Burada, zayıflatılmış BSL-2 onaylı Mycobacterium tuberculosis'un intravital görüntüleme protokolünü sunuyoruz. sürün akciğerinde kalıcı akciğer penceresi kullanarak. Bu yaklaşım, aynı akciğer mikro ortamında bakteriler lokalizasyonu, damar dinamikleri ve makrofaj alımı dahil olmak üzere erken konakçı-patojen etkileşimlerinin uzunlamasına, tek hücre çözünürlüklü analizini mümkün kılar.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Erken Intravasküler Enfeksiyonda Sönmüş Oksotrofik Mycobacterium Tuberculosis'in Sönük Oksotrofik Mycobacterium Tuberculosis'in Erken Intravasküler Enfeksiyonda
Bu makalede
Özet
Özet
İntravital mikroskopi, sağlam dokular içindeki dinamik hücresel süreçlerin doğrudan görselleştirilmesini sağlar. Ancak, Mycobacterium tuberculosis (Mtb) için uygulanması, Biyogüvenlik Seviyesi 3 (BSL-3) kapsama gereksinimleri ve yüksek çözünürlüklü görüntüleme için akciğeri stabilize etme teknik zorlukları nedeniyle sınırlı olmuştur. Burada, morin akciğerinin yüksek çözünürlüklü görüntülemesi için torasik pencere (WHRIL) ile genetik olarak tanımlanmış üçlü auxotrofik Mtb suşu olan mc27902 ile BSL-2 koşullarında kullanımı onaylanan bir protokolü sunuyoruz. Ayrıca, mc27902'nin tdTomato ekspresyonu türevi olan mc28471'in oluşumunu, damar içi enfeksiyon için hazırlanmasını ve raporlayıcı farelerde intravital görüntüleme uygulamasını da tanımlıyoruz. Bu sistem, enfeksiyon sonrası ilk 3 gün içinde akciğer mikro ortamında bakteriyellerin akciğer damarlarına hızlı girişi, toplanma, akciğer parenximasına yayılması ve makrofaj alımı gibi erken enfeksiyon dinamiklerinin gerçek zamanlı görselleştirilmesini sağlar. Tek hücre çözünürlükte basil ve konak-patojen etkileşimlerinin uzunlamasına görüntülemesini mümkün kılarak, bu yaklaşım geleneksel görüntüleme ve yüksek muhafaza modelleriyle ilişkili temel sınırlamaları aşmaktadır. Bu protokol, akciğerdeki zayıflatılmış mikobakterilerin gerçek zamanlı intravital görüntülemesi için pratik bir BSL-2 uyumlu platform sağlar ve bakteriyel fizyoloji, konak tanıma ve bağışıklık aracılı temizleme üzerine mekanik çalışmalar için temel oluşturur.
Giriş
Yüksek çözünürlüklü intravital mikroskopi, hücre göçünün, damar etkileşimlerinin ve bağışıklık gözetiminin doğrudan görselleştirilmesini mümkün kılarak, sağlam dokularda dinamik hücre davranışının incelenmesini dönüştürmüştür; tek hücreçözünürlüğü 1,2,3,4'te mümkün olmuştur. Bu yaklaşımlar kanser araştırmalarındayaygın olarak kullanılsa da, akciğer enfeksiyonlara uygulanmaları solunum hareketi, doku kırılganlığı ve biyogüvenlik kısıtlamaları nedeniyle sınırlı olmuştur. Vakumla stabilize edilmiş ve kalıcı olarak implante edilmiş optik pencereler dahil olmak üzere torasik görüntüleme platformlarındaki son gelişmeler, bu teknik zorlukların çoğunu ele alarak uzun süreler boyunca akciğer mikro ortamının stabil ve hareketsiz görüntülenmesinisağlamıştır 6,7,8,9,10 . Özellikle kalıcı olarak implante edilebilir pencereler, damar akışının, bağışıklık hücre dinamiklerinin ve tek hücre davranışının saatler ile haftalar boyunca tekrar tekrar görselleştirilmesini mümkün kılan güçlü araçlardır ve kanser metastazları, damar geçirgenliği ve bağışıklık gözetiminin mekanizmalarının tanımlanmasında önemlirol oynamıştır 11,12.
Bu gelişmelere rağmen, intravital görüntüleme daha önce in vivo memeli akciğerinde tek hücreli çözünürlükte Mycobacterium tuberculosis (Mtb) enfeksiyonunda uygulanmamıştır. En yakın örnekler, diğer ortamlarda mikobakteriyel enfeksiyonların intravital görüntülemesinden gelir. Zebrafish embriyolarında Mycobacterium marinum enfeksiyonunungerçek zamanlı görüntülemesi 13 erken makrofaj etkileşimlerini ve granüloma başlanmasını ortaya koydu; fare karaciğerindeki BCG ile indüklenen granülomaların iki fotonlu görüntülemesi ise granüloma gelişimi sırasında makrofaj ve T hücresi dinamiklerini ortaya koydu ve granülomatoz lezyonlar içinde sınırlı antijen sunumu ve T hücresi efektör fonksiyonu gösterdi. Bu çalışmalar, mikobakteriyel konak-patojen etkileşimlerine dair temel bilgiler sağladı ancak sağlam memeliakciğerine erişim sağlamadı 8,16.
Intravital görüntüleme yaklaşımları, akciğerde diğer enfeksiyon ve biyolojik bağlamlarda da uygulanmıştır; bunlar arasında genel akciğer görüntüleme8, devriye gezen alveolar makrofajların bakterileri bağışıklık sisteminden gizleyebildiğini ortaya koyançalışmalar 17 ve insan akciğerinde SARS-CoV-2 enfeksiyonuna karşı anlık miyeloid yanıtın karakterize edilmesi16. İntravital görüntüleme benzer şekilde grip enfekte akciğerlere uygulanmış ve enfekte akciğer dokusunda dinamik bağışıklık hücresi davranışının doğrudan görselleştirilmesinisağlamıştır 18,19.
Fiber-optik mikroendoskopikuyarılma 20 ve raporlayıcı enzim floresan teknolojisi21,22 kullanılarak tüm vücut optik görüntüleme yaklaşımları, fare akciğerlerinde Mtb'nin hassas tespitini mümkün kılmıştır, ancak bireysel veya küçük basil kümelerini tespit edemez, bakteriyel agregasyon dinamiklerini takip edemez veya sağlam akciğer dokusunda mikobakteriler ile konak hücreler arasındaki doğrudan etkileşimleri görselleştiremez. BSL-3 ortamlarında enfekte akciğerler için yüksek kapalı intravital görüntüleme yaklaşımları uygulanmıştır; bunlar arasında SARS-CoV-2enfeksiyonu 23 ve Mtbodaklı 24 multifoton görüntüleme platformları bulunmaktadır. Bu çalışmalar, enfekte akciğerlerin kapalı altında görüntülemesinin mümkün olduğunu göstermektedir, ancak bu tür sistemler teknik olarak hâlâ zorlayıcı ve yaygın olarak erişilebilir değildir. Virülent Mtb ile çalışmak, BSL-3 muhafazası gerektirir ve bu da intravital görüntüleme için önemli mühendislik ve biyogüvenlik zorluklarıyaratmaktadır 23,24. Sonuç olarak, erken Mtb enfeksiyonu çalışmalarının çoğu, akciğer içindeki bakteriyel davranışın mekansal ve zamansal dinamiklerini yakalayamayan statik son nokta testlerine dayanır.
Genetik olarak tanımlanmış, BSL-2 onaylı üçlü auxotrofik Mtb suşlarının geliştirilmesi, bu sınırlamaların aşılması için benzersiz bir fırsat sunmaktadır. MC27902 suşu, H37Rv'nin pantotenat-lösin-arginin Mtb auksotrof türevi olarak tamamen zayıflamıştır, bağışıklık sistemi zayıf farelerde çoğalmaz, klasik asit hızlı boyalanmayı korur, normal faj hassasiyeti gösterir ve BSL-3 tesisleri dışında güvenli şekilde elealınabilir 25. Bu özellikler, mc27902'yi intravital görüntüleme yaklaşımları oluşturmak ve düşük biyogüvenlik muhafazası altında erken konak-patojen etkileşimlerini incelemek için ideal bir vekil yapar.
Burada, erken Mtb enfeksiyonunu sağlam fare akciğerinde görselleştirmek için MC 2 8471 ile MC28471 ile Yüksek Çözünürlüklü Görüntüleme Penceresi (WHRIL) uygularız; bu tüve, üç auxotrofik Mtb suşunun floresan tdTomato ekspresyonu olan türevidir. Deneyler, bağışıklık sistemi zayıf Rag2-/- fareler 26 ile MacBluefareleri 27 çaprazlanmış, Csf1r promotorunun monositlerde, mikrogliyalarda ve dendritik hücreler ile makrofajların alt kümelerinde geliştirilmiş siyan floresan proteinin (ECFP) ekspresyonu yönlendirdiği deneyler yapılmıştır. MacBlue transgeni, erken Mtb enfeksiyonu sırasında mononükleer fagosit popülasyonlarının net görselleştirilmesini sağlar. Sistemi en erken doğuştan ev konak-patojen etkileşimlerine odaklamak ve burada incelenen kısa görüntüleme penceresinde adaptif bağışıklık yanıtlarının ek karmaşıklığından kaçınmak için Rag2 eksikliği olan fareleri kullanmayı seçtik. Önemli olarak, bu teknik sadece Rag2 eksikliği olan farelerle sınırlı değildir ve bağışıklık yetkili hayvanlarda da uygulanabilir.
Kalıcı akciğer penceresini BSL-2 uyumlu floresan zayıflatılmış Mtb suşuyla birleştirerek, bu platform, aynı akciğer mikro ortamında basil-konak hücre etkileşimlerinin tek hücre çözünürlükte birkaç gün boyunca seri intravital görüntülemesini sağlar. Burada erken enfeksiyon için gösterilse de, platformun kendisi doğası gereği erken zaman noktalarıyla sınırlı değildir ve prensipte deneysel model ve çalışma tasarımına bağlı olarak sonraki aşamalara da uygulanabilir. Bu görüntüleme platformunun başarılı uygulanması, burada tanımlanan spesifik floresan bakteriler preparatının kullanımına bağlı olduğundan, bu reaktifi üretmek ve hazırlamak için gereken temel adımları tam protokolün bir parçası olarak dahil ettik. Bu platform, Mtb davranışlarının in vivo olarak doğrudan ve gerçek zamanlı görüntülemesini sağlar ve bakteriyel fizyoloji, konak tanıma ve bağışıklık aracılı temizlemenin gelecekteki mekanik çalışmaları için temel oluşturur.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Tüm prosedürler kurumsal biyogüvenlik ve hayvan bakım yönergelerine uygun olarak yürütüldü ve Albert Einstein Tıp Fakültesi Hayvan Bakımı ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylandı. mc28471 suşu, BSL-2 kullanımı için onaylanmış üçlü auxotrofik Mtb suşu olan mc27902'nin pYUB1169 dönüştürücüsüdür. Canlı bakterilerle ilgili tüm çalışmalar, mikobakterilerle ilgilenmek için standart önlemlerle gerçekleştirilmiştir.
1. BSL-2 onaylı tdDomates-ekspresyon Mtb sızı mc28471'in inşası
- plazmid dönüşümü ile tdDomates eksprese eden BSL-2-güvenli mc28471 üretimi
- BSL-2 onaylı üçlü oksotrofik suş mc27902'yi, G13 promotöründen ifade edilen tdTomato genini içeren epizomal mikobakteriyel plazmid pYUB1169 ile dönüştürerek floresan türev mc28471 oluşturuldu.
- 100 mL mc27902 (600 nm optik yoğunluğu 0,7-1,0) steril Middlebrook 7H9'a 100 mL aşılayın; OADC zenginleştirmesi (%10 (v/v)), gliserol (%0,2 (v/v)), D-pantotenat (24 mg/L), L-lösin (50 mg/L), L-arginin (200 mg/L), sodyum propionat (0,1 mM) ve tiloksapol (%0,05 (v/v)) ile desteklenerek 30 mL'lik mürekkep kutusu şişesine aşılanın.
- Kültürü inkubka edin, 37 °C'de yavaşça (100 rpm) sallayarak 0.7-1.0 arası OD600 nm'ye ulaşın.
- Hücreleri 15 mL'lik konik santrifüj tüpüne aktarın ve oda sıcaklığında 3.000 x g sıcaklıkta 10 dakika boyunca santrifüj yapın. Üst sıvıyı atın ve hücreleri %0,05 (v/v) tiloksapol içeren 10 mL steril %10 gliserolde yeniden süzülerek (yıkama #1). Santrifüjleme tekrarlanır ve 2 kez yıkayılır. Hücre pelletini %0,05 (v/v) tiloksapol içeren %10 gliserol içeren 0,175 mL içinde yeniden askıya alın ve 2 μL pYUB1169 DNA'sı (100-200 ng DNA) ekleyin.
- MC27902 ve pYUB1169'u 0,2 cm elektroporasyon küvetine aktarın. 10 dakika bekle. Küveti 2 ila 3 kez vurarak hava kabarcıklarını çıkarın ve oda sıcaklığında 2.500 mV, 1.000 Ω, 25 μF, zaman sabitisi 20 ms ile elektroporat yapın.
- 1 mL steril Middlebrook 7H9 ile desteklenen OADC zenginleştirme (%10 (v/v)), gliserol (%0,2 (v/v)), D-pantotenat (24 mg/L), L-lösin (50 mg/L), L-arginin (200 mg/L), sodyum propionat (0,1 mM) ve tiloksapol (%0,05 (v/v)) ile takviye edilerek küvetin içeriğini 15 mL konik santrifüj tüpüne aktarın. Tüpü gece boyunca 37 °C'de sallayarak kuluçka yapın.
- Dönüşüm karışımının 0,1 mL plakası, OADC zenginleştirmesi (%10 (v/v)), gliserol (%0,2 (v/v)), D-pantotenat (24 mg/L), L-lösin (50 mg/L), L-arginin (200 mg/L), sodyum propionat (0,1 mM) ve kanamisin (20 mg/L) ile desteklenen bir Middlebrook 7H10 agar levhasına yerleştirilir. Kalan dönüşüm karışımını santrifüjlen, 0.9 mL süpernatantı atacak ve hücre pelletini kalan süpernatantta yeniden süspansiyona yerleştirin. Yeniden askıya alınmış hücreleri, aynı takviyeler ve antibiyotikleri içeren ikinci bir Middlebrook 7H10 agar plakasına yerleştirin. Plakaları 37 °C'de 3–4 hafta boyunca kuluçka altına alın. Pembe koloniler başarılı transformantları gösterir.
- İzole bir pembe koloni seçin ve 37 °C'de, yavaşça sallanarak, 5 mL steril Middlebrook 7H9 ile OADC zenginleştirme (%10 (v/v)), gliserol (%0,2 (v/v)), D-pantotenat (24 mg/L), L-lösin (50 mg/L), L-arginin (200 mg/L), sodyum propionat (0,1 mM), tiloksapol (%0,05 (v/v)) ve 20 mg/L kanamisin ile 30 mL'lik mürekkep şişesinde yetiştirin.
- Damar içi enfeksiyon için mc28471 hazırlanması
- 37 °C'de, yavaş sallanarak, steril Middlebrook 7H9'da 10 mL mc28471 yetiştirin; OADC zenginleştiricisi (%10 (v/v)), gliserol (%0,2 (v/v)), D-pantotenat (24 mg/L), L-lösin (50 mg/L), L-arginin (200 mg/L), sodyum propionat (0,1 mM), tiloksapol (%0,05 (v/v)) ve 20 mg/L kanamisin ile 30 mL mürekkep şişesi ile orta günlük fazında (OD600 nm 0,7 ile 1,0 arasında olmalıdır).
- Hücreleri 15 mL'lik konik santrifüj tüpüne aktarın ve oda sıcaklığında 3.000 x g sıcaklıkta 10 dakika boyunca santrifüj yapın. Üst bakteriyi atın ve hücreleri %0,05 (v/v) tiloksapol (yıkama #1) içeren 10 mL steril fosfatla tamponlanmış tuzlu suyla yeniden süzülürler. Santrifüjleme tekrarlanır ve 2 kez yıkayılır. Hücre peletini 4 mL PBS-T ile yeniden askıya alın ve hücreleri 100 W güç, 2x 1.000 J gücünde sonikle geçirin.
- Kültürün optik yoğunluğunu ölçüp PBS-T ile seyreltirin ve enjeksiyon başına 5 x 106 CFU nihai konsantrasyon elde ederek, yaklaşık olarak 1 x 10 nm'nin 1 x 108 CFU/mL'ye karşılık geldiği dönüşümünü kullanın. Bu ilişki deformasyon ve büyüme koşullarına göre değişebileceğinden, OD600 nm, doğruluk ve tekrarlanabilirlik sağlamak için plakalı CFU değerlerine karşı ampirik olarak kalibre edilmelidir.
2. Farelerde intravital görüntüleme için kalıcı akciğer penceresi implantasyonu
- Bir Rag2KO MacBlue faresini intravital görüntüleme için hazırlayın. Bu çalışmada, 30 g ağırlığında 10 haftalık erkek bir fare kullanıldı. Ancak, her iki cinsiyetten de, 8-12 haftalık ve o yaş için beklenen kilo aralığında olan fareler bu işlem için uygundur. Bu suş, Rag2-knockout arka planında makrofajlarda gelişmiş camgöbeği floresan proteini (ECFP) eksprese eder ve B6.129S6-Rag2tm1FwaN12 fareleri (Rag2, Model RAGN12) ile Tg (Csf1r-GAL4/VP16, UAS-ECFP)1Hume/J fareleri (Stok No. 026051) çaprazlanarak üretilmiştir.
- Bakteriyel enfeksiyondan 24 saat önce akciğerin Yüksek Çözünürlüklü Görüntüleme Penceresini (WHRIL) implant ederek akciğere stabil optik erişim sağlanır ve görüntülemeden önce iyileşme sağlanır.
- Bir indüksiyon odasında %5 isofluran ile anestezi indüksiyonu yapın. Herhangi bir prosedüre başlamadan önce yeterli derinlikte anestezi doğrulamak ve ağrı, sıkıntı veya solunum dengesini önlemek için hayvanı ameliyat ve görüntüleme boyunca izlemek için izleyin.
- Ameliyat öncesi analjezi uygulanır: 90 μL steril PBS ile seyreltilmiş 10 μL (0,1 mg/kg) buprenorfin deri altına enjekte edilir.
- Anestezi sırasında korneanın kurumasını önlemek için her iki göze de oftalmik merhem uygulayın.
- 22G kateterin tabanına 2-0 ipek bir dikiş bağlayın, kateteri sabitlemek için ~2 inç kuyruklar bırakın.
- Fareyi dikiş bağlanmış kateterle entübe edin. Trakeal açıklığı transilluminasyonla görselleştirin ve yerleştirmesini şişirme ampulü (iki taraflı göğüs yükselişi) kullanarak onaylayın.
NOT: Yanlış entübe hava yolu travmasına veya yetersiz havalandırmaya yol açabilir. Doğru yerleşim çift taraflı göğüs genişletmesiyle doğrulandıktan sonra devam edin. - Başarılı entübüasyondan sonra 2-0 ipek dikişi burnun etrafına bağlayarak entübasyon kateterini sabitleyin. Kateteri ventilatöre bağlayın.
- Faresi, sol göğüs kısmını açığa çıkarmak için ısıtılmış cerrahi platforma sağ lateral dekubitus'a yerleştirin, ardından ön uzuvları, arka uzuvları ve arkayı bantla sabitleyerek işlem boyunca sabit pozisyon sağlanır.
- Ameliyatın geri kalanında izofluranı %3'e indirin. Sol üst göğüs bölgesindeki tüyleri depilatör krem ile çıkarın.
- Cerrahi alanı antiseptik bir çözeltiyle hazırlayın. Deriyi kaldırın ve yaklaşık 7 mm sternumun solunda ve subkostal kenarın 7 mm üzerinde 5-10 mm dairesel bir kesi (33-35-SH) yapılarak 6. ila 7. interkostal boşluğun ortasında bir biyopsi punch (33-35-SH) yapıldı.
- Açık alanda yüzeysel damarlar için kontrol edin. Görünür bir damarın bölünmesi gerekirse, hemostazı korumak için her iki ucu da yakabilirsiniz. Kaburgaları göğüs boşluğuna girmeden önce net bir şekilde ortaya çıkarmak için üzerindeki yumuşak dokuyu çıkarın.
- 6. veya 7. kaburgayı forsepsle tutup kaldırın ve akciğere bakan yuvarlak taraf olan kör mikro-diseksiyon makasıyla aralarındaki interkostal kası nazikçe delerek torakal boşluğa girin.
NOT: Akciğer, kostallar arası damarlar veya çevre dokuların kesilmemesi için torasik boşluğa nazikçe ve doğrudan görselleştirme altında girin. - Pencere açıklığını oluşturmadan önce bitişik akciğer yüzeyini geçici olarak söndürmek ve göğüs duvarından ayırmak için interkostal açıklığa kısa ve nazik sıkıştırılmış hava patlamaları uygulayın.
- Biyopsi delgesini kesici aletin üzerine yerleştirin ve kesme aletini interkostal açıklıktan geçirin, göğüs duvarına paralel tutun. Kaburga kafesinde 5 mm dairesel bir kusur aç.
- Dairesel kusurun kenarından ~1 mm uzakta, bitişik kaburgaların arasından geçerek açıklığı çevreleyen 5-0 ipek çanta ipi dikişi yerleştirin.
- Pencere çerçevesini, göğüs duvarı kusurunun kenarlarının çerçevenin yuvasına uyacak şekilde oturt, ardından çanta ipi dikişini sıkıp sabitleyerek çerçeveyi yerinde kilitleyin.
- 1 mL'lik bir şırıngaya siyanoakrilat jel yapıştırıcıyı yükleyin. Çerçeveyi akciğerden ayırmak için nazikçe kaldırın, ardından çerçevenin alt yüzeyine ince bir siyanoakrilat yapıştırıcı tabakası uygulayın.
- Akciğer yüzeyini, yüzey mat görünene kadar sürekli ve hafif bir sıkıştırılmış hava akışıyla kurutun.
NOT: Sadece hafif bir hava akışı kullanın ve uzun süreli kurutmadan kaçının; çünkü aşırı kuvvet veya aşırı kurutma akciğer yüzeyine zarar verebilir ve pencere yapışmasını bozabilir. - Pozitif uç ekspirasyon basıncı (PEEP) kullanılarak akciğeri şişirin ve ardından pencereyi çerçeveye yapıştırın. PEEP'i bırakın ve pencere çerçevesine 20-30 saniye boyunca baskı yapın.
NOT: Şişirme veya çerçeve yerleştirme sırasında aşırı basınç akciğeri zarar görebilir veya contayı bozabilir. Nazik bir dokunuş elde etmek için sadece gerekli minimum baskıyı uygulayın. - Deri kesi kenarından <1 mm mesafeye ikinci bir 5-0 ipek çanta ipi dikişi yerleştirin. Deriyi çerçevenin altına sıkıştırın, fazla derinin pencere çerçevesinin altına tutulduğundan veya kesildiğinden emin olun, ardından çanta ipi dikişini sıkıca sıkın sıkın bağlayın ve sıkıca bağlayın.
- Vakumlu manyetik kullanarak, 5 mm kaplama kapağının altına çok ince bir yapıştırıcı tabakası uygulayın, dikdörtgen bir kapak camının kenarındaki fazlalığı kazıyın. Yine, akciğer yüzeyini sürekli ve nazik bir sıkıştırılmış hava akışıyla kurutun.
- Dairesel kapak slipini pencere çerçevesinin girintisi içinde, akciğer yüzeyinin üzerinde sığ bir açıyla (~15°) konumlandırın. Akciğeri şişirmek için hava yolu basıncını kısa süreliğine artırın, ardından örtü kaydırmasını paralel bir konuma döndürerek akciğer yüzeyi camın alt yüzüne karşı durur. Yapıştırıcı sertleşirken yaklaşık 25 saniye hafif basıncı koruyun, ardından vakum manyetikini coverslip'ten çıkarın.
NOT: Örtü kaydırma yerleştirirken baloncukları yakalamak veya fazla yapıştırıcı uygulamaktan kaçının; çünkü bunlar görüntü kalitesini düşürebilir, mühürü bozabilir veya akciğer yüzeyine zarar verebilir. - Hava geçirmez mühürünü güçlendirmek için kapak ile metal çerçeve arasındaki arayüze az miktarda sıvı siyanoakrilat uygulayın.
- 1 mL insülin şırıngasına steril bir iğne takın. İğneyi xiphoid sürecinin hemen altına yerleştirin ve diyaframdan sol omza doğru göğüs boşluğuna doğru ilerleyin. Kalan intratorasik havayı almak için nazikçe aspirasyon yapın.
NOT: İğneyi dikkatlice ilerletin ki akciğer, kalp veya büyük damarları delmesin. Kalan hava giderilene kadar nazikçe ve sadece aspirasyon yapın. - İzofluranı kapatın ve neredeyse normal uyanık solunum hızı yeniden başlayana kadar %100 oksijenle ventilasyonu sürdürün. İyileşme sırasında hayvanı gözetimsiz bırakmayın. Normal spontan solunum hemen geri dönmezse, uygun destekleyici bakım sağlanabilir veya kurumsal yönergelere göre ötenazi yapın.
- Emniyet dikişini çıkarın, fareyi dışarı çıkarın ve iyileşme için temiz, ısıtılmış bir kafese yerleştirin. Hayvanı tam olarak hareket halindekine kadar izleyin; Normal solunumunu geri kazanamayan fareler kurumsal yönergelere göre ötenazi yapılmalıdır.
- Ameliyat sonrası analjezi uygulanır: 90 μL steril PBS ile seyreltilmiş 10 μL (0,1 mg/kg) buprenorfin deri altına enjekte edilir.
3. Intravital görüntüleme
- Pencere implantasyonundan sonra görüntülemeden önce farelerin iyileşmesine izin verin. Ameliyattan 1 ila 5 gün sonra görüntüleme yapılabilir.
- Anestezi %3 isofluran ile indüke edin, ardından görüntüleme süresince %1,5 seviyesinde kalın.
- Özel sahne plaka-pencere çerçevesi adaptörünü akciğer pencere çerçevesinin dış kenarı ile deri arasına yerleştirin ve standart bir mikroskop sahne plakasını yapışkan bantla sabitleyin.
- Özel sahne plaka-pencere çerçevesi adaptörüyle fareyi mikroskop çeviri aşamasına yerleştirin. Vücut sıcaklığını ~37 °C'de tutun, sıcaklık sensörü geri besleme döngüsü ile zorunlu hava ısıtmalı bir oda.
- Fare sahne plakasındayken enjeksiyon tarafında göz çevresindeki deriyi nazikçe geriye çekerek medial kantusu açığa çıkarın ve damar yapısını etiketlemek için retro-orbital olarak FITC-dextran (150 kDa; 20 mg/mL, 100 μL) enjekte edin.
- Bakteriyel enjeksiyondan önce akciğer damarlarının anlık görüntü, z-stack veya zaman geçişli görüntülerini aşağıdaki parametrelerle alın.
- Konfokal mikroskopi ayarları için: Bit derinliği: 12-bit, Kare hızı: 2 fps, Görüntü boyutu: 512 × 512 piksel, Piksel boyutu: 0.497 μm/piksel, 0.994 μm/piksel, Z-adım boyutu: 2 μm, Toplam z-derinliği: 50–70 μm, Çerçeve ortalaması: 3, Tarama hızı: 2 μs/piksel (977 satır/s), Lazer uyarılma dalga boyları: 405 nm, 488 nm, 559 nm, Örnekte lazer gücü: 230 μW (405 nm), 75 μW (488 nm), 40 μW (559 nm), Algılama filtreleri: 430-470 nm (Mavi), 505-540 nm (Yeşil), 575-675 nm (Kırmızı), Dedektör kazançları: Mavi için 800 V, Yeşil için 650 V, Kırmızı için 700 V, Iğne deliği çapı: 60 μm veya 559 nm için 1 Airy birimi
- Multifoton mikroskopi için, konfokal mikroskopi için kullanılan görüntüleme parametreleriyle aynı görüntüleme parametreleri kullanılır, ancak örnekte 25 mW lazer gücüne sahip 920 nm uyarılma lazeri kullanılır.
- Retro-yörüngesel olarak 5 x 106 CFU tdDomates-ekspresyon mc28471 enjekte edilir.
NOT: Geriye doğru enjeksiyonları yalnızca uygun eğitim ve kısıtlama ile yapın; yanlış teknik göz yaralanmasına, kanamaya veya aşılın başarısız yapılmasına yol açabilir. - 3.6.1 ve 3.6.2'deki görüntüleme parametreleriyle tüberküloz ve floresan etiketli hücreler ile damarların anlık görüntü, z-stack ve zaman geçişli görüntülerini alın. Tüm dedektörlerin kazancını sinyali maksimize etmek için ayarlayın ve dedektör doygunluğunu önleyin.
- Görüntülemeden sonra izofluranı kapatın ve fareyi mikroskoptan çıkarın. Fareyi sıcak tutun ve tam iyileşmeye kadar izleyin.
- MC28471 enjeksiyonundan sonraki zaman noktalarında görüntüleme tekrarlanın: 0-60 dakika, 6 saat ve 3 gün. Her görüntüleme seansı için, damar yapısını görselleştirmek için FITC-dextran (100 μL, retro-orbital) tekrar enjekte edilir, ardından 3.8-3.9. adımlarda açıklandığı görüntüler alınır.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Elektroporasyon ve kanamisin seçiliminin ardından, mc28471'in izole kolonileri parlak kırmızı floresans gösterdi ve bu da stabil tdDomates ekspresyonunu doğruladı. MC28471 basilleri genişletildi, tek hücreli süspansiyon olarak hazırlandı ve cerrahi olarak implante edilmiş WHRIL içeren farelere damar yoluyla uygulandı. Akciğer mikroçevresinde erken Mtb enfeksiyonu dinamiklerini görselleştirmek için intravital görüntüleme yapıldı. Bu çalışma için, akciğer damarlarının...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Bu platform, BSL-2 koşullarında sağlam memeli akciğer içindeki basil ve konak-hücre etkileşimlerinin doğrudan görselleştirilmesini sağlayarak tüberküloz araştırmalarındaki gerçek bir boşluğu kapatır. Önceki in vivo görüntüleme stratejileri, fiber optik mikroendoskopik uyarılma20 kullanılarak tüm vücut optik algılama, raporlayıcı enzim floresan görüntüleme21 ve yakın kızılötesi floresan protein ekspresyonu Mtb22
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar, rekabet eden finansal çıkarlar veya başka çıkar çatışmaları belirtmemektedir.
Teşekkürler
Bu çalışma, aşağıdaki hibelerle desteklendi: AI26170; Evelyn-Lipper Aile Vakfı ve Gruss Lipper Biyofotonik Merkezi. NCI Kanser Merkezi Hönesi P30 CA013330 tarafından desteklenen Analitik Görüntüleme Tesisi'nden desteği takdir ediyoruz.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 15 ml conical tube | Corning | 430790 | |
| 2-0 silk tie | Ethicon, Inc | LA55G | |
| 5 mm coverslip | Electron Microscopy Sciences | 72296-05 | |
| 5 mm disposable biopsy punch | Integra | 33-35-SH | |
| 5-0 silk purse-string suture | Ethicon, Inc | 640G | |
| Blunt micro-dissecting scissors | Roboz | RS-5980 | |
| Buprenorphine | Hospira | 0409-2012-32 | 10 μL buprenorfinin (0.3 mg/mL stok çözelti) 90 μL steril PBS'de (final doz = 0.1 mg/kg) seyreltilmiş haliyle enjekte edilir |
| Compressed air canister | Falcon | DPSJB-12 | |
| Cyanoacrylate adhesive | Loctite | 234790 | |
| D-calcium pantothenate | Acros | 243305000 | |
| ECM 630 Electroporation System Complete, with Safety stand | BTX Harvard Apparatus | 45-0051 | |
| Electroporation cuvette | Fisher Scientific | FB102 | |
| FITC-Dextran | Sigma-Aldrich | FD150S-1G | 150 kDa |
| Glycerol | Fisher Chemicals | G33-1 | |
| Graefe forceps | Roboz | RS-5135 | Akciğer pencere implantasyon prosedürü sırasında kaburga tutmak ve kaldırmak için |
| Isoflurane | Pivetal | 78949580 | |
| Isoflurane vaporizer | SurgiVet | VCT302 | |
| Kanamycin | Goldbio.com | K-120-25 | |
| L-arginine monohydrochloride | Sigma-Aldrich | A5131-100G | |
| L-leucine | Sigma-Aldrich | L8000 | |
| MacBlue mice | Jackson Labs | Strain #: 026051 | |
| Middlebrook 7H10 Agar | Difco | 262710 | |
| Middlebrook 7H9 broth | Difco | 271310 | |
| Middlebrook OADC Enrichment | Becton Dickinson | 212351 | |
| Murine ventilator | Kent Scientific | PS-02 | PhysioSuite |
| Nair | Church & Dwight Co., Inc. | 40002957 | |
| PBS | Corning | 21-031-CV | |
| PETG media inkwell bottle | Thermo Scientific | 342020 | |
| PhysioSuite | Kent Scientific | PS-5623 | Cerrahi sırasında entübasyon yoluyla farenin tidal hacmini izlemek için |
| Plasmid pYUB1169 | Custom made plasmid | ||
| Rag2 KO mice | Jackson Labs | Strain #: 008449 | |
| Small animal lung inflation bulb | Harvard Apparatus | 72-9083 | |
| Sodium propionate | Thermo Scientific | A17440.36 | |
| Sonicator | Fisher Scientific | FB705 | |
| Sorval Centrifuge X pro series | Thermo Scientific | 75009020 | |
| Spectrophotometer Genesys 10 UV | Thermo Spectronic | 335903 | |
| SurgiSuite | Kent Scientific | SURGI-M02 | Multi-Functional Surgical Platform for Mice, with Warming |
| Tracheal catheter | Exelint International | 26746 | 22G |
| Tyloxapol | Sigma-Aldrich | T0307-50G | |
| Vacuum pickup system metal probe | Ted Pella, Inc. | 528-112 |
Kaynaklar
- Scheele, C., et al. Multiphoton intravital microscopy of rodents. Nat Rev Methods Primers. 2 (1), 1-26 (2022).
- Niesner, R. A., Hauser, A. E., Entenberg, D. Life Through a Lens: Technological Development and Applications in Intravital Microscopy. Cytometry A. 97 (5), 445-447 (2020).
- Perrin, L., Bayarmagnai, B., Gligorijevic, B. Frontiers in Intravital Multiphoton Microscopy of Cancer. Cancer Rep (Hoboken). 3 (1), e1192(2020).
- Weigert, R., Porat-Shliom, N., Amornphimoltham, P. Imaging cell biology in live animals: ready for prime time. J Cell Biol. 201 (7), 969-979 (2013).
- Entenberg, D., Oktay, M. H., Condeelis, J. S. Intravital imaging to study cancer progression and metastasis. Nat Rev Cancer. 23 (1), 25-42 (2023).
- Borriello, L., Traub, B., Coste, A., Oktay, M. H., Entenberg, D. A Permanent Window for Investigating Cancer Metastasis to the Lung. J Vis Exp. (173), e62761(2021).
- Rodriguez-Tirado, C., et al. Long-term High-Resolution Intravital Microscopy in the Lung with a Vacuum Stabilized Imaging Window. J Vis Exp. (116), e62761(2016).
- Presson, R. G. Jr, et al. Two-photon imaging within the murine thorax without respiratory and cardiac motion artifact. Am J Pathol. 179 (1), 75-82 (2011).
- Looney, M. R., et al. Stabilized imaging of immune surveillance in the mouse lung. Nat Methods. 8 (1), 91-96 (2011).
- Entenberg, D., et al. A permanent window for the murine lung enables high-resolution imaging of cancer metastasis. Nat Methods. 15 (1), 73-80 (2018).
- Alieva, M., Ritsma, L., Giedt, R. J., Weissleder, R., van Rheenen, J. Imaging windows for long-term intravital imaging: General overview and technical insights. Intravital. 3 (2), e29917(2014).
- Prunier, C., Chen, N., Ritsma, L., Vrisekoop, N. Procedures and applications of long-term intravital microscopy. Methods. 128, 52-64 (2017).
- Davis, J. M., et al. Real-time visualization of mycobacterium-macrophage interactions leading to initiation of granuloma formation in zebrafish embryos. Immunity. 17 (6), 693-702 (2002).
- Egen, J. G., et al. Intravital imaging reveals limited antigen presentation and T cell effector function in mycobacterial granulomas. Immunity. 34 (5), 807-819 (2011).
- Egen, J. G., et al. Macrophage and T cell dynamics during the development and disintegration of mycobacterial granulomas. Immunity. 28 (2), 271-284 (2008).
- Magnen, M., et al. Immediate myeloid depot for SARS-CoV-2 in the human lung. Sci Adv. 10 (31), eadm8836(2024).
- Neupane, A. S., et al. Patrolling Alveolar Macrophages Conceal Bacteria from the Immune System to Maintain Homeostasis. Cell. 183 (1), 110-125.e11 (2020).
- Ueki, H., Wang, I. H., Zhao, D., Gunzer, M., Kawaoka, Y. Multicolor two-photon imaging of in vivo cellular pathophysiology upon influenza virus infection using the two-photon IMPRESS. Nat Protoc. 15 (3), 1041-1065 (2020).
- van de Wall, S., et al. Dynamic landscapes and protective immunity coordinated by influenza-specific lung-resident memory CD8(+) T cells revealed by intravital imaging. Immunity. 57 (8), 1878-1892.e5 (2024).
- Nooshabadi, F., et al. Intravital excitation increases detection sensitivity for pulmonary tuberculosis by whole-body imaging with beta-lactamase reporter enzyme fluorescence. J Biophotonics. 10 (6-7), 821-829 (2017).
- Sharan, R., Yang, H. J., Sule, P., Cirillo, J. D. Imaging Mycobacterium tuberculosis in Mice with Reporter Enzyme Fluorescence. J Vis Exp. (132), e56801(2018).
- Sommer, R., Cole, S. T. Monitoring Tuberculosis Drug Activity in Live Animals by Near-Infrared Fluorescence Imaging. Antimicrob Agents Chemother. 63 (12), e01280-19(2019).
- Castanheira, F. V. S., et al. Intravital imaging of three different microvascular beds in SARS-CoV-2-infected mice. Blood Adv. 7 (15), 4170-4181 (2023).
- Barlerin, D., et al. Biosafety Level 3 setup for multiphoton microscopy in vivo. Sci Rep. 7 (1), 571(2017).
- Vilcheze, C., et al. Rational Design of Biosafety Level 2-Approved, Multidrug-Resistant Strains of Mycobacterium tuberculosis through Nutrient Auxotrophy. mBio. 9 (3), e00938-18(2018).
- Shinkai, Y., et al. RAG-2-deficient mice lack mature lymphocytes owing to inability to initiate V(D)J rearrangement. Cell. 68 (5), 855-867 (1992).
- Ovchinnikov, D. A., et al. Expression of Gal4-dependent transgenes in cells of the mononuclear phagocyte system labeled with enhanced cyan fluorescent protein using Csf1r-Gal4VP16/UAS-ECFP double-transgenic mice. J Leukoc Biol. 83 (2), 430-433 (2008).
- Cohen, S. B., et al. Alveolar Macrophages Provide an Early Mycobacterium tuberculosis Niche and Initiate Dissemination. Cell Host Microbe. 24 (3), 439-446.e4 (2018).
- Pandey, A. K., Sassetti, C. M. Mycobacterial persistence requires the utilization of host cholesterol. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (11), 4376-4380 (2008).
- Bhatt, A., et al. Deletion of kasB in Mycobacterium tuberculosis causes loss of acid-fastness and subclinical latent tuberculosis in immunocompetent mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (12), 5157-5162 (2007).
- Hsu, T., et al. The primary mechanism of attenuation of bacillus Calmette-Guerin is a loss of secreted lytic function required for invasion of lung interstitial tissue. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (21), 12420-12425 (2003).
- Vilcheze, C., Porcelli, S. A., Chan, J., Jacobs, W. R. Jr Sterilization by Adaptive Immunity of a Conditionally Persistent Mutant of Mycobacterium tuberculosis. mBio. 12 (1), e02391-20(2021).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
