Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Araştırma makalesi
* These authors contributed equally
Bu çalışma, diyare baskın iritabl bağırsak sendromunda NEAT1'in diagnostik bir belirteç ve intestinal bariyer disfonksiyonunun bir regülatörü olarak değerlendirilmesini amaçlamıştır. NEAT1 düzeylerinin hasta serumunda arttığı, miR-29b-3p'ye bağlandığı ve nakavt edildiğinde lipopolisakkarit ile hasarlanmış Caco-2 hücrelerinde bariyer, apoptoz ve inflamatuar okumaların iyileştiği görülmüştür.
Diyare ağırlıklı irritabl bağırsak sendromunun (IBS-D) patogenezi belirsizdir ve mevcut tedaviler sınırlı kalmaktadır. Bu çalışma, IBS-D'de NEAT1'in tanısal değerini değerlendirmiş ve potansiyel düzenleyici mekanizmasını araştırmıştır. Toplam 116 IBS-D hastası ve 116 sağlıklı kontrol dahil edilmiştir. Serum NEAT1 ve miR-29b-3p seviyeleri ters transkripsiyon kantitatif gerçek zamanlı PCR (RT-qPCR) ile tespit edilmiş ve tanısal değeri değerlendirmek için alıcı işletim karakteristik (ROC) eğrileri kullanılmıştır. Mekanizma çalışmaları için lipopolisakkarit (LPS) ile işlem görmüş bir Caco-2 intestinal epitel hücre modeli oluşturulmuştur. Hücre canlılığı Cell Counting Kit-8 (CCK-8) analiziyle, apoptoz akış sitometrisiyle, bariyer bütünlüğü transepitelyal elektriksel direnç (TEER) ile ve ZO-1, okludin ve klaudin-2 mRNA seviyeleri RT-qPCR ile değerlendirilmiştir. NEAT1 ve miR-29b-3p arasındaki bağlanma ilişkisini doğrulamak için çift-lüsiferaz raporlayıcı (DLR) ve RNA immünopresipitasyon (RIP) analizleri kullanılmıştır. IBS-D'li hastalarda NEAT1 yüksek düzeyde, miR-29b-3p ise düşük düzeyde eksprese edilmiş ve seviyeleri arasında güçlü bir negatif korelasyon görülmüştür. NEAT1 nakavtunun, LPS ile işlem görmüş Caco-2 hücrelerinde miR-29b-3p seviyelerini artırdığı, hücre canlılığını ve TEER'i iyileştirdiği, apoptozu azalttığı, ZO-1 ve okludin mRNA seviyelerini artırdığı, klaudin-2 mRNA seviyelerini düşürdüğü ve bariyer hasarıyla ilişkili okumaları hafiflettiği saptanmıştır. Birlikte değerlendirildiğinde bu sonuçlar, serum NEAT1'in IBS-D için aday bir biyobelirteç olduğunu ve NEAT1/miR-29b-3p aksının intestinal bariyer disfonksiyonunda rol oynayabileceğini göstermektedir.
İshal ile seyreden irritabl bağırsak sendromu (IBS-D); abdominal ağrı, abdominal distansiyon ve değişmiş bağırsak alışkanlıkları ile karakterize yaygın bir fonksiyonel gastrointestinal bozukluktur1. Günümüzde, IBS-D'nin patofizyolojik mekanizması henüz tam olarak aydınlatılmamıştır2. Tedavi yöntemleri çoğunlukla semptomatik rahatlamaya yöneliktir, sınırlı etkililiğe sahiptir ve nüks oranı yüksektir3. IBS-D'nin genellikle beyin-bağırsak aksı disregülasyonu, visseral hipersensitivite, düşük dereceli intestinal inflamasyon ve bariyer disfonksiyonu gibi birden fazla faktörün etkileşimini içerdiği kabu....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Hastaların dahil edilmesi
Tüm katılımcılar, araştırma içeriğini tam olarak anladıktan sonra yazılı bilgilendirilmiş onam vermiştir. Shanghai Pudong New Area People's Hospital Etik Kurulu bu araştırma protokolünü incelemiş ve onaylamıştır (No. 2024k007). Örneklem büyüklüğü G*Power kullanılarak hesaplanmıştır: seçilen test t-testi olup istatistiksel test, iki bağımsız örneklem arasındaki farkları tespit etmek üzere tasarlanmıştır. d = 0.5 etki büyüklüğü, α = 0.05 ve güç = 0.9 ile yapılan hesaplama, her gruba en az 86 deneğin dahil edilmesi gerektiğini göstermiştir. Deney sırasında oluşabilecek öngörülemeyen durumları....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
NEAT1 ekspresyonu ve diagnostik değeri
Sağlıklı kontrol (HC) grubuyla karşılaştırıldığında, IBS-D hastalarındaki NEAT1 ekspresyon seviyeleri belirgin şekilde daha yüksekti (P < 0.0001; Şekil 1A). Alıcı işletim karakteristik (ROC) eğrisi ile gösterilen NEAT1 eğri altı alanı (AUC) 0,867'dir (%95 GA: 0,821–0,913). Özgüllüğü %75,9, duyarlılığı ise %84,5 olarak belirlenmiştir (Şekil 1B
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
IBS-D, yaygın bir fonksiyonel gastrointestinal bozukluktur. Patolojik mekanizması henüz tam olarak aydınlatılmamıştır. Son yıllarda, epigenetik düzenlemede anahtar moleküller olan lncRNA'lar, hastalık teşhis ve tedavisi alanında büyük potansiyel göstermiştir. LncRNA NEAT1; kolorektal kanser24, gliyom25 ve miyokard enfarktüsü26 gibi çeşitli hastalıklar üzerinde çalışılmıştır. Çok sayıda çalışma, NEAT1'in inflamatuar yanıtların
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yazarlar beyan edecek herhangi bir çıkar çatışmasına sahip değildir.
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 24 kuyucuklu plakalar | Corning | CLS3524 | Hücre ekimi için |
| 96 kuyucuklu plakalar | Corning | CLS3599 | CCK-8 analizlerinde hücre ekimi için |
| Annexin V-FITC/PI apoptoz kiti | Invitrogen | V13242 | Apoptoz oranlarının belirlenmesi için |
| Anti-AGO2 Monoklonal antikor | Proteintech | 67934-1-Ig | Ago2-bağlı RNA komplekslerinin immün çöktürmesi için |
| Anti-Claudin-2 antikoru | Invitrogen | 32-5600 | Primer antikor, seyreltme 1:1000 |
| Anti-GAPDH antikoru | Cell Signaling Technology | 5174 | Primer antikor, seyreltme 1:5000; yükleme kontrolü |
| Anti-Human IgG antikoru | Proteintech | 10284-1-AP | RIP analizi için negatif kontrol olarak kullanılır |
| Anti-Occludin antikoru | Abcam | ab31721 | Primer antikor, seyreltme 1:500 |
| Anti-ZO-1 antikoru | Proteintech | 21773-1-AP | Primer antikor, seyreltme 1:1000 |
| Caco-2 hücreleri | SUNNCELL | SNL-068 | Bağırsak epitelyal bariyer modelleri oluşturmak için |
| CCK-8 kiti | Solarbio | CA1210 | Hücre Proliferasyon Analiz Kiti |
| Kloroform | Sigma-Aldrich | C2432 | RNA ekstraksiyonunda faz ayrımı için |
| DMEM medyumu | Gibco | 11965092 | Hücre kültürü için |
| Dual-Luciferase Reporter Assay Kit | ThermoFisher | 16186 | Lusiferaz aktivitesini belirlemek için |
| ELISA kiti (IL-1β için) | R&D Systems | DY201 | Hücre kültürü süpernatantlarındaki hedef proteinleri belirlemek için |
| ELISA kiti (IL-6 için) | R&D Systems | D6050B | Hücre kültürü süpernatantlarındaki hedef proteinleri belirlemek için |
| ELISA kiti (IL-8 için) | R&D Systems | NBP3-28022 | Hücre kültürü süpernatantlarındaki hedef proteinleri belirlemek için |
| ELISA kiti (TNF-α için) | R&D Systems | DTA00D | Hücre kültürü süpernatantlarındaki hedef proteinleri belirlemek için |
| Geliştirilmiş kemilüminesans (ECL) substratı | Thermo Fisher | 32106 | Protein bantlarını görüntülemek için |
| Ethanol (%75) | Sigma-Aldrich | 459844 | RNA peletini yıkamak için |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | Gibco | 10099141 | Hücre kültürü için |
| Akış sitometresi | Beckman Coulter | B53002 | Apoptoz oranlarını belirlemek için |
| HRP-konjuge sekonder antikorlar | Cell Signaling Technology | 7074 | ECL substratlarından kemilüminesans sinyal üretimini katalize eder |
| İzopropanol | Sigma-Aldrich | 1133502500 | RNA çöktürme için |
| Lipofectamine 3000 | ThermoFisher | L3000015 | Transfeksiyon reaktifi |
| Lipopolisakkarit (LPS) | Sigma-Aldrich | L2880 | Hücre modeli kurulumunu indüklemek için |
| Mikroplaka okuyucu | BioTek | Epoch 2 | 96 kuyucuklu plakalardaki örneklerin absorbansını belirlemek için |
| Nanodrop mikro-spektrofotometre | Thermo Scientific | ND-2000C | RNA konsantrasyonunu ve saflığını belirlemek için |
| Yağsız kuru süt | Coolaber | CN7861 | Membranları bloke etmek için (%5 çözelti) |
| PARIS Kiti | Thermo Fisher | AM1921 | Nükleer-sitoplazmik fraksiyonlama için |
| Penisilin–Streptomisin | Gibco | 15140122 | Hücre büyümesi sırasında kontaminasyon direncini sağlamak için |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher | 23225 | Protein konsantrasyonlarını belirlemek için |
| pmirGLO Dual-Luciferase vektörü | Promega | E1330 | Dual lusiferaz rapor gen vektörü |
| PrimeScript RT Reagent Kit | Takara | RR047A | RNA'nın cDNA'ya ters transkripsiyonu için |
| PVDF membran | Millipore | IPVH00010 | SDS-PAGE sonrası protein transferi için |
| Real-time floresan kantitatif PCR cihazı | Applied Biosystems | 4365464 | Hedef genleri belirlemek için |
| RIPA liz tamponu (proteaz inhibitörleri ile) | Thermo Fisher | 89901 | Hücrelerden toplam protein ekstraksiyonu için |
| RNA-Binding Protein Immunoprecipitation Kit | Sigma-Aldrich | 17-701 | Protein A/G Manyetik Boncuklar Kullanılarak RNA-Bağlayan Protein İmmün Çöktürme (RIP) Analizi |
| SDS-PAGE reaktifleri (%10 jel) | TargetMol | C0189 | Proteinleri moleküler ağırlıklarına göre ayırmak için |
| SYBR Green master mix | Thermo Fisher | 4309155 | PCR testlerinde kullanım için |
| TEER ölçer (Volt-Ohm Metre) | Millipore | MERS00002 | Transmembran Direnç Ölçer, Tek Katman Bütünlüğünü Ölçer |
| Transwell odacıkları | Corning Costar | CLS3413 | Hücre monokatmanlarını kültüre etmek ve TEER ölçümü yapmak için |
| TRIzol reaktifi | Invitrogen | 15596026CN | Toplam RNA ekstraksiyonu için |
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.