Yöntem makalesi

Gözenekli ortamda metal oksitlerin mikrobiyal çökelmesini araştırmak için mikrofluidik bir platform

238 görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/71047

⸱

12 Haziran 2026

 ,  ,  , 
1Department of Civil and Environmental Engineering, University of California, Davis, 2Department of Electrical and Computer Engineering, University of California, Davis, 3Energy Geosciences Division, Earth and Environmental Sciences Area, Lawrence Berkeley National Laboratory

Bu makalede

Özet

Bu protokol, manganez oksit minerallerinin mikrobiyal çökelmesini incelemek için mikrofluidik bir sistem sunar. Biyomineral oluşumu yerinde optik mikroskopi ve görüntü analiziyle ölçülür. Bu yaklaşım, gözenekli ortamlarda diğer belirgin renkli biyojenik minerallerin çökelmesini incelemek için uyarlanabilir.

Özet

Mikroorganizmalar genellikle topraklarda, tortullarda ve diğer çevresel açığı gözenekli ortamlarda metal oksit nanopartikülleri çökeltir. Ancak, manganez (Mn) ve demir (Fe) oksitlerinin oluşumu ve reaktivitesi, fiziksel olarak karmaşık ortamlarda zayıf tanımlanmıştır. Laboratuvar sistemleri gözenekli ortamı bir alt taban olarak dahil edebilse de, yıkıcı örnekleme gerektirir ve gözenek ölçeği analizlerine kolayca uygun değildir. Gözenekli ortamın dinamik ama erişilemez yapısı, mikrobiyal aracılı mineral çökelmelerini yerinde ve gerçek zamanlı olarak çözebilme yeteneğini gerektirir. Bu boşluğu kapatmak için, model gözenek alanında metal oksitlerin mikrobiyal çökelmesini değerlendirmek için mikrofluidik bir platform geliştirilmiştir. Bu platform, Mn oksitleyici bakteri Pseudomonas putida GB-1 ile doğrulanmıştır. Biyofilm gelişimi ve ilgili Mn oksit çökelmesi, zaman geçişli renkli parlak alan mikroskopisiyle sürekli akış altında görselleştirilir. Bir görüntü çıkarma algoritması, uç nokta kütle ölçümleriyle birleştirilerek Mn oksit çökelme hızını tahmin edilir. Bu yaklaşım, metal oksitlerin mikrobiyal çökelmesinin değişen fiziksel ve kimyasal koşullara nasıl yanıt verdiğini sistematik olarak test etmek için bir araç sağlar.

Giriş

Metal oksit mineralleri, biyojeokimyasal döngüde kritik bir roloynar 1. Manganez (Mn) ve demir (Fe) oksitler, çevresi nötr pH'da negatif yüklüdür ve katyonikmetalleri 2,3,4,5,6,7,8 kolayca sorblar; bu da rizosfer ve hipiroik bölgede mikrobesin bulunabilirliğini ve kirletici hareketliliğini düzenler. Bu mineraller, organik maddeninstabilitesini ve bozulmasını etkiler 9,10,11,12 ve bitkiler ile toprak mikroplarının karbon alımını belirler. Mühendislik sistemi sistemlerde (örneğin, su arıtma filtreleri, inşa edilmiş sulak alanlar), metal oksit çökeltmesi doğrudan Mn veya Fe çıkarımı ve birlikte bulunan kirleticilerin 13,14,15,16,17 iyileştirilmesi için kullanılır. Bu metal oksitler, okre'den koyu kahverengiye ve siyaha kadar değişen karakteristik renkleriyletanımlanabilir 18,19.

Metal oksitlerin çökeltmesi genellikle mikroorganizmalar tarafından biyomineralizasyonolarak bilinen süreçte kolaylaştırılır 20,21,22. Çok sayıda Mn-oksitleyici bakteri ve mantar, aerobik koşullarda Mn(II)'den Mn(III) ve Mn(IV)'e elektron transferini katalize eden multicopper oksidaz ve peroksidazları sentezler; bu da birnessite benzeri Mn(III, IV) oksitmineralleri 2,23,24'ün çökelmesine yol açar. Ayrıca, çeşitli Fe-oksitleyici bakteriler, oksijen açısından sınırlı çevresel veya asidik ortamlarda Fe(II)'den Fe(III)'ye enzimatik olarak oksitler ve ferrihydrit ve manyetit 25,26,27,28 dahil olmak üzere Fe(II, III) (oksihidr) oksitler üretir. Bu biyojenik mineraller hücre yüzeylerinin yanında çökelir ve hücre dışı polimerlerde, kılıflarda ve diğer hücresel yapılarda birikerek mikrop-mineraltoplulukları oluşturur 2,23,25,27,29,30.

Mn ve Fe biyomineralizasyonunun karmaşık ortamlarda her yerde bulunmasına rağmen, gözenek ölçeği açısından eksik bilgiler vardır. Gözenek boşlukları yapısal olarak heterojendir; tercih edilen sıvı akışı ve düzensiz reaktant taşınımı ile biyojeokimyasal reaksiyonların dağılımınıbelirler 31,32,33,34,35. Ayrıca, mikrobiyal aktivite biyomineralizasyonu teşvik eden veya sınırlayan yerel jeokimyasal gradyanlar oluşturabilirken, gözenek sıvısı kimyasındaki dalgalanmalar (örneğin, pH, çözünmüş oksijen, redoks potansiyeli) mineral çökelmesini artırabilir veya çözünmeyikolaylaştırabilir 34,35. Mn ve Fe biyomineralizasyonu çalışmaları genellikle iyi karıştırılmış partikoşulları 30,36,37,38,39,40 veya 41,42,43,44 sütunlarına dayanarak oksidasyon kinetiklerini nicelikleştirir veya biyomineral çökelmeleri karakterize eder. Ancak, toplu deneyler, gözenekli sistemlere özgü mekansal heterojenlikten yoksundur. Paketlenmiş granül ortam içeren sütunlar, ilgili fiziksel mimariyi sağlar ancak statik zaman noktalarında yıkıcı örnekleme gerektirdikleri için kullanımları sınırlıdır; bu da deneyin ilerlemesini durdurur ve gözenek ölçeği gözlemlerinin bozulmamasını engeller. Bu nedenle, gözenekli ortamlarda metal oksitlerin mikrobiyal çökelmesini incelemek için yeni deneysel yaklaşımlara ihtiyaç vardır.

Mikrofluidik sistemler, biyojeokimyasal reaksiyonları yerinde ve gerçek zamanlı incelemek için bir araçtır. Mikrofluidik reaktörler, doğal veya idealize edilmiş gözenekli ortamı simüle eden tekrarlanabilir ve özelleştirilebilirgeometrilerle hızlı ve düşük maliyetle üretilebilir. Ortaya çıkan cihazlar optik olarak şeffaftır ve gözenek ölçeği süreçlerinin zararsız görselleştirmesi ve nicelendirilmesini kolaylaştırır; bunlar arasında biyofilmoluşumu 46,47,48,49, sıcak noktagelişimi 50,51, abiotik metalçökeltmesi 52,53 ve kalsit biyomineralizasyonu 34,54,55,56 yer alır. Ayrıca, mikrofluidik sistemler kullanıcıların metal konsantrasyonu, çözünmüş oksijen varlığı veya yokluğu ve sıvı akış hızı gibi sınır koşullarını kontrol edip sistematik olarak değiştirmelerini sağlar. Son olarak, reaktör alt malzemesine bağlı olarak, mikrop-mineral-sıvı etkileşimlerinin doğrudan ölçümleri X-ışını, Raman veya kızılötesi spektroskopi57 kullanılarak alınabilir. Metal oksitlerin mikrobiyal çökelmesini incelemek için böyle bir mikrofluidik tabanlı platformun geliştirilmesi, gözenekli ortamlarda karbon, besin ve kirletici döngüsünü tetikleyen Mn veya Fe mineral fazlarının oluşumu ve reaktivitesi üzerine yeni araştırmalar için bir yol sunmaktadır.

Bu çalışma, dinamik gözenekli bir ortamda metal oksitlerin mikrobiyal çökelmesini nicelendirmek için Mn biyomineralizasyonunu bir vaka çalışması olarak kullanmaktadır. Aşağıdaki protokol, Mn(II)'den Mn(III, IV)'e (sabit büyüme aşamasında) oksitlediği bilinen model bakteri olan Pseudomonas putida GB-1 ile mikrofluidik reaktörün nasıl üretilip aşılanacağınıgöstermektedir (58,59). Basınç tabanlı bir akış kontrol sistemi kullanılarak, besin açısından zengin büyüme ortamı ve minimal tuz çözeltisi sıralı olarak enjekte edilir; böylece sırasıyla biyofilm oluşumunu teşvik eder ve Mn oksit çökelmesini indükler edilir. Mikrofluidik gözenek alanının yüksek çözünürlüklü renkli parlak alan görüntüleri düzenli zaman aralıklarında toplanarak P. putida GB-1 biyofilmleri ile biriken Mn oksitleri arasındaki renk kontrastını yakalar. Her deneyin sonunda, reaktördeki tüm Mn oksitler sindirilir ve toplam kütle endüktif bağlı plazma kütle spektrometrisi (ICP-MS) ile ölçülür. Mn oksit çökelme hızı, bu uç nokta kütle ölçümlerinin görüntü çıkarma algoritması ile entegre edilmesiyle zamanın bir fonksiyonu olarak tahmin edilir. Bu iş akışı, çeşitli çevresel koşullar altında diğer organizmaları veya metal oksit çökeltme süreçlerini incelemek için kolayca uyarlanabilir.

Protokol

NOT: Bu protokol, kullanıcıların arka plan bilgisi ve mevcut enstrümantasyon hakkında çeşitli varsayımlarda bulunur. İlk olarak, kullanıcıların ya bir temiz odaya erişimi olmalı ve mikrofluidik kalıp üretmek için fotolitografi prosedürlerine aşina olmalı ya da ticari bir kalıp satın almalıdır. Sonrası, kullanıcılar aseptik tekniği kullanmak, stok çözeltileri hazırlamak ve plakaları çizmek gibi temel mikrobiyoloji yöntemlerine aşina olmalıdır. Kullanıcıların ayrıca bir otoklav, mikrosantrifüj, sarstırıcı kuluçka makinesi ve kütle spektrometresine erişimi vardır. Son olarak, kullanıcılar optik mikroskopi ve görüntü analizinde yetkin olmalıdır.

1. Mikrofluidik reaktör üretimi ve montajı

NOT: Bu protokolte kullanılan mikrofluidik reaktörler, Wang ve ark.55'ten uyarlanmış kum tanesi geometrisiyle AutoCAD olarak tasarlanmıştır. Her kalıp, 15 mm × 10 mm gözenek boşluğu, 0,41 gözeneklilik ve 2,3 μL gözenek hacmi ile altı replikat kanal üretir. Plazma işlemi dışında, reaktörler düşük tozlu ortamı korumak için laminar akış dolabında üretilir.

  1. Mikrofluidik kanallar yumuşak litografi kullanılarak polidimetilsiloksan (PDMS) ile dökülür.
    1. Plastik bir bardakta, elastomer baz ve kürleme maddesini 10:1 oranında tartın (burada sırasıyla 25 g ve 2,5 g).
    2. Plastik bir bıçak kullanarak, elastomer tabanını ve kürleme maddesini 10 dakika boyunca iyice karıştırın.
    3. Hava kabarcıklarını çıkarmak için vakum kuruducu ile 1 saat boyunca PDMS'yi gazdan çıkarın.
    4. PDMS'yi kalıp içine dökün ve kalan havayı gidermek için 30 dakika boyunca gaz dökün.
    5. Kalıpı bir sıcak plakaya koyun ve 95 °C'de 3 saat boyunca kürleyin.
    6. Kürlenip soğuduktan sonra, PDMS'yi kesip kalıptan soyurmak için bir bistüri kullanın.
    7. Bir kesme matında, altı mikrofluidik kanalı jilet bıçağıyla ayırın, her kanalın kenarında 2–3 mm boşluk bırakın. Her kanalda biyopsi deliği ile giriş ve çıkış delikleri açın.
    8. Her mikrofluidik kanalın her iki tarafını toz birikmesini önlemek için şeffaf bir bant şeridi ile kaplayın ve 100 mm Petri kabında saklayın.
  2. Deneyden bir gün önce, son mikrofluidik reaktörü hava plazmasıyla birleştirin.
    1. Bir mikrofluidik kanaldan şeffaf bantı çıkarın, ardından PDMS ve cam kapak parçasını %70 etanol ile durulayın ve sıkıştırılmış azotla kurutun.
      DIKKAT: Etanol yanıcıdır. Güvenlik veri sayfasına göre tutun ve sakla.
    2. Mikrofluidik kanalı ve kapak slipini yüzü yukarı plazma temizleyiciye yerleştirin. Odayı 1 dakika tahliye edin, ardından 1 dakika plazma uygulayın (18 W ve ~0.5 torr).
    3. Plazma temizleyicisinden mikrofluidik kanalı ve kapak kaymasını çıkarın, kapak kazmasını PDMS'ye yerleştirin, bağlanmayı sağlamak için hafifçe dokunun. Monte edilmiş reaktörü gece boyunca 100 mm Petri kapında saklayın.

2. Mikrofluidik akış kontrol sistemi

NOT: Elveflow'dan modüler bir sistem, basınç ve akış hızında minimum bozulma ile ardışık sıvı enjeksiyonunu kolaylaştırmak için kullanılır. Sistem bileşenleri arasında hava kompresörü, akış kontrolörü, dağıtım valfi, akış sensörü, sıvı rezervuarı rafı (15 mL konik borular için) ve Elveflow Akıllı Arayüz (ESI) yazılımı bulunur (Şekil 1). Şırınga pompaları gibi diğer akış kontrol sistemleri ise infüzyon veya çekme modlarında kullanılabilir; her etkili çözelti için özel şırıngalar veya rezervuarlar ve tek bir boru hattından ardışık sıvı enjeksiyonunu kolaylaştıran düşük ölü hacimli bölücü valf bulunur. Ancak, biyofilmleri yerinden çıkarabilecek basınç dalgalanmalarını en aza indirmek için şırınga pompalarıyla dikkatli olunmalıdır.

figure-protocol-1
Şekil 1: Akış kontrol sistemi ve mikrofluidik reaktör geometrisi. Deneysel sistem, pnömatik boru ile bağlı bir akış kontrolörü (1) (2) bir sıvı rezervuarı rafına bağlanmış, (3), büyüme ortamı (GMMn) ve tuz çözeltisi (SSMn) ardışık enjeksiyonu sağlayan bir dağıtım valfi, (4), gerçek zamanlı geri bildirim ve akış ayarı sağlamak için akış kontrolörüne bağlı bir akış sensörü (5), akışkan direnci sağlamak için küçük iç çaplı PEEK boru (7) mikrofluidik reaktörün yukarısında bir baloncuk tuzağı (8) içerir (9). Sistem şeması, ölçekli değil. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

  1. Tüm donanımı üreticinin talimatlarına göre kurup kalibre edin.
    NOT: Sıvı rezervuarı rafı, dağıtım valfi ve akış sensörü, deneyi 30 °C'de tutmak için özel yapılmış bir mikroskop kuluçka makinesinin içine yerleştirilmiştir.
  2. Hava kompresörü basınç regülatörünü 3 bar olarak ayarlayın ve hava kompresörü çıkışını pnömatik poliüretan boru ile akış kontrolör girişine bağlayın.
  3. Akış kontrolörü çıkışına hidrofobik bir filtre takarak sıvı geri akışını önleyin, ardından akış kontrolcüsünü, manifold ve dikenli adaptörlerle pnömatik polieter poliüretan boru ile sıvı rezervuarı rafının iki giriş portuna bağlayın.
  4. Akışkan rezervuarı rafını, dağıtım valfini ve akış sensörünü aşağıdaki gibi borulara bağlayın; 1/16 inç dış çaplı boru için flanşsız bağlantı kurucular kullanın; aksi belirtilmedikçe.
    1. Sıvı rezervuarı rafının iki çıkış portunu, dağıtım valfinin ilk iki giriş portuna 80 cm iç çaplı (ID) politetrafloroetilen (PTFE) boru ile bağlayın.
    2. Dağıtım valfinin çıkış portunu, 15 cm 500-μm ID PTFE boru ve bir adaptör bağlantısı ile akış sensörünün giriş portuna bağlayın.
    3. 60 cm 63,5 μm ID polieter eter keton (PEEK) borusunu akış sensörünün çıkış portuna bir adaptör bağlantısı ile takın.
      NOT: Farklı akış oranları gerektiren deneyler için, PEEK boru uzunluğunu gerektiği gibi ayarlayarak akış stabilitesi için yeterli akışkan direnci sağlanır.
    4. PEEK borusunu 10 cm uzunluğunda 500-μm ID'li PTFE boruya bir birleşik bağlantı ile bağlayın.
    5. PTFE borusunu, bir PTFE membran filtresi (gözenek boyutu ~10 μm) ile donatılmış mikrofluidik baloncuk tuzağının giriş portuna bağlayın.
    6. Etkili kabarcık çıkarımı için geri basınç oluşturmak amacıyla 75 cm 200-μm ID PTFE borusu baloncuk kapanı çıkış portuna takın. Bu tüp, mikrofluidik reaktör giriş deliğine bağlanacaktır.
  5. Her deneyden önce, tüm boru ve donanım bağlanarak akış kontrol sistemi, sistem hacminin üç katı için %1 ağartıcı çözeltisi ile (~4 saat, 7.0 μL·min-1 çözünürlükte) sterilize edilsin, ardından aynı süre boyunca steril ultrasaf su uygulanır.
  6. Deneyler arasında, akış kontrol sistemini aşağıdaki şekilde temizleyin.
    1. Dağıtım valfini ve akış sensörünü %100 izopropanol ve steril ultrasaf suyla yıkayarak durulayın; böylece kalıntı veya çökelti birikmesini önleyin.
      DIKKAT: İzopropanol yanıcıdır. Güvenlik veri sayfasına göre tutun ve sakla.
    2. Balon tuzağını otomatik olarak kapatın.
    3. Her deneyden sonra tıkanmayı (membran filtresi) veya bakteriyel kolonizasyonu (tüp) önlemek için baloncuk kapanı membran filtresi ve 200-μm ID PTFE tüpünü değiştirin.

3. Deneysel ortam ve çözümler

  1. Sıvı Luria Suyu (LB, Miller formülasyonu) ortamını 121 °C'de ultrasaf suda 20 dakika boyunca otoklavlayarak hazırlayın. LB agar plakaları için, %2,5 LB tozu ve %1,5 agar ultra saf suda 121 °C'de 20 dakika otoklav edin, ardından 100 mm Petri kaplarına (her tabak başına ~20 mL) döküp serinleşene kadar soğutulun.
  2. Amerikan Kimya Derneği (ACS) veya ultrasaf suda bakteriyolojik derecede reaktiflerle hazırlanan filtre steril stok çözeltilerinden, aşağıdakilerden 30 mL alın. Tuz çözeltisi ve büyüme ortamı bileşimi Gehin ve ark.59'dan uyarlanmıştır.
    1. Mn(II) olmadan tuz çözeltisi hazırlayın (SS0): 0.4 mM CaCl2·2H2O, 0.25 mM MgSO4·7H2O, 0.25 mM Na2HPO4·2H2O, 0.15 mM KH2PO4, 1:2 Fe(III)-EDTA (20 μM FeCl3·6H2O ve 40 μM EDTA pH 6.5'e ayarlanmış, 1M NaOH ile), 10 mM HEPES tamponu (pH 7.0 ile 1M NaOH ile ayarlanmış), 5 mM (NH4)2SO4 ve temiz metaller (40 nM CuSO4·5H2O, 273 nM ZnSO4·7H2O, 84 nM CoCl2·6H2O, 53.7 nM Na2 MoO 4·2H2O) steril ultrasaf suda.
    2. Mn(II) (SSMn) ile tuz çözeltisi hazırlanır: SS0 ile aynı, 50 μM MnCl2·4H2Oeklenmiştir.
    3. Mn(II) olmadan büyüme ortamı hazırlayın (GM0): SS0 ile aynı 1.5 g· L-1 maya ekstraktı ve 1.5 g· L-1 kasamino asit eklendi.
    4. Mn(II) ile büyüme ortamı hazırlayın (GMMn): GM0 ile aynı, 50 μM MnCl2·4H2Oeklenmiş.
      DIKKAT: Tuz çözeltileri ve büyüme ortamları hem sağlık hem de çevresel tehlikelere sahip metaller içerir. Güvenlik veri sayfalarına göre tutun ve sakla.
  3. Mikrofluidik reaktör içindeki Mn oksitlerin sindirimi için ultrasaf suda 40 mM oksalik asit dihidrat ve %2 nitrik asit içeren bir asit çözeltisi hazırlayın.
    DIKKAT: Oksalik asit dihidrat ve nitrik asit aşındırıcıdır, nitrik asit ise güçlü bir oksitleyicidir. Güvenlik veri sayfalarına göre tutun ve sakla.
  4. ICP-MS numune seyreltilmesi için ultrasaf suda %1 nitrik asit çözeltisi hazırlayın.

4. Bakteriyel kültürleme

NOT: Bakteriyel kültürleme, tezgah üzerinde Bunsen burner kullanılarak aseptik teknikle yapılır. Malzemeler sterildir, aksi belirtilmedikçe. Kuluçka süreleri P. putida GB-1'e özgüdür ve diğer mikroorganizmalar için ayarlanması gerekebilir.

  1. -80 °C sıcaklığındaki stoktan, LB agar plakasında P. putida GB-1 çizgisi kalın. Plakayı yaklaşık 20 saat boyunca 30 °C'de inkubka edin, böylece bakteriyel koloniler büyümesini sağlar.
  2. Deneyden önceki akşam, 50 mL'lik konik bir tüpe 10 mL LB ortamı ekleyin ve bir plaka kolonisiyle aşılayın. LB prekültürünü 30 °C ve 180 devirde bir shaker kuluçka makinesinde 16 saat boyunca kuluçka yapın ve durağan aşamaya ulaşın.
  3. 16 saatlik kuluçkadan sonra, 1 mL LB ön kültürünü 1,5 mL bir mikrosantrifüj tüpüne alıkoyup bakterileri pelletlemek için 8.000 x g hassasiyetinde 1 dakika santrifüj yapın.
  4. Aliquot'u üç kez yıkayarak harcamış LB ortamını çıkarın; süpernatantı atın, hücre pelletini 1 mL SS0'da yeniden süspansiyona yerleştirin ve 8.000 x g'de 1 dakika santrifüj yapın. Son pelleti 1 mL SS0'da yeniden askıya alın.
  5. Hücre yoğunluğu ölçer ile steril olmayan bir küvette yıkanmış hücre süspansiyonunun optik yoğunluğunu (OD600) ölçün. Bu adımda P. putida GB-1 için beklenen OD600 3.6–3.8 arasındadır, bu nedenle SS0'da en az 5 kat seyreltme gereklidir.
  6. 20 mL GM0'ı yıkanmış hücre süspansiyonu ile 50 mL Erlenmeyer şişesinde 0.01 başlangıç OD600'e aşılayın. Orta üstel faza ulaşmak için 30 °C ve 180 rpm'de 6 saat kuluçka yapın.

5. Biyomineralizasyon deneyi

  1. Deneyin sabahı, akış kontrol sistemini çalıştırın.
    1. Mikroskop kuluçka makinesini 30 °C'ye kadar önceden ısıtın.
    2. 10 mL GMMn ve SSMn'yi iki 15 mL konik tüplere dökün ve boruları sıvı rezervuarı rafına bağlayın. SSMn'yi sistem hacminin yaklaşık üç katı için (~4 saat 7.0 μL·min-1'de) boşaltın, ardından aynı süre için GMMn kullanın.
  2. Orta üstel kültür aşılandıktan sonra hazırlanan mikrofluidik reaktörü 5 saat doygunlaştırın.
    NOT: Reaktör doygunluğu ve aşılama, tezgah üzerinde Bunsen burner kullanılarak aseptik teknikle gerçekleştirilir. Malzemeler sterildir, aksi belirtilmedikçe.
    1. Reaktörü 20 dakika boyunca vakum kurutucuda gazdan çıkarın.
    2. Reaktör gazdan çıkarılırken, 1–2 ml SS0 sıvısını 3 mL plastik bir şırıngaya çekin, ardından bir küt uçlu iğne ve 20 cm 0,02 inç ID Tygon borusu takın. Şırınganın pistonuna tüp tamamen doygunlaşana kadar basın.
    3. Reaktörü kurutucudan çıkarın, ardından boruyu açılı cımbızlarla reaktör çıkış deliğine bağlayın ve reaktörü enjektörle manuel olarak doyurarak reaktör giriş deliğinde bir damla oluşana kadar sıvılaştırın.
    4. Reaktör giriş deliğine 20 cm 0.02 inç ID'lik Tygon borusu takın. Tüm hava kabarcıkları (200–300 μL) giderilene kadar SSMn'nin reaktöre dağıtılmasına devam edin.
  3. Reaktör aşısını hazırlayın ve mikrofluidik reaktörü aşılayın.
    1. Aşılamadan 6 saat sonra shaker kuluçka makinesinden orta üstel kültürü çıkarın ve OD600'ü ölçün. Bu aşamada beklenen OD600 1.6–1.8 olduğundan, SS0'da 4 kat seyreltme önerilir.
    2. Orta üstel kültürü 2 mL SSMn'de 2 mL mikrosantrifüj tüpünde başlangıçOD 600'e kadar 0.005'e seyreltin. Karıştırmak için tüpü birkaç kez ters çevirin.
    3. Reaktör giriş borusunu mikrosantrifüj tüpüne yerleştirin; böylece bir damla sıvı aşısına temas ederek tüplere hava girmesini önleyin. Mikrosantrifüj borusunu kısmen kapatın ve kapağı bantla sabitleyin, böylece kontaminasyon önlenir.
    4. 4–5mL SS Mn'yi 5 mL cam gaz geçirmez bir şırıngaya çekip namluyu ıslatın, ardından şırıngada 0,5 mL kalana kadar dağıtın. Şırıngayı bir şırınga pompasına yükleyin.
    5. İğneyi plastik şırıngadan çıkarın ve cam şırıngaya takın, iğne göbeğinde hava tutmamaya özen gösterin.
    6. Reaktöre şırınga pompasıyla aşı verin; inokulum 20 dakika boyunca reaktöre çekilerek 8,33 μL·min-1 (~70 gözenek hacmi) akış hızında.
    7. Aşılamadan sonra şırınga pompasını kapatın ve bakterilerin 1 saat boyunca akım olmadan yerleşip yapışmasına izin verin.
    8. 1 saat sonra şırıngayı şırınge pompasından çıkarın ama çıkış borusuna bağlı bırakın.
  4. Aşılanmış mikrofluidik reaktörü akış kontrol sistemine bağlayın.
    1. Reaktör ve şırıngayı tezgahtan mikroskop kuluçka makinesine taşıyın.
    2. Mikroskop aşamasında, reaktörün giriş borusunu çıkarın.
    3. Şırınganın pistonuna hafifçe basarak reaktör giriş deliğinde bir damla oluşturun.
    4. PTFE borusunu akış kontrol sisteminden manuel olarak dik açıda (~1 cm) bükerek PDMS yüzeyine dik olarak bağlanarak yanal kuvvetleri ve reaktör giriş deliğine hava girişini en aza indirin.
    5. PTFE borusunun ucunu hidrofobik boru dışını ıslatmak için %1 polietilen glikol diyakrilat (PEG-DA) çözeltisine batırın. PTFE borusunun sonunda bir damla GMMn olduğundan emin olun ve boruyu reaktör giriş deliğine takın.
    6. Şırıngayı ayırın ve çıkış borusunu steril olmayan 5 mL mikrosantrifüj borusuna yerleştirerek reaktör atık suyunu toplayın.
    7. Akış kontrol sistem yazılımında akış hızını 1.33 μL·min-1 olarak ayarlayın. Biyofilm oluşumunu teşvik etmek için 15 saat (~500 gözenek hacmi) boyunca GMMn sağlamak, ardından 28,5 saat (~1.000 gözenek hacmi) için SSMn sağlamak için bir program kurmak.
  5. Mikrofluidik reaktörü mikroskop aşama insertine monte edin.
    NOT: Mikroskop aşama insertine bağlı özel yapım ultraviyole C (UVC) ışın sistemi, mikrofluidik gözenek boşluğu dışındaki istenmeyen bakteri büyümesini ve mineral çökelmesini azaltmak için kullanılır (Şekil 2). Bu tasarım, Ramos ve ark.60'tan uyarlanmış olup, otomatik bir programla kontrol edilebilir. Detaylar için Fadely ve ark.61'e bakınız.
    1. Stabilite için reaktörün altına bir örnek çerçevesi yerleştirin, ardından çerçeve ve reaktörü aşama insertine sertçe monte ederek tamamen hareketsiz kaldıklarını garanti edin.
    2. PTFE borusunu sahne girişine bir bant parçası ile sabitleyin, böylece boru reaktör giriş deliğinden ayrılmasını önleyin.
    3. UVC kollarını, giriş tarafında gözenek boşluğu kenarından 3 mm, çıkış tarafında ise 2 mm mesafede hizala, böylece ultraviyole ışık ve gözenek boşluğunda biyofilm hasarının en aza indirilmesini sağlamak sağlanır.
      NOT: Doğru UVC hizası, reaktör giriş bölgesinde çok az veya hiç biyokütle birikimi yaratmaz (Şekil 3A). UVC kollarının gözenek boşluğunun giriş kenarından çok uzak hizalanması (Şekil 3B) veya ışınlanmanın olmaması (Şekil 3C), gözenek boşluğunun yukarısında mineral çökelmesine yol açar.
    4. Reaktör ışınlanması için bir program kurun. Reaktör giriş ve çıkış bölgelerini t = 0 saat ile 5 dakika boyunca tedavi ederek aşılama sırasında biriken bakterileri inaktive edin, ardından çıkış bölgesini t = 17,5 saatte 5 dakika boyunca tedavi ederek kalan biyofilmleri etkisiz hale getirin.

figure-protocol-2
Şekil 2: Mikrofluidik reaktörler için özel olarak üretilen ultraviyole C (UVC) ışınlama sistemi. (A). Mikroskop sahne insertine monte edilmiş sistemin üst görünümü, pozulabilir kolları (mavi) ve bağlı UVC ışık yayıcı diyot (LED) dizilerini (sarı dikdörtgenler) ve örnek çerçevesine monte edilmiş mikrofluidik reaktörü (küçük gri dikdörtgen) gösteriyor. (B). Sistemin alt görünümü, pozitlenebilir kollara gömülü UVC LED'leri (ten kareleri) göstermektedir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

figure-protocol-3
Şekil 3: UVC ışınının mikrofluidik reaktör giriş bölgesi üzerindeki etkisi. (A). T = 0 saat ile 5 dakikalık UVC işlemi yapılan reaktör giriş bölgesi, istenmeyen biyofilmlerin tamamen alınması için doğru hizalanmayı gösterir. (B). Yanlış hizalanmış bir UVC dizisi bulunan reaktör giriş bölgesi, giriş deliğinde ve gözenek boşluğunun dışında kalan biyofilmler bırakarak Mn oksitlerinin yukarı akışta çökelmesine izin veriyor. (C). UVC işlemsiz, yoğun biyofilm büyümesi ve mineral çökelmesine yol açan reaktör giriş bölgesi. Gri gölgelendirme gözenek boşluğunu belirler. Ölçek çubuğu 2 mm'dir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

6. Optik zaman geçişli mikroskopi

NOT: Renkli parlak alan görüntüleme için dijital kamera (görüş alanı başına 2304 x 2304 piksel), beyaz ışık motoru, 4x objektif (1.62 μm·piksel-1) ve NIS Elements yazılımı ile donatılmış Nikon Ti2 Eclipse ters epifloresans mikroskobu kullanılmıştır. Renkli görüntüleme yapabilen diğer optik mikroskoplar da uygundur. Renkli görüntüleme kullanımı, düşük Mn oksit kütlesine karşı hassasiyeti artırır. Zaman geçişi otomasyonu seçenek değilse, kullanıcılar görüntüleri elle toplayabilir ve zaman serisi olarak sonradan işlem yapabilir.

  1. Yüksek kaliteli görüntüler için aşağıdaki hizalama ve düzeltme adımlarını gerçekleştirin:
    1. Eşit aydınlatma sağlamak için, üreticinin talimatlarına uygun olarak Köhler hizasını manuel olarak ayarlayın.
    2. Parlak alan aydınlatmasını görüntünün düşük veya aşırı doygunluğunu önlemek için optimize edin (Fusion Pad > Color > Auto Brightness ve Fusion Pad > Color > Auto White).
      NOT: Zaten biyofilm ve Mn oksitler içeren bir reaktörde parlak alan aydınlatmasını yalnızca bir kez optimize etmek, ardından aynı pozlama süresi ve renk dengesini sonraki tüm deneylere uygular, böylece tutarlı aydınlatma sağlanır. Burada, kırmızı %97,58, yeşil %44,76 ve mavi %100 ile 5 ms aydınlatma kullanılır.
    3. Mikrofluidik gözenek boşluğunun dikişli görüntülerini elde ederken yorgan artefaktlarını önlemek için bir gölgeleme düzeltmesi uygulayın (Hangi > Gölgelendirme Düzeltme Paneli).
  2. Dikişli görüntünün merkez koordinatını ayarlayın (ND Acquisition > XY).
  3. Dikişli görüntü tarama alanını kurun (burada, 5 x 4 görüş alanı) ve %1 örtüşme uygulayın (ND Acquisition > Large Image).
  4. 4x hedefle renkli parlak alan görüntülerinin alınmasını (ND Acquisition > λ) ayarlayın.
  5. Görüntüleme frekansını 15 saat (büyüme fazı) ve 0.5 saat (28.5 saat (mineralizasyon fazı) (ND Alım > Zamanı) aralıklarla ayarlayın, ardından zaman geçişi programını çalıştırın.
    NOT: Büyüme ve mineralizasyon aşamalarının süresi P. putida GB-1'e özgüdür ve diğer mikroorganizmalar için gerektiğinde ayarlanabilir.
  6. Deney tamamlandığında, görüntüleri Etiketlenmiş Görüntü Dosya Formatı (TIFF) olarak dışa aktarın (Makro Paneli > Görüntüleri TIFFye Dışa Aktar).

7. Asit sindirimi ve Mn kütle ölçümü

NOT: Mikrofluidik reaktörün içinde tutulan Mn kütlesini ölçmek için ICP-MS kullanılır, ancak optik emisyon spektrometreleri (ICP-OES) gibi diğer cihazlar da kabul edilebilir. Analitik cihazlar mevcut değilse, asit sindirilmiş örnekler ticari bir laboratuvara gönderilebilir.

  1. Deneyin sonunda, reaktörü mikroskop aşaması insertinden çıkarın ve giriş ile çıkış borusunu ayırın.
  2. 1,5 mL asit çözeltiyi 5 mL cam gaz geçirmez bir şırıngaya (aşılama şırıngasından ayrı) çekilin. Bir küt uçlu iğne ve 20 cm 1/32 inç ID PTFE tüpünü şırıngaya takın ve borunun sonunda bir damla oluşana kadar asit ile manuel olarak dağıtın.
  3. Tezgah üstünde, şırıngayı bir şırınga pompasına yükleyin ve boruyu reaktör giriş deliğine bağlayın; hava kabarcıklarının hapsedilmesine dikkat edin; bu da asit çözeltinin tüm gözeneklere nüfuz etmesini engelleyebilir. 30 cm 1/32 inç ID PTFE borusunu reaktör çıkış deliğine bağlayın ve çıkış borusunun ucunu 2 mL bir mikrosantrifüj tüpüne yerleştirin.
  4. Reaktöre 100 μL·min-1 akış hızında 10 dakika boyunca asit çözeltisi enjekte edin.
  5. Asit çözeltisi enjeksiyonundan sonra, küt uçlu iğneyi cam şırıngadan ayırın. 10 mL'lik plastik bir şırıngayı hava ile doldurup kör uçlu iğneye bağlayın, ardından enjektördeki tüm havayı manuel olarak dağıtarak reaktörden ve borulardan kalan asidi 2 mL mikrosantrifüj tüpüne boşaltın.
    NOT: Hava enjeksiyonundan sonra küçük bir asit çözeltisi hapsedilmiş halde gözenek boşluğunda kalabilir, ancak enjekte edilen toplam hacme göre önemsizdir. Daha düşük gözenekli geometrilerle çalışan kullanıcılar, kötü bağlı gözeneklerden sıvı filmler ve kalıntı asidi çıkarmak için ek hava hacimlerini yıkamayı düşünebilir.
  6. Sindirilen örneği ICP-MS kalibrasyon aralığına göre %1 nitrik asitle seyreltin. Burada, 15 mL'lik konik bir tüpte 100x seyreltme (toplam 5 mL hacim) hazırlayın.
  7. Sulandırılmış örnekteki Mn konsantrasyonunu ICP-MS ile ölçün. Ölçülen konsantrasyonu, seyreltme faktörü ve toplam örnek hacmiyle düzelterek reaktörde kalan Mn kütlesini belirleyin.

8. Görüntü analizi

NOT: MATLAB, metinde yer alan görüntü analizi için yerleşik işlevleri nedeniyle tavsiye edilir. Ancak, ImageJ veya Python'un görüntü analiz kütüphaneleri gibi diğer araçlar da benzer analizler yapmak için kullanılabilir. Temel görüntü analiz adımları Şekil 4'te gösterilmiştir. Tüm görüntü analiz betikleri Ek Dosyalar (Ek Dosya 1, Ek Dosya 2 ve Ek Dosya 3) olarak sağlanır.

figure-protocol-4
Şekil 4: Mn oksit çökeltmelerini izole etmek için görüntü çıkarma iş akışı. Zaman geçişli renkli parlak alan görüntülerinden, sonraki tüm zaman noktası görüntülerinden altta yatan sabit faz biyofilmlerinin yoğunluğunu kaldıran bir referans görüntü (tref) (1) tanımlanmıştır (tn) (2) Tüm tn'nin ikili maskeleri oluşturulmuş ve hem tref (4) ile hem de karşılık gelen tn (5) ile çarpılmış, biyofilm-biyomineral kapsamı yakalanır. Son olarak, maskeli tn (tn) maskalı tref'ten çıkarılmıştır (6). Ortaya çıkan yoğunluk düzeltilmiş matrisler, her pikselde Mn oksit birikimi nedeniyle yoğunluk azalmasını (a.u.) nicelikle gösterir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

  1. Mikrofluidik gözenek alanı geometrisinin (AutoCAD'den dışa aktarılmış) yüksek çözünürlüklü bir TIFF'ini çalışma alanına yükleyin ve böylece bir tahıl maskesi (imread) olarak kullanın.
  2. Renkli parlak alan görüntülerini düzleştirin ve kaydederek gren maskesini etkili şekilde uygulayın.
    1. İlk zaman noktası görüntüsünün kayıt ikili dosyasını oluşturun (t = 0 h).
      1. Renkli parlak alan TIFF'i çalışma alanına yükleyin (imread).
      2. Görüntüyü gözenek boşluğundan biraz daha büyük kırpın (kırpın).
      3. Gren sınırlarının çözünürlüğünü artırmak için görüntüyü keskinleştirin (keskinleştirme).
      4. Karanlık özellikleri önceliklendiren adaptif eşik kullanarak görüntüyü ikili hale getirin (rgb2gray, adaptthresh ön plan polaritesi = "karanlık" ve hassasiyet gerektiğinde ayarlanır, imbinarize et, tamamlayıcı).
      5. Ortaya çıkan kayıt ikili tanelerini doldurarak katı özellikler oluşturun (belirtilen "deliklerle" doldurun ). Tüm tahılların doldurulmayacağını unutmayın.
      6. Arka plan gürültüsünü kaldırmak için kayıt ikili sistemini gerektiği kadar aşındırın, ardından gren kenarlarında kaybedilen pikselleri yerine koymak için genişletin (imerode, imdilate).
    2. Kayıt ikili karakterini tane maskesine hizalamak için gereken dönüşüm matrisini hesaplamak için ölçekli değişken özellik dönüşümü (SIFT) kayıt algoritması kullanın (detectSIFTFeatures, extractFeatures, matchFeatures, estgeotform2d with transform type = "affine").
    3. Bu dönüşüm matrisini kayıt ikili ve ilk zaman noktası görüntüsüne uygulayın, ardından onları damar maskesi ile örtün ve uyumu değerlendirin (imwarp, imshowpair).
    4. SIFT kaydından sonra kötü hizalama devam ederse, gerekirse yerel kayıt uygulanabilir (cpselect, fitgeotform2d dönüşüm tipi = "lwm", imwarp).
    5. Kayıtlı görüntüyü kırpın ve tanen maskesini matris kenarlarındaki kayıt artefaktlarını kaldırmak için gerektiğinde kırpın, ardından gözenek alanı boyutlarına (15 mm x 10 mm) göre boyutlandırın (kırpma, boyutlandırma).
    6. Tüm renkli parlak alan görüntülerini tekrar ederek aynı kayıt (imwarp) uygulanır.
  3. Biyofilmler ilk kez sabit faza girdiğinde, sürekli hareket veya büyüme eksikliği olarak belirlenen(burada t = 18,5 saat) referans görüntüsünü görsel olarak tanımlayın.
  4. Her zaman noktası görüntüsünü (tn, Şekil 4'te Panel 2) (rgb2gray, adaptthresh ön plan polaritesi = "karanlık" ve hassasiyet gerektiğinde ayarlanmış, imbinarize et, imcomplement) öyle binarize edin ki biyofilm-biyomineral toplulukları = 1 ve taneler ile boş gözenekler = 0. Her zaman noktası maskesini, tersli tane maskesi (imkomplement) ile çarparak kalıntı tanen sınırları kaldırılır.
  5. Tn'yi ilgili zaman noktası maskesi ile çarpın ( Şekil 4'teki Panel 3) ve ilgi duyulan biyofilm-biyomineral bölgesini izole edin ( Şekil 4'teki Panel 5), ardından tref'i her zaman noktası maskesi ile çarparak aynı bölgeyi izole edin ( Şekil 4'teki Panel 4).
  6. Her zaman noktasında Mn oksit birikimiyle ilişkili piksel yoğunluğundaki azalmayı nicelendirmek için maskeli tref'ten tüm maskalanmışt n'yi çıkarın (çıkarın), ardından bileşik yoğunluk düzeltmeli matrislere dönüştürün (rgb2gray, Panel 6, Şekil 4).
  7. Gözenek alanı (a.u.) boyunca mineral mekânsal dağılımını değerlendirmek için, her yoğunluk düzeltilmiş matrisin sütunları boyunca toplam (toplam boyut = 1) yapılır.
  8. Mn oksit çökelme oranının zaman içinde (μg·h-1) tahmini olması için:
    1. Her yoğunluk düzeltilmiş matrisi toplamanız (boyutlu toplam = "hepsi") toplap, her zaman noktasında toplam düzeltilmiş yoğunluğu niceleştirin.
    2. Her zaman noktasındaki toplam düzeltilmiş yoğunluğu, son zaman noktasındaki toplam düzeltilmiş yoğunluğa bölerek son zaman noktası = 1 ve önceki tüm değerler kısmal olsun. ICP-MS ile ölçülen Mn kütlesiyle çarparak μg'ye yeniden ölçeklendirin.
    3. Türeveni, ardışık zaman noktaları (fark) arasındaki kütle artışını (μg) görüntüler arasındaki zaman aralığına (0,5 saat) bölerek alın.

Sonuçlar

Bu protokol, biyofilm oluşumu ve Mn biyomineralizasyonunun uzaylı-zamansal çözülen görüntülemesi için deneysel bir platform sağlar. Renkli parlak alan görüntüleri, P. putida GB-1 biyofilmlerinin, Mn oksit çökelmesinin başlamasından önce t = 18,5 saat içinde mikrofluidik gözenek boşluğunda eşit şekilde dağıldığını göstermiştir (Şekil 5A). Bunun sonucunda, Mn oksitleri tercihen etkin Mn(II) kaynağına en yakın gözenek boşluğunun giriş tarafında birikmiştir (Şekil 5B). Referans görüntü ile sonraki görüntü zaman noktaları arasındaki fark, Mn oksit çökelmelerinin genel görüntü yoğunluğuna izole katkısını ortaya koymuş (Şekil 5C) ve gözlemlenen reaktor ölçeği gradyanının mineral birikiminde nicelendirilmesini mümkün kılmıştır (Şekil 5D). Biyofilm ölçeğinde, bu görüntü çıkarma yaklaşımı, biyofilm yüzeylerinde Mn oksitlerin kademeli çökelmesini ve gözenek sıvısıyla temas halinde biyofilmlerin kenarlarında minerallerin birikmesini yakaladı (Şekil 6).

Protokol ayrıca görüntü çıkarma ve ICP-MS ölçümlerinden Mn oksit çökelmesinin kinetik değerini tahmin etmek için bir iş akışı sağlar. Triplicate mikrofluidik reaktörler, son deneysel zaman noktasında 4,29 ± 0,22 μg Mn içeriyordu. Reaktör içeriğinin asit sindirimi, daha önce Mn oksit kütlesinin senkron tabanlı ölçümleriyle doğrulanmış ve %18'in altında bir hataolduğu bulunmuştur 61. Bu nedenle, yoğunluk düzeltilmiş matrisler bu son kütleye yeniden ölçeklendirilmiştir. Ortaya çıkan tahmini Mn oksit çökelme hızı monoton değildi; t = 19,5 saat ile t = 21 saat arasında dik bir şekilde arttı, ardından 0,29 ± 0,04 μg·h-1 seviyesinde zirve noktasına ulaştı ve t = 43,5 saat olana kadar yavaşladı (Şekil 7). Bu hız hesaplamasının, optik mikroskopun çözünürlüğünün altında olan nanopartikül Mn oksitleri veya deney süresi boyunca taşınma nedeniyle kaybedilen herhangi bir oksit kütlesini hesaba katmadığı belirtilmelidir; bu kütlesin minimum olması beklenmektedir. Bu yaklaşım, biyomineralizasyon kinetiğinde zamansal eğilimleri yarı nicel olarak değerlendirmek için erişilebilir mikroskopi tekniklerinden faydalanır.

figure-results-1
Şekil 5: Biyofilmlerin ve Mn oksitlerin reaktör ölçeğinde dağılımı (A). Sabit fazın başlangıcında mikrofluidik gözenek boşluğunda P. putida GB-1 biyofilmlerinin renkli parlak alan görüntüsü (t = 18,5 saat, tref). (B). Mn oksit yüzeyinin renkli parlak alan görüntüsü, P. putida GB-1 biyofilmleri üzerinde ve çevresinde son deneysel zaman noktasında (t = 43,5 saat) çökelmiştir. (C). Son deneysel zaman noktasında (t = 43,5 saat) mineral birikimi yoğunluğu düzeltilmiş matrisi, tanecikler gri ve gözenekler beyazla gösterilmiştir. Ölçeği çubuğu 1 mm. (D). Girişten (soldan) gözenek boşluğunun çıkış (sağ) tarafına (t = 43,5 saat) toplam düzeltilmiş yoğunluğun tek boyutlu uzamsal dağılımı. Düz çizgi, girişten çıkışa kadar gözenek boşluğu boyunca üçlü deneylerde ortalamanın ortalamasını temsil eder ve gölgeleme standart sapmayı temsil eder. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-2
Şekil 6: Biyofilm ölçeğinde Mn oksit birikimleri. (A). Temsilci P. putida GB-1 biyofilmlerinin renkli parlak alan görüntülerini seçin. Manganez oksitleri ilk olarak biyofilm yüzeylerinde griden kahverengiye renk değişimi olarak (t = 20 saat ve t = 21 h olarak gösterilmiştir), daha sonra ise biyofilm kenarlarında koyu kahverengi çökeltmelerin birikimi olarak tespit edilebiliyordu (t = 33 saat ve t = 43 h olarak gösterilmiştir). (B). Koyu gri tanelerle yoğunluk düzeltilmiş mineral birikimi, beyaz gözenekler ve açık gri altındaki biyofilmler. Ölçek çubuğu 150 μm'dir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-3
Şekil 7: Mn oksit çökelme oranının zaman içinde tahmini. Hız (μg·h-1), her zaman noktasında düzeltilmiş toplam yoğunluğun ICP-MS ile ölçülen uç nokta Mn kütlesine yeniden ölçeklendirilmesiyle ve ardından türevin zamana göre alınmasıyla nicelendirildi. Belirteçler üçlü deneylerin ortalamasını temsil eder ve gölgeleme standart sapmayı temsil eder. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Dosya 1: Step1_ImageRegistration.m.Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Dosya 2: Step2_ImageSubtraction.00Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Dosya 3: Step3_Figures.m.Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

Bu deneysel platform, yüksek isabetli veri edinmesini engelleyen eserlerden arınmış gözenekli ortamlarda biyojeokimyasal süreçlerin mekansal-zaman dinamiklerini incelemek için benzersiz fırsatlar sunar. Bu yaklaşım, özellikle Mn ve Fe biyomineralizasyonu için uygundur; bu moleküller, optik mikroskopi ve görüntü analiziyle kolayca segmentlere ayrılabilen karakteristik okra, kahverengi ve siyah tonlarına sahip mineral çökeltmeleri üretir. Mn biyomineralizasyonu bir vaka çalışması olarak kullanılarak, yerinde mineral çökelme desenleri ve oranları yüksek mekânsal ve zamansal çözünürlükle değerlendirilebilir.

Bu protokolün birkaç yönü, biyojeokimyasal dönüşümlerin tekrarlanabilir ölçümlerinin toplanmasını mümkün kıldı. İlk olarak, düşük ölü hacimli ardışık enjeksiyon valfi kullanmak, mikrofluidik gözenek boşluğundaki biyofilmleri bozmadan birden fazla sıvı üzerinde deneyleri kolaylaştırdı. Bu düzen, enjeksiyon yapılan sıvılar değiştirilirken biyofilmlerin dökülmesine veya yer değiştirmesine yol açabilecek basınç artışlarını önleyerek başlangıçtaki biyofilm mekânsal dağılımını korur; bu durum şırınge pompaları gibi diğer aletlerde de ortaya çıkabilir. Bu bileşen, kullanıcıya yerleşik mikroorganizmalara uygulanan jeokimyasal koşulları özelleştirme esnekliği de sağlar. Son olarak, ilk biyofilm dağılımını koruduğu için, bu kurulum kullanıcının farklı biyofilm morfolojilerinin veya biyokütle miktarlarının Mn oksit çökelmesinin dağılımı ve hızını nasıl etkilediğini sistematik olarak test etmesini sağlar.

İkinci olarak, mikrofluidik gözenek alanında baloncukların oluşumunu ve girmesini azaltmak, Mn biyomineralizasyonunun çevresel olarak ilgili zaman ölçeklerini yakalayan çok günlük deneylere olanak sağladı. Odasıcaklığından 62,63 üzerindeki uzun deneylerde yaygın ve çoğu zaman kaçınılmaz bir sorun olan baloncuklar, bireysel gözenekleri parçalayabilir ve tıkayabilir, sıvı akışını yönlendirebilir ve reaksiyon ilerlemesini engelleyebilir. Gözenek boşluğunda kabarcık tuzamasını önlemek için, reaktör aşılamadan önce tamamen doygunlaştırılmıştı. Akış kontrol sistemi üzerinden kabarcıkların girmesini en aza indirmek için, mikroskop kuluçka makinesi deneyden çok önce 30 °C'ye ayarlandı ve aşılanmış reaktör bağlanmadan önce birden fazla hacimli etkili çözelti yıkandı. Bu adım, boru ve bağlantı organlarından hapsolmuş havayı uzaklaştırdı ve deney sırasında sıvı dışarı çıkma riskini en aza indirdi. Ayrıca, kalıntı baloncukları yakalamak için akış kontrol sistemine bir baloncuk tuzağı entegre edildi; tuzak çıkışına 200 μm uzunluğunda PTFE borusu bağlanarak direnci artırdı ve baloncuk çıkarma verimliliğini artırdı. Son olarak, etkili boru ile reaktör giriş deliği arasındaki arayüzde hava hapsolması veya sızıntı önlemek için, tüm bağlantılar borunun her iki ucunda ve delikli delikte sıvı damlalarıyla yapıldı, hidrofobik PTFE boru %1 PEG-DA ile kaplandı ve yerleştirilen borunun ucu deney boyunca PDMS yüzeyine dik tutuldu.

Üçüncü olarak, deneysel platforma özel olarak inşa edilmiş bir UVC ışınlama sistemi dahil etmek, mikrofluidik gözenek alanında tanımlanmış bir jeokimyasal sınır koşulunu koruyor ve tekrarlanabilir şekilde kısıtlanan Mn biyomineralizasyonunu sağlamıştır. Pilot deneyler, reaktör giriş bölgesindeki yabancı biyofilmlerin gözenek boşluğunun yukarısında Mn oksitleri çökelttiği ve Mn(II)'nin aşağı akış erişilebilirliğini kısıtladığını gösterdi. Akış kesintisi sonrası reaktör giriş ve çıkış bölgelerinin doğru hizalanarak kısa bir süre ışınlanması, başlangıçta biriktirilen bakterilerden biyofilm gelişimini engelledi. Sürekli tek yönlü sıvı akışı, bu ilk UVC işleminin ardından reaktör giriş bölgesinin yeniden kolonileşmesini engelledi. Reaktör çıkış bölgesini, sabit faza başlamadan t = 17,5 saat önce ve görünür Mn oksit çökelmesi ile ışınlamak, gözenek boşluğunun aşağısında mineral birikimini en aza indirmiştir. Bu, renkli parlak alan görüntü verilerinin ICP-MS ile sindirilen ve ölçülen Mn kütlesiyle doğrudan karşılaştırılmasını kolaylaştırdı.

Görüntü çıkarma ve uç nokta kütle ölçümlerinin birleşimi, Mn oksit çökelmesinin kinetik noktasında değerlendirilmesi için yarı nicel bir yöntem sağladı. Ancak, kameranın koyu renklere karşı sınırlı hassasiyeti nedeniyle çok yüksek mineral yoğunlukta piksel yoğunluğunun Mn oksit kütlesiyle doğrudan orantılı olmaktan çıktığınıbelirtmek önemlidir 61. Bu doğrusal olmayan davranışın değerlendirilmesi, belirli zaman noktalarında asit sindirme örnekleri ile ve sindirilen kütleyi nihai deneysel zaman noktasına göre ölçeklendirilen orijinal kütle ile karşılaştırarak geliştirilebilir. Mineral kütlesinin kesin olarak nicelenmesi gerekirse, kullanıcılar bilinen yoğunluk ve kütleye sahip mineral örnekleri kullanarak bir kalibrasyon eğrisi geliştirebilir (ki bu daha önce Fadely ve ark.61'de gösterilmiştir) veya senkron tabanlı X-ışını floresansı ile doğrudan ölçümler yapabilir.

Burada sunulan mikrofluidik platform, biyomineralizasyon süreçlerini çok çeşitli çevresel koşullar altında incelemek için kullanılabilir. Temsilci deneyler P. putida GB-1 için optimize edilmiş olsa da, bu düzen, çeşitli etkili çözelti kimyalarını (örneğin, Mn veya Fe konsantrasyonu, karbon kaynağı, birlikte bulunan metallerin varlığı), akış hızları, sıcaklıklar veya mikrobiyal bir konsorsiyumun varlığı sistematik olarak test etmek için kullanılabilir. Fe-oksitleyici bakteriler için uygun olanlar gibi spesifik asidik veya suboxik koşullar, etkili pH azaltarak veya PDMS'yi oksijen geçirimsiz bir polimerle kaplayarak simüle edilebilir. Biyomineralizasyon üzerindeki mikrobiyal kontroller hakkında içgörüler, raporlayıcı gen füzyonu suşlarının uygulanması ve ortaya çıkan optik floresansıtakip ederek elde edilebilir 59,64. Mikrofluidik reaktörler, parçacık boyutu dağılımı, parçacık şekli veya gözenekliliği değiştirilerek veya PDMS'nin kil parçacıklarının veya doğal organik maddenin yüzey yükünü taklit edecek şekilde işlevselleştirilerek çeşitli gözenekli ortamları simüle edecek şekilde yeniden tasarlanabilir. Ek modifikasyonlarla (örneğin, cam reaktör alt tabakasının plastikle değiştirilmesi) reaktörler, metal oksidasyon durumu, mineraloji, organo-mineral ilişkileri veya ikincil metallerin sorbsiyonu veya birlikte çökelmesi gibi doğrudan spektroskopik ölçümleri destekleyebiliyor. Son olarak, bu deneysel platform, optik özellikleri görüntü segmentasyonuna izin verecek kadar farklı olması koşuluyla diğer metal biyominerallerin (örneğin fosfatlar, karbonatlar, sülfürler) çökelmesini incelemek üzere genişletilebilir. Bu protokol, ilgili gözenekli ortamlarda biyomineralizasyon ve mikrop-mineral-sıvı etkileşimlerini kapsamlı şekilde incelemek için bir çerçeve sunar.

Açıklamalar

Yazarlar çıkar çatışması belirtmemektedir.

Teşekkürler

Bu proje, ABD Ulusal Bilim Vakfı Biyo-aracılı ve Biyo-ilham Jeoteknik Merkezi (ERC-1449501), İsviçre Ulusal Bilim Vakfı (200021_188546) ve ABD Ulusal Bilim Vakfı (MCA-2322428, EAR-1847689, DMR-2003849) tarafından desteklenmiştir. Bu çalışmanın bir kısmı UC Davis Nano ve Mikro Üretim Merkezi'nde (CNM2) gerçekleştirildi. Steven Lucero ve UC Davis Tech Foundry'ye mikroskop kuluçka makinesi ve UVC ışınlama sisteminin tasarımı ve üretimi için teşekkür ediyoruz. Ayrıca mikrofluidik reaktör üretiminde kullanılan gözenekli ortam geometrisini sağladıkları için Dr. Yuze Wang ve Dr. Jason DeJong'a, fotolitografi ve yumuşak litografi üzerine faydalı tartışmalar ve/veya eğitim veren Dr. Arunima Bhattacharjee, Dr. Noah Goshi, Dr. Gregory Girardi ve Dr. Hyehyun Kim'e teşekkür ederiz. Son olarak, deneysel tasarım ve görüntü analizi üzerine değerli tartışmalar için Dr. Gaitan Gehin, Dr. Tonya Kuhl, Dr. Filippo Miele ve Dr. Charles Graddy'ye teşekkür ederiz.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Adapter fitting (Elveflow, 6-40 to 1/4-28)Darwin MicrofluidicsLVF-KFI-08Akış sensörü ve flanşsız bağlantı parçaları arasında arayüz için kullanılır.
Agar (Fisher BioReagents)Fisher ScientificBP9744Dondurulmuş stoklar için plaka dökmek için kullanılır.
Hava kompresörü (Jun-Air)ElveflowKCP-110Akış kontrol cihazını hava basıncı ile çalıştırmak için kullanılır.
Amonyum sülfat ((NH4)2SO4, CAS: 7783-20-2)Sigma-AldrichA4915Deneysel ortam ve çözeltiler için kullanılır.
Köşeli penseTDI International7-SAMikroakışkan reaktöre hortum takmak için kullanılır.
AutoCAD yazılımıAutodesk --Mikroakışkan reaktör geometrisini tasarlamak için kullanılır.
OtoklavSteris--Malzemeleri ve sıvıları sterilize etmek için kullanılır. 
TeraziMettler ToledoME2002TPDMS elastomer bazını ve kürlenme ajanını tartmak için kullanılır.
Dirsekli adaptör (1/4-28 döner, 3/32-in dirsekli)ElveflowKFI-06Polieter poliüretan hortumları manifold ve sıvı rezervuar rafına bağlamak için kullanılır.
Biyopsi delici (Rapid-Core, 1,2 mm çap)Darwin MicrofluidicsPT-T983-12-25PDMS mikroakışkan kanallarında giriş/çıkış delikleri delmek için kullanılır. 
Ağartıcı (Chlorox)ULINES-19719Akış kontrol sistemini sterilize etmek için kullanılır. Ultra saf suda %1'e seyreltilir.
Kötü uçlu iğne (Jensen Global, 21 ölçü)QSourceJG21-10HPX-J004Hortumları şırıngalara bağlamak için kullanılır. 30 dakika boyunca otoklavlanmasıyla sterilize edilir.
Bunsen brülörüHumboldtH-5970Steril deneysel çalışma alanı sağlamak için kullanılır.
Kalsiyum klorür dihidrat (CaCl2·2H2O, Fisher Chemical, CAS: 10035-04-8)Fisher ScientificC79Deneysel ortam ve çözeltiler için kullanılır.
Kasamino asit (Fisher BioReagents, asit kazeini pepton)Fisher ScientificBP1424Deneysel ortam için kullanılır.
Hücre yoğunluk ölçer (WPA Biowave CO8000)Avantor490005-906Bakteryal kültürlerin OD600 değerini ölçmek için kullanılır. 
Şeffaf bant (Scotch Magic)ULINES-10223Tozun PDMS mikroakışkan kanallarına yapışmasını önlemek için kullanılır.
Kobalt(II) klorür heksahidrat (CoCl2·6H2O, CAS: 7791-13-1)Sigma-Aldrich255599Deneysel ortam ve çözeltiler için kullanılır.
Sıkıştırılmış azotAirgasNIUHP300Mikroakışkan reaktör bileşenlerini kurutmak için kullanılır.
Konik tüp (Falcon, 15 mL hacim, polipropilen)Fisher Scientific14-959-49BGelen çözeltiler ve ICP-MS örnekleri için kullanılır. Önceden sterilize edilmiştir.
Konik tüp (Falcon, 50 mL hacim, polipropilen)Fisher Scientific14-432-22LB ön kültürü için kullanılır. Önceden sterilize edilmiştir.
Bakır(II) sülfat pentahidrat (CuSO4·5H2O, CAS: 7758-99-8)Sigma-AldrichC8027Deneysel ortam ve çözeltiler için kullanılır.
Kesim matıULINES-18543PDMS mikroakışkan kanallarını kesmek ve giriş/çıkış deliklerini delmek için kullanılır.
Küvet (Fisherbrand, 1,5 mL hacim, polistiren)Fisher Scientific 14-955-127Bakteryal kültürlerin OD600 değerini ölçmek için kullanılır. 
Dijital kamera (Hamamatsu ORCA-Fusion)Nikon77054115Mikroakışkan deneylerinin zaman aşımlı renk parlak alan görüntülemesinde kullanılır.
Dağıtım valfi (MUX)ElveflowMUX-D-12Birden fazla akışkanın sıralı olarak enjekte edilmesi için kullanılır.
Elveflow Smart Interface (ESI) yazılımıElveflow --Akış kontrol cihazı ve akış sensörü arasındaki akış hızı/basınç geri bildirimi ve dağıtım valfi anahtarlama işlemini kontrol etmek için kullanılır.
Erlenmeyer şişesi (Fisherbrand, 50 mL hacim)Fisher ScientificFB50050Orta eksponensiyel kültür için kullanılır. 30 dakika boyunca otoklavlanmasıyla sterilize edilir.
Etanol (Fisher Chemical, reaktif alkol, %90 saflık, CAS: 64-17-5)Fisher ScientificA962P-4Reaktör yapımı için PDMS ve kapak süngerlerini temizlemek için kullanılır. Ultra saf suda %70'e seyreltilir.
Etilendiamintetraasetik asit (EDTA, CAS: 60-00-4)Sigma-

Kaynaklar

  1. Scheinost, A. C., Singh, B., Goss, M. J., Oliver, M. Metal oxides. Encyclopedia of soils in the environment. , (2023).
  2. Tebo, B. M., et al. Biogenic manganese oxides: properties and mechanisms of formation. Annu Rev Earth Planet Sci. 32, 287-328 (2004).
  3. Droz, B., Dumas, N., Duckworth, O. W., Peña, J. A comparison of the sorption reactivity of bacteriogenic and mycogenic Mn oxide nanoparticles. Environ Sci Technol. 49, 4200-4208 (2015).
  4. Holguera, J. G., Etui, I. D., Jensen, L. H. S., Peña, J. Contaminant loading and competitive access of Pb, Zn and Mn(III) to vacancy sites in biogenic MnO₂. Chem Geol. 502, 76-87 (2018).
  5. Peña, J., et al. Mechanisms of nickel sorption by a bacteriogenic birnessite. Geochim Cosmochim Acta. 74, 3076-3089 (2010).
  6. Toner, B., Manceau, A., Webb, S. M., Sposito, G. Zinc sorption to biogenic hexagonal-birnessite particles within a hydrated bacterial biofilm. Geochim Cosmochim Acta. 70, 27-43 (2006).
  7. Castro, L., Blázquez, M. L., González, F., Muñoz, J. A., Ballester, A. Heavy metal adsorption using biogenic iron compounds. Hydrometallurgy. 179, 44-51 (2018).
  8. Whitaker, A. H., Duckworth, O. W. Cu, Pb, and Zn sorption to biogenic iron (oxyhydr)oxides formed in circumneutral environments. Soil Syst. 2, 18 (2018).
  9. Brüggenwirth, L., et al. Interactions of manganese oxides with natural dissolved organic matter: implications for soil organic carbon cycling. Geochim Cosmochim Acta. 366, 182-200 (2024).
  10. Li, H., Santos, F., Butler, K., Herndon, E. A critical review on the multiple roles of manganese in stabilizing and destabilizing soil organic matter. Environ Sci Technol. 55, 12136-12152 (2021).
  11. Li, Q., Hu, W., Li, L., Li, Y. Interactions between organic matter and Fe oxides at soil micro-interfaces: quantification, associations, and influencing factors. Sci Total Environ. 855, 158710 (2023).
  12. Song, X., et al. Towards a better understanding of the role of Fe cycling in soil for carbon stabilization and degradation. Carbon Res. 1, 5 (2022).
  13. Hennebel, T., De Gusseme, B., Boon, N., Verstraete, W. Biogenic metals in advanced water treatment. Trends Biotechnol. 27, 90-98 (2009).
  14. Marsidi, N., Abu Hasan, H., Sheikh Abdullah, S. R. A review of biological aerated filters for iron and manganese ions removal in water treatment. J Water Process Eng. 23, 1-12 (2018).
  15. Li, Y., Xu, Z., Ma, H., Hursthouse, A. S. Removal of manganese(II) from acid mine wastewater: a review. Water. 11, 2493 (2019).
  16. Li, S., et al. Biomineralization mediated by iron-oxidizing microorganisms. Minerals. 15, 868 (2025).
  17. Skousen, J., et al. Review of passive systems for acid mine drainage treatment. Mine Water Environ. 36, 133-153 (2017).
  18. Post, J. E. Manganese oxide minerals: crystal structures and economic and environmental significance. Proc Natl Acad Sci U S A. 96, 3447-3454 (1999).
  19. Cornell, R. M., Schwertmann, U. . The iron oxides: structure, properties, reactions, occurrences and uses. , (2003).
  20. Cosmidis, J., Benzerara, K. Why do microbes make minerals?. C R Geosci. 354, 1-39 (2022).
  21. Ehrlich, H., Bailey, E., Wysokowski, M., Jesionowski, T. Forced biomineralization: a review. Biomimetics. 6, 46 (2021).
  22. Hoffmann, T. D., Reeksting, B. J., Gebhard, S. Bacteria-induced mineral precipitation: a mechanistic review. Microbiology. 167, 001049 (2021).
  23. Hansel, C. M., Learman, D. R., Ehrlich, H. L., Newman, D. K., Kappler, A. Geomicrobiology of manganese. Ehrlich's geomicrobiology. , (2015).
  24. Tebo, B. M., Johnson, H. A., McCarthy, J. K., Templeton, A. S. Geomicrobiology of manganese(II) oxidation. Trends Microbiol. 13, 421-428 (2005).
  25. Kappler, A., Emerson, D., Gralnick, J. A., Roden, E. E., Muehe, E. M., Ehrlich, H. L., Newman, D. K., Kappler, A. Geomicrobiology of iron. Ehrlich's geomicrobiology. , (2015).
  26. Emerson, D., Fleming, E. J., McBeth, J. M. Iron-oxidizing bacteria: an environmental and genomic perspective. Annu Rev Microbiol. 64, 561-583 (2010).
  27. Fortin, D., Langley, S. Formation and occurrence of biogenic iron-rich minerals. Earth Sci Rev. 72, 1-19 (2005).
  28. Konhauser, K. O. Bacterial iron biomineralisation in nature. FEMS Microbiol Rev. 20, 315-326 (1997).
  29. Toner, B., et al. Spatially resolved characterization of biogenic manganese oxide production. Appl Environ Microbiol. 71, 1300-1310 (2005).
  30. Miot, J., et al. Extracellular iron biomineralization by photoautotrophic bacteria. Appl Environ Microbiol. 75, 5586-5591 (2009).
  31. Bottero, S., Storck, T., Heimovaara, T. J., van Loosdrecht, M. C. M., Enzien, M. V., et al. Biofilm development and the dynamics of preferential flow paths in porous media. Biofouling. 29, 1069-1086 (2013).
  32. Dentz, M., Le Borgne, T., Englert, A., Bijeljic, B. Mixing, spreading and reaction in heterogeneous media: a brief review. J Contam Hydrol. 120-121, 1-17 (2011).
  33. Gerke, H. H. Preferential flow descriptions for structured soils. J Plant Nutr Soil Sci. 169, 382-400 (2006).
  34. Jimenez-Martinez, J., Nguyen, J., Or, D. Controlling pore-scale processes to tame subsurface biomineralization. Rev Environ Sci Biotechnol. 21, 27-52 (2022).
  35. Or, D., Smets, B. F., Wraith, J. M., Dechesne, A., Friedman, S. P. Physical constraints affecting bacterial habitats and activity in unsaturated porous media: a review. Adv Water Resour. 30, 1505-1527 (2007).
  36. Toyoda, K., Tebo, B. M. The effect of Ca2+ ions and ionic strength on Mn(II) oxidation by spores of the marine Bacillus sp. SG-1. Geochim Cosmochim Acta. 101, 1-11 (2013).
  37. Toyoda, K., Tebo, B. M. Kinetics of Mn(II) oxidation by spores of the marine Bacillus sp. SG-1. Geochim Cosmochim Acta. 189, 58-69 (2016).
  38. Learman, D. R., Wankel, S. D., Webb, S. M., Martinez, N., Madden, A. S., et al. Coupled biotic–abiotic Mn(II) oxidation pathway mediates the formation and structural evolution of biogenic Mn oxides. Geochim Cosmochim Acta. 75, 6048-6063 (2011).
  39. Bargar, J. R., et al. Biotic and abiotic products of Mn(II) oxidation by spores of the marine Bacillus sp. strain SG-1. Am Mineral. 90, 143-154 (2005).
  40. Mao, Q., Qin, W., Yan, B., Luo, L. Ferrous iron oxidation efficiency and kinetics by indigenous iron-oxidizing bacteria in acid mine drainage. Environ Technol Innov. 36, 103785 (2024).
  41. Farnsworth, C. E., Voegelin, A., Hering, J. G. Manganese oxidation induced by water table fluctuations in a sand column. Environ Sci Technol. 46, 277-284 (2012).
  42. Haukelidsaeter, S., et al. Efficient chemical and microbial removal of iron and manganese in a rapid sand filter and impact of regular backwash. Appl Geochem. 162, 105904 (2024).
  43. Li, C., et al. Immobilization of iron- and manganese-oxidizing bacteria with a biofilm-forming bacterium for effective removal of iron and manganese from groundwater. Bioresour Technol. 220, 76-84 (2016).
  44. Breda, I. L., Søborg, D. A., Ramsay, L., Roslev, P. Manganese removal processes during start-up of inoculated and non-inoculated drinking water biofilters. Water Qual Res J. 54, 47-56 (2019).
  45. Zhu, X., Wang, K., Yan, H., Liu, C., Zhu, X., et al. Microfluidics as an emerging platform for exploring soil environmental processes: a critical review. Environ Sci Technol. 56, 711-731 (2022).
  46. Scheidweiler, D., Peter, H., Pramateftaki, P., de Anna, P., Battin, T. J. Unraveling the biophysical underpinnings to the success of multispecies biofilms in porous environments. ISME J. 13, 1700-1710 (2019).
  47. Aufrecht, J. A., Fowlkes, J. D., Bible, A. N., Morrell-Falvey, J., Doktycz, M. J., et al. Pore-scale hydrodynamics influence the spatial evolution of bacterial biofilms in a microfluidic porous network. PLoS ONE. 14, e0218316 (2019).
  48. Kurz, D. L., et al. Competition between growth and shear stress drives intermittency in preferential flow paths in porous medium biofilms. Proc Natl Acad Sci U S A. 119, e2122202119 (2022).
  49. Kurz, D. L., Secchi, E., Stocker, R., Jimenez-Martinez, J. Morphogenesis of biofilms in porous media and control on hydrodynamics. Environ Sci Technol. 57, 5666-5677 (2023).
  50. Borer, B., Tecon, R., Or, D. Spatial organization of bacterial populations in response to oxygen and carbon counter-gradients in pore networks. Nat Commun. 9, 769 (2018).
  51. Ceriotti, G., Borisov, S. M., Berg, J. S., de Anna, P. Morphology and size of bacterial colonies control anoxic microenvironment formation in porous media. Environ Sci Technol. 56, 17471-17480 (2022).
  52. Park, S., Anggraini, T. M., Chung, J., Kang, P. K., Lee, S. Microfluidic pore model study of precipitates induced by pore-scale mixing of an iron sulfate solution with simulated groundwater. Chemosphere. 271, 129857 (2021).
  53. Wielinski, J., et al. Spatiotemporal mineral phase evolution and arsenic retention in microfluidic models of zerovalent iron-based water treatment. Environ Sci Technol. 56, 13696-13708 (2022).
  54. Elmaloglou, A., et al. Microfluidic study in a meter-long reactive path reveals how structural heterogeneity shapes MICP-induced biocementation. Sci Rep. 12, 19553 (2022).
  55. Wang, Y., Soga, K., DeJong, J. T., Kabla, A. J. A microfluidic chip and its use in characterising particle-scale behaviour of microbial-induced calcium carbonate precipitation. Géotechnique. 69, 1086-1094 (2019).
  56. Wang, Y., et al. Microscale investigations of temperature-dependent microbially induced carbonate precipitation in the range 4–50 °C. Acta Geotech. 18, 2239-2261 (2023).
  57. Pucetaite, M., Ohlsson, P., Persson, P., Hammer, E. Shining new light into soil systems: spectroscopy in microfluidic soil chips reveals microbial biogeochemistry. Soil Biol Biochem. 153, 108078 (2021).
  58. Geszvain, K., McCarthy, J. K., Tebo, B. M. Elimination of manganese(II,III) oxidation in Pseudomonas putida GB-1 by a double knockout of two putative multicopper oxidase genes. Appl Environ Microbiol. 79, 357-366 (2013).
  59. Gehin, G., et al. Population-level control of two manganese oxidases expands the niche for bacterial manganese biomineralization. NPJ Biofilms Microbiomes. 11, 1-12 (2025).
  60. Ramos, G., Toulouze, C., Rima, M., Liot, O., Duru, P., et al. Ultraviolet control of bacterial biofilms in microfluidic chips. Biomicrofluidics. 17, 024107 (2023).
  61. Fadely, E. C., et al. Enhanced manganese oxidation at the biofilm–fluid interface drives pore-scale patterns in mineral precipitation. Environ Sci Technol. 60, 654-663 (2026).
  62. Lochovsky, C., Yasotharan, S., Günther, A. Bubbles no more: in-plane trapping and removal of bubbles in microfluidic devices. Lab Chip. 12, 595-601 (2012).
  63. Pereiro, I., Khartchenko, A. F., Petrini, L., Kaigala, G. V. Nip the bubble in the bud: a guide to avoid gas nucleation in microfluidics. Lab Chip. 19, 2296-2314 (2019).
  64. Gehin, G., et al. Pseudomonas putida coordinates the expression of two manganese oxidases and optimizes manganese oxide precipitation in response to aqueous Mn(II). Environ Sci Technol. 59, 13777-13786 (2025).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Metal Oksit kelmesiManganez OksitlerDemir OksitlerBiyofilm Geli imiPseudomonas PutidaAyd n Alan MikroskopisiG r nt karma

İlgili makaleler