Burada, endotel hücrelerini senkronize salınımlı hiperglisemi ve pulsatil kayma stresine maruz bırakan mikrofluidik bir sistem üretip çalıştırmak için bir protokol sunuyoruz. Bu yaklaşım, diyabetik endotel disfonksiyonunu incelemek için fizyolojik olarak ilgili bir in vitro model sunar. Bu protokol, oksidatif stres ve endotel hücre yanıtlarının nicel ölçümünü sağlar.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Kombine Fizyolojik Pulsatil Kayma Stresi ve Salınım Hiperglisemi Altında Endotel Disfonksiyonunu Modellemek İçin Mikrofluidik Bir Sistem
Bu makalede
Özet
Özet
Diyabetik damar komplikasyonlarında endotel disfonksiyonu, özellikle salınımlı glikoz (OG) ve pulsatil kesme stresi (PSS) olmak üzere metabolik bozukluklar arasında karmaşık etkileşimleri içerir. Bu faktörler izole olarak incelenmiş olsa da, geleneksel modeller statik yüksek glikozlu veya basitleştirilmiş laminar akışla sınırlı kalır ve diyabetik damar damarlarında bulunan entegre uzaylı-zamansal birleşmeyi taklit etme kapasitesine sahip değildir. Programlanabilir bir mikrofluidik platform kullanarak, bu protokol senkronize osilatör hiperglisemi ve fizyolojik PSS'nin endotel hücreleri üzerindeki entegre etkilerini araştırmak için değerli bir platform sağlar. Bu protokol, fizyolojik olarak ilgili bağlı metabolik ve mekanik koşullar altında endotel disfonksiyonunu modellemeyi amaçlamaktadır. Polidimetilsiloksan (PDMS) çipinin basınçla çalışan bir kontrol sistemi ile birleşmesi, akış dalga formlarının ve glikoz konsantrasyon profillerinin hassas ve bağımsız modülasyonunu sağlar. Sistemin hemodinamik doğruluğu Mikro-Parçacık Görüntü Velosimetrisi (Micro-PIV) ile doğrulanırken, hücresel yanıt hücre içi reaktif oksijen türlerinin (ROS) seviyeleri ve hücre yaşamlılığı izlenmesiyle nicel olarak karakterize edilir. Temsilci sonuçlar, fizyolojik PSS'nin OG tarafından indüklenen oksidatif hasarı etkili bir şekilde azalttığını göstermektedir. Bu etki, hücre içi ROS seviyelerinin azalması ve birleşik uyarım koşullarında hücre canlılığının artmasıyla gösterilir. Araştırma sorusuna bağlı olarak, kesme gerilim desenleri, glikoz salınım frekansları ve kanal geometrileri gibi parametreler ayarlanabilir. Bu yöntem, diyabetik damar hastalıklarında terapötik müdahaleler için mekaniksel çalışmalar ve ilaç taraması için çok yönlü bir araç olarak hizmet vermektedir.
Giriş
Endotel disfonksiyonu, hem metabolik bozukluklar hem de anormal hemodinamik kuvvetler tarafından tetiklenen diyabetik damar komplikasyonlarının gelişiminde kritik erken birolaydır 1,2. OG seviyeleri, sadece sürekli hiperglisemi değil, endotel hücrelerinde oksidatif stres ve inflamatuar sinyalizasyonun güçlü indüktörleri olarak giderek daha fazla kabul edilmektedir; bu da damar hasarına ve homeostazın bozulmasına yol açmaktadır 3,4,5. Aynı zamanda, hemodinamik kesme stresi endotel feno....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Etik beyan:
NOT: Bu protokolte kullanılan tüm reaktifler, cihazlar ve yazılımlar Materyal Tablosu'nda listelenmiştir.
1. Mikrofluidik çip üretimi
- Mikrofluidik çipin yapısını tasarlamak için bilgisayar destekli tasarım (CAD) yazılımı kullanın (W x L x H = 2 mm x 30 mm x 0,1 mm, Şekil 1A) ve SU-8 ana kalıbını ticari bir şirket aracılığıyla yapın.
- PDMS kürleme ajanı ve prepolimeri temiz bir karıştırma kabında ağırlık oranında 10:1 oranında karıştırın ve 5 dakika boyunca elle kuvvetle karıştırın.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Mikrofluidik kanal içindeki akış alanının mikro-PIV doğrulaması
Şekil 1D , bağlı metabolik ve mekanik uyarıya endotel yanıtlarını incelemek için kullanılan mikrofluidik platformun genel bir özetini sunar. Sistem, düz kanallı PDMS mikrofluidik çipi ile basınç odaklı akış kontrol modülünü entegre eder ve OG koşulunun fizyolojik PSS ile birlikte uygulanmasını sağlar. NG ve HG ortamları arasında periyodik dönüşüm oluşturmak için programlanab.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Burada tanımlanan mikrofluidik sistem, OG ve PSS'nin endotel hücre fonksiyonu üzerindeki entegre etkilerini araştırmak için sağlam ve fizyolojik olarak ilgili bir platform sağlar. Bu yöntemin temel avantajı, belirli bir mikro ortamda mekanik ve biyokimyasal uyarıcıları hassas şekilde kontrol edip ayırabilme yeteneğidir. Hemodinamik kuvvetlerden yoksun geleneksel statik kültürler veya hücresel seviyede sinyalgöndermelerini genellikle gizleyen hayvan modelleri<.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar çıkar çatışması olmadığını belirtmektedir.
Teşekkürler
Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (hibe numaraları 12372304, 12172081) ve Merkezi Üniversiteler için Temel Araştırma Fonları (DUT25YG272) tarafından desteklendi.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 0.25% Trypsin-EDTA | NEST Biotechnology Co., Ltd. | 211052 | Hücre disosiyasyonu |
| 1 mL şırınga | Shanghai Zhengbang Medical Science Co., Ltd. | 1mL | Sıvı enjeksiyonu |
| 60 mm kültür kabı | NEST Biotechnology Co., Ltd. | 705001 | Hücre kültürü |
| 90° açılı paslanmaz çelik bağlayıcı | Luoyang Mayer Trading Co.,Ltd. | 1.3 mm | Adaptör sızdırmazlık cihazı |
| AutoCAD yazılımı | Autodesk | RRID:SCR_014981 | Bilgisayar destekli tasarım yazılımı |
| Borlu cam şişe | Hunan Aidete Scientific Instruments Co., Ltd. | Çift geçişli 100mL | Depo |
| Calcein-AM/PI Kiti | Beyotime | byt-c2015 | Boyama |
| Hücre inkübatörü | ESCO | Esco CelMate | Hücre kültürü |
| CellROX Deep Red | Invitrogen | C10422 | Boyama |
| D-glukoz | Sigma Aldrich | 47249 | Glukoz |
| D-mannitol | Macklin | M813423 | Osmotik basıncı dengelemek |
| DynamicStudio | Dantec Dynamics | V8.6 | PIV analiz yazılımı |
| Fetal boğa serumu (FBS) | Gibco | 14190-094 | Medya |
| Fibronektin | Sigma Aldrich | F-2006 | Hücre yapışması |
| Floresan mikropartiküller | Thermo Scientific | G0100 | Mikro-PIV |
| Cam kapak camı | Citotest Scientific Co.,Ltd. | #1 | Mikroakışkan çip |
| Yüksek glukoz DMEM | Solarbio | 12100 | Medya |
| Yüksek hızlı kamera | Dantec Dynamics | FlowSense EO | Mikro-PIV |
| ImageJ | NIH | RRID:SCR_003070 | Görüntü işleme yazılımı |
| Ters floresan mikroskobu | Olympus | IX73 | Hücre canlılığı |
| Ters floresan mikroskobu | Olympus | IX83 | Gözlem ve elde etme |
| Düşük glukoz DMEM | Solarbio | 31600 | Medya |
| Origin | OriginLab | RRID:SCR_014212 | Veri analizi ve grafik yazılımı |
| PDMS | Dow lnc. | 184 | Mikroakışkan çip |
| Penisilin/streptomisin (P/S) | NEST Biotechnology Co., Ltd. | 211092 | Medya |
| Fosfat tamponlu salin (PBS) | NEST Biotechnology Co., Ltd. | 211031 | Hücre kültürü |
| Plazma temizleyici | Jiarun Wanfeng Technology Co., Ltd. | PC-6D | Mikroakışkan çip |
| Programlanabilir basınç kontrol sistemi | Elvesys | OB1 MK4 | Akış kontrolü |
| Silikon tüp | Nanjing Runze Fluid Control Equipment Co., Ltd. | 96410 | 1mm*3mm |
| SU-8 ana kalıp | Boao Biology Group Co. Ltd. | N/A | Mikroakışkan çip |
| Valf kontrolörü | Elvesys | MUX Wire V3 | Akış kontrolü |
Kaynaklar
- Zhang, H., Dellsperger, K. C., Zhang, C. The link between metabolic abnormalities and endothelial dysfunction in type 2 diabetes: An update. Basic Research in Cardiology. 107 (1), 237(2011).
- Yang, D. R., Wang, M. Y., Zhang, C. L., Wang, Y.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
