Bütünleyici Transkriptom Çapında İlişkilendirme Çalışması ve Mendel Randomizasyonu, LYNX1 ve MS4A14'ü osteomielit için terapötik hedefler olarak tanımladı

Summary

Bu çalışma, osteomielit için ilaç hedeflerini sistematik olarak belirlemek amacıyla transkriptom genelinde ilişki analizi ve Mendel randomizasyonunu birleştirir. Genetik veri tabanlarından yararlanarak, yazarlar LYNX1 ve MS4A14'ü ana aday genler olarak tanımladı; kritik moleküler yolları vurguladı ve kemik enfeksiyonlarının yönetimi için hassas terapötik stratejiler geliştirdi.

Abstract

Osteomielit, kemik ve kemik iliğinin derin iltihabıyla karakterize edilen şiddetli bir bulaşıcı hastalıktır ve ağırlıklı olarak Staphylococcus aureus (S. aureus) gibi bakteriyel patojenler tarafından neden olur. Ancak, mevcut tedavi rejimleri, antibiyotik direncinin ortaya çıkması ve tekrarlayan enfeksiyonlar nedeniyle önemli ölçüde engellenmektedir; bu durum güçlü biyofilm oluşumu ve hücre içi bakteriyel kalıcılık tarafından yönlendirilmektedir. Bu nedenle, geleneksel antimikrobiyallerin ötesinde yeni terapötik hedeflerin belirlenmesi acil bir ihtiyaç vardır. Osteomielitin altında yatan nedensel duyarlılık genlerini sistematik olarak belirlemek için transkriptom çapında ilişki çalışması (TWAS) ile özet tabanlı Mendel randomizasyon (SMR) analizini birleştiren bütünleşik bir hesaplama yaklaşımı uygulandı. Büyük ölçekli genetik varyantlar, dokular arasında gen ifadesini tahmin etmek için araçsal değişkenler olarak kullanıldı ve bu hedefler ile hastalık riski arasındaki nedensel ilişkilerin araştırılmasına olanak sağladı. Bütünleşik çerçeve, LYNX1 ve MS4A14'ü ana aday genler ve potansiyel terapötik hedefler olarak tanımladı. Özellikle, LYNX1 osteomielite karşı artan yatkınlıkla ilişkilendirilirken, MS4A14 potansiyel koruyucu özellikler gösterdi. Bu bulgular, bu genlerin kemik enfeksiyonu sırasında konak bağışıklık yanıtı ve inflamatuar modülasyondaki düzenleyici rollerini vurgulamaktadır. Bu çalışma, genom çapında ilişki bulguları ile biyolojik yorumlama arasındaki boşluğu kapatarak osteomielitin genetik temelinin anlaşılmasını ilerletiyor ve konak savunmasını artırmak ve terapötik direnci aşmak için hedefli hassas tıp stratejilerinin geliştirilmesini desteklemektedir.

Introduction

Osteomielit, kemik ve kemik iliğinde derin iltihaplanma ile karakterize edilen şiddetli bir bulaşıcı hastalıktır. Genellikle bakteriyel istila ile başlar; Staphylococcus aureus (S. aureus), akut ve kronik hematojen sunumlarında yaygın bir patojendir ^1,2. S. aureus belirgin olsa da, osteomielit genellikle polimikrobiyaldir ve S. aureus'un tek başına yok edilmesi, yetiştirilemeyen mikroorganizmaların ve dinamik biyofilm etkileşimlerinin devam etmesi nedeniyle enfeksiyonu her zaman çözmez ^3,4. Hassas konaklarda patojenler, makrofajlarda hücre içi kalıcılık ve yoğun biyofilm oluşumu gibi karmaşık kaçınma stratejileri kullanır. Bu biyofilmler, hücre dışı DNA, polisakkaritler ve özel proteinlerden oluşur ve konak bağışıklık savunmalarına dirençli güçlü fiziksel engeller oluşturur ve geleneksel antimikrobiyal ajanların nüfuzunu^{sınırlar 5,6}. Sonuç olarak, klinik yönetim genellikle agresif cerrahi debridman ve uzun süreli antibiyotik tedavisi içerse de, dirençli biyofilmler ve polimikrobiyal toplulukların varlığı tedavi etkinliğini önemli ölçüde azaltır ve bu da uzun süreli morbidite ve tekrarlayan enfeksiyonlara^{yol açar 7,8}. Konakçı-patojen etkileşimlerinin altında yatan moleküler mimarinin aydınlatılması, yeni terapötik hedeflerin belirlenmesi için kritik^{olmaya devam eder 9}.

Genom çapında ilişki çalışmaları (GWAS), hastalık yatkınlığıyla ilişkili çoklu genetik lokusları tespit ederek osteomielitin anlaşılmasını^{ilerletmiştir 10}. Ancak, katı çoklu test eşikleri ve istatistiksel güç ile örneklem büyüklüğündeki sınırlamalar nedeniyle, osteomielit hassasiyetini etkileyen birçok kritik lokusun tespit edilmemesi^{muhtemeldir. 7}. Ayrıca, GWAS bulgularının yorumlanması hâlâ zordur; çünkü tanımlanan varyantların çoğu kodlamayan veya intergenik bölgelerde yer almaktadır; bu da protein yapısındaki doğrudan değişikliklerden ziyade gen ifadesi üzerinde düzenleyici etkiler olduğunu öne^{sürmektedir 11}. Ayrıca, birincil GWAS verileri doğrudan doku özbaşılığına sahip değildir; bu da bu varyantların etkilerini gösterdiği hücresel bağlamları belirlemek için tamamlayıcı aşağı akış analizleri gerektirir. Transkriptom çapında ilişki çalışmaları (TWAS), referans panellerinden genetik olarak tahmin edilen gen ifadesini mevcut GWAS veri setlerine entegre ederek bu sınırlamaları ele alır ve birden fazla dokuda fonksiyonel olarak ilgili hastalıkla ilişkili genlerin sistematik olarak tanımlanmasını^{sağlar 12}.

Nedensel çıkarımı güçlendirmek için, Mendel randomizasyonu (MR) genetik varyantları araçlı değişkenler olarak kullanır ve döllenme sırasında alellerin rastgele tahsisini kullanarak karıştırıcı ve nedenselliği tersine^{çevirir 13,14}. İfade nicel özellik lokusları (eQTL) analizleri, GWAS varyantlarını gen^{transkripsiyonu 15} ile daha da ilişkilendirirken, özet tabanlı Mendel randomizasyonu (SMR) GWAS ve QTL veri setlerini entegre ederek nedensel genleri önceliklendirir ve heterojenlik testiyle bağlantı dengesizliğinden kaynaklanan ilişkilerden ayırır^.

Bu çalışma, özellikle osteomielite odaklanan entegre bir TWAS ve MR çerçevesinin ilk uygulamasını temsil etmektedir ve GWAS bulguları ile klinik olarak uygulanabilir içgörüler arasındaki farkı ele almaktadır. Deneysel transkriptomik veriler büyük ölçekli popülasyon genetik verileriyle birleştirilerek, hastalık hassasiyeti genleri sistematik olarak haritalandı ve nedensel ilişkiler çıkarıldı. Bu bütünleşik strateji, osteomielite karşı konak direncinde yer alan daha önce tanınmamış moleküler yolları ortaya çıkarmayı ve hassas terapötik geliştirme için aday hedefleri belirlemeyi amaçlar.

Protocol

Mendel Randomizasyonu (MR) ve Transkriptom Genelindeki İlişkilendirme Çalışması (TWAS) analizlerinde kullanılan tüm özet istatistikler, daha önce yayımlanmış, kimliği yok edilmiş veri setlerinden tamamen türetilmiştir. Orijinal çalışmalar için etik onay ve bireysel onay, ilgili yayınlarda belgelenmiştir. Sonuç olarak, bu veri madenciliği çalışması için ek etik onay Zhejiang Eyaleti Tongde Hastanesi Kurumsal İnceleme Kurulu tarafından kaldırıldı (Zhe Tongde Lunshen 2024 [Yan] No. 028-JY). Bu araştırma için kullanılan araçlar Materyaller Tablosu'nda listelenmiştir.

1. RNA-dizisi veri edinimi ve işlemesi

Transkriptom verileri, memeli türler arasında doğuştan gelen bağışıklık yollarının korunmasının ilk doğrulama için değerlendirilmesi amacıyla Gen İfadesi Omnibus (GEO) veritabanından (GSE272198) alınmıştır^. Kemik iliği kaynaklı makrofajlar (BMDM) 1 saat boyunca S. aureus (enfeksiyonun çokluğu, MOI = 10) ile enfekte edildi, ardından lizostafin (20 μg/mL) ve gentamisin (50 μg/mL) ile ekstrasellüler bakterileri uzaklaştırmak için tedavi edildi. Fosfatla tamponlanmış tuzlu (PBS) üç yıkamadan sonra, BMDM'ler 24 saat kültürlendi, toplam RNA ekstraksiyon reaktifinde lizedildi ve sıralandı.

RNA kalitesi, bütünlüğü sağlamak için otomatik bir elektroforez sistemi kullanılarak değerlendirildi. Kütüphaneler üç bağımsız deneyden hazırlanmış ve yüksek verimli bir dizileme platformunda sıralanmıştır. Ham okumalar, STAR (v2.7.10a) kullanılarak fare genomuna (GRCm38, mm10) hizalandı. Farklı şekilde eksprese edilen genler (DEG) DESeq2 (v1.38.0) kullanılarak tanımlanmıştır. Yanlış pozitifleri azaltmak için, istatistiksel anlamlılık 0,05 ve |log₂ katlama değişimi < ayarlanmış p-değeri (FDR) olarak tanımlanmıştır. > 1. Gen Ontolojisi (GO) analizi clusterProfiler (v4.6.0) kullanılarak yapıldı, Gen Seti Zenginleştirme Analizi (GSEA) ise GseaVis (v0.0.5) kullanılarak gerçekleştirildi. Isı haritaları, R (v4.2.0) içindeki pheatmap paketi (v1.0.12) kullanılarak oluşturuldu.

TWAS analizi

Tam kan RNA dizileme ve tam genom dizileme (WGS) verileri, Genotip-Doku İfadesi (GTEx) projesinden (V8)¹⁸ alındı. Önceden eğitilmiş gen ifade modelleri kamuya açık bir depodan (https://doi.org/10.5281/zenodo.3842289) kullanılmıştır. TWAS için osteomielit özet istatistikleri, 2.336 vaka ve 473.264 kontrol^12'den oluşan FinnGen konsorsiyumundan alındı.

TWAS üç algoritma kullanılarak gerçekleştirildi: eklem dokusu atama (JTI), PrediXcan¹⁹ ve UTMOST ^12,20. JTI, tahmin doğruluğunu optimize etmek için gen ifadesi benzerliğini ve epigenetik kromatin erişilebilirliğini tahmin eder. PrediXcan, beş kat çapraz doğrulama ile elastik net regresyon uygularken, UTMOST, seyrek grup LASSO kullanarak çoklu doku ifade verilerini kullanarak doğruluğu artırır. Zhou ve ^ark.12 tarafından tanımlanan değiştirilmiş UTMOST çerçevesi, tarafsız tahmin için hiperparametreleri standartlaştırır. Kararlı çapraz doğrulama puanlarına sahip genler—önceden tanımlanmış korelasyon katsayısı r > 0.05 21 ve öngörücü anlamlılık p < 0.05²¹—atılabilir olarak korundu. Tam kan transkriptom modelleri, 1000 Genomes referans veri setinden SNP kovaryans matrisleri kullanılarak oluşturuldu.

Tahmin edilen gen ekspresyonu ile osteomielit riski arasındaki ilişkiler daha sonra analiz edildi. Çoklu testleri hesaba katmak için, TWAS için istatistiksel anlamlılık esas olarak Yanlış Keşif Oranı (FDR) eşiği olan < 0.05 kullanılarak tanımlanmıştır. Bu çok aşamalı çalışmanın hipotez üretme doğası göz önüne alındığında, önerici (nominal eşik) p < 0.05'i karşılayan lokuslar da aşağı akış Mendel randomizasyonu (SMR) ve kololokalizasyon analizleri için önceliklendirildi. Bu bütünleşme stratejisi, öncelikli adayların sağlamlığını sağlamak için çoklu omik çapraz doğrulamaya (TWAS + SMR) dayanarak potansiyel düzenleyici sürücülerin yakalanmasını en üst düzeye çıkarmayı amaçlar.

SMR Analizi

Bu çalışma, Epidemiyolojide Gözlemsel Çalışmaların Raporlanmasının Güçlendirilmesi (STROBE)^{rehberlerine uydu 22}. Mitokondriyal işlevsizliğe genetik yatkınlığı temsil eden bir fenotipi hesaplamalı olarak tanımlamak için (analiz amaçları için bundan sonra "mitodiler" olarak adlandırılacaktır), bilinen tüm mitokondriyal genlere karşılık gelen transkriptler MitoCarta3.0^{veritabanından çıkarılmıştır 23}. Bu gen seti, sonraki polijenik risk tahmini için önceden tanımlanmış, biyolojik bilgili bir temel olarak hizmet etti. "Mitodys" ile ilgili tüm sonraki fonksiyonel yorumlar bu hesaplamalı çıkarımdan türetilir ve öngörücü ve hipotez üreten olarak değerlendirilmelidir.

İfade nicel özellik lokusları (eQTL) cihazları, kodlama dizilerinin (cis-eQTL) 1000 kb içindeki varyantlar kullanılarak oluşturuldu. Özet istatistikler eQTLGen Konsorsiyumu ve GTEx V8^24'ten alınmıştır. Toplamda 8.932.843 SNP, 1.013 mitodisle ilgili transkriptle bağlantılı olarak genom genelinde anlamlılık eşiği P < 5E-8 temelinde seçildi. Osteomielit sonuçları için başlangıç GWAS istatistikleri FinnGen^20'den alındı.

Özet veri tabanlı Mendel Randomizasyon (SMR) analizi, gen ifade özellikleri ile osteomielit sonuçları arasındaki pleiotropik ilişkileri tahmin etmek için varsayılan parametrelerle SMR (sürüm 1.0.3) kullanılarak gerçekleştirildi. Nedensel etki beta_mitodys–osteomielit, mitokondriyal disfonksiyonun osteomielit üzerindeki tahmini log-olasılık etkisini temsil eder ve şu şekilde hesaplanır:

Olasılık oranları (OR'lar), standart gen ifade seviyelerindeki bir birim doğal logaritmik artış başına değişen değişimi temsil eder. Ortak lokalizasyon bağımlı aletlerde heterojenlik (HEIDI) testi kullanılarak daha fazla değerlendirildi.

Results

Toplu RNA dizileme ve fonksiyonel zenginleştirmelerin karakterizasyonu

Enfekte olmamış (kontrol) ve S. aureus enfekte olan BMDM'leri izole etmek için kullanılan metodolojiye uygun olarak, deneysel grupta 3.775 DEG'ler tespit edildi; bunların 1.686'sı yukarı regule edildi, 2.089'u ise aşağı regülasyonlu genlerden oluştu. GO analizi, doğuştan gelen bağışıklık yanıtının pozitif regülasyonu (GO:0045089) ve aktivasyonu (GO:0002218) dahil o...

Discussion

TWAS ve SMR analizlerini translasyonel veri setleri arasında entegre ederek, bu çalışma osteomielit fenotipleriyle ilişkili temel genetik lokus ağını belirlemiştir. LYNX1 ve MS4A14'ün aday gen hedefleri olarak tanımlanması, transkriptomik bağlamı dahil ederek geleneksel GWAS bulgularının ötesinde mekanik bir içgörü sağlayacak önemli bir katkıyı temsil etmektedir. Bu bütünleşik yaklaşım, hassas tıp stratejilerinin ciddi kemik enfeksiyonlarının klinik yönetimini ilerletme potansiyelini vur...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
clusterProfiler	Guangchuang Yu's Team (Sun Yat-sen University)	NA	Diferansiyel olarak eksprese edilen genlerin Gene Ontology (GO) fonksiyonel zenginleştirme analizi için kullanılır.
DESeq2	Bioconductor Project (Open Source)	NA	Diferansiyel olarak eksprese edilen genleri (DEGs) tanımlamak için kullanılır
GSEA / GseaVis	Broad Institute / Open Source Community	NA	Koordineli olarak eksprese edilen gen setlerini tanımlamak için Gen Set Zenginleştirme Analizi (GSEA) için kullanılır. GseaVis muhtemelen görselleştirme için kullanılır.
HEIDI (Heterogeneity in Dependent Instruments) test	SMR yazılımındaki entegre işlev	NA	SMR'de gözlenen ilişkinin, paylaşılan bir nedensel varyanttan ziyade bağlantı dengesizliği tarafından yönlendirilip yönlendirilmediğini test etmek için kullanılır. P_HEIDI > 0.05 büyük heterojenite olmadığını gösterir
JTI (Joint-Tissue Imputation)	Zhou ve ark. (Open Source Model)	NA	Gen ekspresyonu benzerliğini ve epigenetik kromatin erişilebilirliğini optimize etmek için tahmin doğruluğunu optimize eden bir TWAS algoritmasıdır.
pheatmap	Raivo Kolde (R paketi)	NA	Veri görselleştirmesi için diferansiyel olarak eksprese edilen genlerin ısı haritalarını oluşturmak için kullanılır.
PrediXcan	Gamazon ve ark. (Open Source Model)	NA	Beş katlı çapraz doğrulama ile elastik ağ regresyonu uygulayan ve hastalık riski ile ilişkilendirmeyi test etmek için gen ekspresyonunu tahmin etmek için bir TWAS algoritmasıdır.
SMR (Summary-data-based Mendelian Randomization)	Fudan Üniversitesi'nden bir ekip tarafından geliştirilmiştir (Open Source Yazılım)	NA	Gen ekspresyonu ve osteomiyelit riski arasındaki nedensel ilişkileri araştırmak için özet tabanlı Mendelian rastgeleştirme analizi gerçekleştirmek için kullanılır. Versiyon 1.0.3 kullanılmıştır.
STAR	Alexander Dobin (Cold Spring Harbor Laboratory)	NA	RNA-seq okumalarını referans genoma (fare genomu GRCm38/mm10) hizalamak için kullanılır.
UTMOST	Hu ve ark. (Open Source Model)	NA	Çok doku ekspresyon verilerini kullanarak tahmin doğruluğunu artıran bir TWAS algoritmasıdır.