Bu deneysel çalışma, Helsinki Bildirgesi'nde belirtilen etik ilkelere uygun olarak yürütüldü ve Çukurova Üniversitesi Klinik Araştırma Etik Komitesi'nden onay aldı (Onay No: 139/25; Tarih: 8 Aralık 2023). Katılımdan önce, tüm bireyler çalışma prosedürleri hakkında bilgilendirildi ve her katılımcıdan yazılı bilgilendirilmiş onay alındı. İnsan kan örneklerini içeren tüm prosedürler kurumsal biyogüvenlik düzenlemelerine uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Deneysel süreç boyunca eldiven, maske ve laboratuvar önlüğü dahil olmak üzere uygun kişisel koruyucu ekipmanlar (PPE) kullanıldı. Biyolojik malzemeler aseptik tekniklerle işlendi ve tüm atıklar yerleşik biyolojik tehlike yönetim protokollerine uygun olarak bertaraf edildi. Bu çalışmada kullanılan tüm reaktifler, tüketim malzemeleri ve ekipmanlar, üretici detayları ve tekrarlanabilirliği sağlamak için ilgili spesifikasyonlar dahil olmak üzere Malzeme Tablosu'nda listelenmiştir.
1. Katılımcı seçimi
Katılımcılar, çalışma prosedürlerine yeterli uyum gösteren 20 ile 30 yaş arası sistematik olarak sağlıklı yetişkinlerden seçildi. Sistemik hastalık, hematolojik bozukluklar veya trombosit fonksiyonunu veya yara iyileşmesini etkileyen bilinen durumlar geçmişi olan bireyler uygun kabul edilmemiştir. Ek dışlama kriterleri arasında hamilelik veya emzirme, mevcut sigara içme, yakın zamanda enfeksiyon, kobalamin veya alfa-tokoferol'e karşı bilinen aşırı hassasiyet ve önceki altı ay içinde trombosit aktivitesini engelleyebilecek vitamin takviyeleri veya ilaçların kullanımı yer alıyordu. Biyolojik değişkenliği azaltmak için, yalnızca normal başlangıç hematolojik bulgularına sahip gönüllüler kaydedildi ve tüm katılımcılar PRF hazırlığına uygunluk açısından dahil edilmeden önce değerlendirildi. Ön keşif klinik araştırması olarak, bu çalışma fizibilite ve çalışma dönemindeki uygun katılımcıların bulunabilirliğine dayalı bir örneklem büyüklüğü kullandı ve on iki katılımcıdan alınan örnekler analiz edildi.
2. Kan toplama ve grup tahsisi
Her katılımcıdan aseptik koşullarda katkısız 10 mL cam tüpler kullanılarak periferik venöz kan alındı. Her katılımcı toplamda beş tüp alındı. Tam kan sayım analizi için bir tüp tahsis edildi, bir tüp ise başlangıç serum kobalamin ve alfa-tokoferol seviyelerini belirlemek için kullanıldı. Kalan üç tüp, trombosit açısından zengin fibrin (PRF) hazırlamak üzere tahsis edildi. Bunlar arasında, bir tüp kontrol PRF grubu olarak herhangi bir katkı maddesi olmadan hizmet verdi, bir tüp santrifüjden önce kobalamin (1 mL) kobalamin ile zenginleştirilmiş PRF elde etmek için aldı ve bir tüp santrifüjden önce alfa-tokoferol (0,5 mL) aldı ve alfa-tokoferol zenginleştirilmiş PRF elde edildi. Kobalamin, steril enjekte edilebilir çözelti (1000 μg/mL) olarak verildi ve alfa-tokoferol ampul formunda (2 mL) kullanıldı. Tüm örnekler, erken pıhtılaşmanı önlemek için kan alındıktan hemen sonra işlendi.
3. PRF Hazırlık
Her katılımcıdan steril, antikoagülant içermeyen cam tüpler kullanılarak periferik venöz kan örnekleri alındı. Toplandıktan hemen sonra, tüpler bir santrifüja yerleştirildi ve erken pıhtılaşmayı önlemek için gecikmesiz işlendi. Santrifüjleme, sabit açılı rotor sistemi kullanılarak oda sıcaklığında 12 dakika boyunca 2700 devir (708 × g) hızında gerçekleştirildi. Santrifüjasyon tamamlandıktan sonra üç farklı tabaka gözlemlendi: alt kırmızı kan hücresi fraksiyonu, üst trombositten faiz plazma tabakası ve trombosit açısından zengin fibrini (PRF) temsil eden ara fibrin pıhtısı. PRF pıhtısı, steril aletlerle kırmızı kan hücresi tabakasından dikkatlice ayrıldı ve daha ileri işlem için izole edildi. Zenginleştirilmiş PRF gruplarının hazırlanması için, standart koşullarda santrifüjden hemen önce kan örneklerine belirlenen katkı maddeleri eklenmiştir. Bu yaklaşım, pıhtı oluşumu sırasında gelişmekte olan fibrin matriksine biyoaktif bileşiklerin dahil edilmesini mümkün kılmıştır (Şekil 1).

Şekil 1: PRF örneklerinin alınması için metodolojik protokolü gösteren akış şeması. Santrifüjden önce kan örneklerine 1 mL kobalamin (A) ve 0,5 mL alfa-tokoferol (B) eklendi. Ortaya çıkan PRF, tüplerde (C) ve kırmızı kan hücresi tabakasından (D) ayrıldıktan sonra örnekler alır. Son kobalaminle zenginleştirilmiş PRF (E) ve alfa-tokoferol zenginleştirilmiş PRF (F). Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
4. PRF örneklerinin in vitro kuluçka
Her PRF pıhtısı steril bir tüpte aktarıldı ve hücre kültür ortamı, tüm örneklerde tutarlı bir difüzyon ortamı sağlamak için 1 g pıhtı başına 1 mL (1:1, v/w) standart oranda eklendi. Tüpler, PRF matrisinden büyüme faktörleri ve sitokinlerin kademeli olarak salınmasını kolaylaştırmak için toplam 72 saat boyunca 37 °C sıcaklıkta inkübe edildi. Süpernatanlar 24 saat ve 72 saat içinde toplanmış, steril mikrotüplere aktarılmış ve daha fazla analiz yapılana kadar −80 °C sıcaklıkta depolanmıştır. Hücre kültürü ortamı, dışsal büyüme faktörlerinin müdahalesini önlemek ve ölçülen tüm biyomoleküllerin yalnızca PRF matrisinden kaynaklandığından emin olmak için serum takviyesi olmadan kullanıldı.
5. Büyüme faktörü ELISA analizi
Toplanmış süpernatantlardaki trombosit kökeni büyüme faktörü (PDGF), transformasyon büyüme faktörü-β1 (TGF-β1), vasküler endotel büyüme faktörü (VEGF), insülin benzeri büyüme faktörü-1 (IGF-1), fibroblast büyüme faktörü-2 (FGF-2), interleykin-1β (IL-1β) ve tümör nekrozi faktörü-α (TNF-α) konsantrasyonları, üreticilerin talimatlarına göre enzimle bağlantılı immünosorbent test kitleri kullanılarak nicelendirildi. Emilimcilik değerleri mikroplaka okuyucu kullanılarak 450 nm'de ölçüldü ve analiz konsantrasyonları standart kalibrasyon eğrilerine göre hesaplandı.
6. İstatistiksel analiz
İstatistiksel analizler IBM SPSS Statistics for Windows (Sürüm 20.0) kullanılarak gerçekleştirildi. Veriler, ortalama ± standart sapma ve medyan (minimum–maksimum) olarak ifade edildi. Veri dağılımının normalliği Shapiro–Wilk testi kullanılarak değerlendirildi. Zaman noktaları arasındaki grup içi karşılaştırmalar eşleştirilmiş t-testi veya Wilcoxon imzalı sıralama testi kullanılarak yapılırken, gruplar arası karşılaştırmalar ise uygun olduğunda tekrar ölçülü varyans analizi veya Friedman testi kullanılarak gerçekleştirildi. <0,05 p-değeri istatistiksel olarak anlamlı olarak kabul edildi.