Serum lncRNA CASC11'in Omurilik Yaralanmasında Yaralanma Şiddeti ve İltihap ile Bağlantısı

Özet

Omurilik yaralanması (SCI) hastalarında, CASC11 regulasyonu yaralanma şiddetiyle ilişkilidir. In vitro, CASC11 aşağı regulasyonu apoptoz ve iltihabı hafifletmiştir; bu da miR-130b-5p/SPP1 ekseniyle ilişki göstermektedir. Bu sonuçlar, CASC11'in SCI patogenezinde biyobelirteç adayı olarak potansiyel rolünü öne sürmektedir.

Özet

Omurilik yaralanması (SCI), şiddetli bir merkezi sinir sistemi travmasıdır. Bu tek merkezli, gözlemsel ve in vitro çalışma, klinik serum örnekleri ve lipopolisakkarit uyarılı hücre modelleri kullanarak CASC11'in tanısal potansiyelini ve SCI'deki olası düzenleyici mekanizmasını araştırdı. CASC11, miR-130b-5p ve SPP1 seviyeleri gerçek zamanlı nicel polimeraz zincir reaksiyonu (RT-qPCR) ile ölçüldü. Hücresel işlevler ve hedefleme ilişkileri, hücre sayma kiti-8 (CCK-8), akış sitometrisi, western blot, enzimle bağlantılı immünosorbent testi (ELISA), çift lusiferaz raporlayıcısı ve RNA immünopresipitasyon (RIP) testleri aracılığıyla değerlendirildi. CASC11 , SCI'de yüksek derecede ekspresyona ulaşmış ve potansiyel bir tanısal biyobelirteç olarak iltihaplanma ile ilişkilendirilmiştir. Lipopolisakkarit (LPS) ile tedavi edilen PC-12 hücrelerinde, CASC11'in susturulması, baskılanmış hücre aktivitesini, apoptozu ve iltihabı hafifletmiştir; bu durum miR-130b-5p inhibitörü tarafından tersine çevrilmiştir. Bu bulgular, CASC11'in SCI şiddetiyle ilişkili olduğunu, in vitro veriler ise CASC11/miR-130b-5p/SPP1 ekseni üzerinden inflamatuar ve apoptotik yanıtlarda rol oynadığını göstermektedir. Bu çalışma, tek merkezli tasarımı ve in vivo doğrulamanın eksikliği nedeniyle sınırlıdır.

Giriş

Omurilik yaralanması (SCI), dış kuvvetler veya hastalıklar nedeniyle omurilik hasarından kaynaklanan geçici veya kalıcı sistemik bir bozukluktur; motor, duyusal, refleks ve otonom sinir sistemi fonksiyonlarının bozulmasına^{yol açar 1,2}. Hastalar sık sık ömür boyu süren fiziksel fonksiyonel eksiklikler ve komplikasyonlarla karşılaşır; bu da bireyler ve aileler üzerinde önemli acı ve yük yükletir. SCI'nin etiyolojisi genel olarak travmatik ve travmatik olmayan kökenler^{olarak sınıflandırılır 3}. Travmatik yaralanmalar, çoğunlukla trafik kazaları, yüksekten düşmeler ve sporla ilgili olaylar gibi dış etkiler nedeniyle omurga kırıklarından kaynaklanan travmatik yaralanmalar, SCI^4'ün klinik yönetiminde giderek artan bir zorluktur. Bu arada, birincil yaralanmadan sonra başlayan ikincil hasar zinciri, özellikle inflamatuar yanıtın düzensizliği ve nöronal apoptoz, nörolojik fonksiyonun sürekli bozulmasına katkıda bulunan kritik faktörler olarak kabul edilmektedir. Son çalışmalar,^{SCI 5'in} patofizyolojisi ve onarımında nöroinflamasyon, rejenerasyon ve fonksiyonel iyileşmenin kritik rolünü vurgulamıştır. Merkezi bir ikincil yanıt olarak, nöroinflamasyon doku hasarı ve onarım sürecinde çift rol oynar. Yaralı omuriliğin sınırlı rejeneratif kapasitesi göz önüne alındığında, anti-inflamatuar tedavi, hücre nakli, rehabilitasyon ve moleküler müdahaleleri birleştiren sinerjistik bir terapötik yaklaşım gereklidir⁶. SCI için çeşitli tanısal ve terapötik stratejiler oluşturulmuş olsa da, mevcut klinik uygulama ağırlıklı olarak görüntüleme muayenelerine^{dayanmaktadır 7}. Ancak, bu teknikler, ileri ekipman gereksinimleri, sıkı hasta ön koşulları ve önemli finansal masraflar nedeniyle^{sınırlıdır 8}. Sonuç olarak, uygun, doğru ve invaziv olmayan bir laboratuvar biyobelirteçine acil ve karşılanmamış bir ihtiyaç vardır. Böyle bir belirteçin tanımlanması, geleneksel tedavi protokollerini bozmadan SCI'nin erken teşhisini mümkün kılar ve böylece daha zamanında ve etkili terapötik müdahalelerin geliştirilmesini kolaylaştırır.

Uzun kodlamayan RNA (lncRNA), protein kodlama potansiyeli olmamasına rağmen, iltihap ve apoptozun düzenlenmesi gibi geniş bir biyolojik fonksiyon yelpazesinin ayrılmaz bir parçası olan fonksiyonel^{RNA moleküllerinin ana kategorisini temsil eder 9}. LNCRNA'lar, mikroRNA'lar (miRNA'lar) için moleküler sünger olarak hareket eder ve böylece bu miRNA'ların hedef mRNA'larına bağlanmasını ve susturmasını etkili bir şekilde^{engeller 10}. Örneğin, lncRNA MAGI2-AS3, miR-223-3p'yi hızlandırarak kırık iyileşmesini^{hızlandırır.} LNCRNA OIP5-AS1/miR-128-3p/Nrf2 ağını hedeflemek, SCI^12'de iyileşmeyi iyileştirmek için umut vadeden bir terapötik yaklaşım sunar. 8q24.21 kromozomunda bulunan 872 bp transkriptiyle karakterize edilen CASC11, çeşitli insan kanserlerinde düzensiz ekspresyona sahip bir molekül olarak^{tanınmaktadır 13}. CASC11, menopoz sonrası osteoporozlu hastalarda pozitif ifade gösterir ve etkilenen bireyleri sağlıklı kontrol kontrollerinden ayırt etme yeteneğine^{sahiptir 14}. Ayrıca, CASC11 kırıkları olan hastalarda benzer bir yukarı regülasyon deseni ve terapötik potansiyel gösterir¹⁵. Bu raporlara dayanarak, CASC11 inflamatuar yanıtları ve hücre aktivitesini düzenleyebilir. Bu içgörülerin farkında olmalarına rağmen, CASC11'in SCI'deki ifade deseni ve biyolojik rolü tamamen bilinmemektedir. Hiperinflamasyon ve apoptozun ikincil SCI'nin başlıca nedenleri olduğu göz önüne alındığında, CASC11'in SCI'de aday bir biyobelirteç ve düzenleyici faktör olabileceğini varsaydık. Bu çalışma, SCI'de CASC11'in klinik ilişkisini ve biyobelirteç potansiyelini, hasta kohortları ve in vitro hücre modellerini analiz ederek incelemiştir (Şekil 1). Ayrıca, SCI sonrası inflamatuar yanıtın modülasyonunda potansiyel rolünü de dahil olmak üzere CASC11'in olası moleküler mekanizmasını inceledik.

Protokol

Derslerin kaydı

Ocak 2023'ten Mayıs 2025'e kadar hastanede tedavi edilen akut omurilik travması (n = 300) olan hastalar, Amerikan Omurilik Yaralanma Ölçeği'ne (AIS sınıflandırması) göre tam omurilik yaralanması (CSCI) grubu (A derecesi, n = 98), eksik omurilik yaralanması (ISCI) grubu (B, C ve D; n = 95) ve normal nörolojik fonksiyon (NNF) grubu (E, n = 107) grubuna (derece E, n = 107) olarak seçildi ve sınıflandırıldı. NNF grubundaki hastalarda, şişme, kontüzyon veya kompresyon gibi SCI'nin radyolojik kanıtları manyetik rezonans görüntüleme (MR) ile doğrulandı, ancak duyusal veya motor eksiklikler gösterilmedi. Aynı dönemde alınan 90 sağlıklı katılımcı daha kontrol grubu olarak seçildi. Dahil etme kriterleri şunlardı: (1) SCI tanısı görüntüleme (MRI veya BT) ile doğrulanmış, yerleşik klinik yönetim^{kılavuzlarına uygun olarak 16}; (2) hastaneye yatıştan 24 saat önce yaşanan travma; ve (3) tam klinik verilere sahip yetişkin katılımcılar. Eleme kriterleri şunlardı: (1) kırık veya SCI ile ilgili önceki ameliyat geçmişi; (2) ağır koroner arter hastalığı veya belirgin kardiyopulmoner hastalık; (3) akut şiddetli kranioserebral yaralanma; ve (4) kötü hutlu tümörler, kardiyovasküler/serebrovasküler hastalıklar veya bağışıklık hastalıkları. Bu çalışma için onay, Shenzhen Dördüncü Halk Hastanesi Etik Komitesi'nden alındı ve katılımcılardan bilgilendirilmiş onayı alındı. Bu çalışmada kullanılan prosedürler Helsinki Bildirgesi'nin ilkelerine uydu.

Örnek koleksiyonu

Katılımcılardan 5 mL, yaralanmadan sonraki 24 saat içinde serum ayırıcı tüplerle kabul sırasında venöz kan örnekleri alındı. Kan, oda sıcaklığında 30 dakika boyunca pıhtılaşmasına bırakıldı ve ardından 3.000 × g ile 4 °C'de 10 dakika boyunca santrifüj edildi. Süpernatan serum dikkatlice ayrıldı, RNazsız mikrotüplere alkotasyon yapıldı ve daha fazla analiz yapılana kadar -80 °C'de saklandı.

Hücre kültürü ve LPS indüksiyonu

Fare feokromositom hücreleri (PC-12) ve fare mikroglial hücreleri (BV-2), Dulbecco'nun modifiye Eagle ortamında %10 fetal sığır serumu ile 37 °C'de takviye edilmiş şekilde kültürlendi. In vitro inflamatuar yaralanma modelleri oluşturmak için, PC-12 ve BV-2 hücreleri 0, 1, 5 ve 10 μg/mL konsantrasyonlarda 12^{saat 17} boyunca lipopolisakkarite (LPS) maruz kaldı. Her konsantrasyon üç bağımsız biyolojik kopyada test edildi.

RT-qPCR

Örneklerden toplam RNA, fenol-kloroform ekstraksiyon protokolü kullanılarak izole edildi ve ardından izopropanol ile çökeltildi. RNA saflığı spektrofotometri ile değerlendirildi ve 1.8–_{2.1 aralığında A 260/280 nm} oranına sahip örnekler aşağı akış analizi için kullanıldı. RNA, ters transkripsiyon kiti protokolüne göre cDNA'ya ters transkribe edildi ve ortaya çıkan cDNA, bir PCR cihazında SYBR Green premix ile RT-qPCR reaksiyonları için şablon olarak kullanıldı. Gliseraldehit 3-fosfat dehidrojenaz (GAPDH), CASC11 ve SPP1 mRNA için referans gen olarak kullanılmış, küçük nükleer RNA (U6) ise miR-130b-5p için referans gen olarak kullanılmıştır. Serum örnekleri için, RNA çıkarımından önce sentetik cel-miR-39 seruma eklenerek RNA geri alımındaki varyasyonları kontrol altına alındı. Başlangıçlar şöyleydi: CASC11 ileri 5'-ACCCTATGGAGAACCGAC-3' ve ters 5'-GAGGACCAACTCAGTAGGAAAT-3'; miR-130b-5p ileri 5'-ATCCATGGTTGAGCTTCCCG-3' ve geri 5'-TAGTGCAACCTCGTCAGAGC-3'; ve SPP1 mRNA öne 5'-GTTAAACAGGCTGATTCTGG-3' ve ters 5'-CATGGTCATCATCATCTCTTCA-3'. İfade ^2-ΔΔCt yöntemiyle hesaplandı. Her RT-qPCR reaksiyonu, üç biyolojik replikasyonla üçlü teknik kopyalar halinde gerçekleştirildi.

Transfeksiyon

Susturma CASC11 (si-CASC11), miR-130b-5p mimik/inhibitörü, SPP1 aşırı ekspresyon plazmidi (ov-SPP1) ve ilgili negatif kontroller (NC), transfeksiyon reaktifi kullanılarak PC-12 ve BV-2 hücrelerine sentezlenip transfeksiyon yapıldı. Transfeksiyon verimliliği, transfeksiyondan 48 saat sonra üçlü biyolojik kopyalarda değerlendirildi.

Proliferasyon ve apoptoz testi

Hücre canlılık testi için, hücreler kuyunun başına 5 ×^10-3 hücre olan 96 delikli plakalara tohumlanarak tutunmaya izin vermek üzere 24 saat kültürlendi. Bu kuluçkadan sonra, her kuyuya 10 μL CCK-8 reaktifi dağıtıldı ve ardından 37 °C'de 2 saat kuluçka yapıldı. Optik yoğunluk daha sonra mikroplaka okuyucu ile 450 nm olarak kaydedildi. Apoptoz tespiti için hücreler tripsin ile ayrılmış, fosfatlı tuzlu (PBS) ile iki kez durulanmış ve bağlanma tamponunda 1 ×^{10 6} hücre konsantrasyonuna askıya alınmıştır. Sonrasında, 100 μL süspansiyon 5 mL'lik akış sitometri tüpüne yerleştirildi, ardından 5 μL Annexin V-FITC ve 5 μL propidium iyodid (PI) boyama çözeltisi eklendi. Örnekler nazikçe karıştırıldı ve ışıktan korunan oda sıcaklığında 15 dakika saklandı. Bağlanma tamponu daha sonra tüp başına 400 μL nihai ek hacme eklendi ve apoptotik hücreler akış sitometrisiyle nicelendirildi. Tüm koşullar, üç bağımsız biyolojik deneyde üç teknik kopya kullanılarak analiz edildi.

Dual-lusiferaz aktivite testi

CASC11 ve miR-130b-5p'nin sonraki hedefleri, biyoinformatik web siteleri (lncRNASNP2 ve TargetScan) aracılığıyla tahmin edildi. Vahşi tip (wt) veya mutant (mut) tamamlayıcı dizileri içeren parçalar, sentezlenip çift lusiferaz raporlayıcı vektör olarak klonlanarak wt ve mut raporlayıcı plazmidler oluşturuldu. PC-12 hücreleri, miR-130b-5p mimik/inhibitörü ve oluşturulan wt/mut plazmidleriyle birlikte lipid bazlı transfeksiyon reaktifiyle tohumlanıp birlikte transfekte edildi. 48 saat sonra, lusiferaz aktivitesi nicelleştirilerek etkileşimi değerlendirildi. Her grup üç teknik replikasyon ve üç biyolojik kopyadan oluşuyordu.

RNA immünopresipitasyon (RIP) testi

RIP, RNA bağlayan protein immünopresipitasyon kiti kullanılarak gerçekleştirildi. Hücreler lizis tamponu ile lizize edilip anti-Ago2 antikor veya normal IgG antikoru ile inkübe edildi. RNA-protein kompleksleri manyetik boncuklar kullanılarak zenginleştirildi. Yıkamadan sonra bağlı proteinler çıkarıldı ve immünopresipitli RNA izole edildi. CASC11 ve miR-130b-5p'nin zenginleştirme seviyeleri RT-qPCR ile nicelenmiştir. Her grup üç teknik replikasyon ve üç biyolojik kopyadan oluşuyordu.

Western Blot

PC-12 ve BV-2 hücrelerinden hücre lizin tamponu kullanılarak protein lizatları hazırlandı ve toplam protein içeriği bir BCA testi ile ölçüldü. Her örnek için, %12 SDS-PAGE jellerine 30 μg protein yüklendi ve elektroforetik ayrılmadan sonra PVDF membranlarına aktarıldı. Zarlar, TBST'de seyreltilmiş %5 yağsız sütte oda sıcaklığında 2 saat boyunca bloklandı ve ardından Bcl-2, Bax, kesilmiş kaspaz-3 ve GAPDH'ye karşı birincil antikorlarla 4 °C'de 1:1.000 seyreltme oranında inkubasyon edildi. Yıkamadan sonra, zarlar HRP ile konjuge edilmiş ikincil antikorlarla oda sıcaklığında 1 saat boyunca kuluçka edildi. Protein sinyalleri görüntü analiz yazılımı kullanılarak analiz edildi ve bant yoğunlukları apoptozla ilişkili proteinlerin ekspresyonu değerlendirmek için kullanıldı. Western Blot deneyleri, her grup için üç teknik replika içeren üç biyolojik kopyayı içeriyordu.

ELISA

Hasta serumunda bulunan TNF-α, IL-1β ve IL-6 inflamatuar sitokinlerinin konsantrasyonları ve PC-12 ile BV-2 hücre süpernatantları, üreticinin talimatlarına göre ELISA kitleri kullanılarak nicelendirildi. Örnekler önceden kaplanmış kuyularda kuluçka alındı ve daha fazla kuluçka için tespit antikorları eklendi. Enzim konjugatları eklenip kuluçka yapıldı. Yıkamadan sonra, renk gelişimi için substratlar eklendi ve reaksiyonlar sonlandırıldı. Emilim, mikroplaka okuyucu kullanılarak 450 nm'de ölçüldü ve verilen standart eğriye göre iltihap faktör konsantrasyonlarına dönüştürüldü. Her ELISA testi, üç bağımsız biyolojik kopya üzerinden üçlü teknik kopyalar halinde gerçekleştirildi.

İstatistiksel analiz

Sürekli değişkenler ortalama ± standart sapma (SD) olarak, kategorik değişkenler ise sayı ve yüzde olarak (n, %) olarak bildirildi. İki grup arasında karşılaştırmalar Öğrencinin t-testi kullanılarak yapıldı. İkiden fazla grubu içeren karşılaştırmalar için tek yönlü varyans analizi (ANOVA) uygulandı, ardından Tukey'nin post-hoc testi yapıldı. CASC11'in klinik gruplar arasında ayrım yapma yeteneği, alıcı operasyonel karakteristikte (ROC) eğri analiziyle değerlendirildi. İki değişken arasındaki ilişkiler Pearson korelasyon analiziyle incelendi. Hücre tabanlı deneyler için, her grup üç bağımsız biyolojik kopya içeriyordu ve her ölçüm üç teknik kopyada tekrarlandı. İstatistiksel anlamlılık P < 0.05 olarak tanımlandı.

Sonuçlar

Katılımcıların temel verileri

Kontrol, NNF, ISCI ve CSCI gruplarındaki hastaların temel özellikleri Tablo 1'de sunulmaktadır. İstatistiksel analiz, cinsiyet, yaş, vücut kitle indeksi (BMI), yaralanmanın etiyolojisi ve yaralanma süresi gibi değişkenlerde gruplar arası anlamlı farklar bulunmamıştır (P > 0.05). Dört grup arasında kalma süresi, ASIA derecesi ve pro-inflamatuar sitokinler tümör nekroz faktörü-alfa (TNF-α),...

Tartışma

SCI, merkezi sinir sisteminin yıkıcı bir durumudur ve sıklıkla duyuyorluk, motor kontrol ve otonom fonksiyonda önemli eksikliklere yol açar; böylece hastanın yaşam kalitesini ve uzun vadeli prognozunu önemli ölçüde^{düşürür 18}. Hastalar omurga travması sonrası fonksiyonel bozukluk ve duyusal kayıpla ortaya çıkabilir ve görüntüleme çalışmaları (örneğin MR) SCI^19'un görülmesini değerlendirmek için kullanılabilir. SCI'nin başlangıcı, yoğun nöroi...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
BCA protein assay kit	Yeasen, China	P0010
CCK-8 solution	Sigma-Aldrich, USA	96992
Dual-luciferase reporter vector	Promega, USA	E133A	pmirGLO vector
Dulbecco’s Modified Eagle Medium	ATCC, Manassas, VA, USA	30-2002
ELISA kit for IL-1β	R&D Systems, USA	DY401
ELISA kit for IL-6	R&D Systems, USA	HS600B
ELISA kit for TNF-α	R&D Systems, USA	DTA00C
Fetal bovine serum	Gibco, Grand Island, NY, USA	10099141
Flow cytometer	BD FACSCalibur, USA	FACS101
Image analysis software	NIH, Bethesda, MD, USA	version 1.44p	ImageJ software
Isopropanol	Beijing Chemical Factory, China	32064
Lipid-based transfection reagent	Invitrogen, Carlsbad, CA, USA	L3000008	Lipofectamine 3000
Lipopolysaccharide	Sigma-Aldrich, USA	L2880
Lysis buffer	Beyotime, China	P0013D	RIPA lysis buffer
Microplate reader	Reagen, China	RNE90002
PC-12 and BV-2 cells	ATCC, Manassas, USA
Phenol-chloroform reagent	Thermo, USA	15596026	Trizol reagent
Reverse transcription kit	Takara, Japan	RR047A	PrimeScript RT Kit
RNA-binding protein immunoprecipitation kit	Millipore, USA	17-700	Magna RIP Kit
RNase-free microtubes	Axygen, Corning, NY, USA	MCT-150-C-S
Serum separator tubes	Terumo, Tokyo, Japan	VP-AS109K60
Statistical analysis software	San Diego, USA	version 9.0	GraphPad Prism
SYBR Green premix	Takara, Japan	RR420A	SYBR Premix Ex Taq