Kombine Fizyolojik Pulsatil Kayma Stresi ve Salınım Hiperglisemi Altında Endotel Disfonksiyonunu Modellemek İçin Mikrofluidik Bir Sistem

Summary

Burada, endotel hücrelerini senkronize salınımlı hiperglisemi ve pulsatil kayma stresine maruz bırakan mikrofluidik bir sistem üretip çalıştırmak için bir protokol sunuyoruz. Bu yaklaşım, diyabetik endotel disfonksiyonunu incelemek için fizyolojik olarak ilgili bir in vitro model sunar. Bu protokol, oksidatif stres ve endotel hücre yanıtlarının nicel ölçümünü sağlar.

Abstract

Diyabetik damar komplikasyonlarında endotel disfonksiyonu, özellikle salınımlı glikoz (OG) ve pulsatil kesme stresi (PSS) olmak üzere metabolik bozukluklar arasında karmaşık etkileşimleri içerir. Bu faktörler izole olarak incelenmiş olsa da, geleneksel modeller statik yüksek glikozlu veya basitleştirilmiş laminar akışla sınırlı kalır ve diyabetik damar damarlarında bulunan entegre uzaylı-zamansal birleşmeyi taklit etme kapasitesine sahip değildir. Programlanabilir bir mikrofluidik platform kullanarak, bu protokol senkronize osilatör hiperglisemi ve fizyolojik PSS'nin endotel hücreleri üzerindeki entegre etkilerini araştırmak için değerli bir platform sağlar. Bu protokol, fizyolojik olarak ilgili bağlı metabolik ve mekanik koşullar altında endotel disfonksiyonunu modellemeyi amaçlamaktadır. Polidimetilsiloksan (PDMS) çipinin basınçla çalışan bir kontrol sistemi ile birleşmesi, akış dalga formlarının ve glikoz konsantrasyon profillerinin hassas ve bağımsız modülasyonunu sağlar. Sistemin hemodinamik doğruluğu Mikro-Parçacık Görüntü Velosimetrisi (Micro-PIV) ile doğrulanırken, hücresel yanıt hücre içi reaktif oksijen türlerinin (ROS) seviyeleri ve hücre yaşamlılığı izlenmesiyle nicel olarak karakterize edilir. Temsilci sonuçlar, fizyolojik PSS'nin OG tarafından indüklenen oksidatif hasarı etkili bir şekilde azalttığını göstermektedir. Bu etki, hücre içi ROS seviyelerinin azalması ve birleşik uyarım koşullarında hücre canlılığının artmasıyla gösterilir. Araştırma sorusuna bağlı olarak, kesme gerilim desenleri, glikoz salınım frekansları ve kanal geometrileri gibi parametreler ayarlanabilir. Bu yöntem, diyabetik damar hastalıklarında terapötik müdahaleler için mekaniksel çalışmalar ve ilaç taraması için çok yönlü bir araç olarak hizmet vermektedir.

Introduction

Endotel disfonksiyonu, hem metabolik bozukluklar hem de anormal hemodinamik kuvvetler tarafından tetiklenen diyabetik damar komplikasyonlarının gelişiminde kritik erken bir^{olaydır 1,2}. OG seviyeleri, sadece sürekli hiperglisemi değil, endotel hücrelerinde oksidatif stres ve inflamatuar sinyalizasyonun güçlü indüktörleri olarak giderek daha fazla kabul edilmektedir; bu da damar hasarına ve homeostazın bozulmasına yol açmaktadır ^3,4,5. Aynı zamanda, hemodinamik kesme stresi endotel fenotipinin önemli belirleyicilerinden biridir; fizyolojik egzersiz koşullarında PSS nitrik oksit üretimini, antioksidan savunmayı ve damar korumasını^{destekler 6,7,8}. Bu nedenle, osilatör hiperglisemi ve hemodinamik uyarılmanın entegre etkilerini anlamak, endotel disfonksiyonunun mekanizmalarını aydınlatmak için gereklidir.

Genellikle statik yüksek glukozlu koşullara veya basitleştirilmiş laminar akışa dayanan geleneksel in vitro modeller, in vivo ^9,10,11 içinde bulunan metabolik ve mekanik ipuçları arasındaki karmaşık ve dinamik etkileşimi taklit edemez. Hayvan modelleri diyabetin sistematik yönlerini yakalarken, kontrollü mikroçevresel koşullar altında sinyalleri disseksiye etmek için gerekli hücresel düzeyde çözünürlükten^{yoksunlar 12}. Mikrofluidik teknoloji, fizyolojik olarak ilgili geometrilerde biyokimyasal ve biyomekanik uyarıların hassas uzaylı-zamansal kontrolünü sağlayan etkili bir alternatif^{sunar ve} çeşitli yenilikçi biyomedikal uygulamalarda önemli son gelişmeleri^{sağlamıştır 14,15}. Örneğin, Chen ve ^ark.16, endotel hücre içi Ca²⁺ dinamiklerini incelemek için mekansal ve zamansal duvar kesme stresi ile ATP sinyal ile mikrofluidik bir cihaz tasarlamıştır. Yu ve ^ark.11, fizyolojik PSS ve yüksek glukoz konsantrasyonlarının farklı kombinasyonları altında hücresel yanıtları tespit etmek için hemodinamik mikrofluidik çip sistemi geliştirmiştir. Bu sistemler, kesme stresine veya tek faktörlü metabolik bozulmalara endotel yanıtlarını incelemek için kullanılmış olsa da, çok azı hem glukoz salınımlarını hem de PSS'yi tek bir sistemde başarılı bir şekilde entegre etmiştir. Bu nedenle, kontrollü mikrofluidik ortamda her iki faktörü senkronize eden standartlaştırılmış ve tekrarlanabilir bir protokol hâlâ eksik durumda.

Bu yöntem, bağlı OG ve PSS verebilen tekrarlanabilir bir mikrofluidik sistem oluşturarak bu boşluğu kapatır. Bu yaklaşımın temel amacı, oksidatif stres, hücre canlılığının bozulması ve endotel işlevsizliğinin altında yatan mekanobiyolojik yanıtları fizyolojik olarak ilgili bir şekilde modellemektir. Statik kültür veya geleneksel perfüzyon odalarının aksine, bu yaklaşım mevcut modelleri geliştirerek, hem metabolik hem de mekanik uyarıcıların eşzamanlı ve kontrollü modülasyonunu mümkün kılarak diyabetik damar mikro ortamına daha yakın bir yaklaşım sunar. Ayrıca, sistem canlı hücre görüntüleme, gerçek zamanlı izleme ve moleküler analiz ile uyumludur; bu da mekanik çalışmalar, hastalık modellemesi ve endotel fonksiyonu ile yaralanma için ilaç taraması gibi geniş bir uygulama yelpazesi için uygundur.

Protocol

Etik beyan:

NOT: Bu protokolte kullanılan tüm reaktifler, cihazlar ve yazılımlar Materyal Tablosu'nda listelenmiştir.

1. Mikrofluidik çip üretimi

1. Mikrofluidik çipin yapısını tasarlamak için bilgisayar destekli tasarım (CAD) yazılımı kullanın (W x L x H = 2 mm x 30 mm x 0,1 mm, Şekil 1A) ve SU-8 ana kalıbını ticari bir şirket aracılığıyla yapın.
2. PDMS kürleme ajanı ve prepolimeri temiz bir karıştırma kabında ağırlık oranında 10:1 oranında karıştırın ve 5 dakika boyunca elle kuvvetle karıştırın.
3. Kabı -0.08 MPa altında bir vakum odasına en az 15 dakika koyarak karıştırma sürecinde sıkışmış hava kabarcıklarını temizleyin.
   NOT: Kabarcıkların çıkarılmasını hızlandırmak ve taşmayı önlemek için, büyük kabarcıkları patlatmak için odayı geçici olarak atmosfer basıncına havalandırın ve ardından hemen vakumu tekrar uygulayın. Bu havalandırma döngüsünü 2–3 kez tekrarlayın, ta ki toplu karışım tamamen şeffaf ve makroskobik baloncuklardan arınana kadar.
4. PDMS'yi cam Petri kabına yerleştirilmiş gofli üzerine dök.
5. PDMS, döküm sırasında oluşan baloncukları temizlemek için ekstra 15 dakika boyunca bir kurutucu ile vafliye döküldü.
   NOT: SU-8 ana kalıp yapılarının yakınında veya içinde sıkışmış inatçı mikro baloncuklar kalırsa, onları nazikçe kenara kadar üfleyin veya manuel kauçuk hava üfleyici ile patlatın. Mikrokanallarda yapısal kusurların önlenmesi için hava kabarcıklarının tamamen temizlenmesi çok önemlidir.
6. Kalıp ve polimer içeren petri kabını 80 °C'ye ayarlanmış sıcak fırına 2 saat koyun.
   DIKKAT: Sıcak malzemelerle çalışırken ısıya dayanıklı eldivenler kullanın
7. Sertleşmiş polimer levhayı ana kalıptan bir neşter ile dikkatlice soyun.
8. Polimer levhanın belirlenen kanal uçlarında giriş ve çıkış portları oluşturmak için bir çekirdek delme aracı (örneğin, 1,2 mm çapı) kullanın.
9. Cam kapak parçasını ve polimer levhanın desenli yüzeyini yapışkan bantla temizleyin.
   DURAKLAMA NOKTASI: Kürlenmiş ve deliklenmiş PDMS plakaları, plazma işlemi ve bağlanmadan önce oda sıcaklığında temiz bir kapta (örneğin, kapalı bir Petri kabı) birkaç hafta boyunca saklanabilir.
10. Hem polimer levhayı hem de cam kapak parçasını 65W gücünde plazma temizleyiciyle oda havası altında 60 saniye işleyin.
11. Polimer kanal yüzünü cam kapak kapağının işlenmiş tarafına hemen hizalayın.
12. Kalıcı, kapalı bir mikrofluidik kanal oluşturmak için nazikçe bastırın.

2. Endotel hücre hazırlanması ve tohumlanması

1. Bağlanmış mikrofluidik çipi, deiyonize su ile doldurulmuş boronlu cam şişeye yerleştirin ve 121 °C ve 15 psi sıcaklıkta 20 dakika boyunca otoklavlama ile sterilize edin.
   NOT: Otoklavlama sırasında baskıyı eşitlemek ve PDMS mikrokanallarının deformasyonunu önlemek için çipi suya batırın. Bu aynı zamanda hapsolmuş hava kabarcıklarını çıkarmaya yardımcı olur ve kanalları sonraki sıvı girişi için hazırlar.
   DURAKLAMA NOKTASI: Sterilize edilmiş mikrofluidik çipler, hücre tohumlaması için ihtiyaç duyulana kadar kapalı cam şişede oda sıcaklığında birkaç haftaya kadar güvenle saklanabilir.
2. Sterilize edilmiş çipi, 1:1 oranında fosfat tampon tuzlu (PBS) ve düşük glikozlu Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı (DMEM) karışımıyla doldurulmuş 60 mm kültür kabına yerleştirin.
3. 1 mL şırınga ile kanala 100 μg·^mL-1 fibronektin aklatın ve 37 °C'de 4 saat kuluçka yapın.
   NOT: Mikrofluidik çipin sıvı seviyesinin altına yerleştirildiğinden emin olun. Adaptör hortumunu şırınga iğnesine bağlayın, hortumu sıvıyla doldurun ve sıvı seviyesinin altına yerleştirin, girişi bağlayın ve ardından kabarcık girmemesi için enjekte edin.
4. Osmotik basıncı yükseltmek için düşük glikozlu DMEM'e (5,5 mM glikoz) 24,5 mM D-mannitol ekleyin. Yüksek glikozlu DMEM'e (25mM glikoz) 5 mM D-glikoz ekleyin, son 30 mM glukoza kadar. Normal glukoz (NG) kültür ortamı ve yüksek glukozlu (HG) kültür ortamı ile %20 fetal sığır serumu (FBS), %1 penisillin/streptomisin (P/S) ile takviye olun.
5. 37 °C'de bir su banyosunda 1× PBS, tripsin, NG ve HG kültür ortamını ısıtın. Kültür kabından %90 birleşimde İnsan Göbek Damarı Endotel Hücreleri (HUVEC) alın. Hücreleri %0,25 Tripsin-EDTA çözeltisi ile ayırın ve 37 °C'de 30 saniye kuluçka yapın. Toplanan hücreleri sayın ve konsantrasyonu sırasıyla NG ortamında ve HG ortamında 1 x 10⁶ hücre/mL olarak ayarlayın.
6. Hücre süspansiyonundan 100 μL, kontrol grubu için NG ortamı ve deneysel grup için HG ortamı kullanılarak mikrofluidik çipin giriş portuna 1 mL enjekte edilir. Mikrofluidik çipleri %5_CO2 ile 37 °C'de nemlendirilmiş bir kuluçka makinesine 48 saat yerleştirin.
   NOT: Hücrelerin en az 4 saat yapışmasına izin verin, sonra daha fazla işlem yapılacak. Statik kültür aşamasında salınımlı hiperglisemiyi uyarmak için her 2 saatte iki kültür ortamını manuel olarak sırayla değiştirin. Hücreleri gece boyunca 5,5 mM glikozda tutarak in vivo durumu taklit edin (Şekil 1B).

3. Dinamik uyarım kurulumu

1. İki 100 mL rezervuarı sırasıyla NG ve HG kültür ortamı ile doldurun ve bunları programlanabilir basınç kontrol sisteminin ilgili kanallarına bağlayın.
2. Rezervuarlar, iki pozisyonlu üç yollu manyetik valf ve mikrofluidik çipi silikon boru kullanarak birbirine bağlayın.
3. PDMS çipinin giriş ve çıkış portlarını boruya bağlamak için 1,3 mm çapında 90° açılı paslanmaz çelik konnektörler kullanın.
   NOT: 100 mL rezervuarlar, silikon boru ve paslanmaz çelik konnektörleri önceden yüksek basınçlı, yüksek sıcaklıklı bir otoklavda sterilize edin.
4. Hedef PSS (τ)'ye ulaşmak için gereken akış hızını (Q) hesaplayın. τ = (6μQ)/(wh²) formülünü kullanın; burada viskozite μ w kanal genişliği, h ise kanal yüksekliğidir.
5. Hedef fizyolojik PSS (τ = 10 ± 2 dyn·^cm-2, 1 Hz) belirleyin; bu, hesaplanan akış hızı 200 ± 40 μL·^min-1'e karşılık gelir.
6. Programlanabilir hava pompasını PSS'yi korumak için sinüs dalgası fonksiyonu üretecek şekilde programlayın. Valf kontrolörünü her 5 dakikada bir kanal değiştirecek şekilde programlayın ve dinamik uyarı sırasında kare dalga glikoz salınımı oluşturulur.
7. Programlanabilir pompa sistemini başlatarak birleşik OG ve PSS toplam 30 dakika teslim edilir.

4. Akış alanı doğrulaması için mikro-PIV

1. %0,05 hacim konsantrasyonu olan floresan mikropartikül (1 μm) içeren NG ve HG ortamını hazırlayın. Parçacıkların eşit şekilde dağılmış ve agregasyondan arınmış olduğundan emin olun.
2. Tersli floresan mikroskobunun aşamasına temiz, hücresiz bir mikrofluidik çip (hücre deneylerinde kullanılanla aynı) yerleştirin.
3. Sistemdeki tüm bileşenleri bağlayın (Şekil 1C).
   1. Basınç kaynağını basınç kontrolörüne bağlayın.
   2. Basınç kontrolcüsünü, basınç dalgalarının otomatik kontrolü için bilgisayara bağlı olan valf kontrolörüne bağlayın.
   3. Basınç kontrolcü çıkışlarını HG ve NG rezervuarlarına ayrı boru hatlarıyla bağlayın.
   4. Her iki rezervuarı da programlanmış salınımlı glukoz protokolüne göre HG ve NG ortamı arasında geçiş yapan 3/2 basınç valfine bağlar.
   5. 3/2 basınç valfinin çıkışını mikrofluidik çipin girişine boru ile bağlayın.
   6. Mikrofluidik çipin çıkışını atık rezervuarına bağlayın.
   7. Mikrofluidik çipi deney boyunca canlı hücre görüntülemesi için mikroskop aşamasına yerleştirin.
      NOT: Akışı başlatmadan önce tüm boru bağlantılarının güvenli ve sızıntısız olduğundan emin olun.
4. Akış sabit hale geldikten sonra yüksek hızlı kamerayı (çift kare modunda 15 Hz'de çalışırken) tetikleyerek akan mikropartiküllerin ardışık görüntü çiftlerini yakalayın. Her çiftin iki kare arasındaki kesin zaman gecikmesini (Δt) 80 μs olarak ayarlayın.
5. Kanal içinde İlgi Bölgesi (ROI) için görüntüler alın. Sonuçta etkileri önlemek ve temsil eden akış ölçümlerini sağlamak için düz kanal kesitinin ortasındaki (Şekil 2A) yatırım getirisi seçilir.
6. Elde edilen görüntü çiftlerini PIV analiz yazılımı ile işleyin. İki çerçeve arasındaki parçacıkların yer değiştirme vektörü (Δx) belirlemek için 64 × 64 piksellik ilk sorgulama alanından başlayıp 8 × 8 piksellik ızgara adım boyutuyla 16 × 16 piksellik nihai alana kadar inceletilerek uyarlanabilir çoklu geçişli çapraz korelasyon algoritması kullanılır.
7. Her sorgulama alanı için hız vektörü (v) v = Δx / Δt formülünü kullanarak hesaplayın.

5. Veri toplama

NOT: Calcein-/propidium iyodid (PI) Kiti ve canlı hücre oksidatif stres floresan probu kullanarak hücre canlılığı ve fonksiyonunu nicelikle ölçerek glikoz dalgalanmalarının neden olduğu hasarı doğrulayın ve birlikte uyarmanın etkisini değerlendirin.

1. Hücre yaşama
   1. Deneysel uç noktada üreticinin talimatlarına uygun olarak Calcein-/PI çalışma çözümünü hazırlayın.
      DIKKAT: PI, bilinen bir mutajen ve DNA'ya karışan şüpheli bir kanserojendir. Son derece dikkatli davranın. Eldiven takın ve belirlenmiş güvenli bir çalışma alanında tutun.
   2. Kanalı bir kez PBS ile durulayın ve kanala Calcein-/PI çalışma çözümünü ekleyin. Cihazı 37 °C'de, %5_CO2 ile 30 dakika karanlıkta kuluçka yapın.
   3. Lekelenmiş hücrelerin floresan görüntülerini, 10× objektif lens ile donatılmış ters floresan mikroskopla hemen yakalayın. Kalsein-için FITC (Yeşil) filtresini, PI için ise TRITC veya Rhodamine (Kırmızı) filtresini kullanın.
2. Hücre içi ROS'u ölçmek
   1. Üretici tarafından belirlenen konsantrasyonda (5 μM) PBS içinde canlı hücreli oksidatif stres floresan probu (bkz. Malzemeler Tablosu) çalışma çözeltisi hazırlanır.
      DIKKAT: Floresan problar ve yaygın çözücüleri (örneğin DMSO) toksik olabilir ve zararlı maddelerin deride emilimini kolaylaştırabilir. Eldiven takın ve belirlenmiş güvenli bir çalışma alanında tutun.
   2. Kanalı PBS ile üç kez yıkayın ve canlı hücre oksidatif stres floresan prob çözeltisini kanala ekleyin. Çipi 37 °C'de, %5 CO2 ile 30 dakika karanlıkta kuluçka yapın.
   3. Kanalı PBS ile üç kez yuyup, bağlanmamış probu çıkarın. Hemen 20× objektif bir lens üzerinden Far-Red filtre seti (uyarılma 640 nm, emisyon 665 nm) floresan görüntüleri yakalayın, tüm gruplar için tam olarak aynı pozlama parametreleri korunur.
      NOT: Artan floresans yoğunluğu daha yüksek ROS seviyelerini gösterir.

6. Veri analizi

DURAKLAMA NOKTASI: Tüm ham floresan görüntüler ve yüksek hızlı kamera görüntüleri alınıp güvenli bir şekilde sabit diske kaydedildikten sonra, sonraki görüntü işleme, nicel analiz ve istatistiksel karşılaştırmalar daha sonra duraklatılabilir ve daha sonra gerçekleştirilebilir.

1. Hücre yaşamlılığını nicelikle ölçer
   1. Alınan Calcein-(yeşil) ve PI (kırmızı) görüntülerini ImageJ'de açın ( bkz. Materyal Tablosu). Her kanal için eşik noktasını manuel olarak ayarlayarak floresan sinyalleri arka plandan ayırt edin. Hücre sayacı fonksiyonunu kullanarak floresan hücreleri sayın, gözlemlenen hücre boyutuna göre minimum hücre boyutunu ayarlayın ve birden fazla görüş alanında yaşayan (N_Canlı) ve ölü (N_Ölü) hücre sayısını sayın.
      NOT: N_Live , Kalsein--pozitif (yeşil) hücrelerin sayısını, N_Ölü ise PI-pozitif (kırmızı) hücrelerin sayısını ifade eder.
   2. Her deneysel durum için canlı hücrelerin yüzdesini (N_Canlı / (N_Canlı + N_Ölü) x %100) hesaplayın, elektronik tablo yazılımı kullanarak. Gruplar arasında karşılaştırma yapmak için istatistiksel analiz yazılımı kullanarak birden fazla görüş alanı boyunca ortalama ve standart sapmayı hesaplayın.
2. Hücre içi ROS'u nicelikle ölçmek
   1. ImageJ'de tercih ettiğiniz görseli sürükleyin. Ölçeği mikroskobun meta verisiyle (veya bilinen bir referans ızgarası) kullanarak piksel boyutunu kalibre ederek ayarlayın: Analiz | Ölçeği ayarlayın.
   2. Arka plan çıkarma fonksiyonunu kullanarak tüm görüntüden belirli olmayan bir tekdüze arka plan sinyalini kaldırın: Süreç | Arka planı çıkar.
   3. Eşik kaydırıcısını manuel olarak ayarlayarak hücre içi ROS sinyalini segment ve tanımlama: Görüntü | Ayarlan | Eşik. Eşik belirlendikten sonra, Analyze | Ölçümler'i Alan ve Ortalama gri değeri seçecek şekilde ayarlayın . Gözlemlenen hücre boyutuna göre minimum hücre boyutunu belirleyin ve hücre monolayer ROI içindeki segmentli sinyalin ortalama yoğunluğunu ölçün: Analiz | Parçacıkları analiz et.
   4. Her deneysel koşul için ROS seviyesini, her çip başına en az üç rastgele seçilmiş görüş alanından elde edilen ölçülen değerlerin (örneğin, ortalama yoğunluk) ortalaması olarak raporlayın.
3. İstatistiksel karşılaştırmalar yapılması
   1. Nicel sonuçları (yaşamlılık yüzdesi ve ROS ortalama yoğunluğu) veri analizi ve grafik yazılımına girin ( bkz. Materyal Tablosu).
   2. İstatistiksel anlamlılığı, deneysel grupları kontrol grubuyla karşılaştırarak iki yönlü Varyans Analizi (ANOVA) ve ardından Tukey'nin post-hoc testi ile belirlenin; anlamlılık seviyesi p = 0.05 olsun. Analizi yapmak için yazılımı kullanın ve standart sapmayı (SD) temsil eden hata çubuklarıyla grafikler oluşturun.

Results

Mikrofluidik kanal içindeki akış alanının mikro-PIV doğrulaması
Şekil 1D , bağlı metabolik ve mekanik uyarıya endotel yanıtlarını incelemek için kullanılan mikrofluidik platformun genel bir özetini sunar. Sistem, düz kanallı PDMS mikrofluidik çipi ile basınç odaklı akış kontrol modülünü entegre eder ve OG koşulunun fizyolojik PSS ile birlikte uygulanmasını sağlar. NG ve HG ortamları arasında periyodik dönüşüm oluşturmak için programlanab...

Discussion

Burada tanımlanan mikrofluidik sistem, OG ve PSS'nin endotel hücre fonksiyonu üzerindeki entegre etkilerini araştırmak için sağlam ve fizyolojik olarak ilgili bir platform sağlar. Bu yöntemin temel avantajı, belirli bir mikro ortamda mekanik ve biyokimyasal uyarıcıları hassas şekilde kontrol edip ayırabilme yeteneğidir. Hemodinamik kuvvetlerden yoksun geleneksel statik kültürler veya hücresel seviyede sinyal^{göndermelerini genellikle gizleyen hayvan modelleri<...}

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% Trypsin-EDTA	NEST Biotechnology Co., Ltd.	211052	Hücre disosiyasyonu
1 mL şırınga	Shanghai Zhengbang Medical Science Co., Ltd.	1mL	Sıvı enjeksiyonu
60 mm kültür kabı	NEST Biotechnology Co., Ltd.	705001	Hücre kültürü
90°'lü açılı paslanmaz çelik bağlayıcı	Luoyang Mayer Trading Co.,Ltd.	1.3 mm	Adaptör sızdırmazlık cihazı
AutoCAD yazılımı	Autodesk	RRID:SCR_014981	Bilgisayar destekli tasarım yazılımı
Borlu cam şişe	Hunan Aidete Scientific Instruments Co., Ltd.	Çift geçişli 100mL	Depo
Calcein-AM/PI Kiti	Beyotime	byt-c2015	Boyama
Hücre inkübatörü	ESCO	Esco CelMate	Hücre kültürü
CellROX Deep Red	Invitrogen	C10422	Boyama
D-glukoz	Sigma Aldrich	47249	Glukoz
D-mannitol	Macklin	M813423	Osmotik basıncı dengeleyici
DynamicStudio	Dantec Dynamics	V8.6	PIV analiz yazılımı
Fetal boğa serumu (FBS)	Gibco	14190-094	Medya
Fibronektin	Sigma Aldrich	F-2006	Hücre yapışması
Floresan mikropartiküller	Thermo Scientific	G0100	Mikro-PIV
Cam kapağı	Citotest Scientific Co.,Ltd.	#1	Mikrodaire çipi
Yüksek glukozlu DMEM	Solarbio	12100	Medya
Yüksek hızlı kamera	Dantec Dynamics	FlowSense EO	Mikro-PIV
ImageJ	NIH	RRID:SCR_003070	Görüntü işleme yazılımı
Ters floresan mikroskobu	Olympus	IX73	Hücre canlılığı
Ters floresan mikroskobu	Olympus	IX83	Gözlem ve alım
Düşük glukozlu DMEM	Solarbio	31600	Medya
Origin	OriginLab	RRID:SCR_014212	Veri analizi ve grafik yazılımı
PDMS	Dow lnc.	184	Mikrodaire çipi
Penisilin/streptomisin (P/S)	NEST Biotechnology Co., Ltd.	211092	Medya
Fosfat tamponlu salin (PBS)	NEST Biotechnology Co., Ltd.	211031	Hücre kültürü
Plazma temizleyici	Jiarun Wanfeng Technology Co., Ltd.	PC-6D	Mikrodaire çipi
Programlanabilir basınç kontrol sistemi	Elvesys	OB1 MK4	Akış kontrolü
Silikon tüp	Nanjing Runze Fluid Control Equipment Co., Ltd.	96410	1mm*3mm
SU-8 ana kalıp	Boao Biology Group Co. Ltd.	N/A	Mikrodaire çipi
Valf kontrolörü	Elvesys	MUX Wire V3	Akış kontrolü