazla analiz edene kadar buzun üzerine koyun.
11. Sitometrede ilk kurulum ve performans kontrolü yapın.
12. Voltajları lekelenmemiş ve tamamen boyalı örneklerle ayarlayın. Boncuk kontrolleri ile tazminat gerçekleştirin ve satın alma işlemlerine devam edin.
    NOT: Birden fazla floroforla yapılan deneyler için telafi yapılması gerekir. Gerekli tazminat kontrollerini hazırlayın. Deneyde kullanılan her florofor için tek boyalı kontrollere (yani telafi boncuklarına) ihtiyacınız olacak. Dengeleme, akış sitometresi yazılım ayarlarına göre otomatik olarak gerçekleştirilebilir. Belirli bir florofor için pozitif ve negatif hücre popülasyonlarını ayırt etmek için FMO (floresans eksi bir) kontrolleri önerilir. FMO'ları numuneye kontrol edilen florofor hariç tüm floroforları dahil ederek hazırlayın.
13. FMO (floresans eksi bir) kontrolleriyle kapıları ayarlayın ve örnek başına 50.000 olay elde edinin.

5. Üretral epitel organoidlerinin kültürü

NOT: Fare üretral epitel organoidleri için, Protokoller, Bölüm 3, Sindirimden tek hücreli süspansiyona geçiş, 3.1'den 3.11'e kadar olan adımları takip edin. tek hücreli süspansiyonlar elde etmek için.

1. Üretral epitel hücre pelletini 50–100 μL organoid genleşme ortamında yeniden süspansiyona alın ( detaylar Ek Tablo 4'te verilmiştir). Hücre canlılığını ve hücre sayısını bir hemositometreye sayarak elde edin.
2. 1:4 oranında hücre süspansiyonu (1 parça) ve Cultrex (4 parça) karışımı hazırlanır; son konsantrasyon 25 μL'de 5000 hücre konsantrasyonu olur. 12 kuyruklu bir plakanın her kuyusuna 3 damla 25 μL hücre süspansiyonu (5000 hücre/damla) ekleyin.
   NOT: Cultrex'i her zaman kesik ucu ile nazikçe pipetleyin, böylece köpükler oluşmasın.
3. Levhayı damlacıkların katılaşması için 15 dakika boyunca 37 °C (%5_CO2) kuluçka makinesine aktarın.
4. Damlacıkları kuyunun yanlarından nazikçe 800 μL organoid genleşme ortamıyla örtün ve plakayı tekrar kuluçka makinesine aktarın.
   NOT: Medya değişikliği her 2 günde bir zorunludur. Kullanılan medyayı 800 μL taze organoid genleşme ortamı ile değiştirin.
5. 0. günden 6. güne kadar olan her gün, 4x–20x büyütme ile ters mikroskop kullanarak organoidlerin görüntülerini alın.

6. Üretral organoidlerin histolojisi ve immünboyama

DIKKAT: Ksilen son derece yanıcı bir çözücüdür. Kimyasalla ilgili PPE kullanın. Kullanılan ksilen organik çözücü atığı olarak toplayın. Onaylanmış tehlikeli kimyasal atık programları aracılığıyla bertaraf edilir. Formalin toksiktir ve cilt, göz ve solunum tahrişine neden olur. Cilt temasından ve solumadan kaçının. Kimyasalla ilgili PPE kullanın. Kurumsal tehlikeli kimyasal atık bertaraf sistemleri aracılığıyla bertaraf edilir. Üretral organoidlerin parafin bloklarına gömülü protokolü, endometriyal organoidlerin gömülmesi^{protokolünden değiştirildi ve optimize edildi 14}.

1. Organoid kültürünün 6. gününde, harcanan ortamı atın ve organoidleri oda sıcaklığında 1x HBSS ile yıkayın. Kuyular için 15 dakika boyunca 1,5 mL nötr tamponlu formalin (%10) ekleyin.
2. Fiksanti atın ve 10 dakika boyunca kuyulara 1,5 mL hematoksilin ekleyin. Lekeyi atın ve 1x HBSS ile iki kez yıkayın.
3. Her kuyuya 1x HBSS içinde hazırlanmış %2 UltraPure düşük erime noktasına sahip agarozu 1 mL ekleyin, 3 damlacık içeren her kuyuya ekleyin, agarozu oda sıcaklığında 15 dakika katılışa bırakın.
4. Agarose'u ince bir spatulan düz ucunu kullanarak nazikçe çıkarın, böylece Cultrex damlacıklarının da onunla birlikte çıkmasını sağlayın.
5. Agararoz diski bir doku kasetine aktarın ve %70 etanolde oda sıcaklığında sürekli çalkalayarak 30 dakika kurutun.
6. Farklı etanol konsantrasyonlarında ve sürede daha fazla dehidratasyon: %90 etanol 30 dakika, %100 etanol 30 dakika, %100 etanol 60 dakika, %100 etanol 90 dakika.
7. Fazla etanolü silinin ve oda sıcaklığında sürekli çaltımarak 45 dakika boyunca ksilen ile temizleyin. Ksilen temizleme adımını 60 dakika boyunca tekrarlayın.
8. Fazla ksilen silinip gece boyunca infiltrasyon parafin mumuna (65 °C) geçin.
9. Metal göme kalıbının tabanına ince bir göme balmumu tabakası ekleyin ve agaroz diski üzerine yerleştirin. Kalıbı sürgü ısıtıcısından çıkarın ve kasetin altındaki çıtalardan hızla üzerine gömülü mum ile örtün. Oda sıcaklığında katılaşmasına izin verin.
10. Mikrotom üzerinde organoid parafin bloklarını keserek 5 μm kesitler elde edin. Bölümleri pozitif yüklü slaytlara yerleştirin.
11. Hematoksilin-Eosin boyama
    1. 60 °C'de kayarak pişirin, ksilenle deparaffinize olun, ardından bir dizi etanol yıkama ile yeniden hidratla (ksilen 1 dakika, %100 etanol 1 dakika, %95 etanol 1 dakika, %75 etanol 1 dakika)
    2. Slaytları musluk suyunda yıkayın ve Gill'in Hematoxylin No. 2 ile 3 dakika kuluçka yapın. Kaydırakları musluk suyu akışının altına yerleştirerek mavi renk elde edin.
    3. Slaytları %95 etanolde 1 dakika inkübe edin, ardından %0,25 eosin çözeltisi ile 1 dakika sürülür. Kaydırakları musluk suyunda yıkayarak su berrak döner.
    4. Sürgüleri kurutma (%95 etanol 1 dakika, %100 etanol 1 dakika) ve hızlı sertleştirici montaj malzemesi ile monte etmeden önce ksilen ile temizleyin (1 dakika).
12. Parafin kesitlerinin immünboya kullanımı
    1. Hibritizasyon fırınında 60 °C'de 1–2 saat boyunca 5 μm parafin kesitlerini pişirin.
    2. Slaytları ksilende, 6 dakika boyunca slayt boyama kavanozunda batırarak mumdan çıkarabilirsiniz.
    3. Slaytları 100%, %95, %75 etanol içinde damıtılmış suda 6 dakika boyunca yeniden hidretleyin. Sonra slaytları damıtılmış suyla 5 dakika yıka.
    4. Slaytları 0,01 M sitrik asit (damıtılmış suda) antijen alma çözeltisi içeren kare bir Pyrex kabına ekleyin ve tabağı yapışkan sargıyla örtün. Antijen toplama işlemi yüksek güçte mikrodalgada 20 dakika boyunca pişirin.
    5. 20 dakika soğutulmuş ila ılık tutun ve PBS'de sürgüleri 5 dakika durula. Doku kesitlerinin etrafına hidrofobik bir bariyer çizin ve oda sıcaklığında 1 saat boyunca nazikçe sallanarak 100 μL/kesitli at bloklama tamponu ekleyin (at bloklama tamponunun hazırlanması için Ek Tablo 5'e bakınız).
    6. Uygun bir seyreltme (1:100–1:200) ile primer antikor ekleyerek at bloklama tamponu içinde primer antikor çözeltisi hazırlayın. Her bölüme 100 μL primer antikor çözeltisi ekleyin. Gece boyunca 4 °C'de hafif sallama ile kaydırılır.
       NOT: Organoidler, Keratin 5/KRT5 (bazal epitel belirteci), P63 (bazal epitel belirteç), KRT4 (orta/suprabazal epitel belirteç) ve KRT13 (orta/suprabazal epitel belirteç) antikorlarıyla immünbonize edildi.
    7. Gece kuluçkasından sonra, PBS 4 x 5 dakika içinde oda sıcaklığında hafifçe sallanarak slaytları yıkar.
       NOT: Sonraki tüm adımlar oda sıcaklığında ışık korumalı bir kutuda yapılmalıdır.
    8. At bloklama tamponu içinde ikincil antikor çözeltisi hazırlayın, 1:500 seyreltme ile floresan etiketli ikincil antikorlar ekleyin. Kaydırakları oda sıcaklığında 1 saat kuluçka için, nazikçe sallayın.
    9. PBS'de oda sıcaklığında 4 x 5 dakika sürer, hafifçe sallanarak yıkayın.
       NOT: Isteğe bağlı adım: Otomatik floresans sinyalini söndürmek için Otofloresan Söndürme kitleri kullanın.
    10. 300 nM DAPI çözeltisiyle 5 dakika boyunca nazikçe sallayarak kuluçka yapın. PBS'de oda sıcaklığında 2 x 5 dakika boyunca hafifçe sallayarak yıkayın.
    11. Sönme önleyici montaj çözeltisi ile montaj edin (%90 Gliserol, %0,2 n-propil gallat 1x PBS'de). Geniş alan floresan mikroskopta görüntü bölümleri.
        NOT: Her florofor için kamera pozlama ayarları, piksel doygunluğunu önlerken sinyal-gürültü oranını en üst düzeye çıkaracak şekilde ayarlanmalıdır. Aynı pozlama ayarlarını kullanarak belirli bir seansta boyanmış organoidleri görüntüleyin.

7. İzole üretral epitel tabakalarının tam montaj immünboyaması

NOT: Tüm montaj immünboyama için, Protokol, Bölüm 2, Üretral epitel dokusunun izolasyonu, 2.1 ile 2.12 arasındaki adımları takip edin. üretral epitel tabakalarını elde etmek için.

1. Epitel dokusunu dikkatlice transfer pipeti veya 200 μL pipet ucu ile %10 nötr tamponlu formalin içeren 24 delikli doku kültürü kabının bir kuyusuna aktarın. Tabak kapağını parafinle kapatın ve 4 °C'de 20 dakika boyunca sallanan bir sallama üzerinde inkübe yapın.
   NOT: Epitel dokusunun kaybını önlemek için tüm adımları aynı kuyuda yapın.
2. Kuyudan formalini dikkatlice aspire edin. 500 μL 1x PBS ile yıkama işlemi yapın ve oda sıcaklığında 5 dakika boyunca bir kaydırıcı üzerinde kuluçka yapın. Aynı yıkama adımını bir kez daha tekrarlayın.
3. Kuyuya 1x PBS + %1 Triton X-100 içeren 500 μL geçirimlilik çözeltisi ekleyin. Plakanın kapağını parafilm ile kapatın ve 4 °C'de 2 saat kuluçka geçirin, hafifçe sallayın.
4. Kuyunun içinden geçirimlilik çözeltini dikkatlice aspire edin.
5. Ek %1 Triton X-100 içeren 500 μL at bloklama tamponu içinde dokuları kuluçka yoluyla bloklama yapın (At bloklama tamponu tarifi Ek Tablo 5'te verilmiştir). Tabağın kapağını parafilm ile kapatın ve 4 °C'de gece boyunca hafif sallayarak kuluçka yapın.
6. Uygun bir seyreltme (1:100–1:200) ile primer antikor ekleyerek ek %1 Triton X-100 içeren at bloklama tamponu içinde birincil antikor çözeltisi hazırlanır. Aspirat bloklayıcı çözelti ve 500 μL primer antikor çözeltisi ekleyin: anti-CDH1 (epitel hücre belirteççi) ve anti-F4/80 (fare makrofaj belirteci). Kapağı parafilm ile kapatın ve 4 °C'de 48–72 saat boyunca nazikçe sallayarak kuluçka yapın.
7. Birincil antikor çözeltisini dikkatlice aspire edin ve 1x PBS ile 3 kez, oda sıcaklığında, nazikçe sallayarak 30 dakika boyunca yıkayın.
8. Uygun bir seyreltme (1:500) ile ikincil antikorlar ekleyerek ek %1 Triton X-100 ile at bloklama tamponu içinde ikincil antikor çözeltileri hazırlayın.
9. Kuyuya 500 μL ikincil antikor çözeltisi ekleyin, plakayı alüminyum folyo ile kaplayın ve oda sıcaklığında bir kaydırıcı üzerinde 4–6 saat kuluçka yapın.
10. İkincil antikor çözeltisini dikkatlice aspire edin ve oda sıcaklığında her biri 30 dakika boyunca 1x PBS ile 3 kez yıkayın.
    NOT: DAPI boyama, oda sıcaklığında 10 dakika boyunca seyreltilmiş DAPI stok çözeltisi (300 nM nihai konsantrasyon) ile dokuların kuluçka yoluyla yapılabilir. Oda sıcaklığında 1x PBS (2x 5 dakika) içeren mendilleri sallanan bir sallayıcı üzerinde yıka.
11. Epitel dokularını dikkatlice cam slayt veya görüntüleme kabına aktarın ve anti-fade montaj çözeltisi (%90 Gliserol, %0,2 n-propil gallat, 1x PBS) ekleyin.
12. Flüoresan mikroskopta görüntü dokuları.
    NOT: Örnek kalınlığı göz önüne alındığında, yazarlar optik kesitleme yapabilen floresan mikroskopla görüntülemeyi önermektedir. Bu çalışmada yazarlar, odak dışı ışığı çıkarmak ve z-stackleri elde etmek için Apotome optik kesitli geniş alan floresan mikroskobu kullandılar. Epitelyal ilişkili makrofajların dendritik projeksiyonlarını görselleştirmek için görüntü z-yığınları elde edildi.

Sonuçlar

Yetişkin dişi fare üretrasının diseksiyonu ve toplanması

Bu çalışmanın ilk bölümünde, yazarlar dişi fare üretrasının diseksiyonu için ayrıntılı bir protokol sunmaktadır. Ventral vajinal duvara ve pubik simfizin altındaki konumuna tutunması nedeniyle, burada sunulan yöntem tam boy dişi üretranın temiz diseksiyonuna olanak tanır (Şekil 1).

Tek hücreli izolatlar için üretral epitel dokusunun izolasyonu ve akış sitometrisi analizi

Tripsin sindirimi, üretra epitelel tabakasının çevresindeki stromadan kolayca ayrılmasını sağlar. Stromal dokudan daha yüksek şeffaflığa sahip epitel tabakaları ayrıldıktan sonra gözlemlenebilir (Şekil 2). Ayrılmış epitel tabakaları, enzimatik sindirim sırasında tek hücreli süspansiyonlar elde etti. Üretral epitelden izole edilen tek hücreler, hemositometrede trypan blue hariç tutulması (Şekil 2L) ve canlı hücreleri kapamak için canlılık boyaları kullanılarak akış sitometrisi ile sürekli yüksek canlılık (%>80) gösterir (Şekil 3, Ek Dosya 1).

Yazarlar, üretral epitelin tek hücreli süspansiyonlarından epitel hücre zenginleşmesini değerlendirmek için akış sitometrisi yaptılar. Hücre canlılığını kontrol etmek için hücre süspansiyonu canlı/ölü bir işaretleyici olan amin reaktif hayalet boya V450 ile boyandı. Yazarlar, canlı/ölü belirteçiyle sürekli olarak %>80 hücre canlılığı gözlemlemiştir. Canlı/ölü işaretçisi, akış analizi sırasında enkaz ve ölü hücrelerin kapıdan çıkarılmasını sağladı. Örnekleri epitel hücre belirteci (CD326/EPCAM), makrofaj belirteci (F4/80) ve bağışıklık hücre belirteci (CD45) ile boyadılar; böylece bu yöntemle izole edilen hücrelerin bileşimi kaydedildi. Akış sitometrisi sonuçları, yazarların dişi fare üretral epitelinden zenginleştirilmiş bir epitel hücre popülasyonunu izole ettiğini gösterdi. Yapılan her iki bağımsız deneyde, grup canlı hücrelerde kapalı olarak EPCAM pozitif epitel hücrelerinin %80–90'ını elde etti. Yazarlar ayrıca epitel preparatında CD45+ bağışıklık hücrelerinin %1,30'unu gözlemlediler. Epitel astarıyla ilişkili makrofajlar, epitel bölmesinden gelen canlı hücrelerin ~%1,18'ini oluşturuyordu. Epitel tabakalarından tek hücreli süspansiyonların akış sitometrisi analizi, önceki çalışmalarına göre çoğunlukla vasküler endotelden kaynaklanan minimal stromal kontaminasyonu (%5–6)^{göstermektedir 5}. Ek Dosya 1 , epitel ve stromal bölmelerden tek hücreli preparatlar için akış sitometrisi sonuçlarını gösterir. Epitel bölmesinden izole edilen epitel hücrelerinin %80–90 zenginleşmesine kıyasla, stromal bölmede kısa kanallar ve üretral lümenden çevredeki stromaya uzanan bezler epitelden gelen epitel hücrelerinin %40–50'si de görüldü (Şekil 3, Ek Dosya 1).

Üretral epitel organoidlerin kültürü, histoloji ve immünboyama

Yazarlar ayrıca üretradan izole edilen tek epitel hücrelerinin nasıl uygulanabilir olduğunu ve 3D bir matriksde organoidler oluşturabildiğini göstermiş ve kültürde tek üretral epitel hücrelerinden 6. güne kadar organoid büyümesini gözlemlemiştir (Şekil 4B–G). Organoidlerin histolojisini gözlemlemek için hematoksilin-eozin boyama (H&E) uyguladılar (Şekil 4H–J). Yazarlar, üretral epitel organoidlerinin iki farklı morfolojisini gözlemlediler; biri büyük ve boş, diğeri ise daha küçük ve katıydı. Her iki durumda da, organoidler kadın üretrasının epitel astarında ifade edilen tabakalı ve tekrar yapılan belirteçlerdi; bunlar arasında bazal tabakayı işaretleyen KRT5 ve P63 ile suprabazal/ara hücre katmanlarını işaretleyen KRT4 ve KRT13 (Şekil 4K–N), Ek Şekil 1). Proksimal ve distal üretra arasındaki organoid oluşum kapasitesindeki farklar incelendi. Proksimal üretradan üretilen organoidlerde daha yüksek oranda içi boş organoidler bulunurken, distal üretradan gelen organoidler katı küreler oluşturur (Şekil 4O–P). Ayrıca, üretranın proksimal ve distal bölgelerinden izole edilen epitel hücrelerinde organoid oluşturma etkinliğinde farklılıklar gözlemlediler. Distal üretral epitel, aynı başlangıç tohumlama yoğunluğuna (5000 hücre/damla) sahip proksimal üretral epitelden daha yüksek verimlilikle organoidler oluşturdu (Şekil 4Q–S).

İzole üretral epitel tabakalarının tam montajlı immünboyaması

Araştırmacılar ayrıca dişi fare üretral epitel tabakalarının tam montajlı boyama yöntemini geliştirmiştir. Burada, epitel levhalarını iki işaretleyiciyle boyadılar: makrofajlar için F4/80 ve epitel hücre-hücre birleşimlerini işaretlemek için E-kadherin/CDH1 (Şekil 5). Dokular, Apotome 3 optik kesitli Zeiss Axio Observer 7 mikroskobu kullanılarak görüntülendi. Epitel tabakaları CDH1 antikoruyla güçlü bir etiketleme gösterir. F4/80 antikorlarıyla etiketlenmiş üretral epitelin tam montaj preparatlarında, epitel tabakasında dendritlerden oluşan bir arbor oluşturan makrofajlar ortaya çıktı. Makrofajlar, üretra epitel hücreleri arasında dendritik süreçler gönderirken gözlemlenebildi. Genel olarak, sonuçlar burada açıklanan protokollerin dişi fare üretrasının epitel tabakasının incelenmesinde faydasını göstermektedir.

Şekil 1: Kadın üretra toplama için fare diseksiyonu. (A) Faresi sırtüstü pozisyona getirin ve karın bölgesine %70 EtOH püskürtün. (B–C) Deriyi kaldırarak karın bölgesini açın ve dikey bir kesi yapın. (D) Yağ ve bağ dokusunu keserek (Siyah Ok) kasık simfizinde birleşen kelebek şeklindeki pubik kemikleri ortaya çıkarmak. (E) Kasık simfizini kes. (F) Kasık kemikleri çıkarıldıktan sonra, üretra mesaneden aşağıya doğru (siyah noktalı çizgi ile çizilmiş) görülebilir. (G) Mesaneyi nazikçe forsepsle yukarı çek. İra, ince kırmızı bir tüp olarak açıkça görünür. (H–I) Mesanesi vücut boşluğundan yukarı doğru çek. Üretrayı ventral vajinal duvardan ayırmak için mesane üzerindeki gerilim kullanın. Makası üretra ile vajinal duvar arasında geçirerek idrar ve üreme yollarını ayırın. (J–K) İrranın deriye bağlı distal ucunu ayırın. (L) Kesilmiş dişi fare alt idrar yolu (FLUT) görüntüsü, mesane ve üretra gösteriliyor. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Üretral epitelin izolasyonu ve tek hücreli süspansiyonun hazırlanması. (A) Üretranın epitel ve stromal bölmelerinin enzimatik sindirimini ve mekanik ayrılmasını ve ardından tek hücreli sindirimi tasvir eden şema. (B) Kadının alt idrar yolundan ekstra yağı temizle. (C–F) Üretrayı mesane boynu bölgesinden keserek üretrayı mesaneden ayırın. Sonra üretrayı ince makasla iki ikiye böl. (G) Üretra parçalarını 1x HBSS çözeltisi ile 100 mikronluk filtre üzerinden geçirerek yıkayın. (H) Üretra dokusu parçalarını %1 tripsin çözeltisine aktarmak. Soğuk odada bir örnek rotatör üzerinde kuluçka yapın. Aynı tüpe MgCl₂ ve DNase I ekleyin. Hibritizasyon fırınında örnek rotatör üzerinde 37 °C'de kuluçka yapın. (I–J) Epitel, üretral parçanın uzunluğu boyunca ince forsepsle nazikçe sıkarak izole edin. (K) Dokular ince makasla küçük parçalara kıymırtılır. Kıyma epitel dokusunu Accutase sindirim çözeltisine aktarın ve örnek rotatörlerde hibritizasyon fırınında 37 °C'de kuluçka yapın. (L) Epitel hücrelerini saymak ve hemositometre ile trypan blue kullanılarak canlılığı değerlendirmek. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Üretral epitel ve stroma bölmelerinden tek hücreli süspansiyonları değerlendirmek için akış sitometrisi. Akış sitometrisi, havuzlanmış fare üretrası (A) epitelyal ve (B) stromal bölmelerinin tek hücreli preparatlarında gerçekleştirildi. Canlı hücreler, Ghost Dye V450 ile boyanmış ölü hücreleri dışlamak için kapılı hale getirildi. Canlı hücreler CD45 (pan-immün belirteç), CD326/EPCAM (pan-epitel belirteç) ve F4/80 (fare makrofaj belirteç) ekspresyonu açısından değerlendirildi. Veriler, epitel ve stromal örnekler üretmek için her deney başına 5–6 fareden oluşan bir havuzda yapılan 2 bağımsız deneyi temsil eder. Kısaltmalar; SSC-A = yan dağılma-zirve alanı; FITC = floressein izotiosiyanat; APC = allofiyosiyanin; PE = fikoeritrin. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: Üretral epitel organoidlerin histolojisi ve immünboyaması. (A) Üretral epitel organoidlerinin üretimi için iş akışını gösteren şema. (B–G) In vitro genişlemenin farklı günlerinde tek hücrelerden üretilen üretral epitel organoidlerinin (UEO) temsil eden parlak alan mikrografları. Hematoksilin ve eosin (H&E) ile boyanmış (H) boş ve (I) katı üretral epitel organoidlerin (UEO) temsil eden parlak alan görüntüleri. (J) Üç bağımsız deneyde üretilen organoid tiplerinin nicelendirilmesi. Hata çubuğu, ortalamanın standart hatasını temsil eder. (K) boş ve (L) katı üretral epitel organoidlerinin (UEO) temsil eden görüntüleri, epitel belirteçleri KRT13 (suprabazal epitel belirteç), KRT5 (bazal epitel belirteç) ve P63 (bazal epitel belirteç) ile immün boyanmıştır. Tek floresan kanalları gösteren görüntüler K', K''', L' ve L''' renkleriyle gösterilmiştir. (M) boş ve (N) katı üretral epitel organoidlerinin (UEO) temsil görüntüleri, epitel belirteçleri KRT4 (suprabazal epitel belirteç) ve KRT5 (bazal epitel belirteç) ile immünboenli edilmiştir. Tek floresan kanalları gösteren görüntüler M', M'', N' ve N" harflerinde gösterilmiştir. (O) Proksimal ve distal üretra diseksiyon şeması. (P) Proksimal ve distal üretradan üretilen organoid tiplerinin iki bağımsız deneyde nicelendirilmesi. (Q) proksimal ve (R) distal üretradan izole edilen epitelden oluşturulan 6. gün üretral epitel organoidlerinin (UEO) temsil parlak alan mikrografları. Tam üretradan üretilen organoidlerin verileri, her deney için 3–5 farelik bir havuzla yapılan 3 bağımsız deneyin temsilcisidir. (S) Proksimal ve distal üretradan üretilen organoidlerin verileri, her deney başına 3–4 fare havuzuyla yapılan 2 bağımsız deneyin temsilcisidir. Çekirdekler DAPI (mavi) ile etiketlenmiş. (Ölçek çizgileri, 100 μM). BioRender ve Adobe Illustrator ile hazırlanmış şemalar. BioRender'da oluşturuldu. Binoy Joseph, D. (2026) https://BioRender.com/jvf17v7 Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 5: Üretral epitel tabakalarının tam montajlı immünboyaması. (A) Yetişkin dişi fare üretrasının optimal kesme ortamında 10 mikron donmuş kesimi, fare makrofaj belirteci F4/80 (kırmızı renk) ve epitel proteini E-kadherin/CDH1 (yeşil) için immünboyama göstermektedir. (A'), (A'da) içindeki inset'in yakınlaştırılmış görünümünü temsil eder. (B) İzole üretral epitel tabakalarının tam montajlı boyama adımlarını gösteren şematik diyagram. İzole dişi fare üretral epitel astarının tam immünboyaması, mare makrofaj belirteci F4/80 (kırmızı renk) ve epitel proteini E-kadherin/CDH1 (yeşil renk) karşısında antikorlarla gerçekleştirildi. (C) Birleşik görünümün temsilci görüntüsü. (D) Makrofaj organizasyonunu gösteren kırmızı kanalın ortogonal maksimum yoğunluk projeksiyonu. (E–F) Epitel ve ilgili makrofajların görüşüne yakınlaştırılmış. Beyaz ölçek çubuğu, 50 μM. Gri ölçekli çubuk, 500 μM. Veriler, 4–5 farelik bir havuzda yapılan 2 bağımsız deneyin temsilcisidir. BioRender ve Adobe Illustrator'da hazırlanmış şemalar. BioRender'da oluşturuldu. Binoy Joseph, D. (2026) https://BioRender.com/tjh9opk Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Tablo 1: 1x HBSS (Ca, Mg yok) hazırlanması.Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Tablo 2: 1x sHBSSa ve %1 Tripsin çözeltisi hazırlanması.Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Tablo 3: Hücre/akış boyama tamponunun hazırlanması.Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Tablo 4: Üretral epitel organoidler için organoid genleşme ortamının hazırlanması.Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Tablo 5: At Bloklama Tamponunun Hazırlanması.Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Dosya 1: İki bağımsız deneyden üretral epitelyal ve stromal bölmelerden tek hücreler üzerinde yapılan akış sitometrisi deneyi için hücre sayımları.Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 1: Yetişkin dişi fare üretral epitelinin üretral epitel organoidleriyle karşılaştırılması. (A) yetişkin dişi fare üretral epitelyumu, (B) içi boş üretral epitel organoidleri ve (C) epitel belirteçleri KRT13 (suprabazal epitel belirteç), KRT5 (bazal epitel belirteç) ve P63 (bazal epitel belirteç) ile immün boyanan katı üretral epitel organoidleri (UEO) temsil eden görüntüler. Tek floresan kanalları gösteren görüntüler A', A''', A'''', B'', B', C' ve C''' renklerinde gösterilir. (D) yetişkin dişi fare üretral epitel, (E) boş üretral epitel organoidleri ve (F) katı üretral epitel organoidleri (UEO) KRT4 (suprabazal epitel belirteç) ve KRT5 (bazal epitel belirteç) işaretleyicileriyle immün boyama görselleri. Tek floresan kanalları gösteren görüntüler D', D'', E', E'', F' ve F" renklerinde gösterilir. Her deney için 3–4 fare havuzuyla yapılan 3 bağımsız deneyin verilerini temsil ediyor. Çekirdekler DAPI (mavi) ile etiketlenmiş. (Ölçek çizgileri, 100 μM). Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

Vücuttaki epitel bariyerleri, konak savunması için kritik öneme sahiptir. Bunlar, birden fazla epitel hücre tipi ve ilişkili yerleşik bağışıklık hücrelerine sahip özel kompartmanlardır. Epitel bariyerleri, gelişim süresince değişir ve genellikle mikrobiyota veya çevresel maruziyete yanıt olarak konak savunma gen ekspresyonunu kazanır. Epitel bütünlüğü veya gen ifadesindeki kusurlar, konak savunmasını^{etkileyebilir 15}. Transkriptomik imzaları anlamak, hücre-hücre temaslarını ve epitel bütünlüğünü incelemek için epitel dokusunu izole olarak incelemek gereklidir. Şu anda, dişi fareden üretral epitel dokusunun izolasyonu için optimize edilmiş bir yöntem ayrıntılı olarak tanımlanmamıştır. Mesane epitelini yalnızca mekanik^{ayrım 16} ile izole edilebilirken, üretral epitel üretra stromal tüpünün içinde bulunur ve epitel dokusunu izole etmek için enzimatik ve mekanik ayrımın birleşimini gerektirir.

Burada yazarlar, dişi farelerin üretral lümeninden epitel tabakalarının izole edilmesi için optimize edilmiş bir yöntem sunmaktadır. Bu yöntem, akış sitometrisi, organoid kültürü ve immünboyama gibi aşağı akış uygulamaları için üretral epitel hücrelerinin yüksek canlılıklı tek hücreli süspansiyonlarının oluşturulmasında kullanılabilir. Bu yöntemin tek hücreli RNA dizileme iş akışlarıyla uyumluluğu daha önce aynı grup⁵ tarafından gösterilmişti. Değişiklikler ve daha fazla optimizasyonla, burada sunulan protokol, diğer tübüler organlardan epitel dokularını alacak şekilde uyarlanabilir.

Protokolün temel adımları, tam boy yetişkin dişi fare üretrasının dikkatli bir şekilde diseksiyonunu içerir; bu da proksimal-distal eksen boyunca bölgesel farklılıkların incelenmesini sağlar. Bunun ardından protokol, üretra epitelyal tabakasını çevredeki stromadan gevşetmek için nazik enzimatik sindirim kullanır. Enzimatik sindirim, epitelyi gevşetirek mekanik ayrılmaya olanak tanır; üretral tüpü forsepsler arasında nazikçe sıkılıp epitel dokusunu serbest bırakır. Araştırmacılar, tripsin sindirimi zamanlamasını dikkatlice optimize etmişler; yüksek canlılıkla (%> %80) üretral epitelin immünboyama veya aşağı akış tek hücreli izolasyon için levha olarak izolasyonu mümkün kılmıştır (Şekil 3, Ek Dosya 1). Üretral epitelin tek hücreli sindirimi, üretral epitel izolatlarındaki epitel hücrelerinin %80–90'ını ortaya çıkardı. Önceki bir çalışmadan yazarlar, bu preparattaki epitel dışı hücrelerin çoğunlukla epitelyal ilişkili bağışıklık hücreleri ve vasküler endotel 5'ten oluştuğunu tespit^ettiler. Mevcut tek hücreli izolasyon yöntemi, akış sitometrisi ve tek hücreli RNA dizileme gibi aşağı akış uygulamaları için yüksek kaliteli tek hücreli süspansiyonlar sağlar; küçük ölçülü iğne aspirasyonu ile mekanik bozulma yoluyla hücre kümelerini ortadan kaldırır ve RBC'ler nazik bir lizle çıkarılır.

Sonuçlar, bu yöntemin kompartmana özgü bağışıklık hücrelerini zenginleştirmek için kullanılabileceğini göstermektedir (Şekil 3). Proksimal ve distal üretradan izole edilen epiteller ayrıca ayrı olarak incelenebilir. Ayrıca, yazarlar izole epitel hücrelerin, daha önce tanımlanmamış üretral organoidlerin üretiminde kullanılabileceğini göstermiştir (Şekil 4). Bu sonuçlar ayrıca dişi üretrada organoid üretim kapasitesinde bölgesel değişkenliği göstermektedir. Yazarın son çalışmaları, dişi fare üretrasında epitel gen ekspresyonunda ve bağışıklık hücresi organizasyonunda proksimal-distal farklılıklar^{gösterse de mevcut} çalışma, proksimal üretral epitel hücrelerinin distal üretradan izole edilen epitelden daha az organoid oluşturduğunu göstermektedir (Şekil 4). Proksimal ve distal üretra arasındaki bu mekânsal sınırın bir sınırlaması, diseksiyon sırasında bu iki alanı ayırt etmek için kullanılabilecek anatomik bir işaret olmamasıdır. Bu çalışmada yazarlar, proksimal ve distal bölmeleri elde etmek için üretra uzunluğunu yarıya bölmüştürler. Burada açıklanan epitel izolasyon yöntemi, proksimal ve distal üretral epiteller arasındaki gen ifadesi ve hücresel bileşim farklılıklarını daha da karakterize etmek için kullanılabilir.

Burada sunulan optimize edilmiş protokol erişilebilir ve tekrarlanabilir olsa da, bazı adımlar pratik ve dikkatli kalibrasyon gerektirir. Özellikle, burada gösterilen diseksiyon yöntemi, üretra borusunun pubik simfizin altından dikkatlice çıkarılmasını ve üretranın tüm uzunluğunun korunmasını gerektirir. Ayrıca, diseksiyondan sonra dorsal üretra duvarına bağlı vajinal dokunun da çıkarılması dikkat edilmelidir. Mesane boynu çevresindeki yağ, tek hücreli RNA dizileme gibi sonraki uygulamalarda adiposit kontaminasyonunu azaltmak için dikkatlice çıkarılmalıdır. Ayrıca, tripsin sindirimi her enzim partisiyle dikkatlice optimize edilmelidir ki tutarlı sindirim sağlansın. Dokunun aşırı sindirimi hücre canlılığının kaybına yol açabilir. Yazarlar, tripsin sindirimi süresini dikkatlice optimize etmiş ve kuluçka aşamaları için 4 °C ile 37 °C arasında 15–30 dakika zaman aralığı göstermiştir. Bu, kullanılan enzim partisine göre daha da optimize edilebilir. Ayrıca, verimli tek hücreli sindirim için dokuları küçük parçalara parçalamak da kritiktir. Yazarlar, hafif bir ayrışma sonucu olduğu için tek hücreli sindirim için Accutase kullandılar. Hücre canlılığı azaldığında, Accutase kuluçka süresi kısaltılabilir. Ayrıca, yazarlar hücre hayatta kalmasını artırmak için Accutase sindirim karışımına Kaya inhibitörü dahil etmiştir. DNaz sindirimi, ölü ve ölen hücrelerden salınan ekstraselüler DNA'yı sindirerek hücre topaklanmasını azaltmak için önerilir. Yazarlar ayrıca, akış sitometrisi ve tek hücreli RNA dizileme gibi sonraki sonuçları karıştıracak kırmızı kan hücresi kontaminasyonunu azaltmak için RBC lizis tamponunun kullanılmasını önermektedir.

Burada sunulan epitel izolasyon yönteminin bir sınırlaması, dişi fare üretrası için optimize edilmiş olmasıdır. Erkek fare üretrası anatomik olarak daha karmaşıktır ve epitel mimarisi proksimalden distal üretraya değişir. Ayrıca, yöntem yalnızca üretral lümenin kaplayan epitel hücrelerini izole edebilir. Kısa epitel kanalları aracılığıyla üretral lümene bağlı üretral sekretör bezler stromal dokuda gömülü olduğundan izole edilemez. Bunun yerine, bu epitel yapıları, üretral epitel tabakası izole edildikten sonra kalan stromal kompartmanda zenginleştirilir (Şekil 3).

Bu sınırlamalara rağmen, bu yöntem üretral epitel mimarisi hakkında önemli bilgiler sağlamış ve epitelyal ilişkili makrofajların yerinde görselleştirilmesi yoluyla epitelyal ilişkili bağışıklık hücrelerinin daha fazla araştırılmasına olanak sağlamıştır. Yöntemin, üretral epitelde ve ilişkili bağışıklık hücrelerinde hücresel heterojenliği belirlemek için tek hücreli RNA dizileme iş akışlarıyla uyumlu olduğu zaten^{kanıtlanmış 5}. Ayrıca, epitelin proksimal ve distal üretradan izole edilmesi yeteneği, çalışmaların üretradaki mekansal farklılıkları anlamasını sağlayacaktır. Önemli olarak, epitel hücre sindirim yöntemi, konak-patojenler etkileşimleri ve üreterin epitel biyolojisini incelemek için faydalı olacak üretral epitel organoidleri üretebilen canlı tek hücreler üretir. Genel olarak, bu yöntemler üretral epitel biyolojisi üzerine daha derin araştırmalar yapılmasını sağlayan araç setine katkı sağlar.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
#5 fine forceps
10% neutral buffered formalin	Sigma Aldrich	HT501128
10X HBSS	Sigma Aldrich	H4641
12-well plate	Corning	3513
30-micron pre-separation filter	Miltenyi Biotec	130-041-407
A83-01	Sigma Aldrich	SML0788
Accutase	Sigma Aldrich	SCR005
Adobe Illustrator	Adobe		Şekil panellerini yapmak için
Adobe Photoshop	Adobe		Şekil panellerini yapmak için
Advanced DMEM/F12	Gibco	12634010
Antibiotic/antimycotic	Sigma Aldrich	A5955
Anti-CD326 (EpCAM)	Invitrogen	17-5791-82	1:20 seyreltme, Akış sitometrisi için
Anti-CD45	Tonbo	35-0451-U100	1:20 seyreltme, Akış sitometrisi için
Anti-CDH1 (Rabbit)	Cell Signalling Technology	3195S	1:200 seyreltme
Anti-F4/80	Tonbo	50-4801-U100	1:20 seyreltme, Akış sitometrisi için
Anti-F4/80 (Rat)	Invitrogen	14-4801-82	1:200 seyreltme
Anti-Keratin 13 (Rabbit)	Abcam	ab92551	1:200 seyreltme
Anti-Keratin 4 (Mouse)	Abcam	ab9004	1:200 seyreltme
Anti-Keratin 5 (Chicken)	Biolegend	905904	1:800 seyreltme
Anti-Keratin 5 (Rabbit)	Cell Signaling Technology	71536	1:200 seyreltme
Anti-p63 (Mouse)	Biocare medical	CM163A	1:200 seyreltme
Axioobserver 7	Zeiss	431007-9904-000
B27 supplement	Invitrogen	12587010
Bovine serum albumin (BSA), fraction V	Genetix	PG-2330
CD-1 Mice	Charles River, USA	Crl:CD1(ICR)
Cultrex BME	R&D systems	3445-005-01
DAPI solution	Sigma Aldrich	D5942
D-Glucose	Qualigens	Q15405
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Himedia	MB058
di-Sodium Hydrogen Ortophosphate (Na2HPO4)	Qualigens	Q15825
DNase I	Sigma Aldrich	10104159001
Donkey anti-Chicken IgG (H+L) (AF488)	Jackson Immunoresearch	703-545-155	1:500 seyreltme
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) (AF488)	Jackson Immunoresearch	715-545-151	1:500 seyreltme
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) (AF594)	Jackson Immunoresearch	715-585-151	1:500 seyreltme
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) (AF594)	Jackson Immunoresearch	711-585-152	1:500 seyreltme
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) (AF647)	Jackson Immunoresearch	711-605-152	1:500 seyreltme
Donkey anti-Rat IgG (H+L) (AF647)	Jackson Immunoresearch	712-605-153	1:500 seyreltme
Donkey anti-Rat IgG (H+L) (AF594)	Jackson Immunoresearch	712-585-153	1:500 seyreltme
EGF	PeproTech	AF-315-09
Eosin	Himedia	GRM938
Ethanol	Supelco	1.00983
Eukitt mounting media	Sigma Aldrich	3989
FGF10	PeproTech	450-61
Filter cap sorting tubes	Falcon/Corning	352235
Ghost Dye™ Violet 450	Tonbo biosciences	13-0863-T100
Glutamax	Invitrogen	35050061
Glycerol anhydrous	Merck	DA1P692899
Hematoxylin	Polysciences	24243
HEPES	Gibco	15630080
Horse serum	Gibco	26050088
Kaluza Analysis	Beckman Coulter	Kaluza Analysis 2.4	Akış sitometrisi verilerinin analizi
Magnesium chloride (MgCl2)	Qualigens	Q15535
Mouse TruStain FcX (anti-mouse CD16/32 )	Biolegend	101320
N-acetyl cysteine	Sigma Aldrich	A9165
Nicotinamide	Sigma Aldrich	N0636
Noggin	PeproTech	AF-250-38
n-Propyl gallate	Sigma Aldrich	P3130
Paraffin wax	Qualigens	Q19215
Potassium chloride (KCl)	Qualigens	Q13305
Potassium dihydrogen orthophosphate (KH2PO4)	Qualigens	19465
Primocin	Invivogen	ant-pm-05
RBC Lysis Buffer (10X)	Tonbo biosciences	TNB-4300-L100
Retinoic acid	Sigma Aldrich	R2625
Rocki  (Y-27632)	Cell Signalling