Fototrombotik İnme Modelleme ve Davranış Eden Farelerde Nöronal ve Astrositik Aktivitenin In Vivo Optrode Kaydı İçin Entegre Bir Yöntem

Özet

Bu protokol, viral teslimat, optrod implantasyonu, fototrombotik indüksiyon, astrosit ve nöron aktivitesinin eşzamanlı kaydı ve astrositlerin optogenetik uyarılmasını içeren entegre bir yöntem sağlar. Bu entegre yöntem, iskemik incinin akut ve kronik evreleri arasında astrosit-nöron ilişkisinin eşzamanlı incelenmesini sağlamayı amaçlamaktadır.

Özet

İskemik inme sonrası astrosit-nöron dinamiklerinin araştırılması, inme sonrası iyileşme mekanizmalarını anlamak için gereklidir. Ancak, mevcut metodolojiler genellikle belirli davranış görevlerini yerine getiren hayvanlarda nöronlar ve astrositler arasındaki gerçek zamanlı etkileşimleri yakalayamıyor; bu da inme patolojisinin akut evresini inceleme yeteneğimizi sınırlıyor. Bu protokol, fototrombotik inme modellemesini, eşzamanlı çok kanallı elektrofizyoloji kaydı ve uyanık, davranışlı farelerde özel üretim optrod kullanan fiber fotometri ile birleştiren entegre bir yöntem sunar. Protokol, fototromboz yoluyla fokal iskemi indüksiyonunu ve ardından nöron siçrayışlarının ve astrositik kalsiyum geçişlerinin eşzamanlı kaydını içerir. Optrod, ayrı cerrahi işlemlere gerek kalmadan fototromboz, kalsiyum sinyal kaydı ve optogenetik manipülasyonun eşzamanlı olarak verilmesini sağlar. Temsilci sonuçlar, astrositli kalsiyum sinyalinin ve nöronal spikingin eşzamanlı kaydedilmesinde başarıyı doğrulamaktadır. Astrositlerin optogenetik manipülasyonu, nöronal ateşleme desenlerinde ölçülebilir değişiklikler üretir (piramidal nöronların ateşlenme frekansının 1,55 ± 0,45 Hz ve internöronların ateşlenme sıklığının 3,64 ± 1,37 Hz azalması, pre-optogenetik uyarıma kıyasla n = 2), bu da sistemin astrosit-nöron etkileşimlerini araştırma kapasitesine sahip olduğunu doğrular. Bu entegre yaklaşım, davranış sergileyen hayvanlarda akuttan kronik inme evresine kadar gerçek zamanlı, multimodal kayıtlar sağlayarak inme araştırma metodolojisindeki kritik boşlukları gidermektedir.

Giriş

İskemik inme, dünya genelinde hem ölüm hem de uzun vadeli edinilmiş engelliliğin önde gelen nedenlerinden biri olan birincil küresel sağlık ^{sorunlarından biri olmaya devam etmektedir 1,2,3}. İskemik inme ile ilişkili yüksek engellilik oranı, motor felç ve duyusal kayıptan bilişsel bozukluklara kadar çeşitli klinik semptomlarla ilişkilidir ^4,5,6. Onarım aşamasında iskemik incinin patolojik ve iyileşme mekanizmalarını derinlemesine anlamaya acil bir ihtiyaç vardır. Nöron yetmezliğinin ötesinde, astrositlerin felaket yüzündeki başarısızlık yakın zamanda^{vurgulandı 7,8}. Astrositler, en bol bulunan glial hücreler olup, merkezi sinir sisteminin ve üçlü sinapsın temel bir bileşenidir. İskemik kaskadın her aşamasında, astrositler vazgeçilmez bir rol oynar ve nöron ile fonksiyonel iyileşmeyi derinden etkiler ^9,10,11. Sağlıklı beyinde, astrositler ve nöronlar işlevsel olarak üçlü sinaps üzerinden bağlanır; burada astrositik süreçler sinaptik öncesi ve sonrası terminalleri kaplar ve sinaptik iletimde aktif olarak^{yer alır 7,8}. Astrositler, eksitasyon amaçlı amino asit taşıyıcıları aracılığıyla hücre dışı glutamat konsantrasyonlarını düzenler, Kir4.1 kanalları aracılığıyla potasyum homeostazını korur ve gliotransmitter salınımıyla sinaptik gücü kalsiyuma bağlı^{ekzositoz 7,8} ile modüle ederler. Bu bağlamda, astrositli hücre içi kalsiyum geçişleri astrositik aktiviteyi temsil eder ve nöronal ateşleme ile sıkı^{bağlantılıdır 7}. İskemik inme sırasında, bu ince ayarlı ilişki hızla bozulur. Enerji eksikliği sonrası iyon gradyanlarının çöküşü, büyük glutamat salınımını ve depolarizasyonun yayılmasını tetikler; bu da eksitotoksik nöron hasarına ve reaktif astrositlerin çoğalmasına yol^{açar 12}. İnfarkt çekirdeği ve çevresindeki astrositler, kalsiyum aşırı yükü, glutamat geri alımının bozulması, sinaps bağlanmasının kaybı ve gliotransmitter^{salınımının 13} başarısızlığı gibi patolojik değişiklikler zincirine uğrar. Aynı zamanda, nöronların canlılık ve zar potansiyel bütünlüğü kaybettiği için nöron sivri aktivitesi derin bir şekilde^{bastırılır 14,15}. Peri-enfarkt bölgesinde, hayatta kalan nöronlar ve reaktif astrositler, inme sonrası iyileşme sonucunu belirlemede kritik olduğu düşünülen dinamik etkileşimlere girer; Ancak, uyanık ve davranan hayvanlarda bu etkileşimin gerçek zamanlı elektrofizyolojik ve kalsiyum korelasyonları hâlâ kötü karakterize edilmiş^13,16. Sonuç olarak, astrositik aktiviteyi nöronal sinyallerle yan yana anlamak, iskemik yaralanma sonrası sinirsel fonksiyonel iyileşme için temel taşlardan biri olarak kabul edilir.

Fototromboz, yaygın olarak kullanılan bir iskemik modeldir; Belirli hedeflenen alanlarda iskemik lezyonları indüklemek için fotosensitsitif boya ve lokal ışık^{kullanır 17}. Mevcut inme modelleme ve kayıt protokolleri, inme sonrası astrosit-nöron etkileşiminin incelenmesini üç ana teknik darboğaz nedeniyle engellemektedir: 17,18,19. Modelleme ve kaydın ayrımcılığı, günümüzdeki çoğu protokolün yaygın bir dezavantajıdır ve modelin kurulması ile gerçek zamanlı sinyal kaydı arasında zaman^{aralığına yol açar (20,21}). Ancak, iskemik felçten sonraki dakikalar ila saatler, hem nöronların hem de astrositlerin ciddi dalgalanmalara maruz kaldığı hayati bir^{dönemdir 12,22}. İskemik olaydan hemen sonra astrosit-nöron etkileşiminin eşzamanlı izlenmesi olmadan, iskemik felcinin etkili erken müdahalesinin araştırılması ciddi şekilde engellenecektir. Mevcut protokollerin daha fazla sınırlaması ise kayıt modalitelerinin izole edilmesidir; Mevcut metodolojilerin çoğu tek bir sinyal türü için optimize edilmiştir. Örneğin, çok kanallı elektrofizyoloji, nöronal ateşleme ve yerel alan potansiyellerinin (LFP) tespitini sunar ancak glial hücrelerin sinyal durumlarına kördür^15,16. Buna karşılık, in vivo kalsiyum görüntüleme ile astrositik dinamiklerin izlenmesi astrositik dalgalanmaları yakalar, ancak nöron ateşleme verisi yoktur. Mevcut protokollerin son darboğazı hayvanın kayıt durumu gibi görünüyor; Çoğu protokolde hayvan anestezi edilir veya serbest hareket eder. Ancak, motor disfonksiyon en sorunlu felç sonuçlarından biri olarak kabul edilir; Belirli davranışlar ile astrosit-nöron olayları arasındaki bağlantıyı anlamak çok önemlidir. Bu nedenle, uyanık farelerde belirli davranışsal testler yaparken aynı anda hem astrosit hem de nöron sinyallerini yakalayabilen fototrombotik inme modeli yapabilen entegre bir yönteme acil ihtiyaç vardır. Mevcut metodolojilerin her biri bu gereksinimlerin yalnızca bir alt kümesini ele alır. İki fotonlu kalsiyum görüntüleme, sağlam beyindeki astrositik mikrodomain dinamiklerinin olağanüstü uzamsal çözünürlüğünü sağlar, ancak hayvanların başlarına sabitlenmesini veya anestezi edilmesini gerektirir, bu da doğal davranışsal değerlendirmeyi engeller ve aynı anda çok kanallı nöronal spike verilerini^{yakalayamaz 13}. Bağımsız lif fotometrisi, serbest davranan hayvanlarda astrositik kalsiyum izleme imkanı sağlar ancak nöronal ateşleme desenlerine kör kalır; bu da devre^{fonksiyonu 16'nın} elektrofizyolojik okuması sunmazdır. Çok kanallı ekstrasellüler elektrofizyoloji, nöron birimlerinin ve yerel alan potansiyellerinin yükselme aktivitesini yüksek zamansal çözünürlükle çözer, ancak astrositlerin sinyal durumu hakkında bilgi^{vermez 15}. Ancak, bu yaklaşımların hiçbiri aynı anda tam olarak lokalize fototrombotik felç indükleyip aynı anatomik bölgeden kesintisiz multimodal kayıt gerçekleştiremez.

Mevcut teknik sınırlamaları gidermek için bu entegre sistemi öneriyoruz. Bu sistem, tek bir kronik olarak implante edilmiş cihazda üç sınırlamayı da ele alır; eşzamanlı fototromboz indüksiyonu, fiber fotometri ile astrositik kalsiyum kaydını ve çok kanallı nöron elektrofizyolojisini mümkün kılar; inme başlangıcından kronik fazlarına kadar uyanık, özgürce davranan farelerde gerçekleşir. Bu yöntemin uygulanabilirliği, farelerin beynine astrosit-spesifik kalsiyum göstergesi ve optogenetik bir viral vektör ifade eden özel üretilmiş optrodun kronik implantasyonuyla doğrulanır. Bu yöntemle, astrositik kalsiyum geçişleri ve nöronal ateşleme aktiviteleri aynı anda davranışsal görevler sırasında ve optogenetik modülasyonlar altında analiz edilir.

Protokol

Bu protokol, Guangzhou Çin Tıp Üniversitesi (00379474) Hayvan Bakımı ve Kullanım Komitesi'nden onay aldı ve Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı için Ulusal Sağlık Enstitüleri Rehberi tarafından hazırlanan yönergeler ve yönetmeliklere uygun olarak yürütüldü. Bu çalışmada kullanılan hayvan sayısını en aza indirmek için tüm olası önlemler uygulandı.

1. Viral vektör teslimatı

NOT: Bu bölüm, astrositlere özgü AAV vektörlerinin motor kortekse (M1FL) stereotaksik enjeksiyonunu açıklar. Amaç, optrod implantasyonundan önce hem GCaMP6 kalsiyum göstergesinin hem de opto-vTRAP optogenetik yapısının stabil, astrosit-spesifik ekspresyonu sağlamaktır. Gerekli ana ekipmanlar: stereotaksik çerçeve, dijital vernier sistemi, cam mikropipet ve mikro-infüzyon pompası.

1. Fareyi indüksiyon odasına yerleştirin; %3–4 isofluran ile anestezi indüksiyonuna başlayın ve izofluran konsantrasyonu ilk dakikada maksimum %5'e çıkarılabilir, ta ki fare tepki vermeyince.
   DIKKAT: İzofluran uçucu bir anestezi ajanıdır. Tüm işlemleri aktif ventilasyon altında gerçekleştirin. Uzun süreli kişisel maruz kalmaktan kaçının.
2. Faresi, anestezi maskesiyle donatılmış stereotaksik çerçeveye aktarın ve derin anestezik düzlem sağlamak için %1–2 izofluran kullanın.
3. Anestezi derinliğini her 10 dakikada bir solunum ritmi, palpebral refleks ve ayak parmağı sıkıştırma ile kontrol edin. Fare vücut sıcaklığını geri besleme kontrollü ısıtmalı ped ile 36–37,5 °C arasında tutun.
4. Ameliyat sırasında kornea hasarını önlemek için gözlere oftalmik merhem uygulayın.
5. Fareyi kulak çubukları ve ağız çubuğu olan stereotaksik bir çerçeveye sabitleyin. Fare başının simetrik sabitlenmesi için kulak çubuklarını ayarlayın. Başın hareketsiz olduğundan nazik bir probing ile emin olun.
6. Saçları depilasyon kremiyle iyice çıkarın ve kafatasını açığa çıkarmak için cerrahi makasla orta hat kesisi yapın. Periosteumu tuzlu su ve pamuklu çubuklarla temizleyerek Bregma ve Lambda'yı açığa çıkar.
7. Cam mikropipeti indirerek Bregma ve Lambda'ya ardışık olarak dokunun; dijital vernier'deki Z-koordinatına dikkat edin. Ağız çubuğunu farkı <0.04 mm olarak ayarlayın.
8. Cam mikropipetini Bregma'ya indirip dijital vernier'i sıfıra sıfırlayın. Mikropipeti 2,3 mm boyunca Bregma'nın soluna ve sağına ardışık olarak hareket ettirin; dijital vernier'deki Z-koordinatına dikkat edin. Kulak çubuklarını ayarlayarak çift taraflı farkların <0.04 mm olmasını sağlayın.
9. Bregma'da dijital vernier'i sıfırlayın ve motor korteksi işaretleyin (M1FL; AP: +1.5 mm, ML: +0.74 mm). İşaretlenen noktada yaklaşık 0,5 mm çapında küçük bir delik açmak için 0,5 mm sondaj uçlu (yuvarlak uçlu) mikromatkap kullanın. Kanama ve beyin dokusuna zarar vermemek için dikkatlice matkap yapın; sondaj sürecinde oluşan ısıyı telafi etmek için buz gibi soğuk tuzlu su damlatılır.
10. Mikro-infüzyon pompasına bağlı cam mikropipet'i hedef bölgeye indirin (DV: beyin yüzeyinden -0,94 mm). Yüklemeden önce, AAV9-GfaABC1D-GCaMP6 ve AAV9-GfaABC1D-opto-vTRAP eşit hacimlerde karıştırarak viral bir karışım hazırlanır. Karışımdan 400 nL (her vektörden 200 nL) 50 nL/dakika hızında infüze edin.
    NOT: Viral kokteyl şunları içerir: 200 nL astrosit-spesifik kalsiyum göstergesi (AAV-GfaABC1D-GCaMP6s, 1.0 ×^{10 13} vg/mL) ve 200 nL astrosit-spesifik optogenetik viral vektör (AAV-GfaABC1D-opto-vTrap, 1 × 10¹³vg/mL). Başarılı astrosit-spesifik transdüksiyon, GFAP için immünoflüoresans boyama ile hayvanların bir alt kümesinde doğrulandı; bu da floresan raporlayıcının GFAP-pozitif hücrelerle birlikte lokalizasyonunu ve GFAP-negatif hücrelerde ekspresyonun olmadığını doğruladı.
    DIKKAT: AAV vektörleri rekombinant biyolojik ajanlardır; kurumun biyogüvenlik yönergeleri kapsamında tüm viral vektörleri ve atıkları ele almak.
11. Infüzyon tamamlandıktan sonra pipeti 10 dakika boyunca yerinde bırakın; böylece daha iyi viral difüzyon sağlanır ve geri akış önlenir. Pipeti yavaşça çekin, saç derisini dikin (4-0, 20 mm, 3/8 daire) ve fareyi tamamen iyileşene kadar ısıtma pedinin üzerine koyun.
    NOT: Optimal viral ekspresyon için 3–4 haftalık bir süre gereklidir. Protokolün ayrıntılı zaman çizelgesi Şekil 1A'da gösterilmiştir.

2. Optrode denetimi ve işlevsel doğrulama

NOT: İmcletmeden önce, özel üretilen optrod fiziksel olarak incelenmeli ve optik olarak test edilmek için üç fonksiyonel modda (fototromboz, optogenetik stimülasyon ve lif fotometrisi) ışık sağlayabildiğinden emin olmalıdır. Gerekli ana ekipmanlar: mikroskop, optik güç ölçer ve 532 nm, 488 nm, 470 nm ve 405 nm lazer kaynakları.

1. Optrode'un fiziksel muayenesi:
   1. Üretilmiş optrodu mikroskop altına yerleştirerek kayıt alanlarının düzenini inceleyin.
   2. 16 volfram mikrotelin eşit şekilde paketlendiğinden ve merkezi optik lifin çevresini sardığından emin olun. Elektrik kısa kesintilerine yol açabilecek herhangi bir bükülmüş veya çapraz kablo olup olmadığını kontrol edin.
   3. Optik lifin ucunun tungsten mikrotellerden daha kısa olduğunu doğrulayın (Şekil 1B).
      NOT: Optik fiber ucu, elektrot^{uçlarından 23} 100-200 μm geri çekilmelidir. Lee ve ^ark.22'den alınan bu ofset, ışık koninin kayıt alanını yeterince kaplamasını sağlarken aşırı fotoelektrik gürültüyü önler. Araştırmacılar, uygun ofseti kendi optrode'ları altında ampirik olarak doğrulamaları teşvik edilir.
2. Optik fiberi lazer modelleme kaynağı ve kayıt kaynağına bağlayın. Aşağıdaki üç fonksiyonel mod için fiber ucundaki çıkışı ölçmek için optik güç ölçer kullanın (Şekil 1B):
   1. Fototrombotik modelleme modu: Sistemin yüksek yoğunluklu sürekli dalga (CW) ışığı (532 nm) sağlayabildiğini doğrulayın.
      NOT: Bu deneyde NA 0.22 ile fiber kullanılmıştır. Lif ucunun 100–200 μm altında tahmini aydınlatılan nokta çapı yaklaşık 200–400 μm olarak belirlenir. Başarılı Rose Bengal aktivasyonu ve trombus oluşumunu garantilemek için uçtaki gücün >20 mW'a ulaşmasını sağla.
   2. Optogenetik manipülasyon modu: Darbeli lazer çıkışını test edin (örneğin, opto-vTrap için 488 nm).
      NOT: Gücü ucundan 10 mW'a kalibre edin; bu, motor kortekste 0,94 mm kayıt derinliğinde opto-vTRAP aktivasyonu için optimize edilmiştir. Diğer beyin bölgeleri için davranışsal veya elektrofizyolojik doğrulama önerilir.
   3. Fiber fotometri (kalsiyum kaydı) modu: Düşük güçlü uyarılma ışığını test edin (örneğin, 470 nm ve 405 nm).
      NOT: Çıkışın stabil olduğundan ve çok düşük bir seviyede (<50 μW) tutulduğundan emin olun; böylece uzun süreli kayıt sırasında kalsiyum göstergesinin fototoksisitesi ve fotobeyazlanması (örneğin GCaMP6'lar) en aza indirilebilir.

3. Kronik optrod implantasyonu

NOT: Bu bölüm, viral enjeksiyon bölgesine optrodun kronik olarak yerleştirilmesi için cerrahi işlemi kapsar. Enjeksiyon koordinatlarının hassas konumu, kayıt elektrotlarının ve optik fiberin GCaMP6 bölgesini ve opto-vTRAP ifadesini örneklemesini sağlamak için kritik öneme sahiptir. Gerekli ana ekipmanlar: stereotaksik çerçeve, mikromatkap, forseps, kranioplasti vidaları, agaroz jeli ve diş çimentosu.

1. Anestezi, stereotaksik fiksasyon, kafatası hazırlığı ve dengeleme için, bölüm 1'de açıklanan aynı prosedürü takip edin; ancak saç derisindeki kesi sırasında göz çevresinde yeterli deri kaldığından emin olun, saç derisinden 1,5 cm × 1,5 cm çıkarılmalıdır.
2. Kafatasını hidrojen peroksit ve %0,9 tuzlu suyla temizleyin. Bregma'yı tespit edin ve dijital vernier'i sıfırlayın.
3. Diş çimentosunun daha iyi yapışmasını sağlamak için kafatasının yüzeyini hafifçe pürüzleştirmek için matkap (0,8 mm, yuvarlak uçlu) kullanın.
4. Motor korteksi bir işaretleyiciyle işaretleyin (M1FL; AP: 1,5 mm, ML: 0,74 mm), ardından bunu merkez noktası olarak kullanarak 5 mm × 5 mm kare çizebilirsiniz (Şekil 1C).
   1. Uygun hızda (yaklaşık 10000 rpm) mikromatkap kullanın ve kareye izleyin. Sondaj sırasında yüksek hızlı sondajın yarattığı ısıyı dengelemek ve beyin dokusu hasarını önlemek için sondaj yoluna sürekli buz gibi tuzlu su damlatın. Kemik flebi gevşediğinde hemen durun (Şekil 1C).
5. Karşı taraf yarımküre ve beyincik üzerine üç küçük delik (0,5 mm çapında) açılır ve deliklere kranioplasti vidaları yerleştirilir. Her vidanın dura mater'e ulaştığından emin olun, ancak daha fazla delme ve beyin dokusuna ekstra zarar vermenin (Şekil 1C).
6. Daha önce gevşemiş olan kemik flebi çıkarmak için forseps kullanın. Çıkarma sırasında beyin dokusuna zarar vermesini önlemek ve dura mater'i sağlam tutmak için aşağıya doğru ek kuvvetlerden kaçının.
   NOT: Herhangi bir kanama olursa, kanamayı hızlıca durdurmak için hemostatik bir sünger kullanılabilir.
7. Kranial penceredeki dura mater'i çıkarmak için ultra ince uclu (<0,03 mm × 0,01 mm) forseps kullanın. Bu süreçte forseps ucunun doğrudan herhangi bir beyin dokusuna sıkışmasını önleyin.
   NOT: Kemik çıkarıldıktan sonra beyin dokusunun nemli kalması çok önemlidir. Herhangi bir işlem yapılmadığında, şişlik ve kuruluk nedeniyle nöron hasarını önlemek için pencereyi kapatmak için steril, tuzlu su ile ıslatılmış pamuk topları kullanılması önerilir.
8. Optrode'u stereotaksik çerçevenin mikromanipülatör koluna sabitleyin ve kafatası penceresinin üzerine taşıyın. Optrodun gümüş topraklama ve referans tellerini üç kranioplasti vidasına sıkıca birbirine geçirin (Şekil 1C).
9. Kafata penceresi yüzeyini steril tuzlu suyla temizleyin, böylece elektrot yerleştirilmesini engelleyecek kanama veya kan pıhtıları olmadığından emin olun. Optrodu istenen derinliğe (DV: -0.94 mm) 1 μm/s hızında yavaşça düşürün.
   NOT: Açık kortikal doku implantasyon sırasında steril tuzlu suyla nemlendirilmelidir.
10. İmplantasyondan sonra kafatası penceresinin üzerine agaroz tabakası uygulayarak kortikal dokuyu diş çimentosu'ndan koruyun.
11. Açıkta kalan kafatasını kapatmak için 3–4 kat diş çimento uygulayın, böylece tüm optrod sabitlendiğinden emin olun. Diş çimento sertleştiğinde fareyi stereotaksik çerçeveden çıkarın (Şekil 1C).
12. 3–5 gün boyunca analjezi sağlayın ve farenin kayıt ile modellemeden önce 1–2 hafta iyileşmesine izin verin.

4. Fototrombotik modelleme ve eşzamanlı kayıt

NOT: Bu bölüm davranışsal alışkanlık, başlangıç kaydı, fototrombozla inme indüksiyonu ve inme sonrası uzunlamasına kayıt prosedürlerini açıklar. Fototromboz, implante edilen optrod üzerinden geçirilirken, eşzamanlı elektrofizyoloji ve fiber fotometri kaydı da sürdürülür. Gerekli ana ekipmanlar: rotarod cihazı, tutuş güç ölçer, fiber fotometri sistemi, çok kanallı sinir kayıt sistemi, Rose Bengal boyası ve 530 nm lazer kaynağı.

1. Modellemeden önce farenin davranış eğitimi almasını sağla.
   NOT: Tüm hayvanlar standart laboratuvar koşullarında barındırıldı ve test edildi. Konut koşulları: oda sıcaklığı 20–25 °C, bilgili nem %50–60%, 12 saatlik ışık/karanlık döngüde (ışıklar 07:00'de yanıyor). Çalışmanın tamamında hayvanlar ücretsiz yiyecek ve suya erişebiliyordu. Tüm testler ve cerrahi işlemler ışık aşamasında gerçekleştirildi. Davranışsal kayıt oturumları, nöron aktivitesi ve astrositik kalsiyum dinamiklerindeki sirkadiyen varyasyonun en aza indirilmesiyle ışık fazında her gün tutarlı bir zamanda gerçekleştirildi. Kayıt alanı ayrıca 20–25 °C ortam sıcaklığında tutuluyordu.
   1. Rotarod testi için, farenin dönen çubukta 5 dakika boyunca ardışık 3 deneme boyunca sürekli çalışması sağlanır ve rotarod 5 dakika boyunca 4 RPM'den 40 RPM'ye hızlanır.
   2. Kavrama gücü testi için, farenin test çubuğunu ön patileriyle çekmeyi öğrenmesini sağlayın ve sonuçlar %10'dan az dalgalanarak ardışık üç denemeyi tamamlasın.
2. Fiber fotometri için veri toplama parametrelerini ayarlayın.
   1. Kalsiyum göstergesini uyarmak için çift veya üç dalga boylu fiber fotometri sistemi kullanın (örneğin, GCaMP6'lar). GCaMP6'lar için, hareket artefaktlarını ve otofloresansı düzeltmek için sinyal kanalını 470 nm'ye, kontrol kanalını ise 405 nm'ye ayarlayın.
      NOT: Foto ağartma ve fototoksisiteyi önlemek için lif ucundaki çıkışın 20–40 μW arasında olduğundan emin olmak için kayıt lazer gücünü tekrar test etmek çok önemlidir.
   2. Veri toplama örnekleme hızını 60–100 Hz olarak ayarlayın; bu da astrositik kalsiyum geçişlerini yakalamak için yeterli olacaktır.
3. Çok kanallı elektrofizyoloji için veri toplama parametrelerini ayarlayın.
   1. Kayıt sistemindeki tüm bileşenlerin (tutuş gücü testi cihazı ve kafes dahil) gürültüyü azaltmak için doğru şekilde topraklandığından emin olun. Kayıt sırasında küresel artefaktları ortadan kaldırmak için ortak bir medyan referans (CMR) kullanın.
      NOT: Güç hattı girişiminin olmadığından ve hareket artefaktlarından kaynaklanan gürültünün en aza indirildiğinden emin olmak için kayıt sistemindeki sinyal spektrogram görünümünü kontrol etmek çok önemlidir. Büyük hareket artefaktları, implantasyon ameliyatı sırasında vidaların ve topraklama tellerinin sabitlenmesinin arızalandığını gösterebilir.
   2. Kayıt yazılımında geniş bant ve LFP sinyallerinin seçildiğinden emin olun ve kayıt oturumu boyunca ortaya çıkan herhangi bir gürültüyü izleyin.
4. Temel kayıt yap.
   1. Kısa süreliğine isofluran ile anestezi edilir (60 saniye içinde); Optrode'u bir adaptör aracılığıyla kayıt hattına bağlayın.
   2. Fareyi kayıt için ev kafesi benzeri bir ortama yerleştirin ve uyandıktan sonra 10 dakika alışma süresine izin verin.
   3. Kayıt tutma gücü testiyle eşzamanlı olarak yapılır, farenin test çubuğunu her dakika 5 dakika boyunca çekmesi gerekir.
   4. Davranış testlerinin hem çok kanallı hem de fiber fotometri sistemlerinde veri hizalanması için tam olarak zaman damgası ile belirlendiğinden emin olun (Şekil 1D).
5. Fototrombotik bir model oluşturun.
   1. %1,5 Rose Bengal boya çözeltisini intraperitoneal (i.p.) 10–20 mg/kg dozda uygulayın, boyağın kortikal damar sisteminde dolaşmasını 5 dakika bekleyin.
      DIKKAT: Rose Bengal foto duyarlılaştırıcı bir boyadır. Reaktifi parlak ortam ışığından koruyun. El yaparken eldiven ve göz koruyucu takın.
   2. Fareyi daha önce açıklanan aynı indüksiyon ve bakım parametrelerine göre izofluran ile anestezi edin.
   3. Fare derin anestezi düzleminde ve anestezi maskesiyle tutulduğunda, optrodun optik probunu lazer kaynağına bağlayın.
   4. Odak iskemiyi indükleyerek implante edilen optrod üzerinden 530 mW hızda 530 nm lazer ışını ileterek 5–8 dakika ilerletin.
      DIKKAT: 15 mW'ta 530 nm lazer tehlikelidir. Tüm araştırmacılar lazer güvenlik göz koruması takmak zorundadır. Fototromboz sırasında lif ucuna doğrudan bakmayın.
6. İnme sonrası kayıt yapın.
   1. Fareyi ısıtılmış bir pedin üzerine yerleştirin, böylece toparlanın. Fare tamamen uyandığında (genellikle 10 dakika içinde), ilk felç sonrası akut kaydı başlatın.
   2. Hastalığın ilerlemesini yakından izlemek için her gün kaydı tekrarlayın.
7. Optogenetik manipülasyon yapın.
   1. Kalsiyum sinyallerinin kaydedilmesi ve iskemik indüksiyon için lazer ışınının yayımının yanı sıra, optrod aynı zamanda temsil edici sonuçlarda gösterildiği üzere optogenetik stimülasyon da sağlayabilir (Şekil 4).
   2. Optrode'u, uygun lazer dalga boyuna ve gücüne sahip optogenetik lazer uyarıcına bağlayın (bu durumda 488 nm, 10 mW, opto-vTrap için 5 dakika) ve optogenetik manipülasyon yapmak için uyarıcıyı açın.

5. Çok modlu veri analiz boru hattı

NOT: Bu bölüm, çok kanallı elektrofizyoloji verilerinin (spike sıralama), astrositli kalsiyum sinyallerinin (ΔF/F hesaplaması) ve iki veri akışının çapraz modal hizalanmasının işlem akışını özetlemektedir. Gerekli yazılım: Plexon Offline Sorter (çevrimdışı spike sıralama yazılımı), NeuroExplorer (sinir veri analiz yazılımı) ve RWD OFRs (fiber fotometri) analiz yazılımı.

1. Nöron spike sıralaması (Plexon Sistemi):
   1. Ham .pl2 dosyalarını çevrimdışı spike sıralama yazılımına aktarın. Yüksek frekanslı spike aktivitesini izole etmek için dijital yüksek bant geçirici filtre (<300 Hz) uygulayın.
   2. Potansiyel artışları tespit etmek için bir voltaj eşiği (genellikle gürültünün -5 standart sapması) ayarlayın.
   3. Gürültü dalga formlarının manuel taraması ve geçersiz hale getirilmesinden sonra, çevrimdışı spike sıralama yazılımındaki tarama fonksiyonunu kullanarak ana bileşen analizini (PCA) gerçekleştirerek dalga formlarını gruplar ve farklı nöron kümeleri için^{taranabilirsiniz 24}.
   4. Aralıklar arası aralık (ISI) histogramlarını inceleyin. Her "Tek Birim"in ISI ihlal oranının %<1 olduğundan emin olun (refrakter dönemi yansıtarak). ISI ihlali oranı, çevrimdışı spike sıralama yazılımında her birimin sol üst köşesinde gösterilmiştir.
   5. Sıralanmış zaman damgalarını sinir veri analiz yazılımına dışa aktarın. Hız histogramları ve peri-uyarıcı zaman histogramları (PSTH) oluşturmak için sinir veri analiz yazılımındaki hız histogramı ve peri-olay histogramları versus zaman fonksiyonunu kullanın.
   6. Daha fazla analiz için sinirsel veri analiz yazılımındaki istatistiksel bölümden her birimin ortalama dalgaformu uzunluğu ve ortalama ateşleme hızını çıkarın.
2. Astrositik kalsiyum sinyal işleme (fiber fotometri analiz yazılımı)
   1. Ham floresan verilerini (sinyal için 470 nm kanal ve hareket kontrolü için 410 nm kanal) analiz yazılımında açın.
   2. Fiber fotometri sisteminin ön işlem bölümünde, hareket düzeltmesi için 410 nm kontrol olarak uygulanır, düzleştirme katsayısını 8'e ayarlayın ve temel düzeltme olarak PLS Fit seçin.
   3. Floresans değişimini (ΔF/F) formül²⁵ kullanarak hesaplayın:
      
   4. Olay zaman damgalarına dayalı astrosit kalsiyum sinyal analizi yapın, görselleştirme için peri-olay verilerini çıkarın (örneğin ısı haritaları ve ortalama izleri) ve eğrin altındaki alanı (AUC) hesaplayın.
3. Senkronize astrosit-nöron korelasyonu
   1. Nöron siçkelileri ve astrosit kalsiyum sinyallerini ortak davranışsal olay zaman damgası olarak sıfır zaman damgası olarak hizalayın.
   2. Peri-olay verileri çıkarıldıktan sonra, iki veri akışını bu paylaşılan zaman sıfırına hizalayıp astrosit-nöron korelasyonunu görselleştirin (Şekil 3).

Sonuçlar

Deneysel zaman çizelgesi

Şekil 1 , deneysel zaman çizelgesini ve önemli cerrahi dönüm noktalarını özetlemektedir. Viral enjeksiyon ile optrod implantasyonu arasındaki üç haftalık aralık, yeterli GCaMP6 ekspresyonu için kritiktir ve indüksiyondan önceki başlangıç kayıt döneminde fiber fotometri izleri incelenerek sağlam astrositik kalsiyum sinyalleri doğrulanmalıdır.

Fototromboti...

Tartışma

Burada tanımlanan entegre protokol, iskemik inme ilerlemesi sırasında astrosit-nöron etkileşimlerinin incelenmesinde önemli bir ilerleme sunmaktadır. Fototrombotik indüksiyonu gerçek zamanlı opto-elektrofizyolojik izleme ve optogenetik manipülasyon ile birleştirerek, bu yöntem inme başlangıcı ile nöronların ve astrositlerin devre düzeyinde yeniden düzenlenmesinin gözlemi arasındaki boşluğu etkili bir şekilde kapatır. Boyce ve ark. tarafından yapılan son çalışmalar, serbest davranan farel...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
2% TTC Staining Solution	Solarbio	G3005
Agorose	Biosharp	BS081
Body Temperature Maintenance System / Homeothermic Monitor	RWD life Science	69002
Cranial Screws	Zhongke Huida	23092007
Data Acquisition and Analysis Software(Fiber photometry)	RWD life Science	ORFs
Data Acquisition and Analysis Software(Multi-channel electrophysiology)	Plexon	PlexControl, Offline Sorter, Neuroexplorer
Digital laboratory stereotactic frame	RWD life Science	68804
Forcep	FST	11252-00	Forcep çapı 0,005 mm ´ 0,025 mm
Laser power meter	Sanwa	LP10
Laser Speckle Blood Flow Imaging System	Pericam AB	Pericam PSI NR
Mice	Risemice	C57BL/6J
Miniature handheld cranial drill	RWD life Science	78001
Mouse Viral Micro-injector	RWD life Science	68025
Optrode	Özelleştirilmiş	Kedou	1 optik fiberi çevreleyen 16 tungsten elektrot ile özelleştirilmiştir
Prism	GraphPad	5.01 sürüm
R studio	Posit	sürüm 4.4.1
rAAV-GfaABC1D-GCaMP6s	BrainVTA	PT-2560	Astrosit özgü kalsiyum göstergesi
rAAV-GfaABC1D-opto-vTrap	BrainCase	BC-2446	Astrosit özgü optik genetik viral vektör
Rose Bengal Boyası	Sigma-Aldrich	198250	Tromboz indüksiyonu için fotoduyarlı boya/Sigma-Aldrich
Trolley-mounted anesthesia workstation	RWD life Science	R520	Mice için kontrol edilebilir inhalasyon anestezi için anestezi makinesi