Tek ve Tekrarlayan Döner Kapalı Baş Beyin Yaralanması Fare Modeli

Özet

Rotasyonel beyin sarsıntısı için tekrarlanabilir bir fare modeli tanımlanır ve açık yapısal beyin hasarı olmadan tek veya tekrarlayan etkilerden sonra nörovasküler, iltihap ve davranışsal değişiklikler dahil olmak üzere ince fonksiyonel ve biyolojik temelleri incelemek için çok yönlü bir yöntem sunar.

Özet

Sarsıntı beyin hasarı (CBI), klinik sarsıntının altında yatan patofizyolojik substrat, hastaların bir alt kümesinde uzun vadeli nörolojik bozulma potansiyeline sahip sıkça ancak yeterince anlaşılamayan bir durumdur. Özellikle tekrarlayan CBI, yani temas sporlarında, kalıcı bilişsel eksiklikler ve ilerleyici nörodejenerasyonla (örneğin, kronik travmatik ensefalopati, CTE) ilişkilendirilmiştir. Bu bilgi boşluğunu gidermek için, CBI'nın temel biyomekanik ve patolojik özelliklerini özetleyen kapalı baş rotasyonel beyin yaralanmasının tekrarlanabilir bir fare modeli oluşturuldu. Standart bir darbeyi sağlam kafatasına indirmek için stereotaktik olarak yönlendirilen elektromanyetik darbe cihazı kullanıldı. Kafatası ve bitişik beyin dokusundaki odak gerilimi azaltmak için, darbe ucu özel yapımı silikon bir kapakla donatıldı. Bu konfigürasyon, düşük hayvanlar arası değişkenlikle baş döndürülmesini güvenilir şekilde indükte ederken kafatası kırıklarını veya mikroskobik doku hasarlarını önlemiştir. Fizyolojik nöronal ve damar aktivitesini korumak ve derin anestezinin potansiyel nöromodülatör etkilerini önlemek için, hafif sedasyon altında bilinçli farelerde α2-agonist medetomidin kullanılarak beyin hasarı indüklenmiştir. İndüklenen çarpışmalar, başlık pozisyonuna yalnızca küçük bir değişkenlik gösteren tekrarlanabilir dönme baş hareketine yol açtı. Yapısal beyin bütünlüğü, in vivo T2 ağırlıklı manyetik rezonans görüntüleme kullanılarak değerlendirildi ve ex vivo histolojik analizlerle doğrulandı; doku bozulması, kontüzyon veya mikro kanamalar belirtilmedi ancak mikrovasküler arayüzde hafif ve yaygın bir bozulma görüldü. Bu rotasyonel kapalı baş beyin hasarı modeli, açık yapısal patoloji yokluğunda meydana gelen ince nörovasküler, iltihap ve kan-beyin bariyeri değişikliklerinin uzunlamasına araştırmaları için sağlam bir deneysel platform sağlar. Uygulaması, klinik sarsıntının patofizyolojisi ve tekrarlayan yaralanmanın olası nörodejeneratif sonuçları hakkında mekanik içgörüler sağlar ve böylece acil ihtiyaç duyulan klinik biyobelirteçlerin geliştirilmesini kolaylaştırır.

Giriş

Travmatik beyin hasarı (TBI), tüm yaş gruplarında uzun vadeli engelliliğin önemli bir nedeni olmaya devam etmektedir; ergenler ve genç yetişkinler orantısız şekilde ^{etkilenmiştir 1,2,3}. TBI'ların büyük çoğunluğu hafif (mTBI) olarak sınıflandırılır; klinik düzeyde genellikle sarsıntı olarak adlandırılır. Sarsıntı, tanım gereği geleneksel nörogörüntüleme ile tespit edilebilen açık yapısal beyin hasarıyla ilişkilendirilmese de, artan kanıtlar altta yatan hasar mekanizmasının—burada sarsıntı beyin hasarı (CBI) olarak adlandırılan—ayrı ve klinik olarak önemli bir patofizyolojik varlık oluşturduğunu göstermektedir.

Özellikle, yakın zamansal ardışıklıkta gerçekleştiğinde, temas sporlarında ve askeri ortamlarda sıkça karşılaşılan tekrarlayan CBI, kalıcı bilişsel gerileme, nöropsikiyatrik semptomlar ve kronik travmatik ensefalopati (CTE) gelişimiyle ^{ilişkilendirilmiştir1,2,3}. İlk yaralanmanın hafif doğası ile uzun vadeli nörolojik sonuçlar potansiyeli arasındaki bu belirgin fark, hem klinik tanı hem de mekanik araştırmalar için büyük bir zorluk oluşturmaktadır.

Ortaya çıkan kanıtlar, nörovastik ve nörogliyal arayüzdeki ince ama kalıcı değişikliklerin ilgili bir hastalık mekanizması^{oluşturduğunu göstermektedir 4}. Bu değişiklikler, kan-beyin bariyeri (BBB) bütünlüğünü, mikrovasküler yapıyı, glial aktivasyonu, nöron uyarılabilirliğini ve endojen onarım süreçlerini kapsıyor; bu da hücresel düzeyde patofizyolojiyi, özellikle tekrarlayan^CBI 5,6,7,8 sonrası gözlemlenen uzun vadeli fonksiyonel ve davranışsal eksikliklerle ilişkilendirebilir . Topluca, bu tür değişiklikler, CBI'dan sonra gecikmiş fonksiyonel ve davranışsal eksikliklere potansiyel katkı sağlayanlar olarak giderek daha fazla kabul edilmektedir. Ancak, dağınık ve çok yönlü doğası, mekanik bir anlayışı karmaşıklaştırmakta ve şimdiye kadar hedefe yönelik terapötik müdahalelerin geliştirilmesini engellemiştir.

Patofizyolojik zincirlemenin temel yönlerini özetleyen preklinik modeller, bu mekanizmaların incelenmesi ve yeni terapötik yolların belirlenmesi için kritik araçlardır. Deneysel TBI modelleri çok çeşitli olmalarına rağmen, çoğu orta ve ağır yaralanmaları taklit etmek veya odak yapısal hasara dayanmak için^{tasarlanmıştır 9,10,11}. Buna karşılık, CBI^5'in karakteristik yaralanma mekanizması için hayvan modelleri şaşırtıcı derecede eksiklik yaşamaktadır. Çoğunlukla, "hafif" olarak etiketlenen bir beyin travması, sert bir şekilde sabitlenmiş başa odaklanan bir darbe veya kraniotomiden sonra doğrudan kortikal darbeyle indüklenir; bu, insanlarda sarsıntıyı tanımlayan yaygın, hızlanma-yavaşlamaya dayalı yaralanma mekanizmasına köklü şekilde^{çelişmektedir 6,7}. Bu yaklaşımlar yaralanma parametreleri üzerinde hassas kontrol sağlasa da, gerçek dünya sarsıntılarının dinamiklerini taklit edebilme konusundaki sınırlı yetenekleri, translasyonel önemlerini azaltır.

Bu sınırlamaları aşmak için, tekrarlanabilir ve yayılan kapalı beyin hasarını indükleyen çeşitli yöntemler^mevcuttur 12,13,14. Bu kavramlar üzerine inşa edilerek ve teknik karmaşıklığı en aza indirmeyi hedefleyerek, diğer deneysel travma modellerinde (örneğin, kontrollü kortikal darbe, CCI) sıklıkla kullanılan ticari olarak kullanılabilir elektromanyetik darbe cihazı kullanılarak farelerde kontrollü bir rotasyon yaralanması modeli geliştirildi. Serbest hareket eden başa tekrarlanabilir bir etki sağlayarak, bu yaklaşım yapısal bütünlüğünü korur ve insan sarsıntısının biyomekanik özelliklerine yakın koşullarda tek ve tekrarlayan CBI sonrası nörovasküler, nörogliyal ve fonksiyonel değişikliklerin uzunlamasına incelemesini mümkün kılar.

Uzunlamasına davranış değerlendirmesi, in vivo görüntüleme ve ex vivo histoloji ile birleşen bu model, tek veya tekrarlayan etkiler sonrası nörovastarkar, glial ve davranışsal değişiklikleri incelemek için çok yönlü ve erişilebilir bir platform sunar. Bu nedenle, CBI'nın ince ikincil hastalık mekanizmalarını incelemek, translasyonel vekil parametreleri belirlemek ve klinik olarak ilgili deneysel ortamda potansiyel terapötik müdahaleleri değerlendirmek için oldukça uygundur.

Protokol

Tüm hayvan prosedürleri Alman Hayvan Refahı Yasası'na uygundu ve kurumsal ile devlet otoriteleri (LANUV Nordrhein-Westfalen; AZ 81-02.04.2020.A058). Deneyler ARRIVE yönergelerine uygun olarak gerçekleştirildi. Şematik bir iş akışı Şekil 1'de detaylandırılmıştır. Bu protokol, yapısal, davranışsal ve nörovasküler doğrulama sonuçlarından oluşan belirlenmiş bir panelle kanıtlandığı gibi, sarsıntı beyin hasarını güvenilir şekilde indükler (Şekil 2). Bu çalışmada kullanılan tüm materyaller Materyaller Tablosu'nda detaylandırılmıştır.

1. Genel Hususlar

NOT: Fareler standart koşullarda (12 saat ışık/karanlık döngü) sosyal olarak barındırıldı ve yiyecek ve suya ima kadar imkansız erişim sağlandı. Fareler, ameliyattan önce en az 7 gün deney tesisine alıştırıldı. Bu pilot çalışmada toplam 40 fare kullanıldı ve her deneysel gruba 10 hayvan ayrıldı (kontrol grubu olarak sahte, tek CBI grubu, yüksek frekansta tekrarlayan CBI ve düşük frekanslı grupta tekrarlayan CBI). Fare başını farenin önünde sabit bir konumda tutarak, göz hizasında yüksek hızlı bir kamera sistemi kurun (örneğin, 10 cm). Denemeler arasında tutarlılığı sağlamak için kamera konumu ve yönelimini sabit tutun. Bu çalışmada 240 kare (fps) hızında ve 1080px çözünürlükte bir GoPro Hero6 kullanıldı. Tanımlanan kinematik analizler için açık kaynaklı hareket analiz yazılımı Kinovea (sürüm 2025.2.0) kullanılmaktadır.

2. Analjezi ve anestezi indüksiyonu

1. Elektromanyetik darbe makinesi için stereotaktik çerçeve ve bağlantı dahil olmak üzere kurulumu hazırla.
2. Travma indüksiyonundan iki gün önce içme suyu ile Tramadol (1 mg/mL) uygulanır ve (son) ameliyattan sonra üç gün devam eder.
3. Anestezi, azot oksit/oksijen karışımında izofluran kullanılarak (O₂ 30%, N₂O 70%) ve indüksiyon odasında %4–4,5 isofluran ile indüksiyon odasında uygulanır.
4. Parmak sıkıştırma refleksi kullanarak cerrahi toleransı değerlendirin. Çekilme tepkisi gelmediğinde devam edin.
5. Fareyi indüksiyon odasından çıkarın ve stereotaktik çerçeve içindeki ısıtma pedine yerleştirin. Çekirdek sıcaklığını fiber-optik rektal prob kullanarak 37 ± 1.0 °C arasında tutun. Göz merhemi uygulayarak gözleri kurumaktan koruyun.
6. Stereotaktik düzene bağlı burun konisi aracılığıyla izofluran %2,0–2,5 oranında verilerek anestezi sürdürülür.

3. Kafatasının hazırlanması

1. Fareyi stereotaktik çerçeve içinde belirli kulak çubukları kullanarak sabitleyin.
2. Saç derisini tıraş edin ve cerrahi bölgeyi alkol bazlı antiseptikle iyice dezenfekte edin.
3. Bupivakain (0,1 mg/kg) deri altı enjeksiyonuyla lokal anestezi uygulanır.
4. Cilt kesisinden önce parmak sıkıştırma refleksini yeniden değerlendirin. Sadece anestezi derinliğinde tutarlı bir şekilde yoksunluk tepkisi olmadığı sürece devam edin.
5. Kafatasını açığa çıkarmak için yaklaşık 7 mm deri kesisi yapın.
6. Bregma ile Lambda arasındaki sağ parietal kemiğin üzerine dikkatlice kafatasını ortaya çıkarın.
7. Stereotaktik çerçevenin kafatasına dik konumda olduğundan emin olun; dikey eksen başlık yüzeyine göre 90° açıda konumlandırılır.
8. Stereotaktik tutucuya bir işaret pimi takın ve doğrudan Bregma'ya ortalayın.
9. Tüm stereotaktik koordinatları sıfırlayın ve işaretleyici pinini önceden tanımlanmış anteroposterior (AP) ve mediolateral (ML) koordinatlarına (modelimizde AP 0.5, ML -2.5) taşıyor. Hedef noktayı suya dayanıklı keçe kalem ile işaretleyin.

4. Analjezi ayarlanması

1. Kulaklıktan fareyi bırakın.
2. Medetomidin'i deri altına enjekte edin (0,5 mg/kg) ve isofluranı kademeli olarak %<0,5 %'e indirin.
3. Anestezi %0,5 izofluran < tutarken, solunum ve vücut sıcaklığını sürekli izleyin.
4. Bu koşullar altında 10 dakika boyunca denge sağlanarak anestezi sabit bir duruma ulaşın ve nöron ağı aktivitesini koruyun. Solunum hızı, refleks yanıtlarının olmaması ve stabil vücut sıcaklığı (37 ± 1,0 °C), hayvanlar arasında karşılaştırılabilir anestezi derinliği sağlamak için standart göstergeler olarak kullanıldı.

5. Darbe indüksiyonu

NOT: Deneyden önce, hayvan modeli için ticari olarak bulunan polietilen (PE) köpük boru yalıtımından bir başlık tutucu üretin; bu kapalı hücreli, çapraz bağlanmamış polimer köpüktür; bu kapalı hücreli, çapraz bağlanmamış bir polimer köpüktür; bu cihaz aşağı doğru ivmelenmeyi sınırlayırken dönme hareketine izin verir. Ayrıca, silpuran'dan özel yapımı 5 mm küresel darbe ucu üretin (oran 1:1; sertlik 830 kPa).

1. Rektal sıcaklık probunu çıkarın ve izofluran dağıtımını durdurun, ardından fareyi baş tutucuya yere pozisyona yerleştirin.
2. Özel yapımı silikon kapağı ticari olarak bulunan darbe ucuna takın.
3. Elektromanyetik darbe cihazını stereotaktik tutucuya monte edin ve cihazın kafatası yüzeyine göre 10° açıda konumlandırıldığından emin olun.
4. Darbe ucu kafatasında önceden belirlenmiş hedef bölgenin üzerine hizalanır.
5. Darbe ucunu hafifçe kafatası yüzeyine temas edene kadar uzun pozisyonda indirin.
6. Darbe ucu geri çekilir ve istenen girinti derinliğine (yani bu deneylerde 3 mm) kafatası yüzeyine doğru ilerledir. Kontrol hayvanları için ucun alçaltılması bırakılmayın ve uç miktarı aynı miktar artırın.
7. Video kaydına başlayın. Kontrol anahtarı üzerinden elektromanyetik sürgü tetikleyerek 5 mm/s hız ve 0,1 ms darbe süresiyle tek bir dönme darbesi verebilirsiniz.
8. Çarpma işlemi tamamlandıktan hemen sonra darbeyi geri çekin.
9. Antagonist atipamazol (0,5 mg/kg, s.c.) kullanılarak medetomidin anestezisini antagonize edin.

6. Etki sonrası değerlendirme ve yara kapanışı

1. Fareyi sırtüstü pozisyona getirin.
2. Hayvanın yatağa dönmesi için gereken süreyi kaydederek düzeltme refleksini değerlendirin.
3. Anestezi azotu oksit/oksijen karışımında (O₂ 30%, N₂O 70%) ve %4 izofluran ile yeniden indük edilir.
4. Fareyi indüksiyon odasından çıkarın ve stereotaktik çerçevenin yanındaki ısıtma pedine yerleştirin. Çekirdek sıcaklığını fiber-optik rektal prob kullanarak 37 ± 1.0 °C arasında tutun.
5. Kulak çubuklarıyla fareyi stereotaktik çerçeveye sabitleyin.
6. Deri kesi, kendi kendine emici filamentlerle kesilmiş dikişler kullanarak kapatın (örneğin, Polyglactin 910, 6-0).
7. Fareyi ısıtıcı bir kutuya aktarın ve bilinç tamamen iyileşene kadar monitasyon yapın.
8. Hayvanı ev kafesine geri götür.

7. Tekrarlanan etki paradigması

1. Deneysel tasarıma göre fareleri sahte, tek veya tekrarlanan CBI gruplarına atayın.
2. Tekrar eden yaralanma grupları için, sonraki CBI seanslarını belirli aralıklarla (örneğin, her 48 saatte bir) planlayın.
3. Her sonraki CBI'dan önce, bölüm 3.1'de tanımlandığı gibi içme suyunda tramadol ile ameliyat öncesi analjezi uygulanır.
4. 3–6. bölümlerde belirtilen aynı prosedürü takip eden tekrar anestezi, stereotaktik işaretleme ve çarpma işlemleri; bunlar arasında bupivakain ile lokal anestezi (0,1 mg/kg, s.c.), medetomidin (0,5 mg/kg, s.c.) ile izofluran < 0,5%, stereotaktik hedefleme ve AP 0,5 ve ML −2,5 ile Bregma'ya göre ve elektromanyetik darbe kullanılarak rotasyonel sarsıntı darbesi (girinti derinliği 3 mm, hız 5 mm/s, darbe süresi 0,1 ms, kafatası yüzeyine göre 10° açı).
5. Tutarlı konumlandırma (dönme hareketini sağlayan polietilen köpük başlık tutucuya yere yere yerleştirme), aynı darbe parametreleri (açı, derinlik, hız ve süre) ve standart peri ve sonrası koşullar (atipamazol ile medetomidin antagonizasyonu (0,5 mg/kg, s.c.), anestezi yeniden indüksiyonu (%4 isofluran O₂ %30/N₂O %70) ve sıcaklık ±kontrolü gibi tekrarlanan seanslar boyunca hayvanlar ve zaman noktaları arasında tekrarlanabilirliği korumak için sağlanır.
6. Hayvanlar ve zaman noktaları arasında tekrarlanabilirliği korumak için tekrarlanan seanslarda tutarlı konumlandırma, darbe parametreleri ve iyileşme koşulları sağlansın.
7. Hayvanları tekrarlayan etkiler sonrası birikimli davranışsal eksiklikler için sürekli izleyin.

8. Kinematik analiz

1. Videoları standart formatta (örneğin MP4) analiz için dışa aktarın ve Kinovea yazılımına yükleyin.
2. Çarpışma öncesi ve sonrası çerçeveleri içeren ilgili zaman penceresine gidin (örneğin, çarpışmadan -0,025 ile 0,3 saniye arasında). Yazılım ayarlarında yeterli bir kare hızı (örneğin, 240 fps) ayarladığınızdan emin olun. Bir ölçeklendirme referansı tanımlayın (örneğin, göz arası mesafe).
3. Kinovea'nın takip aracını kullanarak üç noktalı bir takip sistemi oluşturun (örneğin, sağ göz, sol göz, burun; Şekil 3A). Her noktayı takip etmeye başlayın ve özellikle hızlı hareket veya tıkanma sırasında takip hatalarını manuel olarak düzeltin.
4. İzlenen koordinatları CSV veya Excel dosyaları olarak dışa aktarın.
   NOT: Daha fazla kinematik analiz özel bir MATLAB betiği kullanılarak gerçekleştirildi. Kinovea'dan dışa aktarılan zaman çözümlü takip verileri, geçersiz girişleri kaldırmak ve tutarlı zaman ölçeklendirmesi sağlamak için içe aktarıldı ve ön işlendi. Baş çevirisi, üç izli işaretin (sağ göz, sol göz ve burun) merkezi olarak tanımlanmıştır; buradan doğrusal yer değiştirme, hız ve ivme sayısal farklılaştırma kullanılarak türetilmiştir. Baş dönmesi, göz-burun ekseninin yönünden tahmin edildi; açısal yer değiştirme, çarpışma öncesi bir baz çizgisine göre hesaplandı ve açısal hız ilk türevi olarak elde edildi. Gürültü yükseltmesini azaltmak için, tüm konum ve açısal sinyaller ayırma öncesinde Savitzky–Golay filtresi kullanılarak yumuşatıldı. Birincil sonuç parametresi maksimum açısal yer değiştirme idi; hız ve ivme profilleri ise denemeler boyunca baş hareket dinamiklerinin göreli ölçütü olarak analiz edildi.

Sonuçlar

Genel Düşünceler:

Bu protokolün uygulanması, tanımlanmış yapısal, davranışsal ve nörovasküler doğrulama okumaları setiyle gösterildiği gibi, tekrarlanabilir şekilde sarsıntı beyin hasarını indükler (bkz. Şekil 2). Yaralanmadan sonra yapısal bütünlük korundu. Açık makroskopik doku bozulması veya kanaması tespit edilmedi; bu da protokolün kontüzyon değil, sarsıntı beyin hasarı oluşturduğunu gösteriyor. Histolojik d...

Tartışma

Hızlandırma-yavaşlama yaralanmasına dayanan kapalı başlı CBI'nın yeni bir fare modeli karakterize edilmiştir; bu model, hafif ama yaygın bir BBB bozukluğu ve klinik sarsıntıyı anımsatan belirgin bir nöropsikiyatrik fenotipi içerir. CBI'nın temel özelliklerini kontrollü ve tutarlı bir şekilde yeniden üreterek yapısal bütünlüğü koruyarak, model CBI'nın ve nöropsikiyatrik ile bilişsel sonuçlarının altında yatan mekanizmaları incelemek için faydalı ve iyi karakterize edilmiş deneysel bir çer...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
İlaç
Antipamezole	Vetoquinol	VM 06043/4004	Medetomidin antagonisti (α2-adrenoseptör antagonisti), subkutan (0.5 mg/kg)
Bepanthen Oftalmik Merhem	Bayer	11809917	Anestezi sırasında göz koruması, topikal
Bupivacaine	Sigma-Aldrich	B1160000	Lokal anestezi, subkutan (0.1 mg/kg)
Isofluran	CP pharma	1214CN	Anestezi, inhalasyon (indüksiyonu ve sürdürülmesi)
Medotomidine	Vetoquinol	VM 06043/4003	Sedatif/anestezik katkı maddesi (α2-adrenoseptör agonisti), subkutan (0.5 mg/kg)
Tramadol hidroklorür (100 mg/mL)	Grünenthal	6867645	İçme suyu ile verilen analjezik, fareler için 1 mg/mL son konsantrasyon, ameliyattan 2 gün öncesinden 3 güne kadar
Ekipman
Polietilen boyun yastığı	Özel		Darbeli pozisyonda destek
Sterotaksik Darbe Silupran Kapağı	Özel		Mekanik yükü dağıtır, fokal kafatası hasarını önler, darbe ucuna takılır, 830 kPa
Sterotaksik Darbe	Leica Biosystems	39463923/IM10131	Kontrollü darbe uygulama için elektromanyetik darbe cihazı
Araçlar
GoPro Hero6	GoPro Inc., San Mateo, CA, USA
Kinovea		(sürüm 2025.2.0)
MATLAB	MathWorks, Natick, MA, USA	NA