Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Araştırma makalesi
Bu çalışma, Shengxian Quyu Karışımı'nın kalp yetmezliği üzerindeki terapötik etkisini hayvan deneyleriyle doğruladı. Ultra performanslı sıvı kromatografi–kütle spektrometrisi ve ağ farmakoloji analizleri, potansiyel terapötik hedefler ve mekanizmalar tespit etmiştir.
Shengxian Quyu karışımı (SXQY), kalp yetmezliği (HF) için potansiyel bir terapötik strateji olarak önerilmiştir, ancak terapötik mekanizmaları hâlâ net değildir. Bu çalışma, HF'de SXQY'nin terapötik etkilerini ve altta yatan mekanizmalarını araştırdı. HF'nin bir fare modeli, transversal aort konstriyonu (TAC) ile indüklenmiş ve SXQY ile tedavi edilmiştir. Kardiyak fonksiyon transtorasik ekokardiyografi ile değerlendirildi, miyokard yapısı ve fibrozis ise hematoksilin, eosin ve Masson trikrom boyama kullanılarak değerlendirildi. Serum örnekleri, ultra performanslı sıvı kromatografi–tandem kütle spektrometrisi kullanılarak hedefsiz metabolomiklerle analiz edildi. Kan girişi bileşenleri hedeflere haritalandı ve kesişen HF ile ilgili hedefler protein-protein etkileşimi (PPI) ağ analiziyle analiz edildi, ardından Gen Ontolojisi ve Kyoto Genler ve Genomlar Ansiklopedisi (KEGG) analizleri yapıldı. SXQY, diastolde sol ventriküler iç çapın azalması ve sol ventriküler arka duvar kalınlığının azalması ve sol ventriküler fraksiyon fraksiyonunun artmasıyla görüldüğü gibi, TAC sıçanlarında kalp fonksiyonunu anlamlı şekilde iyileştirdi; bu, diyastolde sol ventriküler iç çapın azalması ve miyokard hipertrofisi, iltihap ve fibrozisin hafifletilmesiyle görüldü. Toplamda 563 kan girişi bileşiği (367 prototip ve 196 metabolit) tanımlanmış, Geleneksel Çin Tıp Sistemleri Farmakoloji veritabanında 63 hedefe karşılık gelen 5 ana aktif bileşik tespit edilmiştir. Ağ analizi, Formononetin, Timosaponin BII ve Sinensetin temel bileşenler olarak, PTGS2, PPARG ve HSP90AA1 ise merkez hedefleri olarak 44 örtüşen gen ortaya koydu. PPI analizi, ESR1, PTGS2, PPARG, HSP90AA1, JUN ve 15 ek gen gibi önemli genleri de tespit etti. KEGG analizi, SXQY'nin esas olarak Ca2+, fosfatidilinizositol 3-kinaz–protein kinaz B, döngüsel adenozin monofosfat ve iltihap ile hormonla ilgili yollar aracılığıyla etki ettiğini göstermiştir. Sonuç olarak, SXQY, çok bileşenli, çok hedefli ve çok yollu mekanizmalar aracılığıyla kalp fonksiyonunu iyileştirerek ve miyokard yeniden modellenmesini zayıflatarak HF'ye karşı koruyucu etkiler uygular.
Kalp yetmezliği (HF), kalp yapısal veya fonksiyonel anormallikler nedeniyle ventriküler dolgu ve ejeksiyon kapasitesinin bozulmasıyla karakterize edilen klinik bir sendromdur ve bu da klinik belirtiler ve belirtiler topluluğuna yol açar. Çeşitli kalp hastalıklarının son aşaması olan HF, hastaların yaşam kalitesini önemli ölçüde zayıflatır ve yüksek ölüm oranı ile sık sık hastaneye tekrar yatışlara yol açar; böylece hem aileler hem de toplum üzerinde ciddi bir hastalık yüküoluşturur 2,3. Klinik yönetimde, HF için farmakoterapi tedavinin temelini oluşturur ve öncelikle diuretikler, renin–anjiyotensin sistem inhibitörleri, beta-blokerler, mineralokortikoid reseptör antagonistleri ve sodyum-glikoz kotransporter 2inhibitörleri 3,4,5,6 gibi temel ilaç sınıflarını içerir . Bu ilaçlar HF hastalarının prognozunu kısmen iyileştirmiş olsa da, her biri elektrolit bozuklukları, bradikardi ve idrar yolu enfeksiyonları gibi belirli sınırlamalar ve yan etkilertaşır. 7. Bu nedenle, HF için farmakolojik tedaviler hâlâ daha fazla araştırma gerektirir.
Geleneksel Çin Tıbbı (TCM), HF'nin uzun vadeli yönetiminde kapsamlı klinik deneyim biriktirmiştir. Bütünsel düzenleme ve çoklu hedefli müdahaleyi vurgulayan bu yöntem, tedaviye ayırt edici bir yaklaşımsunar 8. Son yıllarda, birçok randomize kontrollü çalışma (RCT) Çin bitkisel formüllerinin HF 9,10,11,12,13,14,15 için terapötik etkinliğini göstermiştir. Shengxian Quyu demlendirmesi (SXQY), terapötik etkinliğini doğrulamak için zaten titiz RCT'lerden geçmeye başlamıştır, ancak spesifik terapötik mekanizmaları hâlâ daha kapsamlı ve daha kapsamlı bir inceleme gerektirir16. Ağ farmakolojisi, sistem biyolojisi, polifarmakoloji ve hesaplamalı analizi birleştiren yeni bir disiplin olarak, Çin bitkisel formüllerinin bütünsel etki mekanizmalarını aydınlatmak için güçlü bir araç sunar 17,18,19. Bu nedenle, bu çalışma, hedefsiz metabolomik ve ağ farmakolojisini birleştirerek SXQY'nin kan tarafından emilen bileşenlerini belirlemek ve potansiyel terapötik mekanizmalarını açıklamak için entegre bir strateji kullanmaktadır. Bu çalışma, SXQY'nin daha ileri klinik uygulaması için temel sağlamayı amaçlamaktadır.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tüm deneysel prosedürler, Çin-Japonya Dostluk Hastanesi Hayvan Etiği ve Refahı Komitesi (onay No. zryhyy21-23-01-09) tarafından incelenip onaylandı ve hayvan kullanımı ile acıyı en aza indirmek için değiştirme, azaltma ve iyileştirme ilkelerine uygun olarak gerçekleştirildi. Veri toplama ve analiz yapan araştırmacılar (ekokardiyografi ölçümleri ve histolojik değerlendirme dahil) grup dağılımı konusunda kör oldu.
SXQY örneğinin hazırlanması
SXQY aşağıdaki bitkisel bileşenlerden oluşur: Astragalus membranaceus (Huangqi) (30 g), Codonopsis pilosula (Dangshen; 20 g), Cornus officinalis (Shanyurou; 15 g), Sparganium stoloniferum (Sanleng; 12 g), Curcuma zedoaria (Erzhu; 15 g), Cimicifuga heracleifolia (Shengma; 10 g), Bupleurum chinense (Chaihu; 10 g), Platycodon grandiflorus (Jiegeng; 10 g), Anemarrhena asphodeloides (Zhimu; 15 g) ve Leonurus japonicus (Yimu; 15 g), reçete başına toplam ham bitki ağırlığı 152 g idi. Tüm bitkisel malzemeler Çin-Japonya Dostluk Hastanesi Eczacılık Departmanı'ndan satın alınmış ve standart farmakognostik tanımlama yöntemlerine göre baş eczacı tarafından doğrulanmıştır. Klinik olarak, SXQY günde bir reçete (152 g) dozda uygulanır. Ortalama yetişkin vücut ağırlığı 70 kg varsayarsak, karşılık gelen insan dozu kg'da 2,17 g (ham ot)'dur. İnsanlar ve sıçanlar arasındaki vücut yüzeyi normalizasyonuna dayanarak, eşdeğer fare dozu 13,67 g (ham ot)/kg olarak hesaplandı. Kaynatma hazırlığı için, bir reçete SXQY damıtılmış suda, ham otların gramı başına 10 mL oranında (w/v, bekletildikten sonra ayarlanmadan başlangıç çözücü hacmine göre değişmeden) 1 saat bekletildi, ardından elektrikli ısıtma mantosu kullanılarak kaynatıldı ve 1 saat boyunca sürekli kaynatma altında 100°C'de tutuldu. Ekstrakt daha sonra gazlı bezden (200–300 μm gözenek boyutu) filtrelendi. Kalıntı daha sonra aynı koşullarda iki kez daha çıkarıldı. Toplanan filtratlar, 60°C'de döner evaporatör kullanılarak azaltılmış basınç altında konsantre edilip 111 mL nihai hacme ulaştı ve 1.37 g (ham ilaç)/mL konsantrasyon elde edildi. Konsantre karışım tekrar gazlı bezle (200–300 μm gözenek boyutu) filtrelenip 4°C'de saklanır ve 24–48 saat içinde kullanılır. Uygulama için çözelti doğrudan kullanıldı ve gavaj hacmi 1,37 g/mL konsantrasyonuna göre hesaplandı; böylece yaklaşık 10 mL/kg uygulama hacmi elde edildi ve hedef doz olan 13,67 g/kg elde edildi.
Hayvan Modeli
On sekiz 8 haftalık erkek Sprague–Dawley (SD) sıçanları, standart koşullu bir ortamda (23°C ± 2°C, %50 ± %5 bilgili nem ve 12 saat ışık/karanlık döngü) ücretsiz yiyecek ve suya erişimle tutuldu. Hayvanlar, rastgele sayı tablosu kullanılarak üç gruba (grup başına n = 6) rastgele olarak ayrıldı: sahte ile işletilen bir grup (Sham), bir transversal aort daraltma grubu (TAC) ve bir SXQY ile tedavi edilmiş bir grup (SXQY). TAC ve SXQY ile tedavi edilen gruplardaki fareler, izofluran solumasıyla (indüksiyon %4, bakım %2) anestezi edildi ve 37°C'de tutulan termostat kontrollü ısıtma pedinde sırtüstü pozisyonda yerleştirildi. Yeterli anestezi, pati sıkmaya refleks yanıtlarının olmaması, sabit bir nefes alma hızı ve spontan hareketin olmaması ile doğrulandı. Korneanın kurumasını önlemek için her iki göze de oftalmik merhem uygulandı. Endotrakeal entübasyonun ardından, hayvanlar 200 g vücut ağırlığı başına 4–6 mL gelgit hacmı, dakikada 70 nefes hızı ve 1:1 spirator-ekspirasyon oranı olan küçük hayvan ventilatörüne bağlandı.
Tüm cerrahi işlemler aseptik koşullar altında gerçekleştirildi. Cerrahi aletler otoklavlama ile sterilize edildi ve ameliyat bölgesi tıraş edilip povidon-iyot ile dezenfekte edilip %70 etanol ile hazırlandı. Cerrahi alan hazırlığından sonra sol torasik deri kesisi yapıldı ve pektoralis major ile minor kasları kaburgaları açığa çıkarmak için küt şekilde diseksiye edildi. Sol sternal sınırın bitişiğindeki ikinci ila üçüncü interkostal boşlukta yaklaşık 1,0 cm yatay bir kesi oluşturuldu. Kan damarları ve fasya küt şekilde ayrılmış, timus nazikçe geri çekilerek aort kemeri tamamen açığa çıkmıştır.
Aort kemeri, steril kavisli forsepslerle sağ inominat arter ile sol ortak karotis arter arasında dikkatlice kaldırıldı ve altına 2-0 ipek dikiş geçirildi. Kör uçlu, kavisli 16 gauge iğne (dış çapı 1,6 mm) ucu kütleştirilip uygun bir eğriliğe bükülerek manuel olarak değiştirilir, ardından otoklavlama ile sterilizasyon yapılırdı. Hazırlanan kör uçlu kavisli iğne, aort kemesine paralel konumlandırılır, ardından dikiş hem aorta hem de iğne etrafına sıkıca bağlanır. İğne hemen çıkarılarak standart bir daralma oluşturuldu ve timus yeniden konumlandırıldı. Aktif kanamanın olmadığı doğrulandıktan sonra, göğüs duvarı ve deri katmanlar halinde kapatıldı. Ameliyat sonrası ise mekanik ventilasyon yaklaşık 10 dakika sürdürüldü; spontan solunum geri kazanıldı; bu, stabil ve düzenli solunum hızı ile ventilasyon desteği olmadan spontan nefes almayı sürdürme yeteneği ile gösterildi. Bu noktada endotrakeal tüp çıkarıldı. Sahte ameliyat edilen hayvanlar da aynı cerrahi işlemleri geçirir, ancak aort kemeri bağlanmamıştır.
Ameliyattan sonra kesi bölgesi dezenfekte edildi ve hayvanlar enfeksiyon riskini azaltmak için temiz iyileşme kafeslerine yerleştirildi. Fareler daha sonra iyileşme ve rutin barınma için hayvan tesisine geri getirildi. Analjezi, buprenorfin (0,05 mg/kg, deri altı olarak) kullanılarak uygulandı. İlk 72 saat boyunca her 12 saatte bir ağrı, sıkıntı veya cerrahi komplikasyonlar (hareket kabiliyetinin azalması, piloreksiyon, anormal duruş, zorlanma solunması veya yara açılması gibi belirtiler gözlemlendi).
Ameliyattan üç gün sonra, SXQY ile tedavi edilen gruptaki farelere 9 hafta boyunca 1 mL/100 g vücut ağırlığı SXQY decoction ile ağız yoluyla verildi. Bu arada, sahte ile işletilen ve TAC gruplarındaki farelere garajla eşit miktarda (1 mL/100 g vücut ağırlığı) damıtılmış su verildi.
Transtorasik Ekokardiyografi
Tedavi süresinin sonunda tüm gruplarda transtorasik ekokardiyografi yapıldı. Fareler, izofluran solumasıyla anestezi edildi ve özel bir görüntüleme platformunda sırtüstü pozisyona yerleştirildi. Ön göğüs dikkatlice tıraş edildi ve bol miktarda ultrason jeliyle kaplandı. Ultrason görüntüleme, B-modunda ve M-modunda yüksek frekanslı bir dönüştürücü (18–40 MHz) ile donatılmış yüksek çözünürlüklü küçük hayvan ultrason sistemi kullanılarak gerçekleştirildi. Çevirici, jel kaplı alana nazikçe yerleştirilmiş, derinlik ayarı 12,29 mm ve kazancı 22 dB; odak, görüntü kalitesini optimize etmek için ayarlandı. Görüntüler ve video döngüleri sonraki nicel analiz için alındı. Sol ventriküler end-diastolik iç çapı (LVIDd) ve sol ventriküler posterior duvar kalınlığı son diastolde (LVPWd) ölçüldü ve sol ventriküler ejeksiyon fraksiyonu (LVEF), M-mod ölçümlerine dayanan Teichholz formülü kullanılarak hesaplandı. Her parametre için, 3–5 ardışık kalp döngüsü boyunca ölçümler ortalaması alındı. Tüm ekokardiyografik bulgular ve analizler, standart ekokardiyografi protokollerine uygun olarak resmi ekokardiyografi eğitimi almış sertifikalı bir operatör tarafından gerçekleştirilmiştir.
Örnek Toplama ve İşleme
Ultrason işleminden sonra sıçanlar izofluran ile anestezi edildi. Hayvanlar sırtüstü pozisyona yerleştirildi ve göğüs boşluğu açılarak kalp ortaya çıktı. Kalpler hızla çıkarıldı, soğuk fosfatla tamponlu tuzlu suyla duruldu ve sagital düzlem boyunca kesitlendi. Kardiyak dokular hemen %4 paraformaldehit ile 4°C'de 24 saat sabitlendi, ardından her adımda 1 saat boyunca derecelendirilmiş etanol serisi (70%, 80%, 90%, %95 ve %100) ile dehidrasyon yapıldı; bu süre zarfında dokular belirgin bir küçülme olmadan yavaş yavaş saydam hale geldi. Örnekler ksilende temizlendi, 60°C'de 3 saat boyunca erimiş parafinle sızdırıldı ve oda sıcaklığında (RT; 20°C–25°C) katılaşmasına izin verildi. Parafinle gömülü kalp dokusu blokları mikrotom kullanılarak 4–6 μm kalınlıkta kesilip kesimlendirildi. Bölümler 45°C'de tutulan su banyosunda süzülür, cam kaydıraklara monte edilir ve gece boyunca 37°C–40°C sıcaklıklarında kurutulurdu. Slaytlar RT'de düşük nem koşullarında saklanıyor ve histolojik boyama için 1 hafta içinde kullanılıyordu.
Hematoksilin ve Eozin (HE) Boyama
Parafinli gömülü bölümler aşağıdaki şekilde işlenmiştir. Bölümler önce 5 dakika boyunca ksilen I, II ve III'e batırarak deparafin edildi, ardından bir dizi susuz etanol I ve II ile derecelendirilmiş etanol çözeltileri (%95, 90%, %80, %70 ve %50) ile 5 dakika boyunca hidratlandı ve son olarak görünür mum kalıntıları olmadan damıtılmış suda durulandı. Bölümler daha sonra 5 dakika boyunca Harris hematoksiliniyle boyandı ve akan musluk suyunda 1–2 dakika boyunca durulandı. Farklılaştırma asit alkol çözeltisinde yaklaşık 1–2 saniye yapıldı; arka plan soluk göründükten sonra nükleer boyama net bir şekilde belirgin kaldığında son nokta görsel incelemeyle belirlendi. Bunu 37°C–45°C arasında suya batırıp damıtılmış suyla durulama işlemi izledi. Daha sonra, bölümler 40 saniye boyunca alkolle çözünür eosin ile karşı boyanmış, damıtılmış suyla yıkanmış, derecelendirilmiş etanolden kurutulmuş, ksilen içinde temizlenmiş ve son olarak nötr reçine ile donatılmıştır.
Masson Boyama
Parafinli kesitler, ksilen I, II ve III'te sıralı olarak 5 dakika boyunca deparafinize edildi, ardından susuz etanol I ve II ile derecelendirilmiş etanol çözeltileriyle (%95, 90%, %80, %70 ve %50) her biri 5 dakika boyunca hidrasyon yapıldı ve son olarak damıtılmış suyla durulandı. Bölümler %0,5 asetik asite (4°C'ye kadar önceden soğutulmuş) 1 saniye bekletildi, ardından ticari Masson's trikrom boyama setinden alınan fuchsin çözeltisiyle 10 dakika boyandı, ardından 5 dakika fosfomolibdik asitte farklılaştırma ve 3 dakika boyunca anilin mavisiyle karşı boyama yapıldı. Tüm reaktifler aynı ticari kitin bileşenleriydi ve üreticinin talimatlarına göre kullanılıyordu. Boyamadan sonra, bölümler 4°C'ye (yaklaşık 30 saniye) kadar önceden soğutulan asetik asitte üç kez durulandı, derecelendirilmiş etanolden kurtuldu, ksilenle temizlendi ve nötr reçine ile monte edildi.
Metabolomik Analizi için Serum Örnek Koleksiyonu
Altı adet 8 haftalık erkek SD sıçan, yukarıdaki in vivo deneydeki koşullarla aynı koşullarda barındırıldı. Hayvanlar, bilgisayar tarafından oluşturulan rastgele bir randomizasyon yöntemiyle SXQY ile araç kontrol grubuna (damıtılmış su; n = 3 kişi) bilgisayar oluşturulmuş rastgele bir yöntemle yerleştirildi. SXQY grubundaki farelere SXQY 1 mL/100 g vücut ağırlığı dozunda ağızdan verildi, araç kontrol grubuna ise eşit miktarda damıtılmış su verildi. Yedi gün günlük kargajın ardından, yedinci günün son dozu iki katına çıkarıldı. Son uygulamadan sonra hayvanlar 12 saat oruç tutuldu. Fareler, pedal çekilme refleksinin kaybı yeterli anestezi göstergesi olarak doğrulanana kadar izofluran ile anestezi edildi. Kan örnekleri, steril kapiller tüplerle retro-orbital venöz pleksustan alındı ve antikoagülan olmadan hemen 1,5 mL mikrosantrifüj tüplerine aktarıldı. Tüm kan 1 saat RT olarak bekletildi ve serum elde etmek için 1000 × g 15 dakika boyunca 4°C'de santrifüj edildi. Üst şeffaf serum tabakası ile pıhtı arasında net bir ayrım oluştuğunda, süpernatant serum dikkatlice aspirasyon edilip temiz mikrosantrifüj tüplerine aktarıldı. Serum örnekleri, kan giren bileşenlerin analizine kadar −80°C sıcaklığında saklandı.
Metabolomik Analizi için Örnek Ön İşlem
Serum örnekleri, −80°C depolamadan çıkarıldıktan sonra buzda eritildi ve homojenlik sağlamak için kısa bir süre vorteks karışımı (10 sn) yapıldı. 100 μL serum aliquotu 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarıldı, ardından protein çökelmesini indüklemek için 500 μL ekstraksiyon çözücüsü (%20 asetonitril-metanol, dahili standart olarak 1 μg/mL konsantrasyonda 2-kloro-L-fenilalanin içeriyor) eklendi. Karışım 3 dakika boyunca şiddetle girdablandırıldı ve 12.000 × g sıcaklıkta 10 dakika boyunca 4°C'de santrifüjlendi. Ortaya çıkan süpernatantın 470 μL'lik bir kısmı yeni bir tüpe aktarıldı ve düşük ve kontrollü azot akışı altında azot evaporatörü kullanılarak kuruyana kadar buharlaştırıldı. %70 metanol-su içeren 200 μL ile yeniden yapılandırıldıktan ve 1 dakika girdabla yapıldıktan sonra, örnekler 12.000 × g ile 4°C'de 10 dakika boyunca santrifüjlendi ve 180 μL arıtılmış süpernatant, sıvı kromatografi–tandem kütle spektrometrisi (LC-MS/MS) analizi için otosampler şişelerine aktarıldı.
200 μL SXQY örneği aliquotu daha sonra önceden etiketlenmiş 1,5 mL santrifüj tüpüne aktarıldı. Her numuneye dahili standart ekstraksiyon çözeltisi 1:1 (v/v) hacim oranında eklendi. Karışım 15 dakika vorteks karıştırıldı ve 12.000 × g sıcaklığında 3 dakika boyunca 4°C'de santrifüj edildi. Ortaya çıkan süpernatant dikkatlice toplanıp 0,22 μm mikrogözenekli bir zardan süzüldü; böylece görünür parçacıklar olmayan şeffaf bir filtrat elde edildi. Filtrat, ultra performanslı LC-MS/MS (UPLC–MS/MS) analizinden önce otomatik numune alan şişelere aktarıldı ve 4°C'de saklandı.
İç Standart Çözümlerin Hazırlanması
İç standart (2-kloro-L-fenilalanin) stok çözeltisi, referans standardın 1 mg'ını %70 (v/v) metanol-suda 1 mL içinde çözerek hazırlanmış ve 1.000 μg/mL konsantrasyon elde edilmiştir. Bu stok çözeltisi aynı çözücüyle daha da seyreltilerek 1 ppm nihai konsantrasyona sahip çalışan bir iç standart çözelti elde edildi; bu çözelti taze hazırlanmış, 4°C'de saklanmış ve 48–72 saat içinde kullanılmıştır.
UPLC–MS/MS Koşulları
Kromatografik ayrım, tandem kütle spektrometresine bağlı bir UPLC sistemi kullanılarak gerçekleştirildi. Ayrılma, 40°C'de tutulan bir C18 kolonunda sağlandı; akış hızı 0,35 mL/dakika ve enjeksiyon hacmi 4 μL. Mobil faz, %0,1 (v/v) formik asit (A) içeren ultrasaf su ve %0,1 (v/v) formik asit (B) içeren asetonitril içerirdi. Gradient elüsyonu şu şekilde uygulandı: 0,0 dakikada %5 B; doğrusal olarak 2,0 dakikada %25 B, 3,0 dakikada %35 B, 5,0 dakikada %60 B ve 6,0 dakikada %99 B'ye yükseldi; %99 B'de 1,5 dakika tutuldu; 7,6 dakikada %5 B'ye döndü; ve 10,0 dakikaya kadar %5 B'de dengelendi.
Kütle spektrometrik tespiti, pozitif ve negatif iyon modlarında çalışan elektrosprey iyonizasyon kaynağına sahip yüksek çözünürlüklü bir kütle spektrometresi kullanılarak gerçekleştirildi. Püskürtme voltajları pozitif modda 3500 V, negatif modda 3200 V olarak ayarlandı. Kılıf gazı ve yardımcı gaz sırasıyla 30 ve 5 keyfi birim (enstrüman tarafından tanımlanmış) olarak ayarlandı. İyon transfer tüpünün sıcaklığı ve buharlaştırıcı sıcaklığı sırasıyla 320°C ve 300°C olarak tutuldu. Tam MS taramaları, 84–1250 m/z aralığında, 35.000 çözünürlükte ve otomatik kazanç kontrolü (AGC) hedefi 1.0 × 106 ile elde edildi; ardından 17.500 çözünürlükte veriye bağlı MS/MS (top 10) elde edildi; AGC hedefi 2.0 × 105 ve izolasyon penceresi 1.0–1.5 m/z. 30, 40 ve 50 basamaklı normalize çarpışma enerjileri uygulandı. En yoğun 10 öncü iyon parçalanma için seçildi ve dinamik dışlama süresi 3 saniye oldu.
Ham Veri İşleme
Ham kütle spektrometrisi verileri ProteoWizard kullanılarak mzML formatına dönüştürüldü. Analitik güvenilirliği sağlamak için, tüm serum örneklerinin eşit hacimleri karıştırılarak birleştirilmiş kalite kontrol (QC) örnekleri hazırlandı. UPLC–MS/MS analizi boyunca düzenli aralıklarla (her 5–10 analitik numunede bir kalite enjeksiyonu) kalite kontrol edilen ve cihaz kararlılığı, tutma süresi tutarlılığı ve sinyal tekrarlanabilirliği izlenmiştir. Tekrarlanabilirlik, QC örneklerindeki tepe yoğunluklarının göreli standart sapmasına dayanarak değerlendirildi.
Zirve tespiti, tutma süresi düzeltmesi ve zirve hizalanması XCMS paketi kullanılarak gerçekleştirildi. Herhangi bir grupta eksik oranı %50'den yüksek olan özellikler daha fazla analizden çıkarıldı. Sinyal kayma düzeltmesi, analitik çalışma boyunca sinyal kaymasını düzeltmek için R istatistiksel yazılımında uygulanan destek vektör regresyonu (SVR) tabanlı normalizasyon yöntemiyle zirve alanlarına uygulandı.
Metabolit tanımlama, düzeltilen özelliklerin hem MS1 hem de MS2 spektral verilerine sahip yaklaşık 5.000 bileşik içeren, özel ve kamuya açık olmayan bir referans standart kütüphanesi ile İnsan Metabolom Veritabanı (HMDB), Metabolit ve Tandem Kütle Spektrometrisi Veritabanı (METLIN), MassBank ve Global Natural Products Social Molecular Networking (GNPS) gibi kamuya açık spektral veritabanlarıyla eşleştirilerek gerçekleştirildi. doğru kütle uyumu, tutma süresi hizalanması ve MS/MS spektral benzerliğine dayanır. Kütle eşleştirmesi, öncül (MS1) ve parça iyonları (MS2) için ±25 ppm toleransıyla ve ±6 saniye tutma süresi toleransıyla gerçekleştirildi. Kütüphane araması için, öncü iyonlara (Q1) ±25 ppm tolerans ve MS/MS fragmentlerine ±50 ppm tolerans uygulanmış, minimum MS/MS eşleştirme puanı 0,3 olmuştur. Hedefsiz tanımlama için yalnızca kapsamlı tanımlama puanı 0.5'in üzerinde olan metabolitler tutuldu. Nihai puan, parça (0.1), ileri (0.3) ve ters (0.6) eşleşme puanlarının ağırlıklı toplamı olarak hesaplandı. Pozitif ve negatif iyonizasyon modlarında elde edilen veriler, bileşik seviyesinde birleştirildi. Tekrarlanan notalar için, en yüksek kimlik güveni ve en yüksek puana sahip giriş seçildi. Nihai notasyonlar metabolit annotasyon dosyasına derlendi.
Emilen bileşiklerin tanımlanması için kriterler
Emilmiş prototip bileşenler, SXQY ekstraktında ve SXQY ile işlenmiş grupta tespit edilen bileşikler olarak tanımlandı ve ±0,1 dakika tolerans içinde eşleşen tutma süreleri elde edildi. Ayrıca, bu bileşiklerin SXQY ile işlenmiş grupta araç kontrol grubundakinden en az iki kat daha yüksek bir zirve alanı göstermesi veya araç kontrol örneklerinde bulunmaması gerekiyordu.
Emilen metabolitler farklı bir kriter seti kullanılarak tanımlandı. Bu bileşikler SXQY ekstraktında tespit edilmedi ancak SXQY ile işlenmiş grupta bulundu. Kütle spektrometrik özelliklerinin, hidroksilasyon (Δm/z = +15.9949 Da) ve demetilasyon (Δm/z = −14.0157 Da) dahil olmak üzere karakteristik metabolik dönüşümlerle tutarlı olması gerekiyordu. Ayrıca, SXQY ile işlenmiş gruptaki zirve alanın, sinyal kayma düzeltmesinden sonra normalize edilmiş zirve alanlarına dayanarak araç kontrol grubundakinden en az iki kat daha yüksek olması gerekiyordu, aksi takdirde ilgili sinyalin araç kontrol örneklerinde tespit edilemez olması gerekiyordu.
Emilen bileşik ilişkili genlerin geri alınması
Kan girişi bileşenleri, Geleneksel Çin Tıbbı Sistemleri Farmakoloji Veritabanı ve Analiz Platformu'nda (TCMSP; https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.ph; Ocak 2026'da erişildi)20 sorgulandı. TCMSP'de belgelenen bileşikler, ağızdan biyoyararlanılmanın belirlenmiş farmakokinetik eşikleri ≥% 30 ve ilaç benzerliği ≥ 0,1821 üzerinden belirlenmiş farmakokinetik eşiklere dayanarak aday biyoaktif bileşenler olarak taranmıştır. Tutulan bileşiklere karşılık gelen varsayılan hedefler daha sonra alındı ve tüm hedef tanımlayıcılar UniProtveritabanı 22 kullanılarak resmi gen sembollerine standartlaştırıldı.
Hastalıkla İlgili Hedeflerin ve Kesişim Genlerinin Geri Getirilmesi
HF ile ilgili genler, GeneCards veritabanından (https://www.genecards.org/; Ocak 2026'da erişildi) "kalp yetmezliği" kelimesi kullanılarak toplandı ve 10≥ alaka puanına sahip genler daha ileri analiz için seçildi. HF ile ilgili hedefler, Weishengxin platformu (https://www.bioinformatics.com.cn; Ocak 2026'da erişildi) kullanılarak TCMSP'den tanımlanan bileşik ilişkili hedeflerle kesiştirildi. Örtüşen genler kesişim hedefleri olarak tanımlanmış ve sonraki protein-protein etkileşimi (PPI) ağ inşası ile fonksiyonel zenginleştirme analizleri için kullanılmıştır.
Ağ İnşası ve Fonksiyonel Zenginleştirme Analizleri
Belirlenen hedeflerin PPI analizi, STRING veritabanı (http://cn.string-db.org/; Ocak 2026'da erişildi)23 kullanılarak yapıldı; tür Homo sapiens olarak belirlendi ve güven puanı eşiği ≥0.7 oldu. Etkileşim verileri, ağ görselleştirmesi için Cytoscape görselleştirme aracına aktarıldı. Topolojik analiz, görselleştirme aracındaki NetworkAnalyzer eklentisi kullanılarak gerçekleştirildi ve CytoHubbaeklentisi 24,25 kullanılarak hub genleri tanımlandı. Gen Ontolojisi (GO) zenginleştirme analizi, kesişim hedeflerinde, biyolojik süreç (BP), hücresel bileşen (CC) ve moleküler fonksiyon (MF) kategorilerinde gerçekleştirildi. P değeri 0.05 olan GO terimleri anlamlı olarak görselleştirme 26 için seçildi. Kesişim hedefleri, istatistiksel yazılımdaki clusterProfiler paketi kullanılarak Kyoto Genler ve Genomlar Ansiklopedisi (KEGG) yol zenginleştirme analizine tabi tutuldu. P değeri 0.05 < olan yollar istatistiksel olarak anlamlı kabul edildi ve görselleştirme için en iyi 20 zenginleştirilmiş yol seçildi. Bu yollar daha sonra hedef–yol etkileşim ağı27 oluşturmak için kullanıldı.
İstatistiksel Analiz
Veriler ortalama SD ± olarak sunulmaktadır. Veri dağılımının normalliği Shapiro–Wilk testi kullanılarak değerlendirilmiş ve varyans homojenliği analizden önce Levene testi veya Brown-Forsythe testi kullanılarak değerlendirilmiştir. Gruplar arasında istatistiksel karşılaştırmalar, tek yönlü varyans analizi kullanılarak yapıldı ve ardından Tukey'nin GraphPad Prism ile geçirdiği post hoc testi yapıldı. P < 0.05 istatistiksel olarak anlamlı olarak kabul edildi.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Transtorasik Ekokardiyografi
Ekokardiyografik analiz, TAC sıçanlarında belirgin kardiyak remodelasyon ve işlev bozukluğunu ortaya koydu (Şekil 1). Sahte kontrollerle karşılaştırıldığında, TAC LVIDd ve LVPWd'yi anlamlı şekilde artırırken, LVEF belirgin şekilde azaldı. Özellikle, SXQY uygulaması bu patolojik değişiklikleri kısmen tersine çevirdi; bu, LVIDd ve LVPWd'de önemli bir azalma ve TAC grubuna kıyasla LVEF'de...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
SXQY, yirmi yılı aşkın süredir klinik uygulamada yaygın olarak kullanılmakta olup, çeşitli kardiyovasküler hastalıkların tedavisinde etkinliği göstermektedir. Son zamanlarda, kullanımı kalp yetmezliği olan hastalara da genişletilmiştir; ejeksiyon fraksiyonu azalmış ve ejeksiyonfraksiyonu hafifçe azalmıştır 16. Mevcut çalışmada, HF'nin patolojik değişikliklerini taklit etmek için TAC cerrahisi ile bir fare modeli oluşturuldu ve bu arada bazı fareler etkinliğini inc...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yazarlar bu çalışmada çıkar çatışması belirtmemiştir.
Çin-Japonya Dostluk Hastanesi Hayvan Deney Merkezi'ne hayvan bakımı ve cerrahi işlemler konusunda yardımları için teşekkür ederiz.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 2-kloro-L-fenilalanin | Aladdin | C105993-1g | İç standart; ≥ 98% |
| Asetonitril (LC-MS derecesi) | Aladdin | A120771-1L | Ekstraksiyon çözücüsü |
| Asetik asit | Solarbio | G1340 | Masson boyama; 4 derece dereceye önceden soğutulmuş; C |
| Autosampler şişeleri | Çevik | 5190-9590 | LC-MS/MS örnek yüklemesi için |
| Buprenorfin | Cerilliant | B-044S | Analjezik |
| C18 sütunu (1.8 μ m, 2.1 mm & times; 100 mm) | Sular | 176001125 | ACQUITY Premier HSS T3 sütunu |
| Kapiler tüpler, steril | Fisherbrand | 22-362-566 | Retro-orbital kan toplama |
| Santrifüj (soğutulmuş) | KUBOTA | N61196-F000 | Serum ve örnek işleme için |
| clusterProfiler paketi | Biyoiletken | — | KEGG zenginleştirme analizi için R paketi; v4.0.2 |
| Eğimli forseps, steril | HL-SQX | HL-JP | Aort kemer manipülasyonu |
| Cytoscape yazılımı | NHGRI | NIH NHGRI U24 HG012107 | Sürüm 6.4.1 |
| Özel görüntüleme platformu | Fujifilm Görsel Sonics | VisualSonics Vevo 1100 ultrason görüntüleme sistemi | Ekokardiyografi sırasında hayvan konumlandırması |
| Distile su | Yok | Yok | Demleme hazırlığı ve araç kontrolü |
| Elektrikli ısıtma mantosu | Midea | WK2102 | Kaynatma |
| Endotrakeal tüp | CWE Inc., ABD | SAR-1000 | Endotrakeal entübasyon; Bu çalışmada kullanılan endotrakeal tüp, ventilatör konfigürasyonuna entegre olup, ayrı veya bağımsız bir cihaz değildi |
| Etanol (mutlak) | Pekin Yili Fine Chemicals Co., Ltd. | 64-17-5 | Dehidrasyon ve sterilizasyon |
| Formik asit | Aladdin | O930702 | Mobil faz eklemesi |
| Gazlı bez | Solarbio | YA0720 | Kaynatma filtrasyonu; 200– 300 μ m gözenek boyutu |
| GeneCards veritabanı | GeneCards | — | Hastalıkla ilişkili hedef alımı; Erişim tarihi Ocak 2026 |
| GNPS veritabanı | Kaliforniya Üniversitesi San Diego | — | Spektral veritabanı; sürüm 1.3.16, veri Aralık 2025'te arşivlendi |
| GraphPad Prism yazılımı | GraphPad Yazılımı | — | Sürüm 10.1.2; SCR_002798 |
| Isıtıcı ped (termostatik) | Fiziksel Sıcaklık | HP-4M | 37 derece derecede tutulur; C |
| Hematoksilin ve Eosin (H& E) Boyama Kiti | Solarbio | G1120 | Histolojik boyama |
| Yüksek frekanslı dönüştürücü | VisualSonics | Vevo F2 | 18– 40 MHz |
| Yüksek çözünürlüklü kütle spektrometresi | Thermo Fisher Scientific | Q Exactive | Q Exactive HF-X |
| Yüksek çözünürlüklü küçük hayvan ultrason sistemi | Fujifilm Görsel Sonics | VisualSonics Vevo 1100 ultrason görüntüleme sistemi | Vevo 2100 |
| HMDB veritabanı | Wishart Araştırma Grubu / Metabolomik İnovasyon Merkezi, Alberta Üniversitesi | — | Spektral veritabanı; HMDB güncel sürüm 5.0; sürüm 5.0; Ocak 2022 |
| Kurum içi referans standart kütüphanesi | METWARE | — | Kurum içi referans standart kütüphanesinin bileşimi: Kütüphane toplamda 5.000 bileşik içerir ve hem MS1 (öncü) bilgisi hem de MS2 (parçalanma) spektral verilerini içerir. Erişilebilirlik bildirimi: Kütüphane veri formatı .txt. Depolama koşulları: Veritabanı şirketin dahili sunucusunda depolanır. Erişim izinleri: Bu kendi kendine inşa edilen standart kütüphane, şirketin kendi kendine ait bir spektral kütüphanesidir. Yalnızca metabolit tanımlama, sonuç doğrulama ve şirketin kontrollü analitik iş akışlarında kalite izlenebilirliği için kullanılır. Kütüphane halka açık olarak indirilmek için erişilebilir değildir. Müşteriler, bu kütüphane temelinde oluşturulan açıklama sonuçları, sonuç bilgileri ve gerekli alan açıklamalarını elde edebilir. |
| İzofluran | Sigma-Aldrich | 792632 | Solun anestezi |
| Sıvı kromatografi sistemi (UPLC) | SCIEX | ExionLC AD | ExionLC AD |
| MassBank veritabanı | MassBank konsorsiyumu; Japonya Kütle Spektrometrisi Derneği / MassBank Avrupa | — | Spektral veritabanı; sürüm 2024.06; veri Aralık 2025'te arşivlendi |
| Masson' s Trichrome Stain Kit | Solarbio | G1340 | Histolojik boyama |
| Membran filtresi (0.22 μ m) | Beyotime | FF362 | Polietersülfon (PES) |
| METLIN veritabanı | Scripps Araştırma Enstitüsü / Siuzdak Laboratuvarı | RRID: SCR_010500 | Spektral veritabanı; Bu veritabanı sabit bir yıllık sürüm numarası sağlamaz; 2023'te indirilen veriler |
| Metanol (LC-MS derecesi) | Pekin Yili Fine Chemicals Co., Ltd. | 67-56-1 | Ekstraksiyon çözücüsü |
| Mikrosantrifüj tüpleri (1.5 mL) | Corning Yaşam Bilimleri (Wujiang) Şirketi, Ltd. | MCT-150-C | Örnek işleme |
| Mikrotom | Leica | DSC1 | Doku kesitleme |
| Nötr reçine | Solarbio | G8590 | Sürgü montajı |
| Azot buharlaştırıcı/gaz kaynağı | Organomasyon | N-EVAP | Numune kurutma |
| Oftalmik merhem | Aladdin | 08-03-8009 | Anestezi sırasında göz koruması |
| Parafin | Solarbio | YA0010 | Doku gömülmesi |
| Paraformaldehit (%4) | Solarbio | P1110 | Doku fiksasyonu |
| Fosfatla tamponlanmış tuzlu su | DU SEN SEN | DYP1021 | Mendil yıkama |
| Fosfomolibdik asit | Solarbio | G1340 | Masson boyama |
| Povidone– iyot | Solarbio | IP3800 | Cerrahi dezenfeksiyon |
| ProteoWizard yazılımı | ProteoWizard Vakfı | — | Sürüm 3.0.19254 |
| R yazılımı | R Vakfı | — | Sürüm 4.2.2 |
| Döner evaporatör | QINGDAO JINGCHENG ENSTRÜMAN ŞIRKETI, LTD | JC-2LZF | Azaltılmış basınç altında decoction konsantrasyonu |
| İpek dikiş (2-0) | FULAN | NL30RH26A-76 | Aort kasılması |
| Küçük hayvan ventilatörü | CWE Inc., ABD | SAR-1000 | Mekanik havalandırma |
| Sprague– Dawley fareleri (erkek, 8 haftalık) | SPF Bio Co., Ltd. | — | RGD_70508; Lisans No. SCXK(jing)2024-0001 |
| STRING veritabanı | STRING Konsorsiyumu | — | Protein etkileşim analizi; Erişim tarihi Ocak 2026 |
| Destek vektör regresyon normalizasyon paketi/scripti | MetNormalizer | — | Sinyal kayma düzeltmesi; v1.3.02 |
| TCMSP veritabanı | TCMSP | — | Bileşik ve hedef alımı; Erişim tarihi Ocak 2026 |
| UniProt veritabanı | UniProt Konsorsiyumu | — | Gen sembolü standartlaştırması |
| Ultrason jeli | MAGNAFLUX | 25-912 | Ekokardiyografi |
| Ultrasaf su | Laboratuvarda hazırlanmış | — | Mobil faz çözücüsü |
| Vortex mikser | Yalin | VM-ST | Örnek miksajı |
| Su banyosu | Julabo | PURA22 | Bölüm 45 derece ve derecede yüzüyor; C |
| Weishengxin platformu | Weishengxin | — | Hedef kesişim analizi; Erişim tarihi Ocak 2026 |
| XCMS yazılımı | R Vakfı | — | Sürüm 3.16.1 |
| Ksilen | Aladdin | X775162 | Deparafinizasyon |