Yöntem makalesi

Riboglow Problarının In Vitro Olarak Canlı Memeli Hücrelerinde Floresans Ömür Boyu Görüntülemenin Temeli Olarak Karakterize Edilmesi ve Üç Boyutlu Hücresel Modeller

1.2K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/71048

⸱

4 Ağustos 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Chemistry, Georgetown University

* These authors contributed equally

† These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Bu protokolün amacı, in vitro, canlı memeli hücrelerinde ve üç boyutlu hücresel modellerde tekrarlanabilir RNA görüntüleme iş akışları için Riboglow problarının nicel floresans ömür ölçümünü sağlamaktır. Tarafsız floresan ömür ölçümlerini çıkarmak için örnek hazırlama, prob teslimatı, veri toplama ve nicel analiz iş akışlarını özetliyoruz.

Özet

İnsan genomunun yaklaşık %80'i RNA'ya transkribe edilirken, %2'den azı proteinleri kodlar; bu da memeli transkriptlerinin çoğunun kodlamadığını ve çeşitli düzenleyici süreçlere katıldığını gösterir. Bu nedenle, canlı memeli hücre sistemlerinde RNA moleküllerini nicel olarak algılamak ve görselleştirmek, RNA dinamiklerini ve etkileşimlerini anlamak için kritik öneme sahiptir, ancak teknik olarak özellikle karmaşık hücresel ortamlarda zordur. Riboglow, kısa bir RNA aptamerinin küçük moleküllü bir proba bağlandığı ve floresans ömür boyu görüntüleme mikroskobu (FLIM) ile tespit edilebilen ölçülebilir bir floresans açılması üreten genetik olarak kodlanmış bir RNA biyosensörüdür. Burada, Riboglow-FLIM için örnek hazırlama, görüntü alımı ve FLIM veri setlerinin nicel analizini içeren ayrıntılı bir iş akışını sunuyoruz. Bu protokolün amacı, kontrollü ve canlı hücre ortamlarında Riboglow kullanılarak nicel floresans ömür bazlı RNA tespitini sağlamaktır. Protokol, RNA bağımlı yaşam değişikliklerinin ölçüldüğü in vitro ve canlı memeli hücrelerinde FLIM edinimi, ilgi alanı seçimi ve hücrealtı analizlerin sağlandığı gösterilmiştir. Başarılı uygulama, deneysel ve satın alma parametrelerinin dikkatli kontrolünü gerektirir. Tekrarlanabilir uygulama için temel hususlar vurgulanmaktadır. Bu protokol birlikte, Riboglow-FLIM'in uygulanması ve canlı hücrelerde RNA görselleştirmesinin nicel olarak değerlendirilmesi için pratik bir referans olarak hizmet vermektedir.

Giriş

Son yıllarda, RNA'ların hücresel fonksiyondaki rolünü anlamadaki gelişmeler, özellikle hastalık hallerinde yaşayan hücrelerde RNA'ların görselleştirilmesine yönelik artan bir ihtiyaç yaratmıştır. Ancak, doğal olarak floresan RNA'ların yokluğu, genellikle dışsal florojenik problarla birleştirilen mühendislik amaçlı etiketleme sistemlerini gerektirir. Sonuç olarak, canlı sistemlerde RNA lokalizasyonu, dinamikleri ve etkileşimlerinin görselleştirilmesini sağlamak için geniş bir RNA görüntüleme yaklaşımı geliştirilmiştir.

RNA görüntüleme yöntemlerinin ana sınıflarından biri genetik olarak kodlanmış etiketlere dayanır. Florofor-aptamer sistemleri ve MS2 bakteriyofaj örtü proteini (MCP) sistemi gibi protein tabanlı etiketleme stratejileri yaygın olarak kullanılmaktadır 1,2. MS2 sisteminde, RNA kök döngüleri, canlı hücrelerdeki transkriptleri takip etmek için floresan proteinlerle birleşen bakteriyofaj örtü proteinleriyle bağlanır. Faydalı olmasına rağmen, bu yaklaşım nispeten büyük RNA etiketleri ve doğal RNA davranışını bozabilecek ek protein bileşenleriüretimi gerektirir 1,2,3. Ispanak4 veBrokoli 5, Mısır6, Mango7 ve Pepper8 gibi sonraki varyantlar dahil olmak üzere florofor aptamer sistemleri, ligand bağlanmasıyla doğrudan floresans aktivasyonunu sağlar ve etiket boyutunu azaltır. Ancak, bu sistemler sınırlı sinyal yoğunluğu, arka plan floresansı ve karmaşık hücresel ortamlarda çoklu ortam ile ilgili zorluklardan muzdaripolabilir 3.

Alternatif stratejiler arasında florofor-söndürücü sistemler ve hibritleşme tabanlı yaklaşımlar bulunur. Florofor söndürücü sistemler, RhoBAST dahil, RNA bağlanmasından sonra söndürmenin bozulması durumunda floresans üretir, ancak arka plan sinyali ve probkonsantrasyonu 3,9'a duyarlılık gösterebilir. Hibritleşme tabanlı RNA görüntüleme yöntemleri, örneğin smFISH ve moleküler işaretler, yüksek özgüllük sağlar ancak prob teslimatı gerektirir ve bağlanma kinetiği ve hedef dışı etkileşimler nedeniyle uzun vadeli canlı hücre görüntülemesinde genellikle sınırlı kalır. Bu yaklaşımlar birlikte, canlı hücreli RNAgörüntülemedeki temel zorlukları ortaya koymaktadır 3,13,14. Bu gelişmelere rağmen, karmaşık biyolojik sistemlerde nicel floresans yaşam süresine dayalı RNA görüntüleme için standartlaştırılmış iş akışları eksiklik vardır.

Riboglow bu sınırlamaların çoğunu aşmaya çalışır. Riboglow, kısa riboswitch kaynaklı RNA aptamer "etiketi"ni sentetik küçük molekül kobalamin (Cbl)-florofor "probu" ile birleştiren, canlı hücreRNA'larının görselleştirilmesini sağlayan genetik olarak kodlanmış bir RNA etiketleme sistemidir 15. Doğal bir söndürücü olan Cbl, etiket bağlandığında florofordan mekansal olarak ayrılır veyoğunlukta ölçülebilir bir floresans "açılma" 15 oluşturur. Riboglow'un floresan ömür boyu görüntüleme mikroskobisine (FLIM) genişletilmesi, florofor konsantrasyonu ve uyarılma yoğunluğundan büyük ölçüde bağımsız bir okuma ortaya koymuştur; bu da prob teslimat değişkenliği ve kullanıcı arası farklılıklara karşı tamponoluşturmaktadır 16,17. Daha da önemlisi, RNA aptamerini değiştirmek, FLIM16 ile görselleştirildiği gibi benzersiz floresans ömürleri sağlar. Bu ortogonal ömürler, çoklu RNA görüntüleme imkanı sağlar ve iki RNA'nın tek bir florofor16 ile görselleştirilmesini sağlar. Platform, U-2 OS, HeLa, MDA-MB-231 ve HOS hücreleri dahil olmak üzere çeşitli memeli modelleri üzerinde doğrulanmış ve ACTB mRNA ile NORAD lncRNA 15,16,17'nin eşzamanlı görselleştirmesiyle yapılmıştır. Daha yakın zamanda, Riboglow canlı hayvan embriyolarındaki RNA'ları görselleştirmekiçin kullanılmıştır 18. Bu çalışmalar birlikte, Riboglow'u nicel çoklayıcı RNA görüntüleme için kompakt ve çok yönlü bir sistem olarak ortaya koymaktadır.

Biyolojik sistemlerde, FLIM, yerel moleküler ortama duyarlılığı ve deneysel değişkenliğe karşı göreceli dayanıklılığı nedeniyle canlı sistemlerde moleküler etkileşimler, metabolizma ve hücresel dinamikleri incelemek için yaygın olarakuygulanmıştır 19. FLIM, genellikle zamanla korelasyonlu tek foton sayımı (TCSPC) kullanarak floresan bir örnekten uyarılmış durum bozunma oranını ölçür. TCSPC, bir örneğin lazer uyarılmasıyla yayılan fotonun dedektöre ulaşması arasındaki zamanı ölçür ve elde edilen foton ömürlerini her ölçüm için foton ulaşım zamanının dağılımına derler. Ömür boyu görüntüleme, sistemin florojenik kısımlarının konsantrasyonlarına bağımlılığı azaltarak önemli bir avantaj sunar; bunlara hücrelere yüklenen prob, RNA ifade seviyesi ve optik yol varyasyonları dahildir. Ancak, FLIM deneyleri kavramsal ve teknik olarak zorludur ve foton alımı, modellerin uyumu ve analiz iş akışlarının dikkatli kontrolünü gerektirir.

Burada, örnek hazırlama, görüntü alımı ve floresan ömür boyu veri setlerinin nicel analizi için iş akışlarını tanımlayan ayrıntılı bir protokol sunulmaktadır. Bu çalışmanın amacı, biyolojik sistemler arasında nicel Riboglow-FLIM görüntüleme için tekrarlanabilir bir iş akışı oluşturmaktır. Riboglow-FLIM, nicel karşılaştırmalar için en uygun olup, özel FLIM donanımı ve analiz uzmanlığı gerektirir. Protokol, RNA'ya bağlı yaşam değişikliklerinin ölçüldüğü in vitro ve canlı memeli hücrelerinde ve 3D hücresel sistemlerde FLIM edinimi, ilgi alanı seçimi ve nicel ömür boyu ekstraksiyonun Riboglow probları kullanılarak sağlandığı gösterilmiştir. Bu protokol, FLIM satın alma iş akışlarını ve nicel ve tarafsız FLIM veri analizi için ilkeleri oluşturmanın önemli temelini oluşturur ve Riboglow-FLIM veya diğer FLIM tabanlı sistemler için gelecekteki uygulamaların mümkün olmasını sağlar. Deneysel tasarım seçimleri, tarafsız veri toplama ve FLIM edinimi ile analizi sırasında karşılaşılan yaygın zorluklara vurgu yapılır. Transfekte edilmiş Riboglow etiketli yapılar kullanılarak hücrelerde RNA algılama gösterimi daha önce bildirilmiş olsa da, hiçbiri özellikle 2B ve 3D sistemlerde adım adım bir toplama ve analiz iş akışı sunmamaktadır. Bu çalışmalar birlikte, Riboglow-FLIM'in canlı hücre RNA görüntüleme aracı olarak uygulanması için bir kaynak sağlar.

Protokol

1. RNA Hazırlanması ve Arındırılması

  1. In vitro transkripsiyon reaksiyonu bileşenlerini, üreticinin in vitro RNA sentez kiti talimatlarında belirtildiği şekilde steril 1,6 mL bir mikrosantrifüj tüpünde birleştirin.
    NOT: Bu deneyler için kullanılan RNA, TranscriptAid T7 Yüksek Verimli Transkripsiyon Kiti (Thermo Fisher Scientific) kullanılarak sentezlenmiştir. RNA sentezi, daha önce gösterildiği gibi ticari olarak mevcut diğer kitler dahil olmak üzere herhangi bir yerleşik protokol kullanılarakyapılabilir.
    1. Kısaca, transkripsiyon reaksiyonu tamponu, NTP'ler, enzim karışımı, şablon DNA ve nükleazsız suyu toplam 20 μL hacmde birleştirin.
  2. Tüp ve içeriği en az 4 saat ve gece boyunca 37 °C'lik kuluçka makinesine yerleştirin. Sentezlenen RNA'yı, üreticinin RNA temizleme kiti talimatlarında belirtildiği şekilde bir RNA temizleme kolonu kullanarak arındırın.
    NOT: Bu deneyler için kullanılan RNA temizleme protokolü Monarch RNA Temizleme Kiti (New England Biolabs) idi. RNA temizliği, daha önce gösterildiği gibi17,20,21 üzerinde A260/A230 ve A260/A280 değerleri ile tanımlanmış, saflaştırılmış RNA (burada A260/A230 ve A260/A280 değerleri ile tanımlanmıştır) sonuçlanan herhangi bir yerleşik protokolle yapılabilir. RNA sütunu temizliği için tüm santrifüj adımları, aksi belirtilmedikçe 16.000 x g alanda 1 dakika sürer.
    1. Kısaca, sentezlenen RNA'nın toplam hacmini nükleaz içermeyen suyla 50 μL'ye çıkarın, ardından 100 μL bağlanma tamponu ve ardından %100 etanol 150 μL ekleyin.
    2. Tüm 300 μL'yi kolona yükleyin ve bir toplama tüpüne yerleştirin. Sütunu santrifüj edin ve akışı atın.
    3. Kolona 500 μL yıkama tamponu ekleyin ve santrifüj yapın. Akışı at.
    4. 1.2.3 adımını bir kez daha tekrarlayın.
    5. Toplama tüpünü kolondan çıkarın ve steril 1.6 mL mikrosantrifüj tüpünü takın.
    6. Kolona 15 μL nükleaz içermeyen su ekleyin ve oda sıcaklığında 1 dakika bekletin.
    7. Santrifüj ile mikrosantrifüj tüpüne elüasyon yapın ve kolonu atın.
  3. Mikrohacimli spektrofotometre kullanarak arıtılmış RNA'nın konsantrasyonunu ve saflığını ölçin.
    1. Spektrofotometreyi 1 μL nukleazsız su kullanarak boşaltın.
    2. Temizlenmiş RNA örneğinden 1 μL örnek kaidesine yükleyin ve ölçün.
    3. Örnek konsantrasyonu ve saflığı, A260/A230 ve A260/A280 değerleri ile kaydediliyor.
  4. Arındırılmış RNA'yı -80 °C'de sakla.

2. Riboglow probları

NOT: Bu yönteme dahil edilen tüm Riboglow probları için sentez prosedürü daha önce yayımlanmışliteratür 21'de bulunabilir.

  1. Prob stoklarını (95 μM) RNase içermemiş, ışık korumalı mikrotüplerde kullanılmadığında -20 °C'de depolayın.
  2. Kullanımdan hemen önce eritin ve görüntüleme deneyleri için RNA tamponunda 4,5 μM'e (100 mM KCl, 10 mM NaCl, 1 mM MgCl₂, 40 mM HEPES, pH 8,0) kadar seyreltiltildi.

3. In vitro örnek hazırlama

NOT: Saflaştırılmış RNA ile ilgili tüm adımlar, düzenli olarak RNase denaturantı ile işlenmiş bir duman davlatı gibi RNase içermeyen bir ortamda yapılmalıdır.

  1. RNA ve Riboglow probunun in vitro çözeltisini hazırlayın.
    1. RNazsız bir mikrosantrifüj tüpünde, saflaştırılmış RNA örneğini Riboglow probu (Cbl-3xGly-ATTO590 veya Cbl-5xGly-ATTO590) ile birleştirerek RNA tamponunda 5,0 μM RNA ve 4,5 μM Riboglow probu (100 mM KCl, 10 mM NaCl, 1 mM MgCl2, 40 mM HEPES pH 8.0) nihai konsantrasyon elde edin. Homojenleşmek için pipet karıştırın.
      NOT: Çözeltide Riboglow probundan daha fazla RNA konsantrasyonu olması önemlidir, böylece probun RNA ile doygun olmasını sağlar. RNA veya probun konsantrasyonları şüpheliyse, RNA konsantrasyonu artırılabilir veya prob konsantrasyonu düşürülerekdoygunluk 21 sağlanabilir.
  2. Tüpü veya tüp rafını alüminyum folyoya sarın ve çözeltiyi oda sıcaklığında en az 20 dakika kuluçka yapın. İnkubasyondan hemen sonra FLIM görüntüleme (Step 6) uygulanır.

4. Hücre kültürü

NOT: Bu deneylerde hem HeLa hem de U-2 OS hücre hatları kullanılmaktadır. Kültürleme ve prob yükleme protokolleri aynıdır. Hücre kültürü çalışmaları, BSL-2 laboratuvar ortamının standartları ve prosedürleriyle tanımlanan standart aseptik tekniklerle bir biyogüvenlik kabininde (BSC) tamamlanmalıdır.

  1. Dondurulmuş hücre alikotlarını 37 °C'de bir kriyotüpte hızla çözün ve hücre kültürü ortamını 37 °C su banyosuna yerleştirin.
  2. Kriyotüple, eşit miktarda ısıtılmış hücre kültürü ortamı ekleyin. Hücreleri askıya almak için hafifçe yukarı aşağı pipet yapın.
  3. Hücre süspansiyonunu 90 mm'lik bir doku kültürü kabına ekleyin ve hücre kültürünün toplam hacmini 10 mL'ye çıkarın. Hücreler, hücrelerin yapışması için en az gece boyunca nemlendirilmiş bir kuluçka içinde 37 °C ve %5CO2 sıcaklığında kuluçka yapın.
    1. Hücreleri ışık mikroskobu altında görselleştirerek yapışma ve birleşme noktasını belirleyin.
  4. Birleşme %80–90'a ulaştığında geçiş hücreleri oluşur.
    1. 90 mm plakadan hücre kültürü ortamını aspire edin. Hücreleri 4 mL fosfatla tamponlanmış tuzlu (1 X PBS) ekleyerek yıkayın ve tabağı yan yana nazikçe sallayarak hücrelere dağıtın.
    2. PBS'yi aspire edin ve 2 mL dissosiyaedici reaktif ekleyin. Plakayı nemlendirilmiş kuluçka makinesine geri koyun ve hücrelerin 5–10 dakika boyunca ayrılmasına izin verin.
    3. Hücreler inkübüasyon sırasında en az bir yeni plaka hazırlamak için 8 mL hücre kültürü ortamı ekleyebilirsiniz. Plakaya tarih, hücre satırı ve geçiş numarası ile etiketleyin.
    4. 5–10 dakika sonra, ayrılmayı ışık mikroskobu altında görselleştirin. Ayrılmış hücreler ortamda hareket etmelidir.
    5. Ayrılmış hücrelerin plakasını çıkarın ve yaklaşık eşit hacimde taze hücre kültürü ortamını plaka(lar)a aktarın. Askıda kalan hücrelerin 1–3 mL arasında aktarılması, gelecekteki deney hedeflerine bağlı olarak yeni çanaklara aktarılır.
      NOT: Farklı hücre hatlarının farklı büyüme dönemleri ve hassasiyeti vardır. HeLa ve U-2 OS hücreleri için, tamamen birleşen bir plakadan ~1 mL hücre süspansiyonunu yeni bir plakaya aktarmak yaklaşık 4 gün sürer.
  5. Hücre görüntüleme için, hücreleri 35 mm görüntüleme plakalarına geçirin ve yukarıda açıklandığı gibi yıkama/geçiş yapın.

5. Riboglow sonda boncuk yüklemesi

  1. Hücreler uygun görüntüleme birleşimine ulaştığında, inkübatörden 35 mm görüntüleme kabını çıkarın ve ortamı aspire edin. Hücreleri yukarıda tarif edildiği gibi 1 mL 1X PBS ile T-hareketleriyle yıkayın ve PBS'yi aspire edin.
  2. 3 μL 30 μM Riboglow probunu üç denge dağılımlı damla olarak hücrelere ekleyin. Prob çözeltisini hücre yüzeyine eşit şekilde dağıtmak için plakayı döner şekilde eğin.
    NOT: Riboglow prob konsantrasyonu 5–30 μM arasında değişebilir. Burada anlatılan deneyler için 30 μM stok kullanılmıştır. Ancak, transfeksiyon edilen hücre örnekleri için genellikle 5 μM kullanılır.
  3. Bir boncuk dağıtıcıyla tabakta ince bir cam boncuk tabakası ekleyin.
    NOT: Boncukların hücrelerin üzerinde tek katmanlı bir katman oluşturduğundan emin olun ve çok fazla katman eklemeden kaçının, çünkü çıkarılması zor olabilir.
  4. Tabanın tabanını tezgah yüzeyine 8–10 kez sıkıca vurarak boncuk yüklemesinikolaylaştırın 22.
  5. Plakayı hızla açın ve taze hücre kültürü medyası ekleyin. Probun hücrelere girebilmesi için plakayı nemlendirilmiş kuluçka makinesine 10 dakika geri götürün.
  6. 10 dakika sonra plakayı çıkarın ve hücre kültürü ortamını aspire edin, mümkün olduğunca çok cam boncuk çıkarmaya çalışın.
  7. Kalan cam boncukları çıkarmak için plakayı PBS ile tekrar tekrar yıkayın.
    1. Tabağı açıyla tutun, kabın üstüne küçük bir hacim PBS dağıtın ve aşağı akmasına izin verin, yol boyunca boncuklar toplayın. PBS'yi yemeğin dibine boncuklarla aspire edin. Kalan boncukların çoğunu çıkarmak için gerekli 3–5 kez tekrarlayın.
      NOT: Bu aşamada PBS jetleriyle çok sert davranmayın, çünkü yapışkan hücreler ayrılabilir. Bazı boncuklar birkaç yıkamadan sonra kalırsa, yanlışlıkla çok fazla hücreyi yıkamaktansa onlarla görüntülemeyi denemek daha iyidir.
  8. 1 mL şeffaf görüntüleme ortamı ve %10 FBS ile takviye edilmiş görüntüleme malzemesi görüntüleme kabına ekleyin ve 10 dakika kuluçka yapın. FLIM görüntülemeye geçin (Adım 6). Görüntüleme, boncuk yüklendikten sonra 3 saat içinde tamamlanmalıdır.
    NOT: Yapışkan memeli hücrelerine floresan moleküllerin eklenmesi için boncuk yükleme prosedürü, başka bir protokolden uyarlanmıştır22.

6. FLIM görüntüleme

NOT: Bu protokol, FLIM/FCS donanımı ve NIS-Elements yazılımıyla donatılmış Nikon Ti2 Eclipse AX konfokal mikroskobu için uyarlanmıştır (Detaylara Malzeme Tablosu'nda bakınız).

  1. Mikroskobu aşağıdaki sırayla çalıştırın: Konfokal lazer tarama mikroskobu, mikroskop kontrol ünitesi, ardından zaman bağlantılı tek foton sayımı (TCSPC) tabanlı FLIM sistemi; bu sistem lazer birleştirme birimi, fotoçoğaltıcı dedektör ve olay zamanlayıcısını içerir.
  2. Mikroskop açıldıktan sonra, masaüstü bilgisayarı açın ve görüntü alma ve analiz bilgisayar yazılımını açın.
  3. Başlatma seçeneklerinde "AX with PicoQuant" seçeneğini seçin. Görüntü alma ve analiz yazılımının açılmasını bekleyin.
  4. Açıldıktan sonra "AX FLIM ve FCS" seçeneğini seçin.
  5. Floresans ömrü boyunca veri toplamak için mikroskop kurun.
    1. AX pad bölümünde:
      1. Galvano'nun seçildiğinden emin ol.
      2. Ortalamayı 1'e ayarlayın.
      3. Dwell Time'ı 2'ye ayarlayın.
    2. Lazer gücü bölümü üzerine:
      1. Bireysel lazer kaydırıcılarını %3–4'e indirin.
      2. All Lasers kaydırıcısını sıfıra ayarla.
    3. TI2 Pad üzerinde:
      1. 20x hedefin seçildiğinden emin ol.
    4. Tarama Alanı'nda 512 x 512 seçin.
    5. Doğru dedektörlerin açık olduğundan emin olun. 2-lazer sistemi için örnek:
      1. 560 nm lazer için dedektör 1.
      2. 640 nm lazer için dedektör 2.
        NOT: Deneye bağlı olarak bir veya daha fazla lazer kullanılabilir. Dedektörleri açıp kapatmak için sağ tıklayın.
    6. Veri dosyası yolunu tanımlayın.
      1. Kontrolcü bölümünün altına gidin, "Yapılandırma"ya tıklayın.
      2. PicoQuant/FLIM FCS sekmesine gidin.
      3. "Workspace path" altında sağdaki klasör sembolüne tıklayın.
      4. Bir yer seçin ve günün deneyleri için yeni bir klasör oluşturun.
      5. Yapılandırma bölümünden kapanın.
  6. Görüntü alma penceresi görünene kadar "Live" seçeneğini seçin, ardından foton toplama için tekrar "Live" seçeneğini seçin.
  7. FLIM veri toplama pencerelerini kurmaya başlayın.
    1. Canlı görüntü penceresine sağ tıklayın ve "PicoQuant Eklentisi"ne tıklayın.
    2. Etkinleştirin:
      1. Gösteri Çürüme Eğrisi
      2. Zaman İzini Göster
      3. FLIM İstatistiklerini Göster
        NOT: Bu üç pencerenin tamamı için her seferinde canlı görüntüye sağ tıklamanız gereklidir.
    3. İmaj edilen örnek türüne bağlı olarak uygun protokol alt bölümüne geçin.

7. In vitro veri toplama

  1. In vitro FLIM örneğini yükleyin.
    1. Siyah bir kaydırma pedi ve bir kapak al. Kaydırma pedine bir kapak kuşağı yerleştirin.
    2. In vitro numuneden 5–20 μL damlasını kapak kılıfı üzerine yerleştirin.
    3. Sürgü pedini mikroskop aşamasına yükleyin.
      NOT: ~20 μL büyük, buharlaşmaları daha uzun sürdükleri için küçük damlacıklara göre tercih edilir. Buharlaşma, damlayı küçük bir kapak veya benzer şekilli bir nesneyle kaplayarak daha da yavaşlatılabilir.
    4. Joystick'i kullanarak hedefi görsel olarak damlanın ortasına yönlendirin.
  2. "Live" seçeneğini seçin ve zaman izleme panelini izleyin. Dedektörler tarafından belirli bir zamanda alınan foton sayısını gösterecektir.
  3. Örnek damlasının doğru Z yüksekliğini bulun.
    1. Zaman izi sinyali maksimuma ulaşana kadar Z yüksekliğini ayarlamaya devam edin.
    2. Dedektör kaydırıcısının altında sayma hızını izlerken lazer gücünü artırmaya başlayın. Saniyede hedef sayısı (CPS) değişkenlik gösterir, ancak 1.000-10.000 foton elde etmek tercih edilir.
    3. Z-yüksekliğini aşağı çekmeye başlayın ve sonra tekrar yukarı çıkarak maksimum zaman izini tekrar görebilirsiniz. Bu, slayt-damla arayüzünü temsil eder.
    4. Sağ alt köşedeki mutlak Z yüksekliğine bakın ve odağı düşüşün merkezine taşımak için ~20 μm artırın. Zaman izi sinyali biraz azalmalı ve sonra sabit kalmalıdır.
      NOT: Doğru Z yüksekliğinde, z yüksekliğini marjinal olarak artırmak veya azaltmak canlı görüntünün zaman izini veya ortalama rengini önemli ölçüde değiştirmez. Ayrıca, damlanın sınırı, canlı pencerenin üstündeki "mouse XY" düğmesini seçip görüntüyü hareket ettirerek bulunabilir.
  4. Satın alma ayarlarını belirleyin.
    1. Bozunma eğrisine bak ve hangi fotonun zirvede olduğunu gör. Bu, üç çerçevede elde edilen toplam foton sayısını temsil eder. Bu sayıyı kullanarak, bir satın alma için kaç kare gerektiğini belirleyin. In vitro FLIM analizi için toplam10-5 foton istenmektedir. Her bir satın alma için 10–15 kare yeterli olmalıdır.
    2. Belirlenen kare sayısına göre "Capture" değerini ayarlayın.
  5. Her yakalama için canlı görüntüyü duraklatın, "Yakalama"yı seçin, verilerin toplanmasına izin verin, ardından tekrar "Live"a basın ve "mouse XY" tuşunu kullanarak yeni bir noktaya gidin.
  6. Yeterli veri toplanana kadar teknik replikalar için Adım 7.5'i tekrarlayın.
    NOT: Her bireysel yakalama sonunda o örnek için bir floresan ömür değeri elde edecektir. Ömür boyu on beş veri puanı toplamak için, 7.5 adımı toplamda on beş kez tamamlayın.
  7. Tüm veriler toplandıktan sonra, görüntü alım ve analiz yazılımını kapatın ve floresans ömür boyu görüntüleme mikroskopisi (FLIM) verilerini ihraç edin.
    1. Dosya Geziri'ni açın ve veri için önceden tanımlanmış konuma gidin.
      NOT: Her FLIM veri toplama oturumu, o oturumdaki tüm verilerin bulunabileceği tek bir .sptw klasörü oluşturur. NIS Elements, klasörü deney tarihine göre otomatik olarak adlandırır ve bireysel edinimler satın alma zamanına göre adlandırılır.
    2. .sptw klasörünü dışa aktarın ve FLIM işleme bölümine geçin.

8. 2D hücre veri toplama

  1. Henüz yapılmadıysa, hücresel deney için doğru lazer düzenlemesini kurun.
    1. Sayfanın sağ üst köşesinde, lazerlerin yanında "Deney Ayarları"na gidin.
    2. Çok kanallı boya kutusunun yanındaki "Ekle" tuşuna tıklayın.
    3. İstediğiniz boyaları ekleyin.
      NOT: Riboglow problarının çoğu ATTO 590 floroforunu kullanır, bu yüzden çoğu Riboglow deneyi için bu boya eklenmelidir.
    4. Uzman Modu'na tıklayın.
      1. Burada, hangi dedektörün hangi emisyon spektrumunu aldığını ayarlayın. İdeal olarak, örtüşen uyarılma/emisyon içeren emisyon spektrumları farklı dedektörlere yönlendirilmelidir. GaAsP dedektörleri, MA dedektörlerine göre tercih edilir, çünkü MA dedektörleri ayarlanamaz.
    5. Solda, örtüşen uyarılma/emisyon olan boyalar arasında çapraz konuşmayı en aza indirmek için geçiş sırasını değiştirin.
    6. Ayarları kaydedin ve yeni lazer konfigürasyonunu belirleyin. Deney için onu seçin.
      NOT: Bu adım profil başına yalnızca bir kez tamamlanmalıdır, gelecekteki deneyler için kullanıcı profiline kaydedilmelidir.
  2. View > Acquisition Controls > XYZ Genel Görünümü'ne geçerek XYZ Genel Bakış penceresini açın. Bu görünüm, sahnede her görüntünün nerede çekildiğini gösterir ve yanlışlıkla tekrarlanmanın önüne geçer.
  3. Örnek yüklemeye geçin.
    1. Görüntüleme kabını yüklemeden önce, canlı hücreli nükleer boyama eklendiğinden emin olun. Boya hücrelere nüfuz etmek için ~30 saniye sürer ve çekirdeklerin görselleştirilmesini sağlar.
  4. Görüntüleme kabını mikroskopa yerleştirin. Mikroskop aşamasında çamağı mümkün olduğunca sol alt tarafa itin. Eğer hava dışı objektif kullanıyorsanız, örneği sahneye bantlayın, böylece xy-drift önlenir.
    NOT: Numuneyi mikroskop aşamasına bantlamak, hava dışı objektifler kullanıldığında çanak hareket etmemesini önlemek için gereklidir.
  5. DAPI kanalına geçin ve kontrolcünün yanındaki düğmeyle Z yüksekliğini yükseltmeye başlayın. Hücre çekirdekleri netleşene kadar yavaşça ilerleyin.
    1. Mikroskop kontrolöründeki "havuçları" Z yükseklik düğmesinin hassasiyetini ayarlamak için ayarlayın.
    2. Hücreler görünür olmazsa, XY koordinatlarının çekirdekli bir plaka alanına ayarlanması gerekebilir.
  6. Mikroskop kontrol panelinde PFS otomatik odakını "Açık" olarak ayarlayın.
    1. AX panelinin sağ tarafında, PFS düğmesinin yanındaki büyüteç penceresini seçin. Mikroskop, Z yüksekliğini normalleştirmek için ayarlamaya başlayacak. Tamamlandığında, PFS düğmesi yanmalı ve PFS'nin açık olduğunu göstermek için "odakta" yazmalıdır.
      NOT: Perfect Focus System (PFS), XY aşama hareketi veya uzun süreli deneylerden kaynaklanan Z kaymasını en aza indirir. PFS seçildiğinde, herhangi bir Z yükseklik ayarı için 2 hız kullanın çünkü PFS otomatik olarak küçük ayarlamaları karşılar.
  7. Hücre veri toplamaya başlamadan önce, hücreleri ARAMAK için AX dedektörü kullanıldığından emin olun, FLIM/FCS dedektörleri değil.
  8. Hücre ararken, DAPI kanalını kullanarak hücre alanlarını bulun, ardından ATTO 590 kanalına geçerek etkili şekilde boncuk yüklü hücreleri bulun.
    NOT: Boncuk yükleme verimliliği (bizim elimizde, hücrelerin ~%30'u boncuklu olur) nükleer boyama verimliliğinden çok daha düşüktür, bu yüzden floresan çekirdekli tüm hücrelerde ATTO 590 bulunmaz.
  9. Bir hücre tanımlandıktan sonra, üzerine çift tıklayarak çerçevenin ortasında konumlandırın. Alternatif olarak, satın alma penceresine sağ tıklayın ve "bu noktayı merkeze taşıyın" seçeneğine tıklayın.
  10. Hücre merkeze geldiğinde, "AX FLIM ve FCS" seçeneğine geçin.
  11. Ekranın sağ alt köşesinde "512 x 512" seçeneğinin seçildiğinden emin olun.
  12. Sağ alttaki küçük pencerede, köşeleri tıklayıp sürükleerek çerçeveyi hücreye uyacak şekilde ayarlayın. Yeni boyuttaki çerçevenin kırmızıya dönmesine izin ver. Çerçevenin içine sağ tıklayın veya "Live" seçeneğini seçin, ta ki çerçeve yeşile dönene kadar, bu da ayarın gerçekleştiğini gösterir.
  13. Yakalama sayısını istenen değere ayarlayın.
    NOT: Hücresel deneyler için en az10-4 foton idealdir. Subhücre deneyleri için, 10-5 veya daha fazla toplam foton idealdir; çünkü ilgi alanı (ROI) tanımlandığında fotonların büyük bir yüzdesi dışlanacaktır. 512 x 512 boyutunda bir çerçeve için, ~30 kare genellikle hücresel bir alım için yeterlidir. Daha fazla veya daha az yakalama elde etmek, sırasıyla çözünürlük veya yakalama hızını artırır.
  14. "Capture" seçeneğini seçin. Yakalama ile birlikte yeni bir pencere açılmalıdır. Ekranın sağ tarafındaki yakalama ilerleme kutusu, yakalama giriş kutusunun yanında görünmelidir.
  15. Bu arada, floresans ömür boyu görüntüleme mikroskopisi (FLIM) analiz yazılımını açın ve doğru dosya yoluna gidin. FLIM satın almaları otomatik olarak FLIM analiz yazılımı penceresini doldurur ve alındıkça isimleri değiştirilebilir.
  16. Yakalama işlemi tamamlandıktan sonra, AX dedektörüne geri dönüp "Live" seçeneğini seçerek yeni bir hücre ararsınız. AX FLIM/FCS penceresinin boyutu, daha büyük/küçük hücreleri hesaba katacak şekilde istediğiniz zaman ayarlanabilir.
  17. 3 saatlik görüntüleme süresi içinde yeni hücreler edinmeye devam edin.
  18. İşiniz tamamlandığında, oluşturulan .sptw dosyasını "In Vitro Data Collection" bölümündeki 7. Adımı takip ederek dışa aktarın.
  19. İş bitince FLIM İşleme'ye geçin.

9. 3D Z-Stack hücresel FLIM veri toplama

  1. Tam lazer ayarı, Z-yükseklik ayarı ve hücre araması, 2D Hücre Veri Toplama, Adımlar 8.1 - 8.12'de açıklandığı gibi.
  2. Ayarlar alanının üst kısmında "ND Acquisition" sekmesine geçin.
  3. "XY" işaret kutusuna tıklayın, bir tablo görünecektir.
    1. Tabloda herhangi bir koordinat varsa, tablonun sağ üst köşesindeki "Değerleri Temizle" seçeneğine tıklayın.
  4. Tablonun üstündeki "Ekle" tuşuna tıklayarak hücreyi tabloya ekleyin.
    1. Bu, aşamanın mevcut XY koordinatlarını ve Z-değeri/PFS değerini doldurmalıdır.
  5. Tablonun üzerindeki "Z" kutusuna tıklayın.
  6. Canlı yakalama ve mikroskop kontrolcüsünü kullanarak hücrenin plakaya yakın en altına doğru kaydırın. Hücrenin alt kısmı bulunduğunda, küpün yanındaki sarı "Alt" butonuna tıklayarak bu Z yüksekliğini hücrenin alt kısmı olarak kullanın.
  7. Bu işlemi hücrenin üst kısmında tekrarlayın, mikroskop kontrolörü ile hücrenin üstüne gittikten sonra "Top" butonuna tıklayın.
  8. Küpün altında, "Adım" kutusunun yanındaki butona tıklayın. Bu, adım kutusunu tanımlanmış Z yüksekliği için önerilen adım sayısıyla doldurur.
    NOT: Adım sayısının artırılması, Z eksenindeki nihai çözünürlüğü ve alım süresini artıracaktır. Hücrenin her dilimi ayrıca bireysel olarak analiz edilmek ve tüm hücrenin yaşam süresi belirlenmelidir; bu nedenle bu görüntü analiz süresi hücre başına kaç adım belirlendiğinde dikkate alınmalıdır. Z-stack deneyi için adım sayısına karar vermeden önce FLIM uyum süreciyle ilgili tam detaylar için "Alt Bölüm: Hücresel FLIM İşleme" bölümüne bakınız.
  9. "Acquisition" sekmesine geri döndüğünüzde, kare sayısını normal miktarın yaklaşık yarısına kadar değiştirin.
    NOT: Bu öncelikle zaman kazandırmak içindir, çünkü herhangi bir Z-yığını diliminin kalitesi, nihai görüntünün kalitesi açısından daha az önemlidir. Titiz görüntü kalitesini korumak için, her dilim başına normal veya daha fazla sayıda yakalama seçin. Bu, satın alma süresini uzatacaktır.
  10. "ND Acquisition" tablosuna geri dönün, "Şimdi Çalıştır" seçeneğini seçin.
  11. Mikroskobun hücrenin tüm dilimlerini almasına izin verin; Edinme süresi, seçilen dilim ve yakalama sayısına bağlı olarak değişir.
  12. Görüntü toplandıktan sonra, .nd2 dosyası olarak kaydedin ve edinim penceresinin üstündeki "Show Volume View" butonu ile 3D olarak görselleştirin.
  13. Hücresel Z-yığını için konfokal görüntüler elde etmek gerekirse, AX detektörleri kullanarak hücrenin aynı görüntüsünü alın.
    1. Kontrol panelinin üst kısmında "AX" seçerek AX dedektörlerine geçin.
    2. "ND Acquisition" tablosuna geri dönün, "Run Now" seçeneğini seçin. Konfokal görüntünün elde edilmesi FLIM görüntüsüne kıyasla çok daha kısa sürede gerçekleşir.
  14. Tamamlandığında, oluşturulan .sptw dosyalarını "In Vitro FLIM Veri Toplama" bölümündeki 7. Adımı takip ederek dışa aktarın.
  15. Konfokal görüntü, .nd2 dosyası olarak dışa aktarılabilir ve bilgisayarda bilinen bir konuma kaydedilebilir.
  16. İş bitince "FLIM İşleme" ye geçin.

10. FLIM İşleme

  1. Genel/In Vitro FLIM işleme
    ​    NOT: Hücresel FLIM verilerine özgü protokol değişiklikleri, örneğin ROI seçimi için, bkz. Hücresel FLIM İşleme (Bkz. Adım 10.2).
    1. FLIM analiz yazılımını başlatın.
      NOT: FLIM analiz yazılımı anahtarı mikroskopla aynı bilgisayara bağlıysa, yazılımın açılması için mikroskop tamamen açık olmalıdır. Yazılım anahtarı ayrı bir bilgisayardaysa, yazılım "Cihaz açılış başarısız oldu. TCSPC bağlanamıyor" şeklinde bu güvenle reddedilebilir.
    2. FLIM .sptw dosyasını FLIM analiz yazılımında aşağıdaki yöntemlerden biriyle açın:
      1. Ekranın üst kısmında, Dosya > Open Workspace > [.sptw dosya konumunu seç] seçeneğine gidin.
      2. .sptw dosyasını kaydedilen konumundan sürükleyip pencerenin solundaki büyük beyaz kutudaki FLIM analiz yazılımı penceresine bırakın.
        NOT: FLIM analiz yazılımlarının FLIM klasörlerini tanıyabilmesi için, klasörlerin ".sptw" ile bitmesi ve bir WSLogfile içermeleri gerekir. Veri klasörlerini yeniden adlandırırken veya taşınırken bu tanımlayıcıların kaldırılmadığından emin olun. Başarılı bir şekilde yüklendiğinde, sol taraftaki pencereyi küçük yeşil kareler kaplarak ve bireysel veri toplamalarını temsil eder.
    3. Yeşil satın almalardan birine tek tıklama yapın.
    4. Analysis > Imaging > FLIM'e gidin ve "Start" seçeneğini seçin. FLIM dosyası yüklenmeye başlayacak.
    5. Yüklendikten sonra, otomatik olarak oluşturulan ölçek çubuğu örnek penceresine sağ tıklayarak ve "Scalebar'ı göster" seçeneğinin işaretini kaldırarak kaldırılabilir.
    6. Decay Fitting sekmesinde aşağıdaki açılır menü seçeneklerini seçin:
      1. Uyum Modeli: N-Üstel Yeniden Dönüşüm
      2. Çürüme: Genel Çürüme
      3. IRF: Hesaplanan IRF
        NOT: In vitro FLIM görüntüleri genellikle homojendir ve yatırım getirisi gerektirmez. Ancak, istenmeyen görüntü özellikleri çıkarılabilir. Eğer öyleyse, örnek penceresine sağ tıklayarak ve farklı ROI çizim seçeneklerinden birini seçerek bir ROI tanımlayın. Bir alanı tanımlamak için tıklayın ve basılı tutun. Dışlanan değerler monokrom olmalı, seçilen değerler ise renkli kalmalıdır. Tutarlılık için hesaplanan bir IRF kullanılır; ancak ölçülen IRF, belirli deneysel koşullar için daha iyi doğruluk sağlayabilir ve mevcut olduğunda dikkate alınmalıdır17.
    7. Alt kısımda turuncu "İlk Uyum" düğmesini seçin. Yazılım, en iyi uyum çizgisini hesaplayacak ve yeşil bozulma eğrisi verilerinin yanına siyah renkte çizecek.
    8. Uyumu ve ortaya çıkan kalıntıları analiz edin ve uyumun kalitesini belirleyin.
      1. Bozulma eğrisi altında, üretilen kalıntılara bakın ve uyumun kalitesini belirleyin. Rastgele, gürültü benzeri kalıntılar iyi kalitede uyumu gösterirken, belirgin çizgi özellikleri ve düzgün eğimler kötü uyumu gösterir.
      2. Uyum kalitesini değerlendirmek için χ2 değeri, uyum tablosunun sağ alt köşesinde yer alır. χ2 , uyum geliştikçe 1'e yaklaşıyor.
        NOT: Kalıntılar grafiki, hesaplanan bozulma eğrisi (siyah çizgi) ile ölçülen bozulma eğrisi (yeşil) arasındaki örtüşmenin doğrusal bir temsilidir. Bu, uyumun kalitesinin, iki eğrinin ne kadar hizalandığına bakarak değerlendirilebileceği anlamına gelir. FLIM verilerinin uydurulması hakkında daha fazla detay yakın tarihlibir yayında verilmiştir 23.
    9. Uyum kalitesini artırmak için parametre sayısını ihtiyaç duyduğunuzda ayarlayın.
      1. "Model Parametreleri"nin yanında, n'nin değerini 1 artırın ve "Initial Match"i seçin. Yeni eğri hesaplanacak ve yeni kalıntılar ile χ2 değeri gösterilecektir.
      2. Bu yeni uyumun kalitesini değerlendirin ve ek parametrelere ihtiyaç olup olmadığını belirleyin.
      3. 10.1.9.1 adımlarını tekrarlayın. 10.1.9.2'ye kadar. modellenen çürüme en iyi kaliteye ulaşana kadar.
        NOT: Parametre sayısı en aza indirilerek mümkün olan en yüksek uyum kalitesi sağlanmalıdır. İki parametre neredeyse aynı uyum kalitesi üretiyorsa, daha az sayıda parametre kullanılmalıdır. Teorik olarak, model parametrelerinin sayısı, örneklemdeki yaşam boyu üreten türlerin sayısına karşılık gelir. Pratikte, ideal parametre sayısı, görselleştirilen sistemin karmaşıklığı arttıkça artar.
      4. Son parametre sayısı belirlendikten sonra, Decay Fitting tablosundan τAvAmp ağırlıklı ömrü (τ AvAmp [ns]) kaydedilebilir.
        NOT: Tau ortalama genliği (τAvAmp) ve Tau ortalama yoğunluğu (τAvInt), her ikisi de bir örneklemin ortalama floresans ömrünün ölçümüdür. Ancak, her bir değeri belirlemek için kullanılan hesaplamalar farklıdır ve ikisi birbirinin yerine geçemez. Genel olarak, τAvAmp biyolojik sistemler için daha doğru birmetriktir 23.
      5. Numunenin uyumlu FLIM görüntüsünü elde etmek için, uydurulan verileri kullanarak arka plan çıkarımı yapın ve bir FLIM Uyumu gerçekleştirin.
        1. Decay Fitting tablosunda beyaz kutular için, τn[ns] kutuları hariç tüm kutuları işaretinden kaldırın. τn[ns] kutu sayısı, belirlenen uyum parametrelerinin sayısına karşılık gelir.
        2. BkgrDec[Cnts]'in değerini sıfıra değiştirin.
        3. Örnek penceresinin hemen solunda "FLIM Fit" seçeneğini seçin. Yazılım numuneye uymaya başlayacak.
      6. Takma işlemi tamamlandıktan sonra, sahte renk ölçeği ve yoğunluk gösteri ayarları, örnek penceresinin sağındaki kısaları değiştirerek ayarlanabilir.
      7. Örnek görüntü, sağ tıklayın > Bitmap veya Bitmap ile Bitmap ile sağ tıklayınca daha fazla görüntü işleme için Bitmap >olarak dışa aktarılabilir.
  2. Hücresel FLIM İşleme
    1. Genel/in vitro FLIM İşlemde 10.1.1 - 10.1.5 adımlarını tamamla.
    2. Örnek ekran penceresine sağ tıklayarak ve ROI çizim seçeneklerinden birini seçerek hücresel yatırım getirisi tanımlayın.
      NOT: Düzensiz şekilleri nedeniyle, hücreleri tanımlamak için Serbest ROI seçeneği genellikle en iyisidir. Bir ROI'dan bir alan, bir alanı tanımlarken CTRL tutularak hariç tutulabilir. Zaten seçilen bir ROI'ya SHIFT tuşuna tutarak ek alan eklenebilir. Subhücre bölmeleri analiz edilirken, konfokal görüntülerde görülen floresan lekeler, sonraki FLIM görüntüsünde görünmeyebilir. Bu durumlarda, FLIM görüntüsünde ROI çizmek için konfokal görüntünün referans olarak kullanılması tavsiye edilir.
    3. Decay Fitting sekmesinde aşağıdaki açılır menü seçeneklerini seçin:
      1. Uyum Modeli: N-Üstel Yeniden Dönüşüm
      2. Çürüme: ROI
      3. IRF: Hesaplanan IRF
  3. İşlemin kalan kısmını Genel/In Vitro FLIM İşlem bölümünde, 7'den 13'e kadar olan adımlarda tamamlayın.

Sonuçlar

Deneysel iş akışının tam grafiksel bir özeti Şekil 1'de bulunabilir. Deneysel yanlılığı en aza indirmek için, veri setleri kör şekilde analiz edilebilir. Bu amaç için bir örnek olarak, veri toplama ve işleme sırasında tüm örnek kimlikler araştırmacılardan gizli tutuldu. Bu nedenle, deneysel gruplar atanan tanımlayıcı (grup A, grup B vb.) ile etiketlenir ve gerçek kimlikleri metin ve şekil başlıklarında tanımlanır.

RNA A etiketinin saflaştırılmasının ardından, RNA A etiketinin varlığı ve yokluğunda iki Riboglow probun in vitro floresans ömri Cbl-3xGly-ATTO590 ve Cbl-5xGly-ATTO590 (5xGly) ölçüldü. 3xGly ve 5xGly probları, linker segmentlerindeki glisin monomerik tekrarlarının sayısı dışında aynıdır; 3xGly için üç, 5xGly için beş (Şekil 2D). In vitro floresans ömrü toplanıp yukarıda açıklanan yöntemlerle analiz edildi ve genel bozulma ROI seçimi olmadan analiz edildi (Şekil 2E-2G). n-üssel rekonvolüsyondan sonra, τAvAmp değerleri çıkarıldı ve deneysel grup tarafından çizildi (Şekil 3B). Her grup için normalize edilmiş yanlış renk ölçekleriyle temsil eden FLIM alım pencereleri üretildi ve onların özgün örnek tipine karşılık gelen toplanan τAvAmp değerleriyle uyumlu olduğu gösterildi (Şekil 3A ve 3B). Beklendiği gibi, RNA A etiketi içeren in vitro yaşam süresi örneklerinde (gruplar B ve C), RNA A etiketi olmayanlara (grup A ve D) kıyasla anlamlı derecede yüksek floresans ömrü değerleri bulundu. Her deneysel grup için temsil eden bozunma eğrileri, RNA A Etiketinin varlığının in vitro çıkarılan ömrü artırdığını ayrıca göstermektedir (Şekil 3C). RNA A Etiketi olmayan örnekler için, bozulma eğrileri sola kaydırılır; bu da RNA A Etiketi olan örneklere kıyasla daha kısa ortalama ömür değerlerini gösterir.

Canlı hücrelerde floresan ömrünü araştırmak için, yukarıda açıklandığı gibi yapışkan HeLa hücrelerinin boncuk yüklemesi Riboglow probları 3xGly ve 5xGly ile gerçekleştirilmiştir (Şekil 4A). FLIM analizi, farklı Riboglow problarının canlı hücrelerde benzersiz yaşam sinyalleri üretip üretmediğini belirlemek için kullanıldı. Hücreler, yüklü Riboglow probun varlığı ve hücrenin genel sağlığı temelinde FLIM ölçümü için seçildi. Hücreler, floresans yaşam süresi sonucundan bağımsız olarak, ömür boyu analiz öncesinde doğrulanmış prob yükü ve normal morfolojiye göre seçildi. Toplanan FLIM verileri, hedef dışı floresans sinyallerini sınırlamak için ROI'lar kullanılarak analiz edildi (Şekil 2H, Şekil 4B). Sonuçlar, 3xGly (grup E) ile boncuk yüklü hücrelerin hücresel floresans ömrünün, 5xGly yüklü hücrelere göre (grup F, Şekil 4D) anlamlı şekilde daha düşük olduğunu göstermiştir. Bu eğilim, iki örnek grubunun temsil eden bozunma eğrileriyle daha da görselleştirilebilir; burada 3xGly yüklü bir hücre, 5xGly yüklü hücreye kıyasla sola kaydırılmış bir bozunma eğrisine sahiptir ve bu da daha düşük ortalama floresans ömrünü gösterir (Şekil 4C). Bu sonuçlar, Riboglow problarının hücresel ömrünün 2B hücresel görüntülerden çıkarılmasında tarif edilen protokollerin faydasını göstermektedir.

Daha sonra Riboglow-FLIM'i subhücre bölmelerinde çözmeyi hedefledik. Örneğin, nükleer ve sitozolik FLIM sinyallerini seçtik. Hücre çekirdeklerinin ömrü toplandı ve hücre bölmeleri arasındaki yaşam süreleri karşılaştırılarak sitozolik yaşam süresiyle karşılaştırıldı (Şekil 5). Mavi nükleer lekeli hücrelerin konfokal görüntüleri FLIM görüntüleri ile birlikte toplandı ve nükleer ve sitozol ROI'larını belirlemek için kullanıldı (Şekil 2J, Şekil 5C). 3xGly ve 5xGly ile yüklü hücre çekirdekleri ve sitozollerin FLIM analizi, her iki gruptaki subhücre bölmeleri arasında önemli bir yaşam süresi farkı ortaya koydu (Şekil 5F). Önceki gözlemlere uygun olarak, Riboglow probu ile yüklenmiş hücrelerin çekirdeği, aynı hücrenin sitozolünden sürekli daha yüksek floresans ömrüne sahiptir. Nükleer ömrü, ortalama olarak 3xGly ve 5xGly için sitosolden 0,18 ns ve 0,13 ns daha fazlaydı. Önemli olarak, yanlış renk ölçeği alma penceresi, bozulma eğrileri ve çıkarılan τAvAmp değerleri aynı floresans yaşam eğilimini gösterir (Şekil 5C-Şekil 5F). Nükleer ve sitozolik yaşam sürelerindeki bu farklar küçüktü ancak sağlam veri analiz iş akışımız sayesinde tutarlı şekilde tespit edildi.

Giderek karmaşıklaşan sistemlerde FLIM'in faydasını göstermek için 3D hücresel Z-yığınları toplanıp analiz edildi. Toplam dört hücre, Z-yığın dilimleriyle üç boyutta görüntülendi ve hücre başına 10–15 dilim sayısı değişiyordu. Her hücresel dilim için, çekirdek ve sitozolun ROI'ları toplandı ve tüm dilimler için çıkarılan τAvAmp değerleri eşleştirilmiş bir t-testi kullanılarak çizildi ve analiz edildi (Şekil 5A ve 5B, 5G). Tüm deneylerin sonuçları, bu hücrelerde çekirdek ile sitozolun yaşam süreleri arasında anlamlı bir fark olmadığını gösterdi. Bu, Z-dilim başına foton sayısının azalması ve örneklem büyüklüğünün sınırlı olması nedeniyle 3D analizde istatistiksel güç ve ömür çözünürlüğünü azaltabilir. Bu veriler, FLIM veri toplamada örnek büyüklüğü ve foton sayılarının önemini vurgulamaktadır; burada birden fazla hücre analizi ve daha yüksek foton sayısı ile yakalanın, tek hücreli, düşük foton deneylerinde görülmeyen yaşam boyu farkları ortaya koymaktadır (Şekil 5F ve 5G).

Bu sonuçlar birlikte, Riboglow sistemi tarafından üretilen FLIM verilerinin çeşitli ilgili biyomoleküler bağlamlarda toplanma ve analiz edilmesinde tanımlanan protokolün faydasını göstermektedir.

figure-results-1
Şekil 1: Deneysel iş akışının genel bakışı. A-B) In vitro (A) ve memeli hücresi (B) örnekleri için örnek hazırlama iş akışı. C) FLIM veri toplama iş akışı. D) FLIM veri işleme iş akışı. Toplanan veriler n-üstel yeniden dönüşüm kullanılarak uyarlanır, her alım için uyum parametreleri sayısı belirlenir ve nihai ömür değeri belirlenip dışa aktarılır. E-F) FLIM veri göstergesi. In vitro veriler (E) sahte renkli FLIM görüntüleri veya ömür boyu nokta grafikleri olarak sunulurken, hücresel veriler (F) ise 2D veya 3D hücre FLIM görüntüleri olarak sunulur. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-2
Şekil 2: Riboglow platformu, linker serisi ve FLIM montaj iş akışı. A-B) Riboglow probları ve RNA A etiketi karikatürleri. C) Riboglow probun RNA aptamer etiketine (A Etiketi) bağlanmasının illüstrasyonu; bu da karmaşık oluşumda floresans yoğunluğu ve ömür süresinin artmasına yol açar. D) Bu çalışma için Riboglow linker serisi. Cbl (erik), değişken bir kimyasal bağlayıcı aracılığıyla bir florofora (mavi) kovalent olarak bağlanır. 5xGly, sarı renkle vurgulandığı gibi iki ek glisin kalıntısı içerir. E-J) FLIM veri işleme SymPhoTime 64 üzerinden gerçekleşiyor. E-G) FLIM verileri SymPhoTime 64 (E)'ye aktarılır. Temiz bir ilgi alanı (ROI) (F) seçilir ve ardından dağılma eğrileri n-üssel yeniden dönüşüm modeli (G) kullanılarak uyarlanır. Optimal uyum, genlikli ortalama ömür süresini (τAvAmp) elde etmek için kullanılır. H) U-2 OS hücrelerinde söndürülmüş 3xGly'nin 2D hücresel FLIM analizi, n = 3 için uyma göstermektedir. I) HeLa hücrelerinin 3D hacim renderasyonu, 5xGly ve DAPI ile etiketlenmiş. J) Çekirdek ve sitozol FLIM analizi için Z-yığını iş akışı, ilgili konfokal z-dilimlerinin bölmeye özgü yaşam boyu uyum için kesin bir yatırım getirisi yerleştirmesini nasıl yönlendirdiğini gösteriyor. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-3
Şekil 3: İki prob varyantının in vitro +/- RNA floresans ömürlerinin değerlendirilmesi. A) RNA A etiketi varlığı veya yokluğunda in vitro floresans ömür boyu görüntüleme mikroskopisi (FLIM) ile Riboglow problarının nicel görselleştirmesi. Ölçek çubuğu = 50 μm. B) RNA A etiketi olan ve olmayan 3xGly ve 5xGly in vitro örnekler için τ AvAmp değerleri çizildi. Her puan bir FLIM satın alımı anlamına gelir. Hata çubukları ortalama ve SD'yi temsil eder. Tek yönlü ANOVA ile post hoc Tukey HSD, ömür sürelerinde önemli farklılıklar gösterir (****p < 0.0001). C) RNA-A olan ve olmayan 5xGly ve 3xGly problar için temsil eden in vitro bozunma eğrileri. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-4
Şekil 4: 3xGly (Grup E) ve 5xGly (Grup F) Riboglow problarıyla HeLa hücrelerinin floresans ömür boyu görüntülemesi. (A) Prob yükleme sürecinin genel görünümü. (B) Grup E (solda) ve F'de (sağda) hücresel alım görüntüleri. Ölçek çubuğu = 10 μm. (C) Grup E ve F'den çıkarılan ve IRF ile çizilmiş uyarlanmış yaşam süresi bozunma eğrileri. (D) HeLa hücrelerinde Grup E (n=18 hücre) ve Grup F (n=18 hücre) için floresans ömrü, ortalama ve %95 CI hata çubukları gösterilmiştir. Eşleşmemiş t-testi, 3xGly ve 5xGly ile yüklü hücreler arasında yaşam sürelerinde önemli fark gösterir,*** p < 0.0005. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-5
Şekil 5: 3xGly (Grup L) ve 5xGly (Grup M) Riboglow probları kullanılarak subhücre bölmelerinin FLIM analizi. (A) Z-yığını görüntülemenin şematik temsili. (B) Konfokal Z-yığını görüntüleri aracılığıyla elde edilen bir HeLa hücresinin 3D render edilmiş görüntüsü. HeLa hücreleri mavi bir nükleer leke (cian) içeriyordu ve Riboglow probu (turuncu) ile yükleniyordu. (C) Boncuk yüklü HeLa hücrelerinin FLIM analizi. Konfokal görüntüler (sol sütun) ROI seçimi için referans olarak kullanıldı (orta, sağ sütunlar). Ölçek çubukları = 10 μm. (D-E) ( D) 3xGly veya (E) 5xGly ile yüklenmiş HeLa hücrelerinin nükleer ve sitozolik ROI'larından çıkarılan temsil floresan bozunma eğrileri. Eğriler, normalize foton sayılarını bozunma süresine karşı gösterir ve her bozulma, cihaz yanıt fonksiyonuyla (IRF, siyah) üst üste örtülür. (F) İki deneysel grup arasında nükleer ve sitozolik ROI'lardan floresans ömrünü niceleyen nokta çizimi. Her nokta tek bir hücresel yatırım getirisini temsil eder. Tek yönlü ANOVA ile post hoc Tukey HSD, her iki grupta da çekirdek ve sitozol arasındaki yaşam sürelerinde önemli farklar ortaya koyuyor (****p < 0.0001). (G) Dört hücrenin floresans ömrü boyunca Z-yığınlarının nokta grafiği. Her nokta, hücresel Z-yığının bir diliminden alınan tek bir yatırım getirisini temsil eder. Aynı hücreden türetilen birden fazla yatırım getirisi (ROI) temkinli şekilde ele alınmıştır, çünkü bunlar tamamen bağımsız biyolojik kopyalar değildir. Tüm yatırım getirisi konfokal görüntü referans olarak tanımlanmıştır. Eşleştirilmiş t-testleri, tüm hücresel Z-yığınlarında çekirdek ile sitozol arasında yaşam sürelerinde anlamlı bir fark göstermemiştir (ns p > 0.05). Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

Riboglow-FLIM, floresans ömür boyu okumalarından faydalanarak nicel RNA görüntüleme için bir çerçeve sağlar. Bu protokolün başarılı uygulanması, foton alımı, bozunma uyumu ve tarafsız örnekleme işlemlerinin dikkatli kontrolüne kritik önem verir. Foton sayıları, güvenilir n-üstel yeniden dönüşüm için yeterli istatistikler sağlamak için dengelenmelidir; aynı zamanda dedektör doygunluğu, yığılma etkileri ve çıkarılan ömürleri yapay olarak azaltan foto ağartmadan kaçınmak gerekir. Pratikte, yetersiz foton sayısı genellikle başarısız uyumlara yol açar; özellikle hücre görüntülemede küçük yatırım getirisi (ROI) kullanıldığında, örneğin küçük hücre bölmelerini çözmeye çalışırken, aşırı foton akısı TCSPC algılamasında binning sınırlamaları nedeniyle bozulma eğrilerini sıkıştırır. Bu nedenle, deneysel hedeflere göre uygun dall sürelerini, kare sayılarını ve lazer gücünü seçmek çok önemlidir. Dwell süresi ve kare sayısı, her pikselin ne kadar süre örneklendiğini ve görüş alanının kaç kez tekrar ziyaret edildiğini kontrol ederek toplam foton bütçesini belirler; lazer gücü ise uyarılma oranını ve dolayısıyla dwell süresi başına foton verimini belirler; bu da sinyal-gürültü, foto ağartma ve yığılma için doğrudan sonuçlar doğurur. Aynı derecede önemli olan, model parametrelerini en az şekilde en aza indirerek ve rastgele kalıntıları doğrulayarak bozunma eğrilerinin aşırı uyumunu önlemektir; çünkü aşırı parametreleştirme sistematik olarak ömür değerlerini aşağıya doğru önlüdür. Ömür boyu metrik seçimi önemli bir analitik husustur; çünkü genlik ağırlıklı (τAvAmp) ve yoğunluk ağırlıklı (τAvInt) ortalamaları çoklu üssel azalmanın farklı yönlerini yansıtır ve birbirinin yerine geçemez. Önceki rehberlikle tutarlı olarak, τAvAmp burada kullanılır çünkü yaşam boyunca bileşenlerin kısmal katkılarını daha doğrudan temsil eder ve heterojen biyolojikortamları çözmek için daha uygundur 23. Enstrüman yanıt fonksiyonunun (IRF) doğru belirlenmesi, özellikle kısa ömürlü bileşenlerin çözülürken, güvenilir rekonvolüsyon uyumu için gereklidir. Hesaplanan bir IRF, deneysel uyum tutarlılığını zaman içinde korumak için kullanılır, ancak gerçek enstrüman yanıtından sapırsa sistematik hata yapabilir. Ölçülen ve hesaplanan IRF'ler arasındaki uyumu doğrulamak için potasyum iyodür standardı kullanılarak IRF'nin periyodik ölçümü yapılmalıdır. Hücresel deneyler için, tarafsız örnekleme, ömür boyu çıkarmadan önce hücre sağlığı ve prob yükü değerlendirmesini gerektirir; çünkü ömür boyu sonuçlara dayalı sonradan hariç tutma seçim yanlılığını oluşturur. Boncuk yüklemesi, hücre yaşamında ek değişkenlik getirir ve sadece parlak alan veya konfokal görüntüleme ile belirlenen normal morfolojiye ve stabil floresans sinyali sergileyen hücreler analize dahil edilmelidir. Yuvarlama, blebbing veya loş hücreler gibi düzensiz yapılarhariç tutulmalıdır 22. Deneyimimize göre, görüntüleme, hücresel stresi en aza indirmek için yaklaşık 3 saat içinde yapılması ve zamanla floresans ömür ölçümlerini değiştirebilmesiyle tamamlanır.

Bozulma eğrisi uyumu, Riboglow-FLIM deneylerinde en yaygın sorun giderme sorununu temsil eder. Başarısız uyumlar, negatif uyum genlikleri (FLIM analiz uyumlarından < 0), ölçülen ve ölçülen bozulmalar arasındaki yetersiz örtüşme veya yapılandırılmış kalıntılar gibi fiziksel olmayan parametrelerle tanımlanabilir. Birçok durumda, uyum kalitesi, düşük sinyal veya geç zaman gürültüsünü dışlayacak şekilde zamansal uyum sınırlarının ayarlanmasıyla iyileştirilebilir; ancak bozulmanın doğrusal bölgesi logaritmik ölçekte korunur. Bu yaklaşım ömür boyu çözünürlüğü biraz azaltsa da, çıkarılan ortalama ömür sürelerini en az etkiler ve kullanılabilir veri setlerinin korunmasına olanak tanır. Yeterli foton sayısına ve sınır optimizasyonuna rağmen uyum hataları devam ederse, edinimin hariç tutulması gerekçelidir. Büyük ölçekli hücresel çalışmalar için, konfokal görüntülemeyle hücrelerin ön seçilmesi ve çoklu noktalı FLIM alımlarının otomatikleştirilmesi gibi protokol değişiklikleri verimliliği önemli ölçüde artırabilir; ancak bu yaklaşımlar, uzun süreli görüntüleme seanslarında Z-kaymasını en aza indirmek için mikroskobun mükemmel odak sistemi kullanılarak stabil odak kontrolü gerektirir. Bu protokol, PicoQuant TCSPC donanımına sahip bir Nikon Ti2 Eclipse AX sisteminde gösterilmiştir, ancak genel alım ve analiz prensipleri, foton sayma, zamanlama çözünürlüğü ve dedektör konfigürasyonu üzerinde eşdeğer kontrol sağlandığı sürece Leica SP8 veya Abberior STEDYCON sistemleri gibi diğer FLIM platformlarına aktarılabilir. Burada analiz için SymPhoTime 64 kullanılsa da, dışa aktarılan FLIM veri setleri, TCSPC tabanlı formatları destekleyen diğer analiz yazılım paketleriyle uyumludur ve kullanıcılar iş akışlarını buna göre uyarlayabilir.

Deneyler tasarlanırken yöntemin birkaç sınırlaması göz önünde bulundurulmalıdır. İlk olarak, konfokal görüntüleme sırasında tanımlanan ilgi alanları doğrudan FLIM analiz yazılımına aktarılamaz ve bunun yerine her FLIM veri seti için manuel olarak yeniden çizilmelidir; bu da ek analiz süresi ve potansiyel kullanıcıya bağlı değişkenlik sağlar. Ayrıca, mevcut FLIM işleme iş akışları, SymPhoTime 64'te hacimsel ömür uyumu şu anda desteklenmediğinden, analiz süresini artırarak dilimler arasında foton istatistiklerini parçalamadığı için Z-yığını dilimlerinin bireysel analizini gerektirir. Bu parçalanma, ölçüm başına etkin foton sayısını azaltır ve loş bölgelerde veya küçük bölmelerde uyum hassasiyetini düşürebilir. Bu sınırlama, 3D hücresel görüntülemede etkili hale gelir; çünkü dilim başına azalan foton sayısı ve artan sistem karmaşıklığı yaşam süresini azaltır. Aynı hücreden dilimler boyunca genellikle birden fazla yatırım getirisi alındığından, bu ölçümler tamamen bağımsız değildir; bu da etkili biyolojik tekrarları azaltır ve istatistiksel yorumda dikkate alınmalıdır. Bu kısıtlamayla tutarlı olarak, 3D deneylerdeki küçük örneklem boyutları, tanımlanmış yatırım getirilerinde azalan foton sayıları nedeniyle tek hücre veya 2D analizlerde görülen biyolojik olarak anlamlı yaşam süresi farklarını gizleyebilir. Ayrıca, çok küçük veya loluk hücrealtı lokalizasyonların, mekansal çözünürlük veya foton yoğunluğu yetersiz olduğunda güvenilir şekilde yerleştirilmesi zordur; bu da örnek karmaşıklığı arttıkça mekânsal detay ile ömür boyu hassasiyet arasındaki dengeyi daha da vurgular.

Bu sınırlamalara rağmen, bu protokol, örnek türleri arasında Riboglow-FLIM'in uygulanması için ayrıntılı ve standart bir iş akışı sağlayarak karşılanmamış bir ihtiyacı karşılar. Riboglow daha önce yoğunluk tabanlı ölçümlerle uygulanmış olsa da, Riboglow-FLIM büyük ölçüde prob konsantrasyonu ve RNA ifade seviyesinden bağımsız olan nicel ve çevreye duyarlı bir okuma sağlar. Floresans ömrünün önceki çalışmalarda, prob konsantrasyonuna hassasiyetin azalması, fotobeyazlama ve optik yol farkları gibi yoğunluk temelli yaklaşımlara göre avantajları olduğu bildirilmiştir. Önemli olarak, Riboglow-FLIM edinimi ve analizi için daha önce standart bir protokol yayımlanmamış ve burada sunulan ayrıntılı iş akışı, in vitro, hücresel ve 3D sistemlerde tarafsız veri toplama, disiplin uyumu ve yorumlama için deneysel bir dizi değerlendirme noktası oluşturur.

Doğrulanmış bir Riboglow-FLIM protokolünün varlığı, canlı hücrelerde RNA dinamiği, lokalizasyonu ve düzenlemesini incelemek için deneysel araç setini genişletmektedir. Bu yaklaşım, hücrealtı bölümler, zaman noktaları veya deneysel koşullar arasında nicel karşılaştırma gerektiren deneyler ile ortogonal yaşam imzaları kullanılarak çoklanmış RNA görüntüleme için oldukça uygundur. Temel RNA biyolojisinin ötesinde, bu protokol giderek karmaşıklaşan biyolojik modellerde RNA işleme, taşıma, stres yanıtı ve transkripsiyon düzenlemesi çalışmalarına kolayca uygulanabilir. FLIM enstrümantasyon ve analiz yazılımları gelişmeye devam ederken, burada oluşturulan metodoloji, yaşam temelli RNA görüntülemenin daha yüksek boyutlu ve in vivo sistemlere genişletilmesi için bir temel sağlar.

Açıklamalar

Yazarların açıklamak zorunda kalacak bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

Braselmann laboratuvarındaki çalışmalar, Ulusal Sağlık Enstitüleri (R35GM150823 E.B.), Luce Vakfı (E.B.) ve Georgetown Üniversitesi Kimya Bölümü (L.K.S.'ye Espenscheid bursu) tarafından desteklenmektedir. Bu çalışma, Georgetown Üniversitesi'nde CHEM 4505 laboratuvar kursunun bir parçasıydı. CHEM 4505'e kayıtlı tüm öğrenciler, bu makalenin veri toplama, analiz ve geliştirme süreçlerine katılmış ve ortak yazar olarak listelenmiştir. Tüm yazarlar, bu el yazmasının geliştirilmesinde destekleri için Sanuja Mohanaraj ve Dr. Rodrigo Maillard'a teşekkür eder. Yazarlar ayrıca teknik geri bildirimleri için Emerson Boggs ve Dr. Clayton Hazelett'e teşekkür ediyor.

VERI ERIŞILEBILIRLIĞI

Tüm veri setleri ve analiz dosyaları, yayımlandıktan sonra bir depoda (bu el yazmasına atıfta bulunan halka açık bir Box klasörü) sunulacaktır.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
15 mL centrifuge tubeAbdosP10402Hücre kültürü ve boncuk yükleyici yapımı için kullanılır
Cbl-3xGly-ATTO590N/AN/ARiboglow sisteminde RNA tespiti için kullanılır, sentez bilgisi burada mevcuttur: https://doi.org/10.1021/acschembio.5c00917
Cbl-5xGly-ATTO590N/AN/ARiboglow sisteminde RNA tespiti için kullanılır, sentez bilgisi burada mevcuttur: https://doi.org/10.1021/acschembio.5c00918
Hücre ayırma ortamıGibco12605-28Hücre bölünme ve transfer için kullanılır
Canlı Hücre Görüntüleme TabaklarıIbidi81218-200Canlı hücre görüntüleme için kullanılır
Hücre Mikroskobu DMEMGibcoA1896701Canlı hücre görüntüleme için kullanılır
Konfokal Mikroskop SistemiNikonAXHücresel konfokal görüntüleme için kullanılır
DMEMGibco1195-092Memeli hücre kültürü için kullanılır
FBSCytivaSH30910.03DMEM'e serum takviyesi için kullanılır
Floresan ömür görüntüleme (FLIM) analiz yazılımıPicoQuantSymPhoTime 64, versiyon 2.9, derleme 5818FLIM analizi için kullanılır
Cam boncuklarMillipore SigmaG4649Riboglow problarını canlı hücrelere yüklemek için kullanılır
Cam KaplamalarVWR48368 062In vitro görüntüleme için kullanılır.
HEPESSigmaH3375RNA tamponunu yapmak için kullanılır.
Yüksek Verimli RNA Sentez KitiThermo ScientificK0441RNA transkripsiyon kiti
Hibrit Fotoçarpan DedektörüPicoQuantPMA Hibrit Serisifloresan ömür ölçümü için zaman foton algılaması için kullanılır.
KClFisher ScientificBP366RNA tamponunu yapmak için kullanılır.
Canlı Hücre Çekirdeği BoyasıInvitrogenR37605Canlı hücre görüntüleme sırasında hücre çekirdeğini boyamak için kullanılır
Memeli Hücre Kriyo TüpleriFisher Scientific12-567-501Memeli hücre depolama için kullanılır
MgCl2SigmaM8266RNA tamponunu yapmak için kullanılır.
Mikrosantrifüj TüpleriThermo Scientific90410Genel olarak in-vitro ve hücre kültürü çalışmalarında kullanılır
Mikroskop TabanıNikonTi2 EclipseIn vitro ve hücresel görüntüleme için kullanılır.
Mikroskop ObjektifiNikonN Plan ApochromatIn vitro ve hücresel görüntüleme için kullanılır.
Mikroskop Çalıştırma Yazılımı/Görüntü Alma ve Analiz YazılımıNikonNIS-Elements, versiyon 6.20.02.
Mikro Hacim SpektrofotometreThermo ScientificND-2000DNA ve RNA konsantrasyonu ve saflığının belirlenmesi için kullanılır
Çok Kanallı Olay ZamanlayıcıPicoQuantMultiHarp 150Vitro ve hücresel örneklerden floresan ömrünü çıkarmak için TCSPC için kullanılır.
NaClFisher ScientificBP358RNA tamponunu yapmak için kullanılır.
PBS, 1XCorning21-040-CVHücre yıkama ve boncuk çıkarma için kullanılır
Darbeli Diyot Lazer ve Lazer Birleştirme ÜnitesiPicoQuantSepia PDL 828, PicoQuant LCUVitro ve hücresel örneklerin lazer uyarma için kullanılır.
RNA Temizleme KitiNew England BiolabsT2050LRNA temizleme kiti
RNAse denaturantInvitrogenAM9780RNAse içermeyen bir ortam hazırlamak için kullanılır
Doku Kültürü TabaklarıFisher ScientificFB012923Genel hücre kültürü ve bakımı için kullanılır

Kaynaklar

  1. Bertrand, E., Chartrand, P., Schaefer, M., Shenoy, S. M., Singer, R. H., et al. Localization of ASH1 mRNA Particles in Living Yeast. Molecular Cell. 2 (4), 437-445 (1998).
  2. Johansson, H. E., Liljas, L., Uhlenbeck, O. C. RNA Recognition by the MS2 Phage Coat Protein. Seminars in Virology. 8 (3), 176-185 (1997).
  3. Braselmann, E., Rathbun, C., Richards, E. M., Palmer, A. E. Illuminating RNA Biology: Tools for Imaging RNA in Live Mammalian Cells. Cell Chemical Biology. 27 (8), 891-903 (2020).
  4. Paige, J. S., Wu, K. Y., Jaffrey, S. R. RNA Mimics of Green Fluorescent Protein. Science. 333 (6042), 642-646 (2011).
  5. Filonov, G. S., Moon, J. D., Svensen, N., Jaffrey, S. R. Broccoli: Rapid Selection of an RNA Mimic of Green Fluorescent Protein by Fluorescence-Based Selection and Directed Evolution. Journal of the American Chemical Society. 136 (46), 16299-16308 (2014).
  6. Song, W., et al. Imaging RNA polymerase III transcription using a photostable RNA–fluorophore complex. Nature Chemical Biology. 13 (11), 1187-1194 (2017).
  7. Dolgosheina, E. V., et al. RNA Mango Aptamer-Fluorophore: A Bright, High-Affinity Complex for RNA Labeling and Tracking. ACS Chemical Biology. 9 (10), 2412-2420 (2014).
  8. Chen, X., et al. Visualizing RNA dynamics in live cells with bright and stable fluorescent RNAs. Nature Biotechnology. 37 (11), 1287-1293 (2019).
  9. Sunbul, M., et al. Super-resolution RNA imaging using a rhodamine-binding aptamer with fast exchange kinetics. Nature Biotechnology. 39 (6), 686-690 (2021).
  10. Chen, M., et al. A molecular beacon-based approach for live-cell imaging of RNA transcripts with minimal target engineering at the single-molecule level. Scientific Reports. 7 (1), 1550(2017).
  11. Raj, A., Van Den Bogaard, P., Rifkin, S. A., Van Oudenaarden, A., Tyagi, S. Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes. Nature Methods. 5 (10), 877-879 (2008).
  12. Bratu, D. P., Cha, B. -J., Mhlanga, M. M., Kramer, F. R., Tyagi, S. Visualizing the distribution and transport of mRNAs in living cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (23), 13308-13313 (2003).
  13. Zuo, F., et al. Imaging the dynamics of messenger RNA with a bright and stable green fluorescent RNA. Nature Chemical Biology. 20 (10), 1272-1281 (2024).
  14. Grün, F., et al. Super-Resolved Protein Imaging Using Bifunctional Light-Up Aptamers. Angewandte Chemie International Edition. 63 (51), e202412810(2024).
  15. Braselmann, E., et al. A multicolor riboswitch-based platform for imaging of RNA in live mammalian cells. Nature Chemical Biology. 14 (10), 964-971 (2018).
  16. Sarfraz, N., Moscoso, E., Oertel, T., Lee, H. J., Ranjit, S., et al. Visualizing orthogonal RNAs simultaneously in live mammalian cells by fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM). Nature Communications. 14 (1), 867(2023).
  17. Sarfraz, N., Shafik, L. K., Stickelman, Z. R., Shankar, U., Moscoso, E., et al. Evaluating Riboglow-FLIM probes for RNA sensing. RSC Chemical Biology. 5 (2), 109-116 (2024).
  18. Sarfraz, N., et al. Establishing Riboglow-FLIM to visualize noncoding RNAs inside live zebrafish embryos. Biophysical Reports. 3 (4), 100132(2023).
  19. Datta, R., Heaster, T. M., Sharick, J. T., Gillette, A. A., Skala, M. C. Fluorescence lifetime imaging microscopy: fundamentals and advances in instrumentation, analysis, and applications. Journal of Biomedical Optics. 25 (07), 1(2020).
  20. Stickelman, Z., Sarfraz, N., Rice, M. K., Lambeck, B. J., Milkovich, S., et al. Expanding the Riboglow-FLIM Toolbox with Different Fluorescence Lifetime-Producing RNA Tags. Biochemistry. 64 (11), 2429-2438 (2025).
  21. Shafik, L. K., et al. Evaluating Linker Architecture in RNA-Detecting Riboglow Probes and Effects on Fluorescence Turn-On. ACS Chemical Biology. 21 (2), 371-379 (2026).
  22. Cialek, C. A., Galindo, G., Koch, A. L., Saxton, M. N., Stasevich, T. J. Bead Loading Proteins and Nucleic Acids into Adherent Human Cells. Journal of Visualized Experiments. (172), e62559(2021).
  23. Sarfraz, N., Braselmann, E. Practical guide to fluorescence lifetime imaging microscopy. Molecular Biology of the Cell. 36 (6), tp1(2025).

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

BiyokimyaSayı 234Riboglow-FLIMRNA mikroskopisiTCSPCboncuk yüklemeRNA etiketlemecanlı RNA görüntüleme3D RNA görselleştirme
Riboglow Problarının In Vitro Olarak Canlı Memeli Hücrelerinde Floresans Ömür Boyu Görüntülemenin Temeli Olarak Karakterize Edilmesi ve Üç Boyutlu Hücresel Modeller
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.