Enzimle Bağlantılı İmmünosorbent Testler Kullanılarak İnsan Gözyaşı Filminde Cinsiyet Hormonu Tespiti

Özet

Bu protokol, mikrokapiller tüpler aracılığıyla toplanan insan gözyaşı sıvısında 17β-estradiol ve testosteronu tespit edip niceleyen optimize edilmiş enzim bağlantılı immünosorbent testi (ELISA) yöntemini tanımlar. Bu yaklaşım, gözyaşı hormon seviyelerinin minimal invaziv ölçümünü sağlar.

Özet

Gözyaşı filmi, göz yüzeyinin sağlığını, görsel netliği ve patojenlere ile çevresel stres faktörlerine karşı koruma için hayati öneme sahip karmaşık, çok katmanlı bir sıvıdır. Öncelikle lipidler, sulu sıvı, çözünür proteinler ve müsinlerden oluşur ve sadece gözü yağlamak ve korumak için değil, aynı zamanda kuru göz hastalığı (DED) gibi göz yüzeyi hastalıkları için değerli bir tanı aracıdır. Androjenler ve östrojenler dahil olmak üzere cinsiyet hormonlarının gözyaşı film bileşimini etkilediği bilinir, ancak bu hormonların gözyaşı sıvısında ölçümü düşük örnek hacmi ve teknik zorluklarla sınırlıdır. Bu protokol, mikrokapiller tüpler kullanılarak toplanan bazal yırtıklarda 17β-estradiol ve testosteronu tespit etmek ve nicelemek için ticari olarak mevcut enzim bağlantılı immünosorbent test (ELISA) kitlerinin adım adım uyarlanmasını açıklar. İş akışı, düşük hacimli yırtık örneklerinin analizini mümkün kılmak için optimize edilmiş örnek toplama, seyreltme ve analiz hazırlama stratejilerini içerir. Protokol, uyarlanmış ELISA yöntemleriyle gözyaşı sıvısında hormon algısının uygulanabilirliğini ve tekrarlanabilirliğini göstermektedir. Temsil eden sonuçlar, havuzlanmış pilot örneklerden elde edilir ve biyolojik farklılıklar yerine analiz performansını göstermek amacıyla tasarlanmıştır. Bu yaklaşım, göz yüzeyi araştırmalarında hormon ölçümü için bir matris olarak gözyaşı sıvısını inceleyen gelecekteki çalışmaları destekleyebilir.

Giriş

Gözyaşı filmi, göz yüzeyini korumak, beslemek ve yağlamada hayati roller^{oynar 1}. Yaklaşık 2–5,5 μm kalınlığında ve hacmi 3–10 μL olup, sağlıklı bir gözde dakikada 1–2 μL dönüş^{hızı 2,3}. Göz yaşları bezleri, gözyaşlarının su, elektrolitler, proteinler ve antimikrobiyal faktörler açısından zengin olan sulu bileşenini salgılar; meibomian bezleri ise gözyaşı filminin buharlaşmasını yavaşlatan lipidler üretir ve konjunktival kadeh hücreleri göz yüzeyinin yağlanmasını destekleyen müsinler^{salgılar 4}. Gözyaşı üretimi iki ana şekilde gerçekleşir: 1) sağlıklı bir göz yüzeyinde stabil bir gözyaşı filmi sağlayan bazal salgılanma ve 2) tahriş, duygu veya parlak ışıklar gibi uyaranlarla tetiklenen refleks salgılama. Biyokimyasal bileşim, ikisi arasında farklılık gösterir ve bu da nihayetinde analiz için gözyaşı toplama yöntemini^{etkileyebilir 5,6}. Bazal yırtıklar genellikle gözyaşı filmi stabilitesini ve kornea sağlığını destekleyen protein ve lipid konsantrasyonları içerirken, refleks yırtıklar genellikle daha yüksek sulu hacme sahiptir ve tahriş edicileri temizlemek ve göz yüzeyini^{korumak için daha seyreltilir 7,8,9}.

Gözyaşları, iltihabı modüle etmek, patojenlere karşı savunma ve avasküler^{korneaya besin sağlamak için işlev gördüğü için,} biyobelirteç araştırmaları için odak^{noktası haline gelmiştir 10}. Gözyaşıkları, özellikle hastalık^bölgesine yakın fizyolojik değişiklikleri izlemek için kan örneklemesine kıyasla minimal invaziv ve nispeten maliyet etkin bir alternatif sunar. Bu verileri doğru şekilde yakalamak için doğru bir toplama^{şarttır 10}. Cam mikrokapiller tüpler, bazal yırtıkların örneklenmesinde yaygın olarak kullanılır çünkü minimum tahriş ve gözyaşı seyreltmesiyle toplanma^{sağlar 5}. Bu yöntem, tüpü bulbar konjonktiva ve kapak kenarıyla temas etmemek için dikkatlice konumlandırarak, yırtık^{bileşimini değiştirebilen refleks yırtılmasını uyarma riskini en aza indirir.} Bu yaklaşımla, araştırmacılar göz yüzeyinin fizyolojik durumunu yansıtan seyreltilmemiş bazal yırtıklar elde edebilirler. Bu da numunenin cinsiyet hormonları gibi hassas analitlerin niceliklendirilmesi için güvenilir bir ortam^{olarak kalmasını sağlar 10,12}. Ancak, elde edilen sınırlı hacim, sonraki biyokimyasal testler için analitik zorluklar yaratmaktadır. Mikrokapiler tüplerle bazal yırtılma toplama genellikle örnek başına birkaç mikrolitre verir, bu da standart testlerle uyumluluğu sınırlar.

İnsan göz yüzeyi, cinsiyet hormonları için hedef doku olarak giderek daha fazla^{tanınmaktadır 13,14}. Bunu destekleyen kanıtlar arasında, androjen reseptörleri (AR), östrojen reseptörleri (ER) ve progesteron reseptörleri (PR) için mRNA transkriptlerinin gözlük ve meibomian bezlerin asinar hücrelerinde, ayrıca kornea, konjonktiva ve konjonktival kadeh hücrelerinin epitel hücrelerinde^{tespit edilmesi yer almaktadır 15}. Ayrıca, bu dokularda steroidojenik enzimleri kodlayan mRNA'lar tespit edilmiştir; bu da steroid öncüllerinin yerel olarak biyolojik olarak aktif cinsiyet hormonlarına dönüştürme kapasitesini^{göstermektedir 16}. Bu, göz yüzeyinde yerinde hormon sentezi potansiyelini gösterir ve bu hormonların gözyaşı filmine algılanabilir seviyelerde salgılanıp salgılanmadığı konusunda kritik bir soruyu gündeme getirir.

Mevcut kanıtlar, cinsiyet hormonlarının göz yüzeyi homeostazını korumada hayati öneme sahip olduğunu göstermektedir, ancak kesin moleküler mekanizmalar hâlâ^{araştırılmaktadır 13,14}. Testosteron gibi androjenler, lipid salgısını uyarır ve iltihabı bastırır; Sonuç olarak, androjen eksikliği buharlaşan kuru göz faktörü olarak yaygın olarak^{kabul edilir 13,14,17}. Buna karşılık, östrojenlerin rolü daha nüanslı ve bağlama bağlıdır 13,14,18. Gözyaşı bileşimi ve hacminin modülasyonunda rol oynarken, menopoz, hamilelik veya oral kontraseptif kullanımı gibi östrojen dalgalanmaları sıklıkla sulu salgının zayıflığı, gözyaşı filmi stabilitesinin azalması ve göz yüzeyi iltihabı ile^{ilişkilidir 19,20}. Sonuç olarak, bu hormonal dengesizlikleri yaşayan bireyler, kuru göz hastalığı (DED) geliştirme riski yüksek bir nüfusu temsil eder13,14,20.

Bu kanıta rağmen, DED hastalarında hormonal durumları izlemek hâlâ bir zorluk olarak devam etmektedir. Özellikle, sistemik serum hormon seviyelerinin gözdeki yerel hormon seviyelerini doğru şekilde yansıtıp yansıtmadığı henüz^{belirlenmemiştir 21}. Bu ayrım kritiktir çünkü göz yüzeyi dokularının cinsiyet hormonu reseptörlerine ve cinsiyet steroidlerinin lokal sentezini ve metabolizmasını destekleyen steroidojenik enzim ekspresyonuna sahip olduğu^{gösterilmiştir 16}. Bu intrakrin kapasite, gözyaşı filmindeki yerel hormon konsantrasyonlarının, dolaşımdaki serum^{seviyelerinden önemli ölçüde farklı olabileceğini göstermektedir.} Bu nedenle, göz yüzeyindeki yerel hormonal etkileri daha iyi anlamak için gözyaşı sıvısındaki hormon konsantrasyonunun doğrudan ölçülmesi gereklidir. Ancak, analiz için mevcut küçük gözyaşı örnekleri nedeniyle bu tür önlemler teknik olarak zordur. Sıvı kromatografi-kütle spektrometrisi (LC-MS) gibi gelişmiş analitik teknikler, kan ve gözyaşı sıvılarındaki hormonları yüksek hassasiyetle niceliklendirmek için kullanılmıştır, ancak bu yöntem, tüm araştırmacılar tarafından kolayca erişilemeyebilecek özel enstrümantasyon ve teknik uzmanlık gerektirir^21,22.

Enzimle bağlantılı immünosorbent testi (ELISA), proteinlerin, antikorların ve hormonların tespit edilmesi ve nicelendirilmesi için yaygın bir tekniktir. Cinsiyet steroidleri gibi küçük moleküllerin analizi için bu protokol rekabetçi bir bağlanma formatı kullanır. Bu yöntemde, gözyaşı örneğinde bulunan etiketlenmemiş hormon, sınırlı sayıda antikor bağlanma noktası için enzim etiketli bir hormon analoğuyla rekabet eder. Bu rekabet nedeniyle, optik yoğunluk olarak ölçülen sinyal yoğunluğu, örnekteki hormon konsantrasyonuyla ters orantılıdır; Etkili olarak, daha düşük bir sinyal hedef hormon ^23,24'ün daha yüksek konsantrasyonunu gösterir.

ELISA, hedefli nicelik için birkaç pratik avantaj sunar. Maliyet etkin ve teknik olarak erişilebilir olup, standart laboratuvar ortamlarında özel enstrümantasyon gerektirmeden uygulanabilmektedir. Ayrıca, ELISA minimum örnek hazırlığıyla 96 kuyu plaka formatlarında yüksek verimli tarama sağlar; hem zaman verimliliği hem de yüksek^{tekrarlanabilirlik sağlar 23}. Ancak, ticari olarak mevcut ELISA kitleri genellikle serum veya plazma gibi daha yüksek hacimli biyolojik örnekler için optimize edilir ve düşük hacimli gözyaşı örneklerindeki performansları iyi tanımlanmamıştır. Bu sınırlamayı gidermek için protokol, testin hassasiyet aralığında hormon algısını mümkün kılmak için optimize edilmiş örnek seyreltme ve işleme stratejileri içerir.

Bu çalışmada, cam mikrokapiller tüpler kullanılarak toplanan düşük hacimli insan gözyaşı örneğinde 17β-estradiol ve testosteronun tespiti ve nicelendirilmesi için ticari olarak mevcut ELISA kitlerini uyarlayan görselleştirilmiş bir protokol sunuyoruz. Bu protokol, sınırlı gözyaşı hacimlerinden tekrarlanabilir hormon ölçümü mümkün kılmak için örnek toplama, işleme ve analiz hazırlamada pratik değişiklikleri vurgular. Bu çalışma, mevcut ELISA metodolojisinin gözyaş sıvısı analizine uygulanması için uygulanabilir bir iş akışı oluşturmaya odaklanmaktadır. Bu yaklaşım, göz yüzeyinde yerel hormon seviyelerini inceleyen gelecekteki çalışmalar için bir temel oluşturabilir.

Protokol

Bu çalışma Indiana Üniversitesi Kurumsal İnceleme Kurulu (IRB#1908362633) tarafından onaylanmış ve örnek toplamadan önce tüm katılımcılardan yazılı bilgilendirilmiş onay alınmıştır.

1. Gözyaşı Film Koleksiyonu

1. Hazırlık
   1. ELISA sonuçlarının istatistiksel güvenilirliği için 2 kopya gerektiğini aklınızda bulundurarak toplanacak yırtık hacmini belirleyin.
   2. Gözyaşı film depolaması için 1.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpü hazırlayın.
   3. Gözyaşlarını toplamak için uygun mikrokapiller tüpler seçin. 3.33 μL veya 5 μL ile başlamanı ve göz yüzeyindeki daha düşük bir yırtık hacminden toplanırsa daha küçük boyuta geçmenizi öneririm.
   4. Mikrokapiller tüp kiti ile birlikte verilen bir kauçuk sıkma ampulünü hazırlayın; böylece gözyaşı sıvısının mikrosantrifüj tüpüne aktarılmasını kolaylaştırın.
2. Gözyaşı Koleksiyonu
   1. Katılımcıya doğrudan ileriye ya da biraz yukarıya bakmasını söyle.
   2. Mikrokapiler tüp açıklığını, yan kantusun yanındaki yırtık menisküsün içine nazikçe yerleştirerek bazal yırtıkları toplayın.
   3. Refleks yırtılmasını mümkün olduğunca önlemek için bulbar konjonktiva ve kapak kenarıyla teması en aza indirin.
   4. Tüpü yaşlarla doldurun, dolaya kadar kullanın.
   5. Birden fazla toplama seansı gerekirse, hormon seviyelerindeki değişkenliği en aza indirmek için seansları gün içinde ve gün içinde benzer saatlerde planlayın.
3. Gözyaşı Depolama
   1. Kauçuk sıkıştırma ampulünün üstündeki deliği kapatın, ardından mikrokapiller tüpü ampulün içine yerleştirin ve açık ucu mikrosantrifüj tüpünün içine yerleştirerek yırtıkların mikrokapiler tüpten dışarı akmasını sağlarsınız. Mikrokapiler tüpten mümkün olduğunca çok gözyaşı örneğini çıkarmak için ampulün ek sıkıştırılması gerekebilir.
   2. Buharlaşmayı önlemek için mikrosantrifüj tüpünün kapağını kapatın.
   3. Tüpü 2.000 × g ağırlığında bir tezgah üstü mikrosantrifüj cihazıyla 3–5 saniye boyunca döndürerek numunenin depolamadan önce tüpün dibinde kalmasını sağlar.
   4. Analiz öncesi analiz kararlılığını korumak için -80 °C'de saklanın.

2. Testosteron Testi

1. Testosteron Standartlarını Hazırlayın, Protokole Uyun
   1. Kit protokolünü takip edin, testosteron standartları, kontrolleri ve örnekleri hazırlamak için reaktif ve ekipmanların hazır olduğundan emin olun.
   2. Testosteron standardını deiyonize veya damıtılmış su ile yeniden yapılandırarak 100 ng/mL stok çözeltisi elde edin. Tam yeniden yapılandırılmasını sağlayın ve en az 15 dakika bekletin.
   3. Deneme gününde testosteron standardı hazırlayın.
   4. Standart için 6 mikrosantrifüj tüpü hazırlanır; 10 ng/mL tüplere 900 μL kalibrator sulandırıcı ve kalan tüplere 400 μL sıvılaştırılır.
   5. 100 μL stok çözeltiyi ilk tüpe (10 ng/mL tüp) pipetleyin, iyice karıştırın ve bir sonraki transfer için pipet ucunu değiştirin.
   6. İlk tüpten 200 μL pipetini (10 ng/mL tüp) sonraki tüpe (3.33 ng/mL) ekleyin, iyice karıştırın, bir sonraki transfer için pipet ucunu değiştirin ve bu adımı son tüpe (0,041 ng/mL) kadar tekrarlayın.
   7. Not: Tüm adımları tamamladıktan sonra 7 standart yoğunlaşması olmalıdır. Kalibratör sulandırıcı sıfır standart olarak (0 ng/mL) hizmet eder. Her hazırlanmış standart iki tekrarlama için fazlasıyla yeterlidir.
2. Testosteron kontrollerini hazırlayın: Düşük, Orta ve Yüksek Konsantrasyon
   1. Her şişeni, kontrol kitinin analiz sertifikasında (COA) belirtilen deiyonize veya damıtılmış su hacmiyle yeniden yapılandırın
   2. Her kontrolü kalibratör sulandırıcıda 2 kat seyreldin ve testte kullanılmadan önce
3. Örnekleri hazırla
   1. Gözyaşı örneklerini -80 °C'den alıp buz üzerine yerleştirip çözülmesini sağlayın.
   2. Örnekler tamamen çözüldükten sonra, tüm örneklerin tüplerin dibinde oda sıcaklığında 3–5 saniye boyunca olduğundan emin olmak için gözyaşı örneklerini kısa bir süreliğine santrifüjle yapın.
   3. 20 μL örnek ile 80 μL kalibratör sulandırıcı karıştırın; böylece her çoğaltma başına toplam 100 μL hacmi elde edilir.
   4. Deney için güvenilirlik için iki replika ve arka plan kontrolü için spesifik olmayan bağlanma (NSB) kuyuları planlayın.
   5. Not: Her örnek çift kuyularda analiz edilir. Bu nedenle, her katılımcı için 40 μL yırtık örneği gereklidir; 160 μL kalibratör sulandırıcı ile karıştırılır ve toplam hacim 200 μL elde edilir.
4. Analiz Prosedürü
   1. Tüm reaktifleri, çalışma standartlarını, gözyaşı örneklerini ve kontrolleri hazırlayın.
   2. Mikroplaka çerçevesinden fazla kuyular çıkarılıp 4 °C sıcaklıkta kurutucu pakete geri getirin.
   3. NSB kuyuları için belirlenen kuyular hariç her kuyuya 50 μL Birincil Antikor Çözeltisi (mavi renkli) ekleyin. Plakayı alüminyum folyo ile kaplayın.
   4. Plakayı oda sıcaklığında, yatay yörüngesel mikroplaka sallayıcısında (0.12" yörünge) 500 ± 50 rpm'de veya en yakın mevcut ayarda kümübe edin.
   5. Toplamda 8 yıkama için yeterli yıkama tamponu hazırlayın, 400 μL/kuyu/yıkama (3 saatlik kuluçka aşamasından önce 4 yıkama ve 4 yıkama).
   6. Her kuyunun içindekileri aspire edin ve plakayı yıkama tamponuyla 4 kez yıkayın.
   7. NSB kuyularına 100 μL kalibratör sulaştırıcı ekleyin ve sıfır standart kuyular eklensin.
   8. Belirlenen kuyruklara 100 μL standart, kontrol ve hazırlanmış gözyaşı örnekleri eklenin.
   9. Her kuyuya 50 μL testosteron Konjugat ekleyin ve pipetle iyice karıştırın.
   10. Oda sıcaklığında, yatay yörüngesel mikroplaka sallayıcısında (0.12" yörünge) 500 ± 50 rpm veya en yakın ayarda 3 saat kuluçka için.
   11. Her kiyi aspirasyon yapın ve yıkama tamponu ile 4 kez yıkayın.
   12. Alt tabaka çözeltisini, Color Reagent A ile Color Reagent B'yi 1:1 oranında karıştırarak hemen önce hazırlayın. Her kuyu başına 200 μL tahsis edin. Substrat eklemeden önce kalıntı yıkama tamponunun tam aspirasyonu.
   13. Hazırlıktan sonra 15 dakika içinde her kuyuya 200 μL Substrat Çözeltisi ekleyin. Oda sıcaklığında tezgah üzerinde 30 dakika kuluçka yapın. Tışığa karşı alüminyum folyo ile kaplayın.
   14. Her kuyuya, Substrat Çözeltisi sırasıyla aynı sırayla 50 μL Stop Solution ekleyin. Her birini iyice karıştırın, renk maviden sarıya değişmelidir.
   15. Stop Solution'u ekledikten sonra mikroplaka okuyucu ile 30 dakika içinde 450 nm ve 560 nm optik yoğunluğu ölçün.
   16. Not: Üretici talimatları referans dalga boyunun 540 nm veya 570 nm olmasını önermektedir. Bu protokolde, mikroplaka okuyucuda arka plan sinyali düzeltmesi ve optik kusurlar için en yakın seçenek olarak 560 nm dalga boyu kullanıldı.
5. Hesaplama
   1. 560 nm (referans dalga boyu) ölçülü optik yoğunluğu, 450 nm ölçülen optik yoğunluktan çıkarın.
   2. Standartların, örneklerin ve kontrollerin her bir bireysel okumasından ortalama NSB optik yoğunluğunu çıkarın, ardından tekrarlanan ölçümlerin ortalamasını hesaplayın.
   3. Dört parametreli lojistik (4PL) modeliyle veriyi uyarlayarak standart bir eğri oluşturun.
   4. Standart eğriden numune değerlerini interpolasyon ederek testosteron konsantrasyonlarını belirleyin.
   5. Hesaplanan konsantrasyonları, 1:5 numune seyreltmesini hesaba katmak için 5 seyreltme faktörü uygulayarak ayarlayın.
   6. Tekrarlar arasındaki varyasyon katsayısı (CV) hesaplanarak ölçümü doğrulayın, %20'yi aşmamalıdır.
      1. Not: %CV = (SD/ortalama) × 100

3. Estradiol Testi

1. Estradiol Standartları, Kontrolleri ve Örnekleri Hazırlayın
   1. Kit protokolünü takip edin, standartlar, kontroller ve örnekler hazırlamak için reaktiflerin ve ekipmanların hazır olduğundan emin olun.
   2. Kullanımdan önce tüm reaktiflerin ve malzemelerin oda sıcaklığına ulaşmasına izin verin.
   3. Deney günü taze reaktif hazırlayın.
   4. Standartlar ve kontrol kullanıma hazırdır. Aliquot yalnızca mevcut test için gereken miktarı, kirliliği en aza indirmek ve işlem sırasında tekrar eden sıcaklık değişimlerini sınırlamak için.
   5. Altı standart (No. 0–5) hazırlandığından emin olun; Standart 0 0 pg/mL temsil eder ve kit ile birlikte verilen bir kontrol örneği de dahil edilir.
   6. Donmuş örnekleri -80 °C'den buzun üzerine koyarak eritin.
   7. Tüm örneklerin tüpün dibinde olduğundan emin olmak için gözyaşı örneklerini aşağı döndürün.
2. Analiz Prosedürü
   1. Mikroplakadan fazla kuyular çıkarılıp 4 °C sıcaklıkta kurutucu pakete geri alın.
   2. Kuyular içine 20 μL standard, kontrol ve numune ekleyin.
   3. Not: Her standart ve örnek 2 kopya ile analiz edilmelidir.
   4. Homojen bir dağıtım sağlamak için, tüm standartları, kontrolleri ve örnekleri pipetlemeden hemen önce dikkatlice karıştırın.
   5. Test kuyularına 160 μL 17 beta Estradiol-HRP Konjugatı ekleyin.
   6. Substrat için boş bir kuyu bırakın.
   7. Kuyuyu, kuluçka makinesine koymadan önce alüminyum folyo ile kaplayın. Kuyudaki çözelti buharlaşarak alüminyum folyoya dönüşebilir.
   8. 37 °C'de 2 saat kuluçka yapın.
   9. Kuluçka sırasında 10X yıkama çözeltisinden Wash Buffer hazırlayın.
   10. İnkubasyon tamamlandığında, alüminyum folyoyu çıkarın ve sıvıyı kuyulardan aspire edin.
   11. Her kuyuyu Wash Buffer ile 3 kez yıkayın. Her yıkama döngüsünde > 5 saniye beklet.
   12. Tüm kuyulara 100 μL TMB Substrat Çözeltisi ekleyin.
   13. Tüm plakayı alüminyum folyo ile kaplayın ve oda sıcaklığında tam 30 dakika kuluçka yapın.
   14. Tüm kuyulara önceki eklenen TMB Substrat Çözeltisi ile aynı sırayla ve aynı hızda 100 μL Stop Solution ekleyin.
   15. Mikroplakayı hafifçe sallayın ve reaktif maviden sarıya değişiyor.
   16. Stop Solution eklendikten sonra 30 dakika içinde 450 nm'de absorbansı ölçün.
3. Hesaplama
   1. Arka plan sinyali ve optik kusurları düzeltmek için tüm standartların, örneklerin ve kontrollerin okumalarından boş kuyunun emilimini çıkarın.
   2. Tekrarlanan ölçümlerin ortalamasını hesaplayın.
   3. Dört parametreli lojistik (4PL) kullanarak en iyi uyum standart eğrisi oluşturun.
   4. Standart eğriden örnek değerlerini interpolasyon yoluyla estradiol konsantrasyonu belirleyin..
   5. Tekrarlar arasındaki varyasyon katsayısı (CV) hesaplanarak ölçümü doğrulayın, %20'yi aşmamalıdır.
      1. Not: %CV = (SD/ortalama) × 100.

4. R ve RStudio kullanarak veri analizi

1. R ve RStudio'yu kurun ve veri analizi yapmadan önce Materyaller Tablosu'nda listelenen gerekli paketleri kurun.
2. Standartlar, kontroller ve örnekler için optik yoğunluk ölçümlerini analiz yazılımına aktarın.
3. Testi belirttiği şekilde dalga boyu düzeltmesi uygulanarak veri ön işlenir. Sonra boş veya NSB değerleri çıkarılır ve tekrarlanan ölçümlerin ortalamasını hesaplar.
4. Konsantrasyonu bağımsız değişken olarak ve optik yoğunluğu yanıt değişkeni olarak kullanarak, dört parametreli lojistik (4PL) regresyon modeli kullanılarak standart bir eğri uyumu yapın.
5. DRC paketinden drm() fonksiyonunu kullanarak R'de eğri uyumu gerçekleştirin; model 4PL regresyonu için fct = LL.4() olarak belirtilmiş, konsantrasyon ve optik yoğunluk verileri girdi olarak alınmıştır.
6. Örnek konsantrasyonlarını yorumlamadan önce eğri uyumunun kalitesini (örneğin, R² > 0.99 veya kabul edilebilir uyum kalitesi) doğrulayın.
7. Hormon konsantrasyonlarını, uyarlanan standart eğriye dayalı ED() fonksiyonu kullanılarak ters tahmin ile hesaplayın; uyumlu modele göre örnek optik yoğunluk değerlerine karşılık gelen etkili dozu belirtin.
8. Hesaplanan konsantrasyonları uygun seyreltme faktörü uygulanarak ayarlayın (örneğin, 1:5 seyreltme için ×5).
9. Nihai hormon konsantrasyonlarını uygun birimlerde (örneğin, ng/mL veya pg/mL) raporlayın, standart eğriyle tutarlılığı sağlamak ve işlenen verileri daha fazla analiz veya görselleştirme için dışa aktarmak.

Sonuçlar

Pilot Gözyaşı Film Çalışması

Bu çalışmaya toplam 20 kadın (45–63 yaş arası) dahil edildi. DED sınıflandırması, semptomlara ve en az bir klinik DED belirtisine dayanıyordu. Özellikle, tüm DED katılımcılarının Göz Yüzeyi Hastalık Endeksi (OSDI) puanı > 12 ve en az bir göz, floressein gözyaşı ayrımlama süresi (TBUT) < 5 saniye veya korneal floressein boyama skoru (CFSS) > 3 (NEI^{Ölçeği 25}) idi. DED olmayan katılımcıların OS...

Tartışma

Gözyaşı toplama ve analizi, göz yüzeyi sağlığının bilimsel olarak değerlendirilmesi ve potansiyel biyobelirteçlerin tanımlanması için kolay erişim sağlar^10,22. Protokolümüz, gözyaşı filmi örneklerini cinsiyet hormonları için analiz etmek için yaygın kullanılan ELISA yöntemlerinin başarılı adaptasyonunu tanımlar. Bu yöntemi, gözyaşı analizinin birincil sınırlaması olan nispeten az sayıda gözyaşı hacmini ele almak için geliştirdik....

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
17 beta Estradiol ELISA Kit	Abcam	ab108667
Aluminium foil	Reynolds Wrap	10900000154	Mutfak için herhangi bir mevcut alüminyum folyo, reaktifleri ışıktan korumak için
Microcapillary tube 3.33 µL	Drummond	1-000-0033	Sıvı transferi için bir sıkma baloncuğu içerir
Microcapillary tube 5 µL	Drummond	1-000-0050	Sıvı transferi için bir sıkma baloncuğu içerir
Microcentrifuge device	Benchmark Scientific	C1012
Microcentrifuge tube 1.5 mL	Fisher	05-408-129
Microplate reader	Promega	GM3000
Orbital microplate shaker	Labnet International Inc.	S2030-1000-B
R computer language	Posit Software, PBC (formerly RStudio Inc.)	R version 4.5.1	Rstudio öncesinde R dilini indirin https://cran.r-project.org/
RStudio Software	Posit Software, PBC (formerly RStudio Inc.)	RStudio 2023.06.1 Build 524 "Mountain Hydrangea"	https://posit.co/downloads/
R packages "drc", "ggplot2", "patchwork", "ggpp", "dplyr", "readr", "tidyr", "writexl"	Posit Software, PBC (formerly RStudio Inc.)		Paketi Rstudio'da yükleyin
Testosterone Control kit	R&D Parameter	QC165	ELISA kitinden (KGE010) ayrı satılır
Testosterone ELISA kit	R&D Parameter	KGE010