Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Araştırma makalesi

Lipopolisakkarit ile Hasarlanmış Caco-2 Hücrelerinde miR-29b-3p Bağlanması Yoluyla NEAT1-Aracılı Bağırsak Bariyeri Disfonksiyonu

105 görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/71021

⸱

14 Ağustos 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Internal Medicine, Heyuan Street Community Healthcare Center of Heilongjiang Province Daqing City Datong District, 2Department of Gastroenterology, The Second Hospital of Hebei Medical University, 3Department of Gastroenterology, Shanghai Pudong New Area People's Hospital, 4Department of organ Transplantation, Shanxi Bethune Hospital, Shanxi Academy of Medical Sciences, Third Hospital of Shanxi Medical University, Tongji Shanxi Hospital

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Bu çalışma, diyare baskın iritabl bağırsak sendromunda NEAT1'in diagnostik bir belirteç ve intestinal bariyer disfonksiyonunun bir regülatörü olarak değerlendirilmesini amaçlamıştır. NEAT1 düzeylerinin hasta serumunda arttığı, miR-29b-3p'ye bağlandığı ve nakavt edildiğinde lipopolisakkarit ile hasarlanmış Caco-2 hücrelerinde bariyer, apoptoz ve inflamatuar okumaların iyileştiği görülmüştür.

Özet

Diyare ağırlıklı irritabl bağırsak sendromunun (IBS-D) patogenezi belirsizdir ve mevcut tedaviler sınırlı kalmaktadır. Bu çalışma, IBS-D'de NEAT1'in tanısal değerini değerlendirmiş ve potansiyel düzenleyici mekanizmasını araştırmıştır. Toplam 116 IBS-D hastası ve 116 sağlıklı kontrol dahil edilmiştir. Serum NEAT1 ve miR-29b-3p seviyeleri ters transkripsiyon kantitatif gerçek zamanlı PCR (RT-qPCR) ile tespit edilmiş ve tanısal değeri değerlendirmek için alıcı işletim karakteristik (ROC) eğrileri kullanılmıştır. Mekanizma çalışmaları için lipopolisakkarit (LPS) ile işlem görmüş bir Caco-2 intestinal epitel hücre modeli oluşturulmuştur. Hücre canlılığı Cell Counting Kit-8 (CCK-8) analiziyle, apoptoz akış sitometrisiyle, bariyer bütünlüğü transepitelyal elektriksel direnç (TEER) ile ve ZO-1, okludin ve klaudin-2 mRNA seviyeleri RT-qPCR ile değerlendirilmiştir. NEAT1 ve miR-29b-3p arasındaki bağlanma ilişkisini doğrulamak için çift-lüsiferaz raporlayıcı (DLR) ve RNA immünopresipitasyon (RIP) analizleri kullanılmıştır. IBS-D'li hastalarda NEAT1 yüksek düzeyde, miR-29b-3p ise düşük düzeyde eksprese edilmiş ve seviyeleri arasında güçlü bir negatif korelasyon görülmüştür. NEAT1 nakavtunun, LPS ile işlem görmüş Caco-2 hücrelerinde miR-29b-3p seviyelerini artırdığı, hücre canlılığını ve TEER'i iyileştirdiği, apoptozu azalttığı, ZO-1 ve okludin mRNA seviyelerini artırdığı, klaudin-2 mRNA seviyelerini düşürdüğü ve bariyer hasarıyla ilişkili okumaları hafiflettiği saptanmıştır. Birlikte değerlendirildiğinde bu sonuçlar, serum NEAT1'in IBS-D için aday bir biyobelirteç olduğunu ve NEAT1/miR-29b-3p aksının intestinal bariyer disfonksiyonunda rol oynayabileceğini göstermektedir.

Giriş

İshal ile seyreden irritabl bağırsak sendromu (IBS-D); abdominal ağrı, abdominal distansiyon ve değişmiş bağırsak alışkanlıkları ile karakterize yaygın bir fonksiyonel gastrointestinal bozukluktur1. Günümüzde, IBS-D'nin patofizyolojik mekanizması henüz tam olarak aydınlatılmamıştır2. Tedavi yöntemleri çoğunlukla semptomatik rahatlamaya yöneliktir, sınırlı etkililiğe sahiptir ve nüks oranı yüksektir3. IBS-D'nin genellikle beyin-bağırsak aksı disregülasyonu, visseral hipersensitivite, düşük dereceli intestinal inflamasyon ve bariyer disfonksiyonu gibi birden fazla faktörün etkileşimini içerdiği kabul edilmektedir4,5. Bu kriterler tanıyı bir dereceye kadar standardize etmiş olsa da, sübjektiftirler ve özellikle hastanın semptomları inflamatuar bağırsak hastalığı veya diğer organik hastalıklar ile örtüştüğünde tanısal gecikmelere veya yanlış sınıflandırmalara yol açabilirler. Rutin klinik pratikte, şu an için IBS-D için doğrulanmış objektif biyobelirteçler bulunmamaktadır. Bu nedenle, tanı koymada kullanılabilecek ve potansiyel terapötik değeri olan yeni bir moleküler hedef araştırmak, güncel IBS-D araştırma alanında acil bir ihtiyaç haline gelmiştir.

Son yıllarda, epigenetik düzenlemede kilit moleküller olan uzun kodlamayan RNA'lar, çeşitli hastalıklar genelinde tanısal belirteçler ve terapötik hedefler olarak büyük bir potansiyel göstermiştir6,7. IBS-D'nin temel nedeni bağırsak bariyer fonksiyonunun bozulmasıdır8. Sıkı bağlantı proteinlerinin yıkımı, mukozal bağışıklık yanıtını aktive eden "bağırsak sızıntısına" yol açar9,10. Bağışıklık sisteminin aktivasyonu, bağırsak immün-sinir sistemini aktive ederek bağırsak disfonksiyonuna neden olabilecek çok sayıda pro-inflamatuar faktörün salınmasına yol açar. Çalışmalar, bazı lncRNA'ların bağırsak epitel bariyerini düzenleyebileceğini göstermiştir11,12. NEAT1'in kolit hastalarının kolonik mukoza dokusunda yukarı yönlü düzenlendiği bildirilmiştir13. LncRNA NEAT1 inhibisyonu, ülseratif kolitte bağırsak epitel hücrelerindeki (IEC'ler) disfonksiyonu hafifletebilir14. Ancak, IBS-D'de NEAT1 ekspresyon profili ve tanısal değeri henüz araştırılmamıştır. Ayrıca, NEAT1 tanısal bir biyobelirteç olarak potansiyele sahip olabilir15. Eğer IBS-D hastalarının serumunda NEAT1 anormal şekilde eksprese ediliyorsa, bu durum moleküler bir tanı aracı sağlayarak mevcut Rome IV kriterlerini tamamlayabilir. Bu sırada, miRNA ekspresyon profili de IBS hastalarında önemli ölçüde değişmiştir. Örneğin, miR-29b-3p ekspresyonunun aşağı yönlü düzenlenmesi IBS patogenezi ile ilişkilendirilmiştir16. Ancak, IBS-D'de miR-29b-3p ekspresyonunu yöneten yukarı akış düzenleyici mekanizmalar tamamen keşfedilmemiş durumdadır. Özellikle, bu mekanizma diğer hastalıklarda iyi tanımlanmış olsa da17,18, IBS-D bağlamında NEAT1'in miR-29b-3p için rekabetçi endojen bir RNA (ceRNA) olarak rolü hiç araştırılmamıştır. Dahası, önceki çalışmalar öncelikle doku düzeyindeki ekspresyona odaklanmış olsa da, dolaşımdaki NEAT1'in IBS-D tanısı için non-invaziv bir serum biyobelirteci olma potansiyeli tamamen bilinmemektedir.

lncRNA-NEAT1'in, miR-29b-3p'yi süngerleyen bir ceRNA olarak hareket ederek IBS-D'de bağırsak bariyer fonksiyonunun düzenlenmesinde rol oynayabileceğini hipotez ediyoruz. Yukarıdaki araştırma geçmişine dayanarak, bu çalışma şunları amaçlamaktadır: (1) IBS-D hastalarının serumundaki NEAT1 ve miR-29b-3p seviyelerini ve bunların tanısal değerini değerlendirmek; (2) NEAT1 ve miR-29b-3p arasındaki doğrudan bağlanma etkileşimini doğrulamak; ve (3) LPS ile işlem görmüş bir Caco-2 hücre modeli kullanarak bağırsak bariyer bütünlüğü ve inflamasyonun düzenlenmesinde NEAT1/miR-29b-3p aksının fonksiyonel rolunu aydınlatmak.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Hastaların dahil edilmesi

Tüm katılımcılar, araştırma içeriğini tam olarak anladıktan sonra yazılı bilgilendirilmiş onam vermiştir. Shanghai Pudong New Area People's Hospital Etik Kurulu bu araştırma protokolünü incelemiş ve onaylamıştır (No. 2024k007). Örneklem büyüklüğü G*Power kullanılarak hesaplanmıştır: seçilen test t-testi olup istatistiksel test, iki bağımsız örneklem arasındaki farkları tespit etmek üzere tasarlanmıştır. d = 0.5 etki büyüklüğü, α = 0.05 ve güç = 0.9 ile yapılan hesaplama, her gruba en az 86 deneğin dahil edilmesi gerektiğini göstermiştir. Deney sırasında oluşabilecek öngörülemeyen durumları hesaba katmak için her gruba 116 hasta dahil edilmiştir. Temmuz 2024 ile Temmuz 2025 tarihleri arasında Shanghai Pudong New Area People's Hospital'a başvuran IBS-D tanılı toplam 116 hasta, deney grubu olarak bu çalışmaya dahil edilmiştir. Dahil edilme kriterleri şunlardı: (1) Rome IV tanı kriterlerini karşılayan IBS-D; (2) kolonoskopide mukozada organik lezyon saptanmaması. Hariç tutma kriterleri: (1) inflamatuar bağırsak hastalığı (IBD), kolorektal kanser vb. olan hastalar; (2) diyabetik hastalar; (3) yakın zamanda abdominal cerrahi öyküsü olan hastalar ve (4) şiddetli kalp, karaciğer veya böbrek yetmezliği olan hastalar. Bu arada, hastaların yaş ve cinsiyet gibi demografik özelliklerine uygun 116 sağlıklı gönüllü, kontrol grubu olarak seçilmiştir. Sağlıklı kontrollerin kronik gastrointestinal hastalık öyküsü veya ilgili klinik semptomlarının olmadığı teyit edilmiştir. Tüm deneklerden beş mililitre periferik venöz kan alınmıştır. Süpernatant, daha sonraki RNA ekstraksiyonu öncesinde kriyokorunma amacıyla -80 °C ultra düşük sıcaklıkta bir buzdolabına aktarılmıştır.

Her katılımcı tarafından aşağıdaki klinik belirtileri kaydetmek için 10 günlük bir anket doldurulmuştur: (a) 10 puanlık görsel analog skala kullanılarak abdominal ağrı şiddetinin değerlendirilmesi; (b) anket süresince abdominal ağrının sıklığı (ağrılı gün sayısı); (c) dışkılama sıklığı (günlük maksimum dışkılama sayısı); (d) dışkı özelliklerini değerlendirmek için Bristol Dışkı Formu Ölçeği. Deneklerin duygusal durumu, Hastane Anksiyete ve Depresyon Ölçeği (HADS) kullanılarak değerlendirilmiştir.

Hücre kültürü ve modelleme

Caco-2 hücreleri, %10 fetal bovine serum (FBS) ve %1 penisilin–streptomisin içeren Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) besiyerinde, 37 °C ve %5 CO₂ sıcaklığındaki bir inkübatörde rutin olarak kültüre edildi. Caco-2 hücre hattı, olgun bağırsak epitel hücrelerine benzer morfolojik ve fonksiyonel özellikler sergileyerek, sıkı bağlantılara ve mikrovillüslere sahip polarize bir hücre monokatmanına kendiliğinden farklılaşır. LPS, bağırsak epitelyumunda inflamatuar bir yanıtı tetikler ve sıkı bağlantıları bozarak bağırsak geçirgenliğini artırır; bu süreç IBS-D'nin patolojik özelliklerine oldukça benzerdir. Ayrıca, LPS ile işlem görmüş Caco-2 hücrelerinin, IBS ile ilişkili bariyer disfonksiyonu ve inflamasyonu modellemek için önceki çalışmalarda19,20,21 yaygın olarak kullanılmış olması nedeniyle, bu çalışmada IBS-D'nin in vitro bir modelini oluşturmak için Caco-2 hücrelerinin lipopolisakkarit (LPS) ile tedavisi seçilmiştir. Hücreler yaklaşık %80 konfluense ulaştığında, kültür besiyeri 5 µg/ml LPS içeren tam besiyeri ile değiştirilmiş22 ve hücreler 24 sa boyunca stimüle edilmiştir. LPS uygulanmadan konvansiyonel olarak kültüre edilen hücreler kontrol grubu olarak kullanılmıştır.

Hücre transfeksiyonu

Caco-2 hücrelerinde NEAT1 ve miR-29b-3p'nin rollerini araştırmak için Caco-2 hücreleri transfekte edildi. Hücreler şu şekilde altı gruba ayrıldı: 1. kontrol grubu (tedavi uygulanmadı); 2. LPS grubu; 3. LPS + si-NC grubu; 4. LPS + si-NEAT1 grubu; 5. LPS + si-NEAT1 + inhibitör NC grubu ve 6. LPS + si-NEAT1 + miR-29b-3p inhibitör grubu. NEAT1'i hedefleyen iki küçük müdahale RNA'sı (si-NEAT1) tasarlandı ve sentezlendi: si-NEAT1_1 (5′-GCCTTGTAGATGGAGCTTGC-3′) ve si-NEAT1_2 (5′-GUGAGAAGUUGCUUAGAAAUU-3′). Negatif kontrol olarak hedef dışı rastgele bir sekansa sahip siRNA (si-NC) kullanıldı. Aynı zamanda miR-29b-3p inhibitörü ve bunun negatif kontrolü de sentezlendi. miR-29b-3p inhibitörü: 5’-AACACUGAUUUCAAAUGGUGCUA-3’. Negatif kontrol: 5’-CAGUACUUUUGUGUAGUACAA-3’.

Caco-2 hücreleri 24 kuyucuklu plakalara ekildi ve üretici protokolü takip edilerek kültürler %60–70 konfluens düzeyine ulaştığında transfekte edildi. Kısaca, 50 nM son siRNA konsantrasyonu elde etmek için 1,25 µL siRNA, 25 µL düşük serumlu ortamda seyreltildi. miRNA inhibisyonu için, 2 µL miR-29b-3p inhibitörü veya negatif kontrolü, 25 µL düşük serumlu ortamda 100 nM son konsantrasyona seyreltildi. Ayrı olarak, 1,5 µL transfeksiyon reaktifi, 25 µL düşük serumlu ortamla karıştırıldı. Ardından seyreltilmiş siRNA (veya inhibitör/negatif kontrol), transfeksiyon kompleksini oluşturmak üzere seyreltilmiş transfeksiyon reaktifi ile karıştırıldı ve hücrelere damla damla eklendi. Transfeksiyondan altı saat sonra, transfeksiyon karışımı taze tam ortamla değiştirildi ve hücreler, sonraki fonksiyonel analizlerden önce 48 saat daha inkübe edildi. Diğer deneylerden önce, knockdown veya inhibisyon verimliliği RT-qPCR ile doğrulandı.

Gerçek zamanlı kantitatif ters transkripsiyon PCR (RT-qPCR)

Belirtilen işlemlere tabi tutulan serum örneklerinden ve Caco-2 hücrelerinden toplam RNA izole edildi. Kısaca, her örnek 1 mL RNA ekstraksiyon reaktifi ile lizlendi ve 200 µL kloroform ile birleştirildi. 4 °C'de 15 dakika boyunca 12,000 × g santrifüj sonrası, üst sulu faz yeni bir tüpe aktarıldı, 500 µL izopropanol ile karıştırıldı ve 30 dakika boyunca −20 °C'de bekletildi. Örnekler daha sonra 4 °C'de 10 dakika boyunca 12,000 × g hızda santrifüj edildi. Elde edilen RNA peleti %75 etanol ile iki kez yıkandı, havada kurutuldu ve 20 µL RNase-free su içinde yeniden süspanse edildi. RNA verimi ve saflığı bir mikro-spektrofotometre ile ölçüldü ve yalnızca A260/A280 değerleri 1,8–2,0 olan örnekler kullanıldı. RNA, üreticinin protokolü takip edilerek cDNA'ya ters transkripsiyonla geçirildi. NEAT1, ZO-1, occludin, claudin-2 ve GAPDH tespiti için, 1× RT tamponu, 0,5 mM dNTP'ler, 0,5 µM oligo(dT) primeri, 200 U ters transkriptaz ve RNase-free su içeren her 20 µL'lik ters transkripsiyon reaksiyonu için 1 µg toplam RNA kullanıldı. Reaksiyon 37 °C'de 15 dakika boyunca gerçekleştirildi ve ardından 85 °C'de 5 saniye boyunca enzim inaktivasyonu yapıldı.

SYBR Green tabanlı bir gerçek zamanlı PCR sistemi kullanılarak, şablon olarak cDNA ile kantitatif PCR gerçekleştirildi. NEAT1, miR-29b-3p, ZO-1, occludin, ve claudin-2 ekspresyon seviyeleri gene özgü primerlerle ölçüldü. miR-29b-3p için referans gen olarak U6 kullanılırken, NEAT1 ve sıkı bağlantı (tight junction) ile ilişkili genleri normalize etmek için GAPDH kullanıldı. Bağıl ekspresyon, 2−ΔΔCt yöntemi kullanılarak hesaplandı. Primer dizileri Tablo 1'de listelenmiştir.

Hücre canlılığı analizi

Logaritmik fazdaki Caco-2 hücreleri, kuyuk başına 1 × 104 hücre olacak şekilde 96 kuyucuklu plakalara ekildi. Her grupta 5–6 duble kuyucuk bulunacak şekilde; bir boş kontrol grubu (yalnızca kültür ortamı içeren), bir kontrol grubu (işlem görmemiş hücreler) ve bir deney grubu (farklı işlem koşulları altındaki Caco-2 hücreleri) oluşturuldu. Hücreler 0, 24, 48 ve 72 sa şeklinde dört farklı zaman noktasına ayrıldı. Ölçümler sırasında inkübatörün sürekli açılmasını önlemek için her zaman noktası için ayrı bir kültür plakası hazırlandı. Kültür süresinin ardından, her kuyucuğa hava kabarcığı oluşmamasına dikkat ederek 10 µL CCK-8 solüsyonu eklendi. Sonrasında kültür plakası, 37 °C, %5 CO₂ içeren inkübatöre geri yerleştirildi ve 2 sa boyunca karanlıkta inkübe edildi. Her kuyucuğun absorbsansı, bir mikroplaka okuyucu kullanılarak derhal 450 nm'de ölçüldü. Son olarak hücre canlılığı yüzde olarak ifade edildi.

Hücre apoptoz analizi

Apoptoz, Annexin V-FITC/PI boyamasının ardından akış sitometrisi ile nicelendirildi. Her tedavi grubundaki Caco-2 hücreleri hasat edildi ve buz gibi soğuk PBS ile iki kez durulandı. Santrifüj işlemi 4 °C'de 5 dk boyunca 300 × g hızda gerçekleştirildi. Hücre peleti daha sonra 100 µL 1× bağlama tamponunda resüspande edildi ve ardından sırayla 5 µL Annexin V-FITC ve 5 µL PI eklendi. Nazikçe karıştırıldıktan sonra örnekler, oda sıcaklığında, karanlıkta 15 dk boyunca inkübe edildi. Sonrasında, 300 µL 1× bağlama tamponu eklendi ve süspansiyon, 5 mL'lik bir akış sitometrisi tüpüne aktarılmadan önce dikkatlice karıştırıldı. Örnekler 1 saat içerisinde akış sitometrisi ile analiz edildi.

Transepitelyal elektriksel direnç (TEER)

Geçirgenlik, Caco-2 hücrelerinin TEER değerleri ölçülerek değerlendirilmiştir23. Caco-2 hücreleri Transwell odacıklarına ekilmiş ve yoğun bir monokatman oluşturması için 21 gün boyunca kültüre edilmiştir. Her bir deneysel koşul altında altı bağımsız biyolojik tekrarlanan işlem ve ayrıca her koşul altında beş teknik tekrarlanan işlem gerçekleştirilmiştir. Deneysel işlemden önce ve sonra, her grubun TEER değerleri, etanolle sterilize edilmiş ve PBS ile dengelenmiş elektrotlar kullanılarak bir transmembran direnç ölçer ile ölçülmüştür. Kısaca, filtre membranı ile temastan kaçınmak için elektrodun uzun çubuğu bazolateral kültür ortamına, kısa çubuğu ise apikal kültür ortamına daldırılmıştır. Stabilizasyon sonrası direnç değeri (Ω) okunmuş ve üç tutarlı okuma elde edilene kadar ölçümler tekrarlanmıştır. Hücre içermeyen boş Transwell filtrelerinin direnci aynı koşullar altında ölçülmüş ve bu değer tüm deneysel okumalardan çıkarılmıştır. TEER (Ω·cm2) = (örnek direnci – boş filtre direnci) × etkili membran alanı. Veriler şu şekilde sunulmuştur: (deney grubu/kontrol grubu) × 100%.

Enzim bağlı immünosorbent assay (ELISA)

Farklı tedavi gruplarındaki Caco-2 hücrelerinin süpernatantları, 24 saatlik kültürden sonra toplandı. Tümör nekroz faktör-alfa (TNF-α), interlökin-6 (IL-6), interlökin-8 (IL-8) ve interlökin-1β (IL-1β) dahil olmak üzere pro-inflamatuar sitokinlerin seviyeleri, üretici talimatlarına uygun olarak ticari ELISA reaktifleri kullanılarak ölçüldü. Analiz, talimatlara kesinlikle uygun olarak gerçekleştirildi. Örnekler ve standartlar, antikorlarla önceden kaplanmış kuyucuklara eklendi, ardından inkübe edildi ve yıkandı. Sonrasında, biyotinize deteksiyon antikoru eklendi. Bir başka inkübasyon ve yıkama işleminin ardından, horseradish peroksidaz ile işaretlenmiş streptavidin eklendi. Son olarak, renk gelişimi için TMB substratı eklendi ve reaksiyon durdurma solüsyonu ile sonlandırıldı. Her bir kuyucuğun absorbansı, bir mikroplaka okuyucu kullanılarak hemen 450 nm'de ölçüldü.

Western blot

Proteinler, belirtilen işlemlerden sonra proteaz inhibitörleri içeren RIPA tamponu kullanılarak Caco-2 hücrelerinden izole edildi. Protein seviyeleri bicinchoninic acid (BCA) testi ile ölçüldü. Her örnek için, kuyucuk başına 30 µg protein yüklendi, %10 SDS-PAGE jellerinde çözümlendi ve PVDF membranlara aktarıldı. Membranlar, oda sıcaklığında 1 saat boyunca %5 yağsız süt ile bloke edildi ve ardından 4 °C'de gece boyunca ZO-1 (1:1.000), occludin (1:500), claudin-2 (1:1.000) ve GAPDH (1:5.000) karşıtı antikorlar ile inkübe edildi. Yıkama işleminin ardından membranlar, oda sıcaklığında 1 saat boyunca HRP-konjuge ikincil antikorlar ile inkübe edildi. Bantlar, gelişmiş kemilüminesans (ECL) ile tespit edildi ve bant yoğunluğu ImageJ kullanılarak analiz edildi. GAPDH, yükleme kontrolü olarak kullanıldı.

Çift lusiferaz raporlayıcı (DLR) analizi

miR-29b-3p'nin NEAT1 dizisindeki potansiyel bağlanma bölgeleri ENCORI veri tabanı (https://rnasysu.com/encori/) aracılığıyla tahmin edilmiştir. Ardından, vahşi tip (WT) veya mutant (MUT) bağlanma bölgelerini içeren NEAT1 fragmanları pmirGLO raporlayıcı vektörüne klonlanmıştır. Oluşturulan rekombinant plazmid, miR-29b-3p mimikleri (Sense: 5’-UAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU-3’; Antisense: 5’-CACUGAUUUCAAAUGGUGCUAUU-3’) veya inhibitörleri ve bunlara karşılık gelen negatif kontrolleriyle (mimik NC, Sense: 5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’; Antisense: 5’-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3’) birlikte hücrelere ko-transfekte edilmiştir. Transfeksiyondan kırk sekiz saat sonra hücreler toplanmış ve ateş böceği lusiferaz ile renilla lusiferaz aktiviteleri, dual lusiferaz tespit reajeni kullanılarak belirlenmiştir. Renilla lusiferaz aktivitesi, standardizasyon için internal referans olarak kullanılmıştır.

RNA İmmünopresipitasyon (RIP) analizi

RIP analizi için, Caco-2 hücreleri hasat edildi, PBS ile durulandı ve proteaz ile RNase inhibitörleri eklenmiş 200 µL RIP lizis tamponunda buz üzerinde 15 dk inkübe edildi. Hücre lizatları 4 °C'de 10 dk boyunca 16,000 × g hızda santrifüj edildi ve her süpernatanttan 10 µL girdi kontrolü olarak saklandı. İmmünopresipitasyon için, 40 µL Protein A/G manyetik boncukları, 200 µL RIP yıkama tamponu içerisinde 5 µg anti-Ago2 antikoru veya normal IgG ile oda sıcaklığında 30 dk boyunca rotasyonda tutuldu. 500 µL RIP yıkama tamponu ile üç kez yıkandıktan sonra, 100 µL boncuk süspansiyonu 100 µL lizat ile birleştirildi, RIP yıkama tamponu ile final hacmi 1 mL'ye ayarlandı ve rotasyonla 4 °C'de gece boyu inkübe edildi. Ardından boncuklar 500 µL RIP yıkama tamponu ile beş kez yıkandı ve aynı tamponun 150 µL'si içinde yeniden süspanse edildi. Protein sindirimi, 15 µL proteinaz K (20 mg/mL) ve 15 µL %10 SDS eklenmesinin ardından 55 °C'de 30 dk boyunca çalkalama ile inkübasyon yapılarak gerçekleştirildi. Süpernatant toplandı, RNA ekstraksiyon reaktanı ile izole edildi ve gece boyu çöktürüldü. Daha sonra NEAT1 ve miR-29b-3p zenginleşmesi RT-qPCR ile değerlendirildi.

Hücre altı lokalizasyon analizi

Caco-2 hücreleri, üretici talimatlarına uygun olarak, referans verilen ticari olarak mevcut nükleer-sitoplazmik ayırma reaktifi kullanılarak nükleer ve sitoplazmik fraksiyonlara ayrılmıştır. Bu iki bileşenden toplam RNA ekstrakte edilmiş ve NEAT1'in çekirdek ve sitoplazmadaki dağılımı RT-qPCR ile tespit edilmiştir. Kalibrasyon, ayırma verimliliğinin göstergeleri olarak U6 (esas olarak nükleer) ve GAPDH mRNA'sı (esas olarak sitoplazmik) kullanılarak gerçekleştirilmiştir.

İstatistiksel analiz

Klinik serum örnekleri için yapılan güç analizi (t-testi, d = 0.5, α = 0.05, güç = 0.9), grup başına minimum 86 deneğin gerekli olduğunu göstermiştir. Çalışma sırasında oluşabilecek öngörülemeyen durumları hesaba katmak amacıyla, klinik olarak anlamlı farkları tespit etmek için her gruba 116 hasta dahil edilmiştir. Sürekli değişkenler için veri normalliği Shapiro-Wilk testi kullanılarak değerlendirilmiştir. Tüm sürekli veriler normal dağılım gösterdiğinden (P > 0.05), parametrik analizler uygulanmıştır. Kategorik değişkenler ki-kare testi kullanılarak analiz edilmiştir. Hücre bazlı deneyler, her bir biyolojik replika için beş teknik replika olmak üzere altı bağımsız biyolojik replika içermektedir. Veriler ortalama ± SD olarak sunulmuştur. İki sürekli değişken grubu arasındaki karşılaştırmalar Student's t-testi ile gerçekleştirilirken, birden fazla grup arasındaki karşılaştırmalar tek yönlü ANOVA ve ardından Tukey post hoc testi ile analiz edilmiştir. İstatistiksel anlamlılık P < 0.05 olarak tanımlanmıştır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

NEAT1 ekspresyonu ve diagnostik değeri

Sağlıklı kontrol (HC) grubuyla karşılaştırıldığında, IBS-D hastalarındaki NEAT1 ekspresyon seviyeleri belirgin şekilde daha yüksekti (P < 0.0001; Şekil 1A). Alıcı işletim karakteristik (ROC) eğrisi ile gösterilen NEAT1 eğri altı alanı (AUC) 0,867'dir (%95 GA: 0,821–0,913). Özgüllüğü %75,9, duyarlılığı ise %84,5 olarak belirlenmiştir (Şekil 1B

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

IBS-D, yaygın bir fonksiyonel gastrointestinal bozukluktur. Patolojik mekanizması henüz tam olarak aydınlatılmamıştır. Son yıllarda, epigenetik düzenlemede anahtar moleküller olan lncRNA'lar, hastalık teşhis ve tedavisi alanında büyük potansiyel göstermiştir. LncRNA NEAT1; kolorektal kanser24, gliyom25 ve miyokard enfarktüsü26 gibi çeşitli hastalıklar üzerinde çalışılmıştır. Çok sayıda çalışma, NEAT1'in inflamatuar yanıtların

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar beyan edecek herhangi bir çıkar çatışmasına sahip değildir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
24 kuyucuklu plakalarCorningCLS3524Hücre ekimi için
96 kuyucuklu plakalarCorningCLS3599CCK-8 analizlerinde hücre ekimi için
Annexin V-FITC/PI apoptoz kitiInvitrogenV13242Apoptoz oranlarının belirlenmesi için
Anti-AGO2 Monoklonal antikorProteintech67934-1-IgAgo2-bağlı RNA komplekslerinin immün çöktürmesi için
Anti-Claudin-2 antikoruInvitrogen32-5600Primer antikor, seyreltme 1:1000
Anti-GAPDH antikoruCell Signaling Technology5174Primer antikor, seyreltme 1:5000; yükleme kontrolü
Anti-Human IgG antikoruProteintech10284-1-APRIP analizi için negatif kontrol olarak kullanılır
Anti-Occludin antikoruAbcamab31721Primer antikor, seyreltme 1:500
Anti-ZO-1 antikoruProteintech21773-1-APPrimer antikor, seyreltme 1:1000
Caco-2 hücreleriSUNNCELLSNL-068Bağırsak epitelyal bariyer modelleri oluşturmak için
CCK-8 kitiSolarbioCA1210Hücre Proliferasyon Analiz Kiti
KloroformSigma-AldrichC2432RNA ekstraksiyonunda faz ayrımı için
DMEM medyumuGibco11965092Hücre kültürü için
Dual-Luciferase Reporter Assay KitThermoFisher16186Lusiferaz aktivitesini belirlemek için
ELISA kiti (IL-1β için)R&D SystemsDY201Hücre kültürü süpernatantlarındaki hedef proteinleri belirlemek için
ELISA kiti (IL-6 için)R&D SystemsD6050BHücre kültürü süpernatantlarındaki hedef proteinleri belirlemek için
ELISA kiti (IL-8 için)R&D SystemsNBP3-28022Hücre kültürü süpernatantlarındaki hedef proteinleri belirlemek için
ELISA kiti (TNF-α için)R&D SystemsDTA00DHücre kültürü süpernatantlarındaki hedef proteinleri belirlemek için
Geliştirilmiş kemilüminesans (ECL) substratıThermo Fisher32106Protein bantlarını görüntülemek için
Ethanol (%75)Sigma-Aldrich459844RNA peletini yıkamak için
FBS (Fetal Bovine Serum)Gibco10099141Hücre kültürü için
Akış sitometresiBeckman CoulterB53002Apoptoz oranlarını belirlemek için
HRP-konjuge sekonder antikorlarCell Signaling Technology7074ECL substratlarından kemilüminesans sinyal üretimini katalize eder
İzopropanolSigma-Aldrich1133502500RNA çöktürme için
Lipofectamine 3000ThermoFisherL3000015Transfeksiyon reaktifi
Lipopolisakkarit (LPS)Sigma-AldrichL2880Hücre modeli kurulumunu indüklemek için
Mikroplaka okuyucuBioTekEpoch 296 kuyucuklu plakalardaki örneklerin absorbansını belirlemek için
Nanodrop mikro-spektrofotometreThermo ScientificND-2000CRNA konsantrasyonunu ve saflığını belirlemek için
Yağsız kuru sütCoolaberCN7861Membranları bloke etmek için (%5 çözelti)
PARIS KitiThermo FisherAM1921Nükleer-sitoplazmik fraksiyonlama için
Penisilin–StreptomisinGibco15140122Hücre büyümesi sırasında kontaminasyon direncini sağlamak için
Pierce BCA Protein Assay KitThermo Fisher23225Protein konsantrasyonlarını belirlemek için
pmirGLO Dual-Luciferase vektörüPromegaE1330Dual lusiferaz rapor gen vektörü
PrimeScript RT Reagent KitTakaraRR047ARNA'nın cDNA'ya ters transkripsiyonu için
PVDF membranMilliporeIPVH00010SDS-PAGE sonrası protein transferi için
Real-time floresan kantitatif PCR cihazıApplied Biosystems4365464Hedef genleri belirlemek için
RIPA liz tamponu (proteaz inhibitörleri ile)Thermo Fisher89901Hücrelerden toplam protein ekstraksiyonu için
RNA-Binding Protein Immunoprecipitation KitSigma-Aldrich17-701Protein A/G Manyetik Boncuklar Kullanılarak RNA-Bağlayan Protein İmmün Çöktürme (RIP) Analizi
SDS-PAGE reaktifleri (%10 jel)TargetMolC0189Proteinleri moleküler ağırlıklarına göre ayırmak için
SYBR Green master mixThermo Fisher4309155PCR testlerinde kullanım için
TEER ölçer (Volt-Ohm Metre)MilliporeMERS00002Transmembran Direnç Ölçer, Tek Katman Bütünlüğünü Ölçer
Transwell odacıklarıCorning CostarCLS3413Hücre monokatmanlarını kültüre etmek ve TEER ölçümü yapmak için
TRIzol reaktifiInvitrogen15596026CNToplam RNA ekstraksiyonu için

Kaynaklar

  1. Ren M, Ma J, Qu M. Network pharmacology integrated with molecular docking and molecular dynamics simulations to explore the mechanism of Shaoyao Gancao Tang in the treatment of asthma and irritable bowel syndrome. Medicine (Baltimore). 2024;103(50).
  2. Zhao C, Zhou X, Shi X. The influence of Nav1.9 channels on intestinal hyperpathia and dysmotility. Channels (Austin). 2023;17(1):2212350.
  3. Jiang J, et al. Effectiveness of Tong-Xie-Yao-Fang combined with Si-Ni-San for irritable bowel syndrome: a protocol for systematic review and meta-analysis. Medicine (Baltimore). 2021;100(11).
  4. Lenoir M, Wienke J, Fardao-Beyler F, Roese N. An 8-week course of Bifidobacterium longum 35624 is associated with a reduction in the symptoms of irritable bowel syndrome. Probiotics Antimicrob Proteins. 2025;17(1):315-27.
  5. Tao E, et al. Early life stress induces irritable bowel syndrome from childhood to adulthood in mice. Front Microbiol. 2023;14:1255525.
  6. Biswas S, et al. Expressions of serum lncRNAs in diabetic retinopathy: a potential diagnostic tool. Front Endocrinol (Lausanne). 2022;13:851967.
  7. Li W, et al. Functional roles of non-coding RNAs in panvascular diseases. J Vis Exp. 2025;(226).
  8. Shin SY, et al. The effect of phloroglucinol in patients with diarrhea-predominant irritable bowel syndrome: a randomized, double-blind, placebo-controlled trial. J Neurogastroenterol Motil. 2020;26(1):117-27.
  9. Yang S, et al. Ginseng-derived nanoparticles alleviate inflammatory bowel disease via the TLR4/MAPK and p62/Nrf2/Keap1 pathways. J Nanobiotechnology. 2024;22(1):48.
  10. Zhang J, et al. Role of the gut microbiota in complications after ischemic stroke. Front Cell Infect Microbiol. 2024;14:1334581.
  11. Chen S, et al. The role of lncRNAs in regulating the intestinal mucosal mechanical barrier. Biomed Res Int. 2021;2021:2294942.
  12. Lu Q, et al. The role of long noncoding RNAs in intestinal health and diseases: a focus on the intestinal barrier. Biomolecules. 2023;13(11):1674.
  13. Li F, et al. Knockdown of long non-coding RNA NEAT1 relieves inflammation of ulcerative colitis by regulating the miR-603/FGF9 pathway. Exp Ther Med. 2022;23(2):131.
  14. Ni S, Liu Y, Zhong J, Shen Y. Inhibition of lncRNA NEAT1 alleviates intestinal epithelial cells dysfunction in ulcerative colitis by maintaining the homeostasis of the glucose metabolism through the miR-410-3p-LDHA axis. Bioengineered. 2022;13(4):8961-71.
  15. Aparicio P, et al. Serum lncRNAs NEAT1, PVT1 and H19 as novel biomarkers for sarcopenia diagnosis and treatment response. Noncoding RNA Res. 2025;14:166-76.
  16. Martínez C, et al. miR-16 and miR-125b are involved in barrier function dysregulation through the modulation of claudin-2 and cingulin expression in the jejunum in IBS with diarrhoea. Gut. 2017;66(9):1537-8.
  17. Che F, et al. Lnc NEAT1/miR-29b-3p/Sp1 form a positive feedback loop and modulate bortezomib resistance in human multiple myeloma cells. Eur J Pharmacol. 2021;891:173752.
  18. Zhang Y, et al. LncRNA NEAT1/miR-29b-3p/BMP1 axis promotes osteogenic differentiation in human bone marrow-derived mesenchymal stem cells. Pathol Res Pract. 2019;215(3):525-31.
  19. Ludidi S, et al. The intestinal barrier in irritable bowel syndrome: subtype-specific effects of the systemic compartment in an in vitro model. PLoS One. 2015;10(5).
  20. Fan Z, et al. Investigation of the biomarkers and mechanism based on endoplasmic reticulum stress in irritable bowel syndrome. Arab J Gastroenterol. 2025;26(4):337-46.
  21. Zhang H, Xiong Z, He Y, Su H, Jiao Y. Cimifugin improves intestinal barrier dysfunction by upregulating SIRT1 to regulate the NRF2/HO-1 signaling pathway. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 2025;398(3):2897-908.
  22. Zhang Y, et al. Decreased expression of microRNA-510 in intestinal tissue contributes to post-infectious irritable bowel syndrome via targeting PRDX1. Am J Transl Res. 2019;11(12):7385-97.
  23. Li BR, et al. In vitro and in vivo approaches to determine intestinal epithelial cell permeability. J Vis Exp. 2018;(140).
  24. Zhang M, et al. The lncRNA NEAT1 activates Wnt/β-catenin signaling and promotes colorectal cancer progression via interacting with DDX5. J Hematol Oncol. 2018;11(1):113.
  25. Liang J, Liu C, Xu D, Xie K, Li A. LncRNA NEAT1 facilitates glioma progression via stabilizing PGK1. J Transl Med. 2022;20(1):80.
  26. Yu Q, et al. Silencing of lncRNA NEAT1 alleviates acute myocardial infarction by suppressing miR-450-5p/ACSL4-mediated ferroptosis. Exp Cell Res. 2024;442(2):114217.
  27. Gong Z, Zhang Y, Jiang Y, Chen P, Ji J. LncRNA NEAT1 targets miR-342-3p/CUL4B to inhibit the proliferation of cutaneous squamous cell carcinoma cells. J Oncol. 2022;2022:8145129.
  28. Han M, et al. LncRNA NEAT1 protects uremic toxin-induced intestinal epithelial barrier injury by regulating miR-122-5p/Occludin axis. PLoS One. 2025;20(5).
  29. Cui J, Wang J, Lv Y, Xu D. LncRNA NEAT1 regulates infantile pneumonia by sponging miR-146b. Mol Biotechnol. 2021;63(8):694-701.
  30. Xiao P, et al. LncRNA NEAT1 regulates chondrocyte proliferation and apoptosis via targeting miR-543/PLA2G4A axis. Hum Cell. 2021;34(1):60-75.
  31. Wu X, et al. Aberrant expressions of circulating lncRNA NEAT1 and microRNA-125a are linked with Th2 cells and symptom severity in pediatric allergic rhinitis. J Clin Lab Anal. 2022;36(3).
  32. Wang K, Liu Y, Chai Y. NEAT1/miR-181a-5p/HMGB1 axis regulates macrophage polarization and inflammation in sepsis models. J Vis Exp. 2026;(227).
  33. Tojo González R, et al. Síndrome de intestino irritable: papel de la microbiota y probióticos [Irritable bowel syndrome; gut microbiota and probiotic therapy]. Nutr Hosp. 2015;31(Suppl 1):83-8.
  34. Hwang HJ, et al. Ferulic acid as a protective antioxidant of human intestinal epithelial cells. Antioxidants (Basel). 2022;11(8):1448.
  35. Wu Y, et al. Probiotics (Lactobacillus plantarum HNU082) supplementation relieves ulcerative colitis by affecting intestinal barrier functions, immunity-related gene expression, gut microbiota, and metabolic pathways in mice. Microbiol Spectr. 2022;10(6).
  36. Kuo WT, et al. The tight junction protein ZO-1 is dispensable for barrier function but critical for effective mucosal repair. Gastroenterology. 2021;161(6):1924-39.
  37. Furuse M, et al. Occludin: a novel integral membrane protein localizing at tight junctions. J Cell Biol. 1993;123(6 Pt 2):1777-88.
  38. Wang Z, et al. Binding of Trichinella spiralis C-type lectin with syndecan-1 on intestinal epithelial cells mediates larval invasion of intestinal epithelium. Vet Res. 2023;54(1):86.
  39. Kaya İslamoğlu ZG, Unal M, Küçük A. Atopic dermatitis in adults and irritable bowel syndrome: a cross-sectional study. Indian J Dermatol. 2019;64(5):355-9.
  40. Ma C, et al. LncRNA PTS-1 protects against osteoarthritis through the miR-8085/E2F2 axis. J Inflamm Res. 2025;18:347-66.
  41. Tong Y, Zhou Z, Tang J, Feng Q. miR-29b-3p inhibits the inflammation injury in human umbilical vein endothelial cells by regulating SEC23A. Biochem Genet. 2022;60(6):2000-14.
  42. Li Z, et al. miR-29b-3p protects cardiomyocytes against endotoxin-induced apoptosis and inflammatory response through targeting FOXO3A. Cell Signal. 2020;74:109716.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

NEAT1 EkspresyonuLipopolisakkarit HasarIBS D BiyobelirteciRT qPCRH cre Canl lBariyer B t nlApoptoz Analizi
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.