Hücre Geçişleri Arasında Diş Pulpun Kök Hücresinden Türetilen Ekzosomlarının İzolasyonu ve Karakterizasyonu

Özet

Bu protokol, diş pulpu kök hücrelerinden (DPSC) türetilen ekzozomların geçişler arasında izole edilmesi ve karakterize edilmesi için standartlaştırılmış bir iş akışı sunar; böylece rejeneratif uygulamalar için ekzozom kalitesi ve fonksiyonel aktivitenin tekrarlanabilir değerlendirilmesini sağlar.

Özet

Diş pulpu kök hücreleri (DPSC'ler), mezenkimal kök hücrelerin erişilebilir ve klinik olarak önemli bir kaynağıdır ve bunlardan türemiş ekzosomlar, doku mühendisliği ve rejeneratif tıpta hücresiz uygulamalar için umut vadeden biyoaktif veziküller olarak ortaya çıkmıştır. Ancak, DPSC kaynaklı ekzosomları izole etmek ve işlevsel olarak doğrulamak için tekrarlanabilir ve standartlaştırılmış yöntemler, özellikle hücre genişlemesi sırasında geçişler boyunca ortaya çıkan değişkenlik açısından sınırlı kalır. Burada, rutin laboratuvar uygulamasıyla uyumlu olan DPSC ile koşullandırılmış ortamdan ekzozomların izolasyonu ve arındırılması için kapsamlı, standartlaştırılmış, kit tabanlı bir iş akışını tanımlıyoruz. Bu yöntem, yaygın kullanılan tekniklerle morfolojik, moleküler ve fonksiyonel karakterizasyon için uygun sağlam veziküllerin tutarlı şekilde geri kazanılmasını sağlar. Ekzosom kimliği morfoloji, boyut dağılımı ve belirteç ifadesine göre değerlendirilirken, biyolojik aktivite tanımlanmış bir in vitro anti-inflamatuar test kullanılarak değerlendirilir. Geçişle ilgili etkileri incelemek için, farklı DPSC pasajlarından türetilen ekzosomlar bu fonksiyonel okuma kullanılarak karşılaştırılır ve hücre genişlemesi sırasında tutarlılığı değerlendirmek için pratik bir çerçeve sağlar. İzolasyon, arındırma, karakterizasyon ve fonksiyonel doğrulamayı tek bir iş akışına entegre ederek, bu protokol biyomalzeme araştırmaları ve rejeneratif uygulamalar için fonksiyonel olarak doğrulanmış DPSC kaynaklı ekzosomlar üretmek için tekrarlanabilir ve ölçeklenebilir bir yaklaşım sunar.

Giriş

Mezenkimal kök hücrelerden türetilen ekzosomlar, hücrelerarası iletişimde kritik arabulucular olarak hizmet verir ve doku mühendisliği ile rejeneratif tıp alanlarında önemli terapötik potansiyel gösterir. Ekzosomlar, 30–150 nm çapında veziküllerdir; biyoaktif moleküller taşıyabilir ve alıcı hücrelerde proliferasyon, farklılaşma ve bağışıklık yanıtı gibi çeşitli işlevleri^{düzenleyebilir 1,2}. Çeşitli mezenkimal kök hücre (MSC) kaynakları arasında, diş pulpu kök hücreleri (DPSC) kolay erişilebilirlikleri, sağlam çoğalma kapasitesi, düşük tümörjenik riski ve minimal etik endişeleri nedeniyle özellikle ilgi^{çekicidir 3,4,5}. DPSC'lerden (DPSC-Exos) türetilen ekzosomlar, proteinler, mRNA'lar ve mikroRNA'lar dahil olmak üzere çeşitli fonksiyonel yük repertuarına sahiptir ve bu da ebeveyn hücrelerinin birçok biyolojik özelliğini korumalarını sağlar. Önceki çalışmalar, DPSC-Exos'un anjiyogenezi, sinirsel onarımı, kemik yenilenmesini ve anti-inflamatuar yanıtları destekleyebildiğini göstermiştir. Doku mühendisliğindeki rollerinin ötesinde, ekzosomlar onkogenez ve kanser tedavisinde giderek önemli düzenleyiciler olarak kabul edilmektedir; burada tümör mikro ortamının yeniden şekillendirilmesi, ilaç direnci ve bağışıklık kaçışına katkıda^{bulunurlar 6}. MSC kaynaklı ekzosomlar, DPSC'lerden olanlar da dahil, doğuştan gelen tümör yönlendirme yeteneklerine ve immünomodülatör özelliklere sahiptir; bu da onları hedefe yönelik anti-kanser ilaç teslimatı veya hücresiz immünoterapi ajanları olarak umut vadeden yeni nesil araçlar olarak konumlandırır. Hücre tabanlı tedavilerle ilgili çeşitli sınırlamaları aşarak, DPSC-Exos, rejeneratif uygulamalar için umut vadeden hücresiz biyoaktif^{bileşen olarak ortaya çıkmıştır} 7,8,9,10,11,12.

Bu avantajlara rağmen, DPSC-Exo araştırmalarının tekrarlanabilir deneysel veya klinik kullanıma dönüştürülmesi hâlâ zordur. Büyük bir sınırlama, ekzosom izolasyonu ve arındırma için birleşik ve standartlaştırılmış protokollerin olmamasıdır. Şu anda kullanılan yaklaşımlar arasında ultrasantrifügasyon¹³, ultrafiltrasyon, çökeltme, boyut dışlama kromatografisi ve immünoafinite yakalama^14,15 yer almaktadır. Bu yöntemler arasında, polimer bazlı çökeltme yüksek veri verimliliği, geniş bir numune hacimleriyle uyumluluk ve operasyonel basitlik gibi pratik avantajlar sunar; bu da büyük örnek sayıları veya ölçeklendirme gereksinimleri içeren çalışmalar için^uygundur 16,17,18. Farklı izolasyon yöntemlerinin karşılaştırmalı analizleri, özellikle protein verimi ve parçacık-protein oranı açısından literatürde geniş çapta^{belgelenmiştir 19}. Ancak, DPSC geçiş numarasının türetilmiş ekzosomların özellikleri ve biyolojik aktivitesi üzerindeki etkisi yeterince ele alınmamış olup, DPSC-Exo üretiminin standartlaştırılması ve kalite kontrolü için önemli bir boşluk oluşturmaktadır.

Bu teknik sınırlamaları gidermek için, bu çalışma DPSC ile koşullandırılmış ortamdan ekzosomları izole etmek ve saflaştırmak için standartlaştırılmış, kit tabanlı bir protokol sunmaktadır. Fiziksel ve moleküler karakterizasyonun yanı sıra, protokol farklı DPSC pasajlarından türetilen ekzosomların anti-inflamatuar etkinliğini değerlendirmek için fonksiyonel bir test içermekte; bu da ekzosom kalitesi ve fonksiyonunda geçişe bağlı tutarlılığın karşılaştırmalı bir değerlendirmesini mümkün kılar. İş akışı, standart hücre kültürü ve moleküler biyoloji olanaklarıyla donatılmış laboratuvarlarda doğrudan uygulanacak şekilde tasarlanmıştır. Deneyler arası değişkenliği azaltmak için ticari olarak mevcut kitlere dayanır ve farklı deneysel ihtiyaçlara uygun şekilde kolayca ölçeklendirilebilir. Donör-donör değişkenliğini en aza indirmek için, DPSC'ler bireysel dişlerden izole edilir ve birden fazla bağışçıdan toplanmak yerine bağımsız olarak genişletilir. Bu protokol, özellikle yara iyileşmesi, kemik dokusu mühendisliği ve partiden partiye tutarlılığın önemli olduğu immünomodülasyon çalışmaları gibi sonraki uygulamalar için fonksiyonel olarak doğrulanmış DPSC kaynaklı ekzosomlar üretmek isteyen araştırmacılar için faydalıdır. Genel olarak, doku mühendisliği ve rejeneratif tıp araştırmalarında kullanılmak üzere DPSC kaynaklı ekzosomların üretimi için pratik ve standartlaştırılmış bir çerçeve sunar.

Protokol

Bu çalışma, Helsinki Bildirgesi'nin ilkelerine uygun olarak yürütüldü ve kurumsal etik komiteleri tarafından onaylandı. İnsan diş pulsu dokuları, Ningbo Stomatoloji Hastanesi'nde toplanan atılmış üçüncü azı dişlerden veya ortodontik premolarlardan kurumsal etik yönergelere uygun olarak elde edilmiştir (Protokol No. NBKQYY2025LS-04; onay tarihi: 30 Mayıs 2025). İnsan derisi dokuları, Ningbo Üniversitesi Bağlı Halk Hastanesi Üroloji Bölümü'nde rutin sünnet işlemleri sırasında toplanan terk edilmiş sünnet örneklerinden, kurumsal etik yönergeler (Protokol No. 2024104; onay tarihi: 30 Ekim 2024) doğrultusunda alınmıştır. Örnek toplamadan önce tüm bağışçılardan veya yasal vasilerinden yazılı bilgilendirilmiş onay alınmıştır.

1. Diş pulpası kök hücresinden kaynaklanan ekzosomların izolasyonu

1. DPSC'lerin izolasyonu, kültürü ve tanımlanması
   1. Örnek toplama ve taşıma
      1. Ortodontik ekstraksiyondan sonra 18–25 yaş arası donörlerden sağlam insan üçüncü azı dişlerini veya 12–16 yaş arası donörlerden premolarları toplayın.
      2. Hemen çekilen dişleri önceden soğutulmuş fosfatlı tampon tuzlu sunu (PBS) ve 100 U/mL penisilin ve 100 μg/mL streptomisin ile takviye edilmiş içine yerleştirin.
      3. Örnekleri laboratuvara 4 °C'de taşıyın ve ekstraksiyondan 6 saat içinde işlem.
   2. Diş pulpu maruziyeti ve doku ayrışması
      1. %70 etanol içinde 30 saniye batırın; 1× PBS ile üç kez yıkayım; %3 P/S (her biri 30 saniye) içerir. Diş yüzeyinden kalan diş eti ve periodontal dokuları steril makas veya bistüri kullanarak dikkatlice çıkarın.
      2. Dişi steril gazlı bezle sar, ardından steril bir çekiçle kronu dikkatlice kırarak pürsü haznesini ortaya çıkar.
      3. Pulp dokusunu dentinden nazikçe ayırın, steril cerrahi bıçaklarla küçük parçalara (<1 mm³) doğrayın.
      4. Doku parçalarını, 2.5 mg/mL Dispaz II ve 2.5 mg/mL kollagenaz tip I sindirim çözeltisi içeren 1,5 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın.
      5. Karışımı 37 °C inkübatörde 30–45 dakika boyunca hafif çalkalayarak kuluçka yapın.
         NOT: Enzimatik sindirim süresi, diş pulsu dokusunun hacim ve homojenleşme derecesine göre belirlendi.
   3. Sindirim sonlandırması ve primer hücre kültürü
      1. Enzimatik sindirimi durdurun; %10 fetal sığır serumu (FBS) ile takviye edilmiş Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı (DMEM) ekleyerek enzimatik sindirimi durdurun.
      2. Hücre süspansiyonunu 200 × g boyunca 5 dakika boyunca santrifüjlenerek hücreleri ve doku parçalarını pellet edin.
      3. Üst malzemeyi atıp pelleti 1 mL tam kültür ortamında (%20 FBS, 100 U/mL penisilin ve 100 μg/mL streptomisin ile α-MEM) yeniden askıya alın.
      4. Yeniden askıya alınmış hücreleri ve ekizleyicileri 60 mm'lik bir kültür kabına tohumlayın ve son 5 mL hacme tam kültür ortamı ekleyin.
      5. Hücreleri %5 CO₂ içeren nemlendirilmiş bir atmosferde 37 °C'de kuluçkaya geçirin.
   4. Hücre bakımı ve alt kültür
      1. Kültür ortamını her 2–3 günde bir yenileyin.
      2. Hücreleri her gün takip edin.
         NOT: Birincil DPSC'ler genellikle doku explant'larından göç eder ve 7–14 gün içinde %80–90 birleşime ulaşır.
      3. Alt kültür için, hücreler %80–90 birleşime ulaştığında %0,05 tripsin-etilendiamintetraasetik asit (EDTA) kullanılarak ayrılır.
         DIKKAT: Tripsin bir tahriş edici kaynaktır. Eldiven ve koruyucu gözlük dahil olmak üzere uygun kişisel koruyucu ekipman giyin.
      4. Tam kültür ortamı ile (%20 FBS ile) 1:3 oranında geçiş hücreleri yapılır.
      5. Tüm aşağı akış ekzosom izolasyonu ve fonksiyonel testler için 2, 4 ve 6. pasajlarda DPSC'ler kullanın.
   5. DPSC'lerin akış sitometrisi ile karakterizasyonu
      1. DPSC'leri istenen pasajda %0,05 tripsin-EDTA ile ayırın, tam kültür ortamıyla nötralize edin ve hücre süspansiyonunu toplayın.
      2. Oda sıcaklığında 300 × g boyunca 5 dakika boyunca santrifüj yapın ve süpernatantı atın. Hücre pelletini PBS'ye yeniden süzüldürün ve hücreleri sayın. Hücre yoğunluğunu yaklaşık 1 ×^{10 6} hücre/mL olarak ayarlayın.
      3. Her akış sitometri tüpüne hücre süspansiyonunun 100 μL alısı. Hücreleri, CD44, CD90, CD105, CD45, CD19 ve CD14'e karşı florokrom ile konjuge edilmiş antikorlarla PBS'de 1:100 seyreltme ile 4 °C sıcaklıkta 30 dakika boyunca 4 °C sıcaklıkta kuluçka yapın.
      4. Hücreleri her tüpe 1 mL PBS ekleyerek yıkayın, ardından 300 × g 5 dakika boyunca santrifüj yapın. Süpernatantı dikkatlice atın ve hücre pelletini analiz için 300–500 μL PBS ile yeniden süspansiyona bırakın.
      5. Her florokrom için uygun izotip kontrol antikorlarını eşleştirilmiş konsantrasyonlarda ekleyin; böylece arka plan düzeltmesi ve gating sağlanır.
      6. Seçilen florokromlar için uygun lazerler ve filtrelerle donatılmış bir akış sitometresi kullanarak örnekleri analiz edin. Her örneklem başına en az 10.000 olay edinin.
      7. Akış sitometrisi yazılımı kullanarak veri analizi yapın. İlk olarak, döküntüleri dışlamak için ileri saçılma (FSC) ve yan saçılma (SSC) tabanlı kapı kullanılabilir hücreler. Sonra doubletleri çıkarmak için singlet kapı uygulayın.
      8. Pozitif ve negatif popülasyonları tanımlamak için floresans yoğunluğunu ilgili izotip kontrolleriyle karşılaştırarak belirtici ifadesini belirleyin.
2. DPSC-Exos'un izolasyonu ve arındırılması
   1. Koşullu ortamın hazırlanması
      1. DPSC'leri 10 cm'lik bir kültür kabında %70–80 birleşime ulaşana kadar kültürleyin.
      2. Kullanılan ortamı çıkarın ve hücre monolayer'ı önceden ısıtılmış PBS ile iki kez nazikçe yıkayın.
      3. 10 mL tam ortam ve %10 ekzozom eksiklenmiş FBS ekleyin.
      4. Kültürü 37 °C'de hücre birleşimi %90–100'e ulaşana kadar daha fazla kuluçka edinin (bu süreç genellikle 24 saati aşmaktadır).
   2. Koşullu ortam koleksiyonu
      NOT: Tüm sonraki adımları buzda veya 4 °C'de tutun.
      1. Koşullu ortamı santrifüj tüpüne aktarın.
      2. Ortamı 4 °C ve 3.000 × g sıcaklıkta 10 dakika boyunca santrifüjle ederek hücreleri ve büyük kalıntıları çıkarın.
      3. Süpernatantı dikkatlice yeni bir santrifüj tüpüne aktarın, peleti rahatsız etmeden.
      4. Süpernatantı 4 °C ve 10.000 × g sıcaklıkta 10 dakika boyunca santrifüjlenerek daha küçük parçacıklar ve apoptotik cisimler pellet edilsin.
      5. Süpernatantı 0.22 μm şırınga filtresinden temiz bir 50 mL santrifüj tüpüne filtreleyin.
      6. Ekzozom izolasyonu için derhal işlenmiş ortamı veya aliquot ile -80 °C'de sakla.
         NOT: Aydınlaştırılmış koşullu ortam birkaç ay boyunca -80 °C sıcaklıkta saklanabilir. Tekrarlayan donma-erime döngülerinden kaçının.
   3. Polimer bazlı çökeltme ile ekzosom izolasyonu
      1. Dondurulmuşsa arındırılmış koşullu ortamı buz üzerinde eritin.
      2. Buz üzerindeki steril bir tüpte, ortamı 4:1 hacim oranında bir ekzosom konsantrasyon çözeltisiyle birleştirin (örneğin, 20 mL ortam: 5 mL çözeltisi). Karışımı 1 dakika boyunca vortex ile homojenliği sağlamak için.
      3. Karışımı 4 °C'de 16–18 saat boyunca bozulmadan bırakın, böylece ekzosom çökelmesi sağlanır.
         NOT: Kuluçka süresi, verimi artırmak için uygun şekilde uzatılabilir, ancak 24 saati geçmemelidir.
      4. Karışımı 4 °C ve 10.000 × g sıcaklıkta 75–80 dakika boyunca santrifüjlenerek ekzozomları peletleyin. Süpernatantı dikkatlice aspire edin ve pelleti rahatsız etmeden atın.
      5. Tüpü tekrar 4 °C ve 10.000 × g'de 2 dakika boyunca santrifüjleyin. Kalan süpernatantı pipetle çıkarın.
      6. Ekzosom pelletini 1x PBS ile yeniden süskü (20 mL koşullu ortam başına 200 μL PBS kullanın).
      7. Resüspansiyonu yeni bir 1,5 mL santrifüj tüpüne aktarın ve 4 °C ve 12.000 × g sıcaklıkta 2 dakika boyunca santrifüj yapın; üst-süperatantı koruyun; bu da ekzosom parçacıklarıyla zenginleştirilmiş (gerekirse tekrarlanın).
   4. Ekzosomların Arındırılması
      1. Ekzozom süspansiyonunu, toplama tüpüne yerleştirilmiş bir ekzozom arıtma filtresi kolonuna uygulayın.
      2. Kolonu 4 °C ve 3.000 × g'de 10 dakika boyunca santrifüjleyin.
      3. Toplama tüpünün altından akış sıvısını toplayın. Bu sıvı, saflaştırılmış ekzosomları içerir.
   5. Temizlenmiş ekzosomların depolanması
      1. Aliquot, saflaştırılmış ekzosom süspansiyonunu sonraki deneyler için uygun tek kullanımlık hacimlere dönüştürür.
      2. Aliquotları -80 °C'de sakla.
         NOT: Aliquote, ekzosom bütünlüğünü ve biyolojik aktiviteyi bozabilecek tekrar eden donma-erime döngülerini önlemek için kritiktir.
   6. DPSC-Exo'nun karakterizasyonu ve tanımlanması
      1. 1.2.6.2–1.2.6.6 adımlarında tanımlandığı gibi transmisyon elektron mikroskopisi (TEM) ile morfolojik analiz yapılacaktır.
      2. Bir pipet kullanın, hazırlanmış ekzozom süspansiyon örneğinden 10 μL çekin ve önceden hazırlanmış Parafilm'e bırakın. Formvar/karbon kaplamalı bakır ızgarayı, film tarafı aşağıya bakacak şekilde, damlanın üzerine yerleştirin; böylece damlanın doğal olarak adsorbasyonuna 10–15 dakika bekleyin.
      3. Fazla sıvıyı çekmek için filtre kağıdı şeridi kullanın ve kısa bir süre hava kurumasına izin verin.
      4. Bir pipet kullanın, %2 fosfotungstik asit çözeltisinden 10 μL çekin ve Parafilm'e bırakın. Adsorpsiyon adımını tamamlamış ızgarayı, film tarafı boyama çözeltisine bakacak şekilde ters çevirin ve 3–5 dakika bekletin.
      5. Fazla sıvıyı çekmek için bir filtre kağıt şeridi kullanın ve ızgaranın akkor lamba altında kurumasına izin verin.
      6. Geçirimli elektron mikroskobu kullanarak gözlem ve görüntü yakalamak.
      7. 1.2.6.8–1.2.6.12 adımlarında tanımlandığı gibi nanopartikül takip analizi (NTA) ile boyut dağılımı ve konsantrasyon analizi yapılmalıdır.
      8. Numune haznesini ultra saf suyla üç kez durulayın.
      9. Cihazı, üreticinin talimatlarına göre standart 100 nm polistirol boncuklarla kalibre edin. Başarılı kalibrasyondan sonra ölçümlere devam edin.
      10. Numune odasını 1× PBS ile durulayın.
      11. Ekzozom örneğini 1× PBS (1:500 seyreltme) ile seyreldin ve örnek odasına yükleyin. Parçacık hareketini gerçek zamanlı olarak cihaz yazılımı kullanarak izleyin.
      12. Veri edinin ve ilgili analiz raporunu oluşturun.
      13. Protein belirteçlerini Western blot analiziyle tanımlayın; bu da 1.2.6.14–1.2.6.24 adımlarında açıklanır.
      14. Ekzozom özgül protein lizis tamponu kullanarak ekzozom örnekleri liz yapın ve protein konsantrasyonunu bicinchoninic acid (BCA) testi ile nicelikle ölçün.
      15. Jelleri çözme ve üst üste yığma hazırlayın. Her şerit başına eşit miktarda protein yükleyin ve her jele 5 μL protein belirteci ekleyin.
      16. Elektroforez işlemi 80 V sabit voltajda boya cephesi çözücü jele ulaşana kadar gerçekleştirin, ardından 120 V'a çıkarın ve boya cephesi jelin dibine ulaşana kadar devam edin.
      17. Bir poliviniliden florür (PVDF) membranını uygun boyutta kesin ve 5 dakika boyunca metanolde bekletilerek aktive edin.
      18. 25 mM Tris bazı, 192 mM glisin ve %20 (v/v) metanolden (pH = 8.3) oluşan transfer tamponu hazırlanır. Tüm transfer bileşenlerini transfer tamponunda dengeleyin.
      19. Transfer sandviçi katottan anoda aşağıdaki sırayla birleştirin: sünger – filtre kağıdı – jel – PVDF membran – filtre kağıdı – sünger. Hava kabarcıklarını çıkarın ve 300 mA sabit akımda protein transferi gerçekleştirin.
      20. Transferden sonra, PVDF membranını Tris tamponlu tuzlu suyla kısa süreliğine 0,1% Tween20 (TBST) ile durulayın ve %5 yağsız sütle oda sıcaklığında 1 saat boyunca nazikçe çalkalayın.
      21. Membranı, %5 yağsız sütle seyreltirilmiş birincil antikorlarla (örneğin, anti-CD63 ve anti-TSG101) kübe edin; gece boyunca 4 °C'de hafif sallanarak. Zarı TBST ile üç kez, her biri 5 dakika boyunca yıka.
      22. Uygun ikincil antikorla oda sıcaklığında 30 dakika kuluçka yapın, ardından TBST ile üç yıkama (her biri 5 dakika) yapın.
      23. Yeni elektrokemilyünesans (ECL) çalışma çözeltisi hazırlayın (A ve B çözeltilerini 1:1 oranında karıştırın), membrana uygulayın ve kemilyünlümensans görüntüleme sistemi kullanarak sinyalleri tespit edin.

2. İnsan birincil derisi epidermal keratinositlerinin izolasyonu ve kültürü

1. Örnek toplama ve taşıma
   1. Ningbo Üniversitesi Bağlı Halk Hastanesi'nde sağlıklı erkek bağışçılardan sünnet derisi dokusu örnekleri alın.
   2. Alınan sünnet derisi dokusunu hemen 4 °C PBS sıcaklığında, 100 U/mL penisillin-G ve 100 μg/mL streptomisin takviyesine yerleştirin.
   3. Örnekleri laboratuvara 4 °C'de taşıyın ve 6 saat içinde işlenin.
2. Aseptik hazırlık ve doku parçalanması
   1. Dokuyu %70 etanol içinde 30 saniye ile 3 dakika arasında batırın.
      NOT: İlk dezenfeksiyon için dalış süresini doku boyutuna göre ayarlayın.
   2. Steril makas veya bistüri kullanarak, yıkanmış doku örneğinden deri altı yağ ve bağ dokusunu diseksiyon ve çıkar.
   3. Steril cerrahi bıçaklarla küçük parçalara (parça boyutu <1 mm³) doğrayın.
      NOT: 3–4 doku örneği doğramak genellikle 15 dakikadan az sürer. Doku kuru görünürse doğrama sırasında az miktarda PBS ekleyin.
   4. Kıyılmış doku bulamaçı, 2.5 mg/mL Kollagenaz Tip I ve 2.5 mg/mL Dispaz II sindirim çözeltisi içeren 50 mL santrifüj tüpüne aktarın. Her parça kıyma dokusu için 10–20 ml sindirim çözeltisi ekleyin.
   5. Karışımı 37 °C kuluçka makinesinde 60 dakika kuluçka yapın. Nazik çaltımı 80 × g seviyesinde tutun veya tüpü her 20 dakikada bir elle kuvvetli şekilde karıştırın.
3. İkincil sindirim ve DNaz tedavisi
   1. Sindirim karışımına %0,25 Tripsin-EDTA ekleyin, 1:5 hacim oranında. Tüpü 37 °C'de 25 dakika boyunca hafif bir çalkalama ile kuluçka yapın.
      DIKKAT: Tripsin bir tahriş edici kaynaktır. Eldiven ve koruyucu gözlük dahil olmak üzere uygun kişisel koruyucu ekipman giyin.
   2. Karışıma DNase I çözeltisi (10 mg/mL) ekleyin; toplam sindirim hacminin her mL oranında 10 μL. 37 °C'de hafif bir çalkalama ile 5 dakika kuluçka yapın.
4. Sindirim sonlandırması ve primer hücre kültürü
   1. Enzimatik sindirimi durdurun, %10 FBS ile takviye edilmiş eşit hacimde DMEM ekleyin.
   2. Karışımı yaklaşık 20 kez yukarı aşağı pipetleyerek doku parçalarını ayırarak iyice tritüre yapın. Hücre süspansiyonunu 100 μm hücre süzgecinden yeni bir 50 mL santrifüj tüpüne filtreleyin.
   3. Hücre süspansiyonunu 200 × g ile 5 dakika boyunca santrifüjlenerek hücreleri ve doku parçalarını peletleyin.
   4. Üst malzemeyi atıp pelleti 1 mL tam kültür ortamında (%20 FBS, 100 U/mL penisilin ve 100 μg/mL streptomisin ile α-MEM) yeniden askıya alın.
   5. Yeniden askıya alınmış hücreleri ve ekizleri 10 cm'lik bir kültür kabına tohumlayın ve nihai hacmi 6 mL'ye tam kültür ortamı ekleyin.
   6. Hücreleri %5_CO2 içeren nemlendirilmiş bir atmosferde 37 °C'de kuluçka edin.
      NOT: Kültür sırasında Y-27632 ile birlikte 5 μM nihai konsantrasyonda keratinosit kültürlerini takviye edin.
5. Hücre bakımı ve alt kültür
   1. Kültür ortamını her 2–3 günde bir yenileyin.
   2. Hücreleri her gün takip edin.
      NOT: Birincil cilt epidermal keratinositleri genellikle doku ekplantlarından göç eder ve 10-14 gün içinde %80-90 birleşime ulaşır.
   3. Alt kültür için, hücreler %80–90 birleşime ulaştığında %0,05 tripsin-EDTA ile ayrılır.
      DIKKAT: Tripsin bir tahriş edici kaynaktır. Eldiven ve koruyucu gözlük dahil olmak üzere uygun kişisel koruyucu ekipman giyin.

3. Farklı geçişlerden alınan ekzosomların anti-inflamatuar fonksiyonunun fonksiyonel doğrulanması

1. Hücre tohumlama ve hazırlığı
   1. Tohum epidermal keratinositler 1,5 yoğunlukta ×^10-5 hücre her kuyuyla 12 kuyruklu bir plakaya yerleştirilir. Her kuyuya 1 mL tam ortam ekleyin ve hücreleri 24 saat kültürleyin.
   2. Hücre birleşimi yaklaşık %70'e ulaştığında, ortamı dikkatlice aspire edin, hücre monokatmanını önceden ısıtılmış 1× PBS ile iki kez nazikçe yıkayın.
2. İltihap uyarım ve ekzosom tedavisi
   1. Bir psoriasiform hücresel modeli indük edin, hücreleri proinflamatuar sitokin karışımı "M5" ile uyarın (IL-1α, IL-17A, IL-22, Oncostatin M ve TNF-α içerir, her biri nihai konsantrasyon 10 ng/mL).
   2. Tedavi grupları için, uyarılmış hücreleri DPSC-Exos (kuyuya 50 μg) ile birlikte inkübe edin.
   3. Negatif kontrol (NC) grubu için, ekzosomlar yerine eşdeğer bir hacim PBS ekleyin.
      NOT: Tüm uyarımları ve tedavileri, Y-27632 içermeyen bir ortamda uygulayarak inflamatuar sinyal yollarına potansiyel müdahalesini önlemek.
3. Örnek toplama ve qRT-PCR analizi (pasajlar arasında fonksiyonel karşılaştırma)
   1. Hücreleri toplayıp 24 saatlik tedaviden sonra RNA çıkarın.
   2. Ana inflamatuar belirteç IL-23A'nın ifadesini analiz edin.
      1. Farklı pasajlardan (P2, P4 ve P6) türetilen ekzozom tedavi grupları arasında IL-23A ifadesi üzerindeki inhibitör etkileri, qRT-PCR kullanarak ekzosom fonksiyonundaki geçiş bağımlı değişiklikleri değerlendirin.
      2. Aşağıdaki döngü koşullarıyla qRT-PCR yapılın: başlangıçta denatürasyon 95 °C'de 3 dakika boyunca, ardından 95 °C'de 10 saniye boyunca 40 döngü denatürasyon ve 60 °C'de 30 saniye tavlama/uzatma yapılın.
      3. 65 °C'den 95 °C'ye kadar erime eğrisi analizi yaparak amplifikasyon özgüllüğünü doğrulayın.
         NOT: Başlangıç dizileri: İnsan-IL-23A (ileri: 5'-GAAGAGGGAGATGAAGAGAC-3', geri: 5'-TATCCGATCCTAGCAGCTTC-3'); İnsan-H36B4 (ileri: 5'-GCAATGTTGCCAGTGTCTGT-3', geri: 5'-GCCTTTGACCTTTTCAGCAAG-3')

Sonuçlar

Diş Pulpu kök hücrelerinin tanımlanması ve karakterizasyonu
Tarif edilen protokolle izole edilen birincil diş pulp kök hücreleri (DPSC'ler), in vitro genişleme sırasında stabil büyüme ve tipik mezenkimal morfoloji sergilemiştir. Şekil 1'de gösterildiği gibi, 2, 4 ve 6. pasajlardaki DPSC'ler, morfolojik farklar veya geçitler arasında spontan farklılaşma belirtisi olmayan homojen bir iğne şeklinde, fibroblast be...

Tartışma

Bu çalışmada tanımlanan standartlaştırılmış protokol, diş pulpu kök hücrelerinin (DPSC) izolasyonu, DPSC kaynaklı ekzosomların (DPSC-Exos) üretimi ve bu veziküllerin birden fazla hücre geçişi boyunca fonksiyonel doğrulanması için tekrarlanabilir bir çerçeve sağlar. Aşağıdaki tartışma, kritik prosedürel hususları, optimizasyon stratejilerini, metodolojik sınırlamaları ve bu iş akışının rejeneratif tıp araştırmaları için daha geniş önemini vurgulamaktadır.

Bu pr...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
%0,05 Tripsin-EDTA Çözeltisi	Gibco	25300054	Sindirim gücü nedeniyle tripsin, hücre ayrışması, rutin hücre kültürü geçişi ve birincil doku ayrışması için yaygın olarak kullanılır.
100 mm Hücre ve Doku Kültürü Çanakı	Biofil	TCD010100	Yüzey Tedavisi/Tedavi Edilmemiş Steril & Non-Pyrogenic DNaz/RNase-Free
100 nm PS boncukları	Thermo Fisher	3100A	Nanopartikül takip analizi (NTA) deneyleri yapılmadan önce, cihaz tam olarak bilinen parçacık boyutuna (100 nm) sahip bir standart kullanılarak kalibre edilmelidir.
15 mL Toplu Konik Santrifüj Tüpü	KIRGEN	KG2611	Steril, RNaz/Dnase ve pirojenik içermiyor
200 ağlık Formvar karbon kaplamalı bakır ızgara	Zhongjing  Scientific  Enstrümanlar	AZH200	TEM görüntüleme için ekzozom örneklerini destekler. Formvar-karbon kaplama, örnek yapışmasını ve iletkenliğini artırırken, 200 ağlık ızgara ise eşit parçacık dağılımı ve stabil görüntüleme için yeterli açık alan sağlar.
37 ve derece; C Kuluçka Makinesi	Termo Bilimsel	51032877	37 derecelik CO2 kuluçka makinesi, ideal bir in vitro ortam sağlar.
50 mL Toplu Konik Santrifüj Tüpü	KIRGEN	KG2811	Steril, RNaz/Dnase ve pirojenik içermiyor
Anti-CD63 antikor [MX-49.129.5]	Abcam	AB193349	Anti-CD63 antikoru [MX-49.129.5] (ab193349), CD63 in  Western Blot, Akış Sitometrisi (İç Da), Akış Sitometrisi, IHC-P, ICC/IF. Uygun  İnsan.
Anti-TSG101 antikor [EPR7130(B)]	Abcam	AB125011	Anti-TSG101 antikoru [EPR7130(B)] (ab125011), TSG101 in  Western Blot, Akış Sitometrisi (İç Da), Akış Sitometrisi, IHC-P, ICC/IF. Uygun  İnsan, fare, fare.
Otomatik hücre sayacı	Countstar	IC1000	Hızlı ve hassas hücre sayımı için otomatik hücre sayacı
BCA Protein Test Kiti	Beyotime	P0012	50 - 2000 ve mu konsantrasyon aralığında iyi doğrusal ilişkiye sahip olur; G/ML.
Tezgah Üstü Santrifüj	BIORIDGE	TD5	Laboratuvar ortamlarında hızlı ve verimli örnek ayrımı için tezgah üstü santrifüj
Biyolojik güvenlik kabini	Termo Bilimsel	1379	Biyolojik Güvenlik Dolabı, havadaki patojenleri filtreleyerek ve mikrobiyolojik çalışmalar sırasında çapraz kontaminasyonu önleyerek operatörleri, örnekleri ve çevreleri biyolojik tehlikelerden koruyan steril bir muhafaza cihazıdır.
Hücre Kültür Plakası, 12-Well	Eppendorf	0030721110	Doku kültürü işlenmiş, kapak, düz taban Steril, tespit edilebilir pirogen, RNaz ve DNase, insan & bact. DNA Sitotoksik Olmayan
Hücre Kültür Plakası, 96-Well	NEST	701001 0714B	Doku kültürü işlenmiş (Polistiren), Pirojen Olmayan, Steril
Hücre kaydetme	NCM	C40100	Serumsuz, hayvansal proteinsiz Hücre Dondurma Ortamı
Kollagenaz, Tip I, toz	Gibco	17100017	Kollagenaz, nötr bir amino asit (X) ile glisin arasındaki bağı Pro-X-Gly-Pro dizisinde kesen bir proteazdır ve bu sırada kolajen içinde yüksek sıklıkla bulunur.
Dispase II, barut	Gibco	17105041	Dispaz II (nötr proteaz), polar olmayan amino asit kalıntılarının N-terminal peptid bağlarını hidrolize eden bir amino-endo peptidazdır.
Dulbecco'nun Modifiye Kartal Orta Modeli	Gibco	C11995500BT	[+]4.5g/l D-Glukoz [+]L-Glutamin [+]110mg/L Sodyum Piruvat
Evo M-MLV Ters Transkripsiyon Kiti	AG	AG11707	Gerçek Zamanlı RT-PCR için özel bir ters transkripsiyon reaktifi. Evo M-MLV ters transkriptazını güçlü uzatma yeteneğine sahip kullanır ve kısa sürede cDNA'nın verimli sentezini sağlar.
Ekzosom Konsantrasyon Çözeltisi	Umibio	UR52111	Hücre süpernatantından ekzosomları çıkar
Ekzosom Azalmış Fetal Sığır Serumu	Umibio	UR50202	Ekzosomsuz fetal sığır serumu, steril toplanan sağlıklı fetal sığır serumu filtrelenerek elde edildi ve ≥ Fetal sığır serumundaki endojen ekzosomların %99'u çıkarıldı. İşlemden önce fetal sığır serumuyla aynı hücre büyüme hızı ve morfolojiye sahipti.
Fetal Sığır Serumu, Nitelik, Avustralya	Gibco	10099141	Hemoglobin seviyesi:  ≤ 30 mg/dL (seviyeler rutin ve be; 25 mg/dL)
İnsan-H36B4	Sangon Biyoteknoloji	SB002	İleri: 5'-GCAATGTTGCCAGTGTCTGT-3'; Geri dönüş: 5'-GCCTTTGACCTTTTCAGCAAG-3'
Human-IL-23A	Sangon Biyoteknoloji	SB002	İleri: 5'-GAAGAGGGAGATGAAGAGAC-3'; Geri dönüş: 5'-TATCCGATCCTAGCAGCTTC-3'
Ters Biyolojik Mikroskop	Leica	DMI1	Kültür şişeleri ve petri kapları gibi kapların duvarlarına yapışan canlı hücreleri veya dokuları doğrudan gözlemleyin.
Minimum Gerekli Malzeme	Gibco	C12571500BT	[+]L-Glutamin [+]Ribonükleozidler [+]Deoksiribonukleozidler [+]Deoksiribonukleozidler
NcmSpin Hızlı RNA Çıkarma Kiti	NCM	M5106	Bu kit, 3.000.000 hücreye kadar toplam RNA ve 10mg'a kadar doku çıkarabilir.
Penisillin-Streptomisin	NCM	C100C5	10.000 birim/ml penisilin ve 10.000 mikrogram/ml streptomisin içerir. Bakterileri uzaklaştırmak için filtrelenmiştir ve doğrudan hücre kültürü için kullanılabilir. Hücrelerin bakteriyel kontaminasyonunu etkili bir şekilde önler.
PerfectStart Green qPCR SuperMix	TransGen	AQ601-02-V2	Tüm çift zincirli DNA'nın küçük yivine bağlanan ve uyarıldığında yeşil ışık yayan floresan bir boya. PCR amplifikasyonu sırasında, yeni amplifikasyon olmuş DNA'ya entegre olur ve bu da floresansın artmasına yol açar. Denatürasyon aşamasında, DNA zincirleri ayrılır, boyayı serbest bırakır ve floresans sinyalinde önemli bir düşüşe neden olur.
Fosfat Tamponlu Tuzlu Su (PBS)	Viva Cell Biosciences	C3582-0500	Görevi, ortamın pH'ını fizyolojik aralıkta tutmak ve hücre içinde ve dışında osmotik basınç dengesini sağlamaktır.
Fosfortungstik asit	Solarbio	G1870	TEM numune hazırlığında negatif boya olarak kullanılır.
SW Sallamalı Su Banyoları	Julabo	(DIN 12876-1)I	Çalışma sıcaklığı +20 ile +99,9 derece arasında değişir; C
Şırınga Filtresi,0.22 μ m/33 mm, PES	Beyotime	FF362	DNaz/RNaz Serbest Düşük Protein Bağlanan Pirojenik Olmayan Bireysel Sarılı
Geçirim Elektron Mikroskobu (TEM)	HITACHI	HT7700	Ekzosomlar dahil olmak üzere nanopartikül morfolojisinin yüksek çözünürlüklü görüntülemesi için kullanılır. 80&ndash hızlanma voltajında çalıştı; 100 kV, negatif boyalı örnekleri görselleştirmek ve parçacık boyutu, şekli ve yapısal bütünlüğünü doğrulamak için.
ZetaView_Particle Metrix	Parçacık Metrixi	PMX-120	Nanopartiküllerin parçacık boyutu, konsantrasyonu, Zeta potansiyeli ve floresans özelliklerini ölçmek için kullanılır.