Hemefir Taşıma Yollarının Eşzamanlı Lenfatik ve Kan Damarları Örneklemesi Yoluyla Değerlendirilmesi İçin Kapsamlı Fare Modeli

Özet

Bu deneysel protokol, karaciğer lenfatik ve damar drenajının doğrudan ve nicel olarak değerlendirilmesini sağlayan karaciğer lenf kanalı kanülasyonlu bir fare modelini tanımlar. Model, karaciğer taşıması, metabolizması ve bağışıklık sinyalini incelemek için karaciğer lenf ve sistemik kanın eşzamanlı örneklenmesine olanak tanır ve ilaç farmakokinetiği ile karaciğer-spesifik biyolojinin çalışmalarını destekler.

Özet

Karaciğer, besinleri, ksenobiyotikleri ve dolaşımdaki bağışıklık aracılarını işleyen merkezi bir metabolik ve immünolojik merkezdir. Maddeler, bağırsaktan portal ven üzerinden ve sistemik dolaşımdan karaciğer arter yoluyla kanı alan sinüzoidal kapillyarlar aracılığıyla hepatositlere ve diğer hepatik hücrelere ulaşır. Sinüzoidal kapillyarlardan plazma süzülmesi, Disse alanına akar; burada metabolik dönüşüm geçirebilir, bağışıklık gözetimine katılabilir veya lenfatik damarlara akarak hepatik lenf oluşturabilir. Karaciğer lenf ve kan örneklemeleri, karaciğer taşını, metabolik süreçler ve bağışıklık aktivitesinin ayrıntılı analizini mümkün kılabilir. Karaciğer lenf çıkışı ve sistemik kanın üç farklı kanülasyon noktasından eşzamanlı örnek alınmasına olanak tanıyan cerrahi bir fare modeli tanımlanır: hepatik lenf kanalı, karotis arter ve juguler vein. Hepatik lenf ve arterial kanülasyonlar sürekli örnekleme sağlarken, jugulyar ven kanülü sürekli hidrasyon ve sıvı desteği veya venöz kan toplama için kullanılabilir, böylece arterial ve venöz kan karşılaştırması mümkün olur. Başarılı kanülasyon, anestezi altındaki sıçanlarda yaklaşık 0,1 mL/h karaciğer lenf akış hızları sağlar; bu da aynı anda arterial ve venöz kan örneklemesi yapılırken 8 saate kadar sürekli lenf örneklemesi yapılmasını sağlar. Bu düzen, sistemik arterial kan ile hepatik lenfatik çıkış arasında doğrudan karşılaştırma imkanı sunar ve karaciğer taşınımı ve temizlenmesinin yanı sıra metabolik ve bağışıklık sinyal süreçlerinin kapsamlı incelenmesini sağlar. Modeli daha da genişletmek için, işlemin sonunda hepatik ater ve portal venin terminal örneği alınabilir ve böylece hepatik giriş, çıkış ve lenfatik drenajın doğrudan karşılaştırılması mümkün olur. Sonuç olarak, bu teknikler çeşitli patofizyolojik koşullar altında ilaç farmakokinetikleri, besin akışı ve metabolizması ile karaciğere özgü yanıtlar dahil olmak üzere karaciğer süreçlerini değerlendirmek için çok yönlü bir platform sağlar.

Giriş

Karaciğer, besin işleme, ksenobiyotik detoksifikasyon ve bağışıklık gözetiminden sorumlu merkezi bir metabolik ve immünolojik organdır. Karaciğer, vücuttaki en büyük lenf üreten organdır. Büyük memelilerde yapılan çalışmalar, toplam lenf akışının %25–%^{50'sini oluşturduğunu göstermektedir 1,2}. Kemirgenlerde yapılan kanülasyon çalışmaları, toplam torasik lenf akışının yaklaşık %10–%20'sinin^{karaciğerden kaynaklandığını göstermektedir 3,4}. Hepatik lenf, karaciğer parenximası içindeki sinüzoidal kapillyarların fenestral endoteli üzerinden filtrelenen plazmadan kaynaklanır. Bu filtrat, hepatositler ile sinüzoidal endotel hücreleri arasındaki bir ara bölme olan Disse alanında toplanır. Filtrat daha sonra Mall alanından portal lenfatik kapillyarlara girer; bu damarlar birleşerek hepatik hilum ve sarnıç^{chyli 5,6'ya} doğru drenaj yapar.

Karaciğer lenfatik sistemi anatomik olarak portal, subkapsüller ve sublobular^{ağlara bölünür 6,7}. Son zamanlarda yapılan hacimsel görüntüleme çalışmaları, hepatik lenfatiklerin büyük ölçüde portal traktlarla sınırlı olan yüksek bir Vasküler Endotel Büyüme Faktörü C (VEGF-C)-bağımlı bir ağ oluşturduğunu göstermektedir. Bu ağ ağırlıklı olarak portal ven yönüne doğru retrograd olarak akan lenfatik kapillyarlardan oluşur. Öte yandan, hepatik yüzey boyunca ve merkezi venöz bölgelerde dağılmış subkapsular ve sublobular lenfatikler ek drenaj yollarıdır. İnsan ölüm sonrası görüntülemesi, karaciğer damarları boyunca yoğun bir lenfatik damar ağı ortaya koymuştur; bu da periportal ve hepatik venöz lenflerin birlikte karaciğer lenf^{çıkışını düzenlediğini göstermektedir 8}.

Hepatik lenf, hem metabolik hem de bağışıklık süreçlerini yansıtan plazma kaynaklı bir^{ultrafiltratı temsil eder 9,10}. Biyokimyasal analizler, karaciğer lenfinin albümin, lipoproteinler, sitokinler ve karaciğer parenximal^{aktivitesinden türetilen metabolitler içerdiğini göstermektedir 3,4,6}; bu, diğer dokularda bildirilen lenfatik sıvının genel proteomik profiliyle^{uyumludur 10}. Erken çalışmalar, karaciğer lenfin farklı lipoprotein sınıflarına sahip olduğunu göstermiştir; yüksek yoğunluklu lipoproteinler (HDL) baskın bir fraksiyonu temsil eder ve karaciğerin HDL sentezi ve yeniden şekillendirmedeki merkezi^{rolüyle uyumludur 11}. Özellikle, daha yeni çalışmalar karaciğer lenfinin mezenterik lenfa kıyasla HDL ve kolesterol esterleri açısından zenginleştiğini göstermiş ve bu da lipid taşımına ve ters kolesterol taşınımına belirgin^{katkısını vurgulamaktadır.} Ayrıca, hepatik lenf immünolojik bir kanal olarak görev yapar; bağışıklık aracıları, antijen sunan hücreler ve karaciğer mikro ortamlarını sistemik bağışıklık ile bağlayan ekstraselüler^{vezikülleri taşır.}

Karaciğer lenf oluşumu ve drenajındaki değişiklikler, karaciğer hastalığının temel özellikleridir. Sirroz ve portal hipertansiyonda, yüksek sinüzoidal basınç lenf üretiminde birkaç kat artışa yol açar ve drenaj kapasitesi aşıldığında limfanjiektazi, fibroz ve asitlere yol açar. Kronik karaciğer hasarı ayrıca VEGF-C/VEGFR-3 bağımlı limfanjiyogenezi teşvik eder; aşırı veya anormal lenfatik remodelasyon karaciğer iltihabı, ödem ve lipid birikimine katkıda^{bulunur 9,12}. Ayrıca, metabolik işlev bozukluğu ile ilişkili steatotik karaciğer hastalığı (MASLD) ve hepatosellüler karsinomda, artan karaciğer lenfatik yoğunluğunun hastalık ilerlemesi ve metastaz ile ilişkili olduğu^{gösterilmiştir 13,14}.

Hepatik lenfin merkezi fizyolojik ve klinik rolüne rağmen, özellikle saf hepatik lenfin izole edilmesindeki teknik zorluklar nedeniyle, deneysel araştırmalarda yeterince incelenmemiş ve keşfedilmemiştir. Toraks ve mezenterik lenf toplama modelleri daha geniş şekilde tanımlanmıştır, ancak bunlar karaciğer taşıma mekanizmaları hakkında yalnızca dolaylı bir bakış sunar. Alandaki bir sınırlama, doğrudan hepatik^{lenf 4'ün} toplanmasını mümkün kılan bir fare karaciğer lenf kanülasyonu modeli geliştirilerek ele alındı. Bu yaklaşımla, intravenöz verilen terapötik proteinlerin lenfatik alımının çoğunun karaciğer ve mezenteride gerçekleştiği gösterilmiştir. Bu bulgular, karaciğer lenfini kan ve lenfatik sistemler arasında makromoleküler değişimin önemli bir yolu olarak ortaya koymakta olup, biyolojik tedavilerin farmakokinetiği ve dağılımı için önemli sonuçlar^{içermektedir 4}.

Kalan boşlukları kapatmak için, bu çalışma karaciğer lenf kanalı, karotis arter ve juguler venin kanülasyonu yoluyla karaciğer lenf ve sistemik kanın eşzamanlı örneklenmesini mümkün kılan kapsamlı bir fare modelini tanımlıyor. Bu yaklaşım, hepatik interstisyel ve sistemik bölümler arasında çözünen taşınımının ve değişiminin gerçek zamanlı olarak değerlendirilmesini sağlar ve fizyolojik ve patolojik koşullarda karaciğer taşını, metabolizma, bağışıklık sinyalleri ve ilaç mevzimini araştırmak için sağlam bir deneysel platform sağlar. Model ayrıca, karaciğer girişi, çıkışı ve lenfatik drenajın doğrudan karşılaştırılmasını mümkün kılmak için hepatik arteri ve portal venin isteğe bağlı terminal örneklemesini de kapsar.

Şekil 1. Eşzamanlı lenfatik ve kan örnekleme için çoklu kanülasyon modelinin şeması. Karotis arter, juguler ven, hepatik arter, hepatik lenf kanalı ve portal venden eşzamanlı örnekleme gösteren kapsamlı bir kanülasyon modeli. (A) Karotis arteri aralıklı kan örneği için kanülüle edilir. (B) Dış juguler damar, hidrasyonu korumak ve örnekleme sırasında sıvı kaybını telafi etmek için sürekli tuzlu infuzyon için kanülasyon yapılır. (C) Karaciğer lenf kanalına paralel uzanan ortak hepatik arter terminal kan örneği için kanülasyon yapılır. (D) Hepatik lenf kanalı sürekli lenf toplama için kanüllenir. (E) Portal ven, terminal kan örneği almak için iğne delmesiyle erişilir. (A), (B) ve (D) maddelerinde gösterilen işlemler, terminal numune almadan önce yapılır, ardından (C) hepatik arter örneklemesi ve ardından (E) portal ven örneklemesi yapılır. Kısaltmalar: EJV, dış juguler ven; CA, karotis arter; SVC, superior vena cava; IVC, alt vena cava; Ao, aorta; CHA, yaygın hepatik arter; HL, karaciğer lenf kanalı; ML, mezenterik lenf kanalı; SMA, superior mezenterik arter; PV, portal damar. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Protokol

Hayvanları içeren tüm deneysel prosedürler, Monash İlaç Bilimleri Enstitüsü Hayvan Etik Komitesi (Etik Kimliği #46283) tarafından incelenip onaylandı ve Avustralya ve Yeni Zelanda Araştırma ve Öğretimde Hayvan Bakıcılığı Konseyi (ANZCCART) yönergeleri ile Avustralya Bilimsel Amaçlarla Hayvanların Bakımı ve Kullanımı Kodu'na (Ulusal Sağlık ve Tıbbi Araştırma Konseyi, Avustralya⁾¹⁵.

Hayvan modelleri: 250–350 g ağırlığında erkek veya dişi dışlanmış albino Rattus norvegicus veya Sprague–Dawley (SD) fareleri kullanıldı. Hayvanlar, lisanslı laboratuvar hayvanı tedarikçilerinden (Monash Hayvan Araştırma Platformu) temin edilip, kontrollü sıcaklık (22 ± 2 °C) ve 12 saat ışık-karanlık döngü altında bireysel havalandırılan kafeslerde, deney öncesinde serbest yiyecek ve suya erişim sağlanıyordu. Stresle ilişkili fizyolojik varyasyonu en aza indirmek için hayvanlar ameliyattan en az bir hafta önce aklimatize edildi.

Karaciğer lenf kanalı, karotis arteri ve juguler ven kanülasyonu modeli tanımlanır; bu model, karaciğer lenf ve sistemik kan aynı anda örneklemeyi sağlar. Karaciğer girişi ve lenfatik çıkışın karşılaştırmalı analizi için anestezi altında karaciğer arteri ve portal venin isteğe bağlı terminal örneği alınabilir. Kullanılan reaktifler ve ekipmanlar Malzeme Tablosu'nda listelenmiştir.

1. Ameliyattan bir gün önce hazırlıklar

1. Belirli deneysel protokol için gerekirse fareyi gece boyunca oruç tutun. Her zaman suya ücretsiz erişim sağlansın.
2. Lenf toplama sırasında damar içi infüzyon için steril salin hazırlayın. Toplama süresine (genellikle 3–5 saat) ve lenf ve kan toplamasından kaynaklanan sıvı kaybının yanı sıra idrar çıkışı gibi fizyolojik kayıpların yerine 1,5–3,0 mL/h önerilen infüzyon hızına göre gerekli hacmi belirleyin.
3. Karaciğer lenf kanalı, karotis arter ve juguler ven kanülasyonu için üç polietilen kanül hazırlamak için aşağıdaki gibi hazırlanır:
   1. Hepatik lenf kanalı
      1. 0,8 mm dış çaplı (O.D.), 0,5 mm iç çaplı (I.D.) bir kanülü 30–35 cm'ye kadar kesin. Uzunluğun gerilim olmadan toplama sağlamasını sağladığından emin olun.
      2. Yerleştirme ucu yaklaşık 45° eğimle steril cerrahi bıçakla eğimlen, böylece yerleştirmeyi kolaylaştırın.
   2. Karotis arteri
      1. 0,8 mm O.D., 0,5 mm I.D. kanülünü 20–30 cm uzunluğunda kesin. İç uçtan yaklaşık 2–2,5 cm aralıda yerleştirme derinliğini işaretleyin.
   3. Juguler ven
      1. 0,8 mm O.D., 0,5 mm I.D. veya 0,96 mm O.D., 0,58 mm I.D. kanülü 50 cm veya daha uzununa kesin. İç uçtan 1–1,5 cm aralıda yerleştirme derinliği işaretlenin. Uzunluğun infuzyon pompasına gerilim olmadan ulaşabildiğinden emin olun.
4. Steril suda %0,1 EDTA veya steril salinte 20 IU/mL heparin içeren bir antikoagülan çözelti hazırlayın.
5. 1 mL bir şırıngayı antikoagülan çözeltisiyle doldurun ve 0,8 mm aşırı doz kanüllerine 25G iğne veya 0,96 mm aşırı doz kanüllerine 23G iğne takın.
6. Her kanülü iç hacminin yaklaşık üç katıyla yuyuyor, böylece hava kabarcığı kalmamasını sağlıyor.
7. Kanülleri antikoagülantla doldurup iğne ile şırıngayla gece boyunca tıkalı tutun. Antikoagülanla önceden ıslatmak pıhtı oluşumunu en aza indirir.
8. Kan ve lenf için toplama tüpleri hazırlayın. Numune topladıktan sonra nihai konsantrasyon elde etmek için 1 mg/mL EDTA veya 10 IU/mL heparin konsantrasyonu elde etmek için antikoagülant çözelti ekleyin.

2. Ameliyattan hemen önce yapılan hazırlıklar

1. Tüm kanülleri antikoagülantla yıkayarak açıklığı doğrulayın. Hava kabarcıkları olmadığından emin olun.
2. Bir indüksiyon odasında oksijende %5 isofluran ile 1 L/dakika oranında sıçanlarda anestezi indüksiyonu yapılsın.
3. Solunumu takip edin ve hızın yaklaşık saniyede 1,5 nefese (yaklaşık 90 nefes/dakika) düşürdüğünden emin olun; bu da yeterli anestezi derinliğini gösterir.
   DIKKAT: İzofluran uçucu bir anestezidir ve mesleki maruziyeti en aza indirmek için uygun havalandırılan anestezi sistemi veya duman davlumbazında kullanılmalıdır.
4. Fareyi ısıtılmış cerrahi pedlere (37°C) aktarın ve burun konisi aracılığıyla 0,4–0,6 L/dakika oranında %1–3 isofluran ile anestezi sürdürün.
5. Kornea ve parmak sıkıştırma reflekslerinin olmaması nedeniyle yeterli anestezik derinliğini doğrulayın. Cerrahi işlem ve lenf toplama süresi boyunca anestezi devam edin.
   NOT: Ameliyat sırasında ağrıyı önlemek ve hareket nedeniyle kanülün yerinden çıkmasını önlemek için sürekli anestezi gereklidir.
6. Sağ karın kadranı (orta çizgiden sağ kanata kadar, kaburga kafesinin yaklaşık 2 cm altında) ve sağ veya sol klaviküler bölge dahil olmak üzere cerrahi bölgeleri tıraş edin.
7. Tüm cerrahi alanları %0,5 klorheksidin ve %70 etanol ile dezenfekte edin.

3. Karotis arterinin kanülasyonu

NOT: Karotis arter kanülasyonu, juguler ven kanülasyonundan önce veya sonra yapılabilir.

1. Aynı sırt pozisyonunu ve servikal kesiyi koruyun.
2. Boynun altına küçük bir destek (örneğin, 3 mL şırınga) yerleştirerek karotis bölgesini yükseltin.
   NOT: Bu adım isteğe bağlıdır.
3. Boyun kaslarını ayırarak deri yüzeyinin yaklaşık 1 cm altında karotis arteri ortaya çıkarın.
4. Arteri kavisli iris forsepsiyle izole edin. Sinirin zarar görmesini önlemek için bitişik vagus sinirini nazikçe ayırın.
5. Kan akışını engellemek için arterin altına düz Graefe pensepsi yerleştirin ve altına iki adet 4-0 ipek dikiş geçirin. Proksimal (kafatası) dikişini sıkıca bağlayın.
6. Arter yüzeyinde küçük bir kesi yapın.
7. Damar lümenini kanül yerleştirmek için damar lümenini stabilize etmek için lens forsepsinin ucuyla nazikçe kaldırın.
8. Kanülü önceden işaretlenmiş 2–2,5 cm derinliğe yerleştirin. Hafif geri dönüş bekleyin; Eğer fazlaysa, devam etmeden önce tekrar kapatıp temizleyin.
   DIKKAT: Damar delme ve kanülasyon keskin aletler gerektirir ve kazara yaralanmayı önlemek için dikkatli yapılmalıdır.
9. Doğru yerleştirmeyi nazikçe küçük bir kan hacmi çekip antikoagülan solüsünü kanülün içine geri enjekte ederek direnç hissetmeden veya deri altı şişme gözlemlemeden doğrulayın.
10. Kanülü dikişlerle sabitleyin ve dış ucu bir tıpla mühürleyin.
11. Ameliyat, karotis arter kanülasyonundan sonra kısa bir süre duraklatılabilir ve anestezi sürdürülebilir.
12. Boyundaki yarayı steril dikişlerle kapatın. Karotis arter izolasyonu ve başarılı kanülasyonun genel bir görünümü Şekil 2'de gösterilmiştir.

Şekil 2: Karotis arter kanülasyonu. (A) Karotis arterinin yanındaki eşleşmiş boyun kasları (turuncu oklar). Tükürük bezi (mavi oklar) kafatası şeklinde saklanmıştır. (B) Açıkta kalan karotis arter cilt yüzeyinin yaklaşık 1 cm altında yer alır. Tükürük bezi (mavi oklar) kafatası şeklinde saklanmıştır. (C) Kanül yerleştirilmeden önce cerrahi düzenleme, düz Graefe pensleri ve iki ipek dikiş ile kan akışının tıkandığını göstermek, arteri izole etmek, üst ucu bağlanmak. (D) Kanülün yaklaşık 2 cm'si karotis arterine başarıyla yerleştirilir (sarı oklar). Karotis arter kanüsü yeşil oklarla belirtilir. (E) Karotis arterinin başarılı kanülasyonu, kanüle kan çekilerek doğrulandı. (F) Üç dikiş (4-0 boyut) karotis arter ve kanülün etrafına bağlanarak sabitlenir (mor oklar). Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

4. Juguler venin kanülasyonu

1. Fareyi sırt yatağı pozisyonunda, boynu uzatılmış ve başı hafifçe sola çevirilmiş şekilde konumlandırın.
2. Köprücük köprücüğün üzerindeki juguler veni konumuna ve görünür kan akışına göre tanımlayın. Köprücük kemiğinden trakeaya doğru 1–1,5 cm eğik bir kesi yapın.
3. Deri altı dokuyu keserek damarı ortaya çıkarın.
4. Damarı çevresindeki bağ dokusundan eğimli iris forsepsiyle ayırın. Damarın altından penseps geçirerek izolasyonu doğrulayın.
5. Açık segmentin her iki ucundaki damarın altına iki adet 4-0 ipek dikiş yerleştirin. Kafatası (üst) dikişi sağlam bir şekilde bağlayarak kan akışını kapatın.
6. Kanın geri akmasını önlemek için, damarın altına düz Graefe forsepsleri yerleştirin ve sapları bir şırınga veya destek üzerine dayasın.
7. Damarın üstünde, izole segment boyunca üçte biri boyunca iris makası ile küçük (~1 mm) bir kesi yapın.
8. Damar lümenini kanül yerleştirmek için damar lümenini stabilize etmek için lens forsepsinin ucuyla nazikçe kaldırın.
9. Kanül ucunu iris pensepsiyle kesiye sokun ve önceden işaretlenen derinliğe (1–1,5 cm) ilerletin.
10. Kanül stabil hale getirildikten sonra kan akışına izin vermek için tıkanıklığı serbest bırakın.
    NOT: Venöz geri akıntıyı önlemek için stabil bir tutuş kalın. Kanama olursa, hemen tekrar kapatın ve devam etmeden önce alanı temizleyin.
11. Doğru yerleştirmeyi nazikçe küçük bir kan hacmi çekip antikoagülan solüsünü kanülün içine geri enjekte ederek direnç hissetmeden veya deri altı şişme gözlemlemeden doğrulayın.
12. Kanülü hem proksimal hem de distal uçlarda dikişlerle sabitleyin.
13. Dış boru geçici olarak kapatın, şırıngayı çıkarın ve kanülü bir tıpla kapatın.
14. Kesiyi sıcak tuzlu suyla nemlendirilmiş gazlı bezle kaplayın, karotis arteri kanülasyonu tamamlanana kadar. Juguler ven izolasyonu ve kanülasyonun temsilci görüntüleri Şekil 3'te gösterilmiştir.

Şekil 3: Juguler ven kanülasyonu. (A) Juguler ven (siyah noktalı kontur) köprücük derisinin hemen altında, köprücük üzerinde yer alır. Yerleşik karotis arter kanülü, juguler venin (yeşil oklar) yakınında gözlemlenebilir. (B) Juguller damar iki ipek dikiş ile izole edilmiştir; üst ucu bağlanır. (C) Kanülün yaklaşık 1 cm'si juguller ven içine başarıyla yerleştirilir (sarı oklar). Juguler ven kanülü mavi oklarla belirtilir; karotis arter kanülü yeşil oklarla gösterilir. (D) Üç dikiş (4-0 boyut) juguler ven ve kanülün etrafına bağlanarak sabitlenir (mor oklar). Yuguler venin başarılı kanülasyonu düzgün tuzlu su enjeksiyonu ile doğrulandı. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

5. Karaciğer lenf kanalının kanülasyonu

1. Fareyi cerrahi mikroskop altında dorsal yatma pozisyonuna yerleştirin.
2. Orta hattan sağ kana, kaburga kafesinin yaklaşık 1,5–2 cm altında 4–5 cm yatay bir deri kesisi yapın (Şekil 4A, B).
3. Deriyi geri çekin ve dış ile iç oblik kaslarda uyumlu kesiler yapın.
4. Karşılaşılan büyük kan damarlarını aşırı kan kaybını önlemek için koterize edin veya bağlayın.
5. Organları tuzlu nemli pamuk çubuklarıyla nazikçe yeniden konumlandırın: karaciğeri diyaframa doğru, mideni sola ve ince bağırsağı alt tarafa hareket ettirin.
6. Organları tuzlu gazlı bezle geri çekin. Kesi yeri ve organ konumu Şekil 4C'de gösterilmiştir.
7. Karaciğer lenf kanalını (çapı ~0,6 mm) yerleşik anatomik işaretler kullanarak tanımlayın. Kanal, karaciğer arterine paralel ve hafifçe kaudal olarak uzanır, sağ böbreğe medial ve alt vena kava bitişiğinde bulunur.
8. Karaciğer lenf kanalının görünümünü gözlemleyin. Genellikle saydam ve dar görünür.
9. Karaciğer lenf kanalını, mezenterik lenf kanalından ayırt edin; mezenterik lenf kanalı daha büyüktür ve genellikle şilomikron içeriği nedeniyle opak veya beyaz görünür. Bu nedenle, mezenterik lenf kanalı, kafatasında bulunan karaciğer lenf kanalının tanımlanmasına yardımcı olmak için anatomik bir işaret görevi görebilir.
10. Lenf kanalı ve vena kava üzerindeki bağlayıcı dokuyu düz Graefe forsepsiyle çıkarın.
11. Sağ böbreğin altındaki yağ yatağından düz Graefe pensepleri geçirerek vena kava altından bir geçiş oluşturun. Uçlar vena cava'nın karşı tarafında, karaciğer lenf kanalına paralel olarak çıkana kadar ilerleyin.
12. Hazırlanan kanülün dış ucunu düz Graefe forsepsiyle tutun ve vena kava altında oluşturulan tünelden çekin, ta ki uç karşı tarafta çıkana kadar.
13. Halsted-Mosquito hemostat forsepslerini kullanarak, 25G iğnesinin ucunu yaklaşık 90°'ye doğru bük. Bükülü iğneyi kullanarak, sağ taraftaki (operatöre en yakın olan) karaciğer lenf kanalını delin.
    DIKKAT: Lenf kanalı delintisi sırasında keskin iğnelerle çalışırken kazara yaralanmayı önlemek için dikkatli olun.
14. Kanülün hava kabarcıkları olmadan antikoagülan çözelti ile doldurulduğundan emin olun. Eğimli ucu kanala yaklaşık 2 mm sokuyor.
15. Kanülün dış ucunda lenf akışı (~ 100 μL/s) gözlemleyin. Eğer akış yoksa, kanülü ayarlayın veya yeniden takın.
16. Lenf akışı doğrulandıktan sonra, kanülü tıkadıktan sonra yerleştirme yerini sabitlemek için küçük bir veteriner yapıştırıcı damlası uygulayın. Kuruduktan sonra lenf akışını tüpten doğrulayın.
17. Gazlı bezi çıkarın ve organları orijinal konumlarına geri döndürün.
18. Antikoagülan çözelti içeren toplama tüpünü kanül çıkışının altına yerleştirin. Lenfin tüpün içine damla yoluyla aktığını doğrulayın.
19. Karın duvarını, iç oblique, dış oblique ve deri katmanlarını sıralı olarak dikerek kapatın. Karaciğer lenf kanalının tanımlanması ve başarılı kanülasyonu Şekil 5'te gösterilmiştir.
    NOT: Başarılı karaciğer lenf kanalı kanülasyonu sonrası, işlem kısa bir süre durdurularak anestezi ve hidrasyon devam ederken lenf toplama başlangıcına başlanabilir.

Şekil 4: Hepatik lenf kanalına maruz kalma. (A) Kesi için sağ kaburga kafesinin 1,5–2 cm altında anatomik bir işaret. (B) Deri ve karın kaslarından kesik, iç organlar ortaya çıkar. (C) Organların karaciğer lenf kanalını açığa çıkarmak için yeniden konumlandırılması. Karaciğer diyaframa doğru kaydırılır, mide hayvanın soluna ve ince bağırsaklar alt tarafa yerleştirilir. Karaciğer lenf kanalı, hepatik arter (yeşil ok) ile mezenterik arter (mavi ok) arasında yer alır. L: karaciğer; SI: ince bağırsak; IVC: alt vena cava; RK: sağ böbrek. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 5: Hepatik lenf kanalı tanımlaması ve kanülasyonu. (A) Lenfatik ve arteriyel yapılar, organların yeniden konumlandırılmasından ve çevredeki bağlayıcı dokunun çıkarılmasından önce gözlemlenebilir. Hepatik arter (yeşil oklar), bitişik karaciğer lenf kanalına (sarı oklar) göre kafatasında konumlanır. Mezenterik lenf kanalı (mor oklar) mezenterik arterin (siyah noktalı kontur) üzerinde yer alır. Bu yapılar alt vena kavaya dik olarak uzanır. IVC: alt vena cava; RK: sağ böbrek. (B) Karaciğer lenf kanalı (sarı oklar) çevresindeki bağ dokusu çıkarıldıktan sonra net şekilde görselleştirilebilir. Karaciğer lenf kanalı, hepatik arteriye paralel (yeşil noktalı kontur) ve kafatasında mezenterik lenf kanalı (mor oklar) ve mezenterik arter (siyah noktalı hat) ile ilişkili olarak uzanır. (C) Kanül (beyaz oklar) lenf kanalında yapılan küçük delik (turuncu oklar) aracılığıyla karaciğer lenf kanalına (sarı oklar) yerleştirilir. Mezenterik lenf kanalı (mavi oklar) görselleştirilebilir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

6. Ameliyat sonrası dönem

1. Başarılı hepatik lenf kanülasyonundan hemen sonra, juguler ven kanülü üzerinden 1.0–2.0 mL/s hassasiyetinde steril salin enfuzu ile rehidrasyonu başlatın.
2. Lenf toplama sürecinde infüzyonu sürdürün. Alternatif olarak, rehidrasyon mide veya onikili kanül ile yapılabilir; gerekirse juguler ven kanülü venöz kan örneği için ayrılabilir.
3. Hayvanı tüm toplama süresi boyunca anestezi altında, ısıtılmış cerrahi pedde (37°C) tutun.
4. Deney boyunca solunum hızını ve anestezik derinliğini izleyin; nefes alışkanlıklarını ve refleks tepkilerini gözlemleyerek burun konusuyla izofluran anestezisini koruyun.
5. Hidrasyon, juguler ven kanüsü aracılığıyla sürekli tuzlu infuzyon (1.0–2.0 mL/s) ile korundu.
6. Fizyolojik bozukluğu en aza indirmek için, terminal numune almadan önce toplanan toplam kan hacmi, kurumsal hayvan etik yönergelerine uygun olarak tahmini dolaşımdaki kan hacminin %<10'u ile sınırlandırılmıştır.
7. Karaciğer lenfini sürekli olarak antikoagülant içeren tüplere toplayın. Toplama tüplerini saat veya gerektiğinde değiştirin.
8. Belirlenen zaman noktalarında arteriyal kan örnekleri alın:
   1. Dış boru geçici olarak kapatın ve boş bir şırınga takın.
   2. Tüp dolana kadar kan çekin.
   3. Örnek toplama için şırıngayı yeni bir şırınga ile değiştirin ve belirlenen her örnekleme zaman noktasında yaklaşık 100–200 μL arterial kan çekilin.
   4. Her koleksiyondan sonra kanülü antikoagülan çözeltiyle yıkayın.
   5. Kanülü bir tıpla mühürleyin.
9. Örnek toplama tamamlandıktan sonra, ya hepatik arter ve portal venin terminal örneklemesine geçin ya da karotis veya juguler kanül aracılığıyla sodyum pentobarbiton (>100 mg/ kg) ile sıçayı insancıl bir şekilde öldürebilirsiniz.

7. Karaciğer arteri ve portal venin terminal örneklemesi

1. Lenf ve kan toplama işlemi tamamlandığında, derin anestezi uygulanır ve terminal damar numunesi alınmadan önce stabil solunum sağlanır.
2. Karın kesisini dikkatlice açın, üst karın boşluğunu açığa çıkarın.
3. Karaciğeri nazikçe diyaframa, mideyi sola ve ince bağırsağı aşağıya doğru tuzlu nemli gazlı bezle geri çekerek kanüllenmiş hepatik lenf kanalını ortaya çıkarın.
4. Karaciğer lenf kanalına paralel ve kaudal olarak uzanan karaciğer arterini tanımlayın.
   NOT: Arter portal venden daha küçük ve daha solgun görünür ve daha nabızlı bir akış gösterir.
5. 0.61 mm O.D., 0.28 mm I.D. polivinil kanül, önceden antikoagülan çözelti ile doldurulmuş ve hava kabarcıklarından arınmış bir polivinil kanül hazırlayın.
6. Eğimli iris forsepsleri kullanarak, hepatik arterin kısa bir bölümünü izole edin ve altına 4-0 ipek bir dikiş yerleştirin.
7. Atardamarı nazikçe kaldırın ve birincinin distalına ikinci bir dikiş yerleştirin. Distal dikişi geri akışı kontrol etmek için bağlayın, proksimal dikiş ise daha sonra kapanmak için açık bırakın.
8. İnce uçlu mikro-makas kullanarak, dikişler arasındaki arter duvarında yaklaşık 0,5 mm çapında küçük bir enine kesi yapın.
9. Dumont forsepsinin ucuyla damar kapağını nazikçe kaldırarak kanül yerleştirilmesi için damar lümenini stabilize edin.
10. Polivinil kanülün eğimli ucunu açıklığa sokun ve yaklaşık 2–3 mm ilerleyin.
11. Kanülü, proksimal dikişi hem damarın hem de kanülün etrafına bağlayarak sabitleyin.
12. Doğru yerleştirmeyi kanüle darbesel kan akışını gözlemleyerek veya az miktarda parlak kırmızı arterial kan hafifçe aspire ederek doğrulayın.
13. 0,5–1 mL kan, antikoagülan içeren önceden etiketlenmiş bir tüpte toplayın.
14. Toplandıktan sonra kanülü çekin ve her iki dikişi sıkılaştırarak hemostaz sağlanın. Karaciğer arteri maruziyeti ve kanülasyon prosedürü Şekil 6'da gösterilmiştir.
15. Karaciğer arterine medial ve dik uzanan portal ven tespit edilir. Portal ven, karaciğer arterine kıyasla daha büyük çaplı ve daha koyu renkte olur.
16. 23G veya 25G iğneleri, antikoagülant çözeltiyle önceden yıkamalı 1 mL bir şırıngaya takın.
17. İğne eğimliliğini portal damara sığ bir açıyla (yaklaşık 20°–30°) sokarak damarın çökmesini veya yırtılmasını önleyin.
18. Gerekli kan hacmini nazikçe aspire edin.
19. Portal ven ponksiyonu terminal olduğundan, hayvan derin anestezi altında kalırken karotis veya jugulyar kanül üzerinden >100 mg/kg sodyum pentobarbiton verilerek insan yoluyla hayvanı insancıl bir şekilde öldürür. Portal ven konumu ve terminal örnekleme yöntemi Şekil 7'de gösterilmiştir.
    DIKKAT: Sodyum pentobarbiton kontrollü bir maddedir ve kurumsal düzenlemeler ile uygun güvenlik prosedürlerine uygun olarak işlenilmeli ve uygulanmalıdır.
20. Avustralya Bilimsel Amaçlarla Hayvanların Bakımı ve Kullanımı Kanunu (NHMRC)¹⁵ ve ANZCCART yönergelerine uygun olarak, karkas bertaraf edilmeden önce solunum ve kalp aktivitesinin durmasıyla ölümü doğrulamak.

Şekil 6: Hepatik arter tanımlaması ve kanülasyonu. (A) Karaciğer arterinin (yeşil oklar) açığa çıkması. Karaciğer arter, mezenterik lenf kanalının (siyah noktalı kontur) yanında ve alt vena kavaya dik konumdadır. IVC: alt vena cava; L: karaciğer. (B) Eğimli forseps kullanılarak karaciğer arterinin izolasyonu. (C) 0,61 mm × 0,28 mm polivinil kanülün (turuncu oklar) karaciğer arteriye (yeşil oklar) başarılı şekilde yerleştirilmesi, terminal arteriyal kan örneği için 4-0 ipek dikişlerle sabitlenmiş. Mezenterik lenf kanalı (siyah noktalı kontur) görselleştirilebilir. PV: portal damar. (D) Kanül sabitlendikten sonra, kanülün açıklığı kanülün içine kan çekilerek doğrulanır. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 7: Portal ven tanımı ve terminal örnekleme. (A) Portal ven (25G iğneyle belirtilen) karaciğer arteri (beyaz noktalı kontur) ile safra kanalı (siyah noktalı hat) arasında yer alır. Portal ven, karaciğer arterinden daha büyük ve koyu görünür ve terminal kan toplama için derin anestezi altında erişilir. PV: portal ven; IVC: alt vena cava; L: karaciğer; SI: ince bağırsak; RK: sağ böbrek. (B) 25G iğnesinin portal vene (siyah noktalı kontur) başarılı şekilde yerleştirilmesi, terminal venöz kan örneği alınması. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Sonuçlar

Protokol bölümünde tanımlanan cerrahi yaklaşım, sağ böbreğin medialinde bulunan ve çölyak ile karaciğer arterlerine paralel uzanan karaciğer lenf kanalının net bir şekilde tanımlanmasını sağlar; daha önce bildirildiği^{gibi. 4}. Temsil edici anatomi ve kanülasyon Şekil 5'te gösterilmiştir. Başarılı kanülasyon, sütlü şilomikron kontaminasyonundan arınmış şeffaf veya hafif bulanık lenf sıvısının hemen ortaya çıkmasıyla doğrulanır; bu da mezenterik lenfle minimal karışımı olduğunu gösterir. Bu gözlem, hepatik^{lenf 3'ün} bildirilen özellikleriyle tutarlıdır. Karaciğer lenfinin tanımlanması, karaciğer arteri ve alt vena kavaya göre anatomik konumuna ve mezenterik lenfin tipik opak veya süt görünümünün aksine, karakteristik net görünümüne dayanıyordu.

Hepatik lenf akışı toplama dönemi boyunca sabit kalmalı ve ortalama 0,1 mL/h ^3,4,11 oranında olmalıdır. Hepatik lenf akışı genellikle anestezi koşullarında kanülasyondan sonra yaklaşık 2–3 saat boyunca en stabil şekilde kalır, ancak optimal deneysel koşullarda daha uzun toplama süreleri (~6–8 saate kadar) mümkün olabilir. Önceki çalışmalarda bildirilen temsil lenf akışı^{değerleri 4} Tablo 1'de özetlenmiştir. Hepatik lenf akışı, anestezi altındaki farelerde mezenterik ve torasik lenf kanalı akışında bildirilen hızdan genellikle daha düşüktür.

Lenfatik bölgeler (bilinçli durum)	Ortalama lenf akış hızı (mL/s)
Toraks lenfi (bilinçli)	1.74 ± 0.33
Toraks lenfesi (anestezi)	0.65 ± 0.10
Mezenterik lenf (anestezi)	0.45 ± 0.11
Hepatik lenf (anestezi)	0.12 ± 0.02

Tablo 1: Bilinçli ve anestezi altında olan sıçanlarda torasikal, mezenterik ve hepatik lenf kanalı kanülasyonları üzerinden ortalama lenf akış hızları (mL/h). Veriler, n = 3–5 sıçan için ortalama ± SEM olarak sunulur. Yadav ve ark. (2018)4 içindeki Tablo 3'ten uyarlanmıştır^.

Makromoleküllerin lenfatik taşınımını gösteren temsil eden sonuçlar Şekil 8'de gösterilmiştir. Bu örnekler, yaklaşık 60 kDa pegile interferon α2a (IFN-PEG40), yaklaşık 31 kDa pegile interferon α2b (IFN-PEG12) ve monoklonal antikor trastuzumab dahil olmak üzere terapötik makromoleküllerin intravenöz uygulanmasından sonra lenfatik iyileşmenin değerlendirilebileceğini göstermekte modelin nasıl kullanılabileceğini göstermektedir; bu da karaciğerin makromoleküler tedaviler için ekstravazasyon ve lenfatik erişim için ana bir yer olduğunu^{göstermektedir 4}.

Şekil 8: Torasel, mezenterik ve hepatik lenfte intravenöz uygulanan makromoleküler tedavilerin lenfatik iyileşmesi. Farklı moleküler boyutlarda PEGilated interferonların (IFN-PEG12 ve IFN-PEG40) ve monoklonal antikorun (trastuzumab) intravenöz uygulanması sonrası torakik, mezenterik ve karaciğer lenfte toplam doz yüzdesi. Veriler, 8 saat boyunca ortalama ± doz geri dönüş SEM'ini temsil eder. Yadav ve ark. (2018)4'ten uyarlanmıştır^. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Model ayrıca hepatik^{lenf 3'ün} ayrıntılı lipoprotein profilini mümkün kılar. Lenf lipid bileşiminin temsil analizleri Şekil 9'da gösterilmiştir. Toraks ve mezenterik lenflerle karşılaştırıldığında, hepatik lenf belirgin şekilde daha düşük toplam lipid içeriğine sahiptir ancak protein konsantrasyonları diğer lenf kaynaklarınakiyle karşılaştırılabilirdir. Karaciğer lenflerinin lipoprotein analizi, karaciğerin lipid kaçakçılığı ve kolesterol taşınmasındaki benzersiz rolünü vurgular. Temsil lipid bileşimi verileri Tablo 2'de özetlenmiştir. Hepatik lenf HDL, kolesteril esterlerle zenginleştirilir, mezenterik lenf HDL ağırlıklı olarak trigliserit açısından zengindir ve torasik lenf HDL nispeten daha yüksek fosfolipid içerir. Bu bileşimsel farklılıklar, her lenfatik kaynağın lipid metabolizması ve taşınmadaki farklı rollerini gösterir.

	%wt/wt
Kesirler	Fosfolipid	Serbest kolesterol	Kolesteril ester	Trigliserit
Mezenterik lenf
D-HDL	20 ± 3	1 ± 0	5 ± 1	16 ± 1
L-HDL	21 ± 4	2 ± 0	8 ± 2	23 ± 5
Hepatik lenf
D-HDL	24 ± 1	3 ± 0	12 ± 3	8 ± 1
L-HDL	23 ± 1	6 ± 1	13 ± 2	14 ± 2
Toraks lenfi
D-HDL	25 ± 1	1 ± 0	7 ± 0	11 ± 3
L-HDL	29 ± 1	2 ± 0	11 ± 1	11 ± 0
Plazma
D-HDL	29 ± 2	2 ± 0	20 ± 3	2 ± 0
L-HDL	36 ± 6	2 ± 0	18 ± 3	4 ± 1

Tablo 2: Mezenterik, hepatik ve torasik lenf ile plazmadan izole edilen yoğunluk (D-HDL) ve hafif (L-HDL) yüksek yoğunluklu lipoprotein fraksiyonlarının lipid bileşimi. Değerler, fosfolipid, serbest kolesterol, kolesteril ester ve trigliseridin toplam lipid fraksiyonuna göre ağırlık oranını (%/wt) temsil eder. Veriler ortalama ± SEM olarak sunulmaktadır. Gracia ve ark. (2020)3 Tablo 1'den uyarlanmıştır^.

Şekil 9: Mezenterik, hepatik ve torasik lenfin protein ve lipid bileşimi. Mezenterik, karaciğer ve torasik lenfte protein ve toplam lipid orantılı içeriği. Lipid içeriği, fosfolipidler (PL), trigliseridler (TG), kolesteril esterler (CE) ve serbest kolesterol (FC) içerir; bunlar lipid ağırlığının protein ve lipidin toplam ağırlığına göre yüzdesi olarak ifade edilir. Veriler ortalama ± SEM olarak sunulur. Gracia ve ark. (2020)^3'ten uyarlanmıştır. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

Hepatik lenf kanalı kanülasyonu, deneyimli mikrocerrahlar için bile teknik olarak zor bir işlemdir. Birkaç kritik adım, lenf kanalının bütünlüğünün korunması ve stabil lenf akışı sağlanması olasılığını artırabilir. Karaciğer lenf kanalı tanımlanıp izole edilirken (Protokol adımları 5.7-5.10), ilk adım, mezenterik lenf kanalı ve vena kava üzerindeki biriktirici doku ve yağı karaciğer lenf kanalına yakın şekilde çıkarmaktır. Karaciğer lenf kanalı, daha kalın ve opak mezenterik lenf kanalına kıyasla saydam ve kırılgandır ve doğrudan ele alındığında kolayca yırtılabilir. Mezenterik lenf kanalı, üst dokusunun boşalmasıyla karaciğer lenf kanalının üst konumda olduğunu ortaya koyduğu için faydalı bir anatomik işaret olarak hizmet eder. Karaciğer lenf kanalında genellikle bükülmeler veya eğrilik görüldüğünden, operatör düz bir segment boyunca bir kanülasyon noktası seçmeli ve tıkanma veya yırtılma riskini en aza indirmek için kanalın doğal akışına paralel konumlandırmalıdır (adım 5.11-5.14).

Kanülasyonun kendisi başarının en kritik belirleyicisidir. Kanal delindikten sonra (adım 5.13), forseps ucu açılışa yerleştirilerek ve sadece bir damar duvarının aletin üzerinde olduğundan emin olarak intraluminal erişim görsel olarak doğrulanabilir. İki karşıt duvarın ortaya çıkışı, tamamen delik olduğunu gösterir. İntraluminal erişim doğrulandıktan sonra, kanül aynı açıda kanal boyunca pürüzsüzce ilerletilebilir. Komşu damarlara zarar vermemek için dikkatli olunmalıdır; çünkü alana kan akması, lenf toplama kanülüne kan girebilir, örneğin kirlenmesine ve pıhtı oluşumu riskini önemli ölçüde artırabilir. Lenf akışı kurulduktan sonra (adım 5.15), kanülün toplayan ucu kapatılmalı ve veteriner yapıştırıcısı dikkatlice uygulanarak lümenin içine girmesini önlemelidir. Kanülün hava kabarcıkları olup olmadığı kontrol edilmelidir, çünkü hapsolmuş hava geri basıncı artırır ve lenf akışını engelleyebilir. Karaciğer lenfi düşük tahrik basıncı altında üretildiğinden, kanülün toplayıcı ucu her zaman cerrahi alan seviyesinin altında konumlandırılmalıdır ki yerçekimiyle drenaj yapılsın.

Başarılı karaciğer lenf kanalı kanülasyonu, lenf akışının hemen başlamasıyla belirtilir. Bir kez oluştuktan sonra, karaciğer lenfi genellikle yaklaşık 0,1 mL/s hızla akar ve birkaç saat boyunca sabit bir çıkış sağlar. Akış hızı, hayvanın anatomisi, fizyolojisi ve deneysel koşullarına bağlı olarak değişebilir. Örneğin, bu protokolde izofloran anestezisi altında lenf toplanmıştır. İzofloran anestezisi, lenfatik fonksiyonla ilgili fizyolojik parametreleri etkileyebilir ve bu nedenle anesteziyle ilgili deneysel koşullar lenf oluşum oranları yorumlanırken dikkate^{alınmalıdır 16}. Hepatik lenf kanalı kanülasyonu, laparotomi ve karın lenfatik damarlarının hassas mikrocerrahi manipülasyonu gerektirir; bu nedenle bilinçli farelerden lenf toplamak bu modelde mümkün değildir. Anestezi ve bilinçli koşullarda veya farklı anestezik rejimler kullanılarak lenf taşınımını karşılaştıran önceki çalışmalar, anestezinin mutlak lenf akış oranlarını mütevazı şekilde etkileyebileceğini, ancak genel lenfatik taşıma düzenlerini önemli ölçüde değiştirmediğini^{göstermiştir 4}. Bu nedenle, bu modelde elde edilen lenf akış değerleri, anestezi edilmiş deneysel koşullar bağlamında yorumlanmalıdır.

Toplama sırasında akışın kademeli azalması veya durması, çoğunlukla kanül içinde kan kontaminasyonu veya fibrin birikimiyle oluşan pıhtı oluşumundan kaynaklanır. Akış bazen kanülün lokalize edilip ince forsepslerle nazikçe sıkıştırarak pıhtı mekanik olarak parçalanarak veya kanülün toplanan ucundan nazikçe aspirasyon yoluyla tıkanıklığı çıkararak yeniden sağlanabilir. Tıkanıklık sadece dış kısımda kalıyorsa, kanül pıhtığa yakın kesilebilir ve steril silikon konnektör kullanılarak taze boruya yeniden bağlanabilir. Pıhtı kanülasyon bölgesinde oluşursa, genellikle yeniden kanülasyon gereklidir. Bu durumlarda, kanalın veya bitişik kan damarlarının yırtılmasını önlemek için yapıştırıcının büyük dikkatle çıkarılması denilebilir. Kanülasyonu yeniden denemeden önce hemostaz sağlanmalıdır; çünkü kanüle küçük kan sızıntısı bile düşük basınçlı hepatik lenf sisteminde pıhtılaşmayı belirgin şekilde teşvik eder.

Fizyolojik faktörler de lenf akışını ve açıklığını etkiler. Sıçanlarda hepatik lenf akışı, bazal koşullarda bile mezenterik veya torasik kanal akışından doğası gereği daha^{yavaştır 17,18}. Ayrıca, genel anestezi diğer lenfatik devrelerde bilinçli ve serbestçe hareket eden farelere kıyasla lenf akışını^{azaltabilir 19}. Karaciğer lenf kanülasyonu anestezi ve laparotomi gerektirdiğinden, bu faktörler uzun süreli toplamalar sırasında nispeten düşük akış hızlarına ve artan pıhtı eğilimine katkıda bulunabilir. Toplama sırasında juguler ven veya gastrointestinal kanül üzerinden hidrasyonun sürdürülmesi, lenf akışını stabilize etmeye ve pıhtı oluşumunu azaltmaya yardımcı olur. Bu modelde, stabil karaciğer lenf akışı genellikle 2–3 saat boyunca sağlanabilir, bundan sonra akış bozulabilir ve pıhtılaşma olasılığı daha yüksek hale gelir. Ancak, optimal deneysel koşullarda, lenf toplama süresi daha uzun süreler sürdürülebilir ve maksimum sürenin ~8 saate kadar olduğu^{bildirilmektedir 4}.

Karaciğer arter ve portal ven örneklemesinin dahil edilmesi (Şekil 6 ve Şekil 7), hepatik giriş, lenfatik efflow ve sistemik dolaşım arasında doğrudan karşılaştırma imkanı sağlayarak modelin uygulanabilirliğini genişletir. Bu terminal örnekleme adımı, tek bir hayvan içinde karaciğer mikrovasküler taşınım ve interstisyel klirensin eşzamanlı olarak değerlendirilmesini sağlar. Bu tür karşılaştırmalar, özellikle interstisiyal difüzyona bağımlı büyük makromoleküller veya lipofilik bileşikler için, karaciğer damar ve lenfatik bölmeler arasındaki çözünür maddelerin dağılımı hakkında değerli bilgiler sağlar.

Bu zorluklara rağmen, hepatik lenf kanülasyonu modeli değerli ve bilgilendirici bir teknik olmaya devam etmektedir. Karaciğer, toplam vücut lenf akışının önemli bir kısmını oluşturur ve hepatik lenf, hepatik interstisyel sıvıdan kaynaklanan proteinler ve diğer bileşenler içerir. Karaciğerden doğrudan lenf boşalmasını örnekleyerek, bu model, mezenterik ve sistemik lenf tarafından torakik kanalda seyreltilmeden önce karaciğerden çıkan moleküllerin ve hücrelerin analizini sağlar. Karaciğer lenfin biyokimyasal analizi, karaciğer interstisyel metabolizması ve lipid taşıma süreçleri hakkında içgörü^{sağlar 12,20}. Bu, portal veya sistemik kandan elde edilen bilgileri tamamlar; bu bilgiler karaciğer metabolizması ile ekstrahepatik değişim etkilerini entegre eder. Önemli olarak, karaciğer lenf, karotis arterial ve jugulyar venöz kanülasyonları birleştiren bu konfigürasyon, hepatik efflux ile vasküler giriş arasındaki çözünen gradyanlarının dinamik olarak değerlendirilmesine olanak tanır ve karaciğer taşınımı ile boşalmanın daha kapsamlı bir görünümünü sağlar.

Bu modeli kullanan önceki çalışmalar, hepatik lenf örneklemesinin, makromoleküler tedavilerin lenfatik iyileşmesinin değerlendirilmesini ve karaciğer lenfi ile sistemik dolaşım arasındaki çözünen taşınımının karşılaştırılmasını mümkün kıldığını göstermektedir. Hepatik lenf kanülasyonu, eşzamanlı damar örnekleme ve biyokimyasal profilleme, hepatik mikrovasküler ve interstisyel dinamiklerin incelenmesi için sağlam bir deneysel platform sağlar. Model, karaciğer taşınımının, metabolizmanın, lipid işlemenin ve bağışıklık sinyalinin eşzamanlı değerlendirilmesini sağlar ve MASLD veya karaciğer iltihabı gibi patofizyolojik koşullar altındaki değişiklikleri incelemek için uyarlanabilir.

Sonuç olarak, karaciğer lenfatik, karaciğer arteriyel ve portal venöz erişimi entegre eden bu gelişmiş cerrahi model, karaciğer taşıma yollarını incelemek için kapsamlı ve tekrarlanabilir bir yaklaşım sunmaktadır. Bu yöntem, vasküler giriş, interstisiel efflow ve lenfatik drenajın doğrudan karşılaştırılmasına olanak tanır ve karaciğere özgü taşınma, metabolizma ve farmakokinetik süreçler hakkında mekanik içgörüler sağlayan çalışmaları destekler. Ayrıca, karaciğer lenfi örnekleme yeteneği, karaciğerden bağışıklık hücresi ve antijen ticaretini incelemek için benzersiz bir fırsat sunar ve karaciğer bağışıklık gözetim, iltihap ve tolerans mekanizmaları hakkında değerli bilgiler sunar.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Anticoagulant solution (EDTA 0.1%)	Invitrogen	AM9261	Kanüllerde ve toplanan numunelerde pıhtı oluşumunu önler
Anticoagulant solution (Heparin 20 IU/mL)	Pfizer	00409-2723-01	Kanüllerde ve toplanan numunelerde pıhtı oluşumunu önler
Chlorhexidine (0.5%)	McFarlane Medical	12120-OR	Cerrahi bölge dezenfeksiyonu için kullanılır
Collection tubes (microcentrifuge)	Greiner Bio-One	616201	Lenf ve kan toplama için kullanılır
Cotton gauze	Winc Australia	18874125	Organ manipülasyonu ve nem sağlamak için kullanılır
Cotton swabs	Pacific Laboratory	1005199	Cerrahi sırasında organ yeniden yerleştirme için kullanılır
Curved iris forceps	Macquarie Medical Systems	TTP5002-5	Damar izolasyonu ve doku manipülasyonu için kullanılır
Dumont forceps	Fine Science Tools	11251-35	Kanül yerleştirimi için karaciğer arter damar lümenini açmak ve stabilize etmek için kullanılır
Ethanol (70%)	Ajax	AJA214-2.5PL	Cerrahi bölge dezenfeksiyonu için kullanılır
Halsted-Mosquito hemostat forceps	Fine Science Tools	13009-12	Karaciğer lenf kanalı ponksiyonu için 25G iğneyi bükmek için kullanılır
Heated surgical pad (37 °C)	Ratek	IC-WT1	Cerrahi sırasında vücut ısısını korur
Induction chamber	Darvall	1859	İlk anestezi indüksiyonu için kullanılır
Infusion pump	Adelab Scientific	NE-300	Kanül yoluyla kontrollü salin infüzyonu sağlar
Iris scissors	Stark Medical	E-AC985-11	Deri ve kas kesimi için kullanılır
Isoflurane	Provet Pty Ltd	ISOF07	Anestezinin indüksiyonu ve sürdürülmesi için kullanılan inhalasyon anestezisi
Kelman-McPherson lens forceps	ProSciTech	TY-1301	Kanül yerleştirimi için jugüler ven ve karotid arter damar lümenini açmak ve stabilize etmek için kullanılır
Needle (23G × 1")	Livingstone	DN23GX1.0LV	Portal ven ponksiyonu ve kan örneklemesi için kullanılır
Needle (25G × 1")	Livingstone	DN25GX1.0LV	Kanül yıkama ve karaciğer lenf kanalı ponksiyonu için kullanılır
Nose cone anesthesia system	Darvall	7885	Cerrahi sırasında anesteziyi korur
Oxygen supply with flowmeter	BOC	400NE	Izofluran anestezi için taşıyıcı gaz
Polyethylene cannula (0.8 mm O.D., 0.5 mm I.D.)	Microtube Extrusions	PE8050	Karotis arter, jugüler ven ve karaciğer lenf kanalı kanülasyonu için kullanılır
Polyvinyl cannula (0.61 mm O.D., 0.28 mm I.D.)	Microtube Extrusions	PIV6128	Karaciğer arter kanülasyonu için kullanılır
Silk sutures (4-0)	SMI AG	SM8015	Damarları ve kanülleri sabitlemek için kullanılır
Sodium pentobarbitone	Lyppard Australia Pty Ltd	LETH250	Ötenazi için kullanılır (>100 mg/kg)
Sterile saline (0.9% NaCl)	FreeFlex	K690531	Rehidrasyon ve yıkama için kullanılır
Straight Graefe forceps	Fine Science Tools	11150-10	Delikli damar izolasyonu için kullanılır
Surgical microscope	Zeiss	Stemi 2000-CS	Karaciğer lenf kanalı kanülasyonu sırasında görselleştirme için kullanılır
Surgical sterile blades (for scalpel use)	Livingstone	SBLDCL15	Hazırlık sırasında kanül uçlarının konik şekil verilmesi için kullanılır
Syringe (1 mL)	Terumo	19032-TE	Kanülleri yıkamak için kullanılır
Syringe (3 mL)	Terumo	19048-TE	Kan örneklemesi için kullanılır
Syringe (30 mL)	Terumo	19034-TE	Salin infüzyonu için kullanılır
Vannas scissors	Fine Science Tools	91500-09	Vasküler kesiler için kullanılır
Veterinary tissue adhesive	3M	1469SB	Karaciğer lenf kanalı kanülünü sabitlemek için kullanılır